ES2324188T3 - Moleculas de acido nucleico que codifican proteinas que tienen actividad de fructosil-transferasa, y metodos para producir inulina de cadena larga. - Google Patents
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- C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans
Abstract
Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que tiene la actividad enzimática de una fructosiltransferasa (FFT) que conduce a la síntesis de polímeros de fructano de alta molecularidad, cuyas moléculas contienen por término medio más de 20 residuos fructosilo, seleccionadas del grupo constituido por: (a) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 4; (b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos que se indica bajo SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 3 o una secuencia de ribonucleótidos correspondiente; (c) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 80% a la secuencia codificante indicada en SEQ ID No. 1; (d) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 85% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2; y (e) moléculas de ácido nucleico que comprenden un fragmento de la secuencia de nucleótidos de (a), (b), (c), o (d).
Description
Moléculas de ácido nucleico que codifican
proteínas que tienen actividad de
fructosil-transferasa, y métodos para producir
inulina de cadena larga.
La presente invención se refiere a moléculas de
ácido nucleico que codifican proteínas que tienen la actividad
enzimática de una fructosil-transferasa (FFT). La
invención se refiere también a vectores que contienen tales
moléculas de ácido nucleico así como a células hospedadoras
transformadas con dichas moléculas de ácido nucleico, en particular
células de plantas, tejidos de plantas y plantas. Además, se
describen métodos para la producción de plantas transgénicas que
sintetizan inulina de cadena larga debido a la introducción de
moléculas de ácido nucleico que codifican una FFT. La presente
invención se refiere también a métodos de producción de FFT y a la
producción de inulina de cadena larga en diversos organismos
hospedadores, en particular plantas, así como a métodos in
vitro para la producción de inulina de cadena larga por medio
de la FFT de la invención. La presente invención se refiere
adicionalmente a las células hospedadoras de la
\hbox{invención
y a usos de la inulina que puede obtenerse por los procesos de la
presente invención.}
Los polímeros lineales solubles en agua son
aptos para una diversidad de aplicaciones, por ejemplo para aumentar
la viscosidad en sistemas acuosos, como detergentes, como agentes
de suspensión o para acelerar la sedimentación, para complejación y
también para la fijación de agua. Los polímeros que están basados en
sacáridos, tales como fructosil-polisacáridos, son
materias primas particularmente interesantes, dado que son
biodegradables.
Aparte de su aplicación como materias primas
regenerables para la producción y el procesamiento industriales,
los polímeros de fructosilo deben considerarse también como aditivos
en alimentos, por ejemplo como edulcorantes. Para diversos usos, se
precisan polímeros con longitudes de cadena variables. En tanto que
los polímeros de cadena corta y cadena media se prefieren
particularmente en la industria de procesamiento de alimentos,
polímeros con un alto grado de polimerización (DP) se precisan para
usos técnicos, tales como la producción de agentes
tensioactivos.
Hasta ahora, únicamente se han descrito métodos
para producción de polisacáridos de fructano de cadena larga en las
plantas, en los cuales se expresan
fructosil-transferasas de origen bacteriano. La
mayoría de las fructosil-transferasas bacterianas
sintetizan levano, un polímero de fructosilo con enlaces
\beta-2,6 que tiene numerosas ramificaciones
\beta-2,1. Debido a sus numerosas ramificaciones,
el levano tiene desventajas decisivas cuando se trata de
procesamiento industrial y es por esta razón considerablemente menos
importante como materia prima técnica que la inulina. Hasta ahora,
únicamente se conoce un gen bacteriano, cuyo producto génico está
implicado en la síntesis de la inulina, a saber el gen ftf
de Streptococcus mutans. En principio es posible expresar el
gen en plantas si el gen ha sido modificado con anterioridad
genéticamente. No obstante, el rendimiento de inulina obtenido a
partir de plantas transgénicas es tan bajo que la utilización
económica de las plantas transgénicas es imposible.
Adicionalmente, se conoce un método para
producir plantas transgénicas que expresan
fructosil-transferasas a partir de Helianthus
tuberosus. La expresión de estos genes en plantas transgénicas
conduce a la producción de inulina con un grado de polimerización
medio comprendido en DP = 6 y DP = 10. Los polímeros que tienen
este grado de polimerización no pueden considerarse como inulina de
cadena larga. La inulina con un DP medio = 6 a DP = 10 es
inadecuada para la mayoría de los usos industriales.
No se conocen métodos para producción económica
de inulina de cadena larga en plantas o para la síntesis de enzimas
para la producción de inulina de cadena larga.
PCT/US 89/02729 describe la posibilidad de
sintetizar polímeros de carbohidratos, en particular dextrano o
polifructosa, en células de plantas transgénicas, específicamente en
los frutos de plantas transgénicas. Con objeto de producir plantas
modificadas de este modo, se ha propuesto el uso de
levano-sacarasas a partir de microorganismos, en
particular de Aerobacter levanicum, Streptococcus
salivarius y Bacillus subtilis, o de
dextrano-sacarasas de Leuconostoc
mesenteroides. No se describe la formación de las enzimas
activas ni la de levano o dextrano o la producción de plantas
transgénicas. PCT/EP 93/02110 describe un método para producir
plantas transgénicas que expresan el gen lsc de la
levano-sacarasa de la bacteria
gram-negativa Erwinia amylovora. Las plantas
producen un levano de alto peso molecular, fuertemente ramificado.
PCT/NL93/00279 describe la transformación de plantas con genes
quiméricos que contienen el gen sacB de Bacillus
subtilis o el gen ftf de Streptococcus mutans.
Las plantas transgénicas que expresan el gen sacB producen un
levano ramificado. Las plantas que expresan el gen ftf
sintetizan inulina de alta molecularidad; sin embargo, el
rendimiento es tan bajo que una utilización económica está fuera de
cuestión. PCT/NL96/00012 describe secuencias de DNA que codifican
enzimas que sintetizan polímeros de carbohidrato así como la
producción de plantas transgénicas por medio de estas secuencias de
DNA. Las secuencias descritas se derivan de Helianthus
tuberosus. De acuerdo con PCT/NL96/00012, las secuencias
descritas pueden utilizarse para modificar el perfil de fructanos
de petunia y patata, pero también de Helianthus tuberosus
propiamente dicho. Cuando se expresan los genes SST y FFT en
plantas transgénicas, es posible producir inulina. Sin embargo, el
grado de polimerización medio de la inulina, oscila entre DP = 6 y
DP = 10. La producción de inulina de alta molecularidad no es
posible por medio del método descrito en PCT/NL96/00012. PCT/EP
97/02195 describe un método para producir plantas transgénicas
productoras de inulina por medio del gen ftf a partir de
Streptococcus mutans. El rendimiento de inulina de alta
molecularidad es bajo, como ocurre con las plantas descritas en
PCT/NL93/00279. DE 197 08 774.4 describe la producción de inulina
de cadena corta por medio de enzimas que exhiben actividad de
fructosil-polimerasa. La inulina de cadena corta
puede producirse en plantas transgénicas. El rendimiento de inulina
de cadena corta es alto y en la patata corresponde al contenido
celular de sacarosa. Sin embargo, no se describe la producción de
inulina de cadena larga.
La síntesis de inulina en plantas ha sido
examinada concienzudamente (Pollock & Chatterton, Fructans, The
Biochemistry of Plants, vol. 14 (1988), Academic Press, pp.
109-140). Sin embargo, la inulina existente
naturalmente en las plantas es fructano de cadena corta con un
grado de polimerización máximo de aproximadamente DP = 35 (Pollock
& Chatterton, 1988, loc. cit.). La síntesis y el metabolismo de
los fructanos en las plantas se basan en la actividad de al menos
tres enzimas: una
sacarosa-fructosil-transferasa (SST)
dependiente de sacarosa que forma el trisacárido kestosa, una
fructan-fructosil-transferasa (FFT)
dependiente de fructano que transfiere residuos fructosilo de las
moléculas de fructano con un grado de polimerización mínimo de DP =
3 (kestosa) a sacarosa y fructanos superiores, y una
fructano-exohidrolasa (FEH) que elimina residuos
fructosa de las moléculas de fructano. Se desconoce si las
diferencias en el peso molecular medio de la inulina en diversas
especies de plantas, por ejemplo aproximadamente 2 x 10^{3} en el
caso de Allium cepa y 5 x 10^{3} en el caso de
Helianthus tuberosus, están basadas en las diferentes
propiedades de sus SST, FFT o FEH.
Por esta razón no es posible, teniendo en cuenta
el conocimiento actual con relación a la síntesis de inulina en las
plantas, identificar secuencias de DNA adecuadas por medio de las
cuales pudiera sintetizarse inulina de alta molecularidad en
plantas en cantidades económicamente interesantes.
Así pues, el problema técnico subyacente en la
presente invención es proporcionar moléculas de ácido nucleico y
métodos que permitan la producción de organismos genéticamente
modificados, en particular plantas, capaces de formar inulina de
cadena larga.
Este problema se resuelve por la provisión de
las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.
Por consiguiente, la presente invención se
refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas que
tienen la actividad enzimática de una FFT, seleccionadas del grupo
constituido por:
- (a)
- moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 4;
- (b)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos que se indica bajo SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 3 o una secuencia de ribonucleótidos correspondiente;
- (c)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 80% a la secuencia codificante indicada en SEQ ID No. 1;
- (d)
- moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 85% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2; y
- (e)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden un fragmento de la secuencia de nucleótidos de (a), (b), (c), o (d).
En el contexto de la presente invención, una
fructosil-transferasa (FFT) es una proteína capaz de
catalizar la formación de enlaces glicosídicos
\beta-2,1 y/o enlaces glicosídicos
\beta-2,6 entre unidades de fructosa. De este
modo, un residuo fructosilo a transferir puede derivarse de
1-kestosa o de un polímero de fructano. En conexión
con la presente invención, un fructano de alta molecularidad es un
polímero cuyas moléculas contienen un número medio mayor que 20,
preferiblemente mayor que 25 y todavía más preferiblemente al menos
32 residuos fructosilo. Adicionalmente, el fructano de alta
molecularidad es preferiblemente un polímero cuyas moléculas
contienen como promedio menos de 3000, más preferiblemente menos de
300 y de modo particularmente preferible menos de 100 residuos
fructosilo. Los residuos fructosilo pueden estar enlazados
glicosídicamente por enlaces \beta-2,1 o por
enlaces \beta-2,6. En el caso de la inulina, los
residuos están unidos generalmente por enlaces glicosídicos
\beta-2,1. En un menor grado, pueden existir
también enlaces \beta-2,6, en particular en
proporción inferior a 5%, preferiblemente en proporción inferior a
3%, más preferiblemente en proporción inferior a 1,5% y muy
preferiblemente en proporción inferior a 0,5%. El polímero de
fructosilo puede llevar en su extremo un residuo glucosa que está
unido por el grupo OH C-1 de la glucosa y el grupo
OH C-2 de un residuo fructosilo. En este caso, está
contenida también una molécula de sacarosa en el polímero de
fructosilo.
Sorprendentemente, se forman altas cantidades de
inulina de alta molecularidad durante la expresión de las moléculas
de ácido nucleico de la invención en plantas transformadas. Esto
resultó inesperado, dado que una enzima similar de Helianthus
tuberosus está implicada en la síntesis de la inulina con un
grado de polimerización medio inferior a DP = 20 en plantas
transgénicas (WO 96/21023).
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
pueden ser moléculas tanto de DNA como de RNA. Las moléculas de DNA
correspondientes son por ejemplo moléculas de DNA genómico o cDNA.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden aislarse de
fuentes naturales, preferiblemente de la alcachofa, o pueden
sintetizarse de acuerdo con métodos conocidos. Por medio de
técnicas convencionales de biología molecular es posible (véase
v.g. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory
Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Col Spring
Harbor, NY) para introducir diversas mutaciones en las moléculas de
ácido nucleico de la invención, lo que conduce a la síntesis de
proteínas con propiedades biológicas probablemente modificadas. A
este respecto, es posible por una parte producir mutantes de
deleción, en los cuales se producen moléculas de ácido nucleico por
deleciones progresivas en el extremo 5' o 3' de la secuencia de DNA
codificante. Estas moléculas de ácido nucleico conducen a la
síntesis de proteínas correspondientemente acortadas. Por medio de
tales deleciones en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos es
posible por ejemplo identificar secuencias de aminoácidos que son
responsables de la translocación de la enzima a la vacuola (péptidos
de tránsito). Esto permite la producción direccionada de enzimas
que, debido a la eliminación de las secuencias correspondientes, ya
no están localizadas en el interior de la vacuola sino en el
interior del citosol, o en el interior de otros compartimientos
debido a la adición de otras secuencias señal.
Por otra parte, es imaginable también introducir
mutaciones puntuales en posiciones en las cuales una modificación
de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, influye en la actividad
enzimática o la regulación de la enzima. De este modo, v.g. pueden
producirse mutantes que exhiben un valor K_{m} modificado o que ya
no están sometidos a los mecanismos de regulación que tienen lugar
en la célula, tales como regulación alostérica o modificación
covalente.
Adicionalmente, pueden producirse mutantes que
exhiben una especificidad de sustrato o producto modificada.
Adicionalmente, pueden producirse mutantes con un perfil
actividad-temperatura modificado.
Para la manipulación del DNA recombinante en
células procariotas, las moléculas de ácido nucleico de la invención
o partes de estas moléculas pueden insertarse en plásmidos que
permiten una mutagénesis o una modificación de la secuencia por
recombinación de secuencias de DNA. Por medio de técnicas estándar
(véase Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
NY, EE.UU.) pueden realizarse intercambios de bases o pueden
añadirse secuencias naturales o sintéticas. Con objeto de unir
entre sí los fragmentos de DNA, pueden conectarse adaptadores o
enlazadores con los fragmentos. Adicionalmente, pueden utilizarse
manipulaciones que proporcionan sitios de restricción adecuados o
que eliminan DNA o sitios de restricción superfluos. Si puede
hacerse uso de inserciones, deleciones o sustituciones, pueden
utilizarse mutagénesis in vitro, reparación de iniciadores,
restricción o ligación. Como método de análisis, se hace uso
habitualmente de análisis de secuencia, análisis de restricción, u
otros métodos
bioquímico-biológico-moleculares.
En el contexto de la presente invención, el
término "hibridación" significa hibridación en condiciones
convencionales, preferiblemente condiciones severas, como se
describe por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2ª edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY. Un ejemplo de condiciones de
hibridación severas es una hibridación en formamida al 50%, 5 x SSC,
5 x solución de Denhardt, fosfato de sodio 40 mM, pH 6,8; 0,5%
(p/v) BSA, 1% (p/v) SDS, 0,1 mg/ml de DNA de esperma de arenque a
42ºC. Un ejemplo para condiciones de hibridación no severa
convencionales es una hibridación en las condiciones arriba
descritas en las cuales, sin embargo, se utiliza formamida al 30% en
lugar del 50%. Las condiciones de lavado en el caso de las
condiciones severas son preferiblemente 0,5 x SSC/0,5% SDS a 60ºC, y
en el caso de las condiciones no severas, preferiblemente 2 x
SSC/0,5% SDS a 56ºC.
Moléculas de ácido nucleico que se hibridan a
las moléculas de la invención pueden aislarse v.g. de genotecas
genómicas o de cDNA producidas a partir de los organismos
correspondientes, tales como la alcachofa.
Tales moléculas de ácido nucleico pueden
identificarse y aislarse por utilización de las moléculas de la
invención o partes de estas moléculas o, según sea el caso, los
complementos inversos de estas moléculas, v.g. por hibridación de
acuerdo con técnicas estándar (véase, v.g. Sambrook et al.,
1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Como sonda
de hibridación, pueden utilizarse v.g. moléculas de ácido nucleico
que exhiban exacta o básicamente la secuencia de nucleótidos
indicada bajo SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o partes de las mismas.
Los fragmentos utilizados como sonda de hibridación pueden ser
también fragmentos sintéticos producidos por medio de las técnicas
de síntesis usuales y cuya secuencia es básicamente similar a la de
una molécula de ácido nucleico de la invención.
Las moléculas que se hibridan a las moléculas de
ácido nucleico de la invención comprenden también fragmentos,
derivados y variantes alélicas de las moléculas de ácido nucleico
arriba descritas que codifican una proteína de la invención. Se
supone que los "fragmentos" son partes de las moléculas de
ácido nucleico que son suficientemente largas para codificar una
proteína de la invención. En este contexto, el término
"derivado" significa que las secuencias de estas moléculas
difieren en una o más posiciones de las secuencias de las moléculas
de ácido nucleico arriba descritas. Sin embargo, los mismos exhiben
un alto grado de homología con estas secuencias. Homología
significa una identidad de secuencia mayor que 80% y preferiblemente
mayor que 90%. Las proteínas codificadas por estas moléculas de
ácido nucleico exhiben una identidad de secuencia con la secuencia
de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2 de al menos 85% y
preferiblemente mayor que 90%, más preferiblemente mayor que 95%,
aún más preferiblemente mayor que 97% y todavía más preferiblemente,
mayor que 99%. Las desviaciones de las moléculas de ácido nucleico
arriba descritas pueden ser resultado, por ejemplo, de deleción,
sustitución, inserción y/o recombinación.
Las moléculas de ácido nucleico que son
homólogas a las moléculas arriba descritas y representan derivados
de estas moléculas, son usualmente variaciones de estas moléculas
que representan modificaciones con la misma función biológica.
Estas pueden ser variaciones existentes naturalmente, por ejemplo
secuencias de otros organismos, o mutaciones, en cuyo caso estas
mutaciones pueden haberse producido naturalmente o pueden haber sido
introducidas por medio de mutagénesis direccionada. Adicionalmente,
las variaciones pueden ser secuencias producidas sintéticamente.
Las variantes alélicas pueden ser variantes existentes naturalmente
o variantes producidas por síntesis o recombinantemente.
Las proteínas codificadas por las diversas
variantes de las moléculas de ácido nucleico de la invención exhiben
ciertas características comunes tales como la actividad enzimática,
peso molecular, reactividad inmunológica o conformación o
propiedades físicas tales como la movilidad en electroforesis en
gel, características cromatográficas, coeficientes de
sedimentación, solubilidad, propiedades espectroscópicas;
estabilidad, pH óptimo, temperatura óptima, etc.
En una realización preferida, las secuencias de
ácido nucleico de la invención se derivan de alcachofa (Cynara
scolymus).
La invención se refiere adicionalmente a
vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico de la
invención. Éstos son preferiblemente plásmidos, cósmicos, virus,
bacteriófagos y otros vectores comunes en tecnología de genes.
Dentro del vector de la invención, la molécula
de ácido nucleico de la invención está enlazada operativamente de
modo preferible a elementos reguladores que aseguran la
transcripción y síntesis de un RNA traducible en células
procariotas y/o eucariotas.
Los vectores de expresión de la invención
permiten la producción de inulina de cadena larga en diversos
organismos hospedadores, en particular en células procariotas o
eucariotas tales como bacterias, hongos, algas, células animales y
preferiblemente células de plantas y plantas. Organismos
hospedadores preferidos son en particular levaduras tales como v.g.
S. cerevisiae, y bacterias de ácido láctico tales como
Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus,
Streptococcus lactis, S. cremoris, Lactobacillus acidophilus y
Leuconostoc cremoris. Las enzimas codificadas pueden
utilizarse también probablemente fuera de los organismos
hospedadores para la producción de inulina de cadena larga. Se
prefieren particularmente células de plantas.
Una revisión concerniente a diversos sistemas de
expresión pueden encontrarse p.ej. en Methods in Enzymology 153
(1987), 385-516, en Bitter et al. (Methods in
Enzymology 153 (1987), 516-544), Sawers et
al., Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996),
1-9, Billmann-Jacobe, Current
Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-504,
Hockney, Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463,
y Griffiths et al., Methods in Molecular Biology 75 (1997),
427-440. Sistemas de expresión para levadura han
sido descritos en Hensing et al., Antonie van Leuwenhoek 67
(1995) 261-279, Bussineau et al.,
Developments in Biological Standardization 83 (1994),
13-19, Gellissen et al., Antonie van
Leuwenhoek 62 (1992), 79-93, Fleer, Current Opinion
in Biotechnology 3 (1992), 486-496, Vedvick,
Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742-745,
y en Buckholz, Bio/Technology 9 (1991), 1067-1072.
Vectores de expresión han sido descritos con gran extensión en la
técnica anterior. Aparte de un gen marcador de selección y un
origen de replicación que asegura la replicación en el hospedador
seleccionado, los mismos contienen usualmente un promotor
bacteriano o viral y en la mayoría de los casos una señal de
terminación para la transcripción. Existe al menos un sitio de
restricción o un polienlazador entre el promotor y la señal de
terminación que permite insertar una secuencia de DNA codificante.
Si la misma es activa en el organismo hospedador seleccionado, la
secuencia de DNA que controla naturalmente la transcripción del gen
correspondiente puede utilizarse como secuencia promotora. Esta
secuencia puede intercambiarse también con otras secuencias
promotoras. Puede también hacerse uso de promotores que conducen a
una expresión constitutiva del gen así como de promotores
inducibles que permiten una regulación direccionada de la expresión
del gen situado aguas abajo. Secuencias promotoras bacterianas y
virales con estas propiedades han sido descritas extensamente en la
técnica anterior. Secuencias reguladoras para la expresión en
microorganismos (tales como E. coli, S. cerevisiae)
han sido descritas suficientemente en la técnica anterior.
Promotores que permiten una expresión particularmente fuerte del
gen situado aguas abajo son, v.g. el promotor T7 (Studier et
al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89),
lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., en
Rodriguez y Chamberlin (eds.), Promoters, Structure and Function;
Praeger, Nueva York (1982), 462-481; DeBoer et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25),
\lambdap1, rac (Boros et al., Gene 42 (1986),
97-100). Usualmente, las cantidades de proteína son
máximas desde el punto medio hacia el final de la fase logarítmica
del ciclo de crecimiento de los microorganismos. Por esta razón, se
utilizan preferiblemente promotores inducibles para la síntesis de
proteínas. Éstos conducen frecuentemente a mayores rendimientos de
proteína que los promotores constitutivos. El uso de promotores
fuertemente constitutivos conduce a menudo, por la vía de la
transcripción y traducción permanentes del gen clonado, a la pérdida
de energía para otras funciones celulares esenciales, lo que
ralentiza el crecimiento de la célula (Bernard R. Glick, Jack J.
Pasternak, Molekulare Biotechnologie (1995), Spektrum Akademischer
Verlag GmbH,
Heidelberg-Berlin-Oxford, p. 342).
Así pues, con objeto de alcanzar una cantidad óptima de proteína se
utiliza a menudo un proceso en dos etapas. En la primera, se
cultivan células hospedadoras en condiciones óptimas hasta que se
alcanza una densidad de células relativamente alta. En la segunda
etapa, se induce la transcripción dependiendo de la clase de
promotor utilizada. En este contexto, es particularmente adecuado un
promotor tac inducible por lactosa o IPTG (=
isopropil-\beta-D-tiogalacto-piranosido)
(deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983),
21-25). Señales de terminación para la transcripción
se describen también en la técnica anterior.
La transformación de la célula hospedadora con
el DNA correspondiente que codifica la proteína puede llevarse a
cabo generalmente por medio de técnicas estándar, tal como se
describe por Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory
Course Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Press, Nueva
York). El cultivo de la célula hospedadora tiene lugar en medios
nutrientes que corresponden a los requerimientos respectivos de las
células hospedadoras utilizadas, considerando particularmente el
valor de pH, la temperatura, la concentración de sales, el aireado,
antibióticos, vitaminas, elementos traza, etc.
La purificación de la enzima producida por las
células hospedadoras puede llevarse a cabo por medio de técnicas de
purificación convencionales tales como precipitación, cromatografía
de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, filtración en
gel, cromatografía HPLC en fase inversa, etc.
Por modificación del DNA expresado en las
células hospedadoras, puede producirse en la célula hospedadora un
polipéptido que puede aislarse más fácilmente del medio de cultivo
debido a ciertas propiedades. Así, existe la posibilidad de
expresar la proteína a expresar como una proteína de fusión con una
secuencia polipeptídica adicional, cuyas propiedades de fijación
específicas permiten el aislamiento de la proteína de fusión por
cromatografía de afinidad (v.g. Hopp et al., Bio/Technology 6
(1988), 1204-1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8
(1990), 88-93).
Para expresión en células de plantas, se
prefieren elementos reguladores del promotor patatín B33. Otros
promotores preferidos son el promotor 35S CaMV y el promotor del
gen de alcohol-deshidrogenasa de Saccharomyces
cerevisiae. Los vectores de la invención pueden poseer otras
unidades funcionales que estabilizan el vector dentro de un
organismo hospedador, v.g. un origen de replicación bacteriano o el
DNA de 2 micrómetros para estabilización en Saccharomyces
cerevisiae. Adicionalmente, aquéllos pueden contener secuencias
de borde izquierda y derecha de T-DNA de
agrobacterias, permitiendo así una integración estable en el genoma
de las plantas.
Los vectores de la invención pueden contener
adicionalmente terminaciones funcionales, tales como el terminador
del gen de octopina-sintasa de Agrobacterias.
En otra realización, la molécula de ácido
nucleico de la invención está enlazada a una molécula de ácido
nucleico dentro del vector de la invención, codificando dicha
molécula de ácido nucleico una secuencia señal funcional con objeto
de dirigir la enzima a diversos compartimientos celulares. Esta
modificación puede consistir por ejemplo en una adición de una
secuencia señal N terminal para la secreción en el apoplasto de las
plantas superiores; sin embargo, cualquier otra modificación que
conduzca a la fusión de una secuencia señal a la FFT codificada es
también una materia objeto de la invención. La molécula de ácido
nucleico contenida en el vector de la invención puede contener en
particular una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos
causante de secreción. En este contexto, se hace uso preferiblemente
del péptido señal de la \alpha-CGTasa de
Klebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler et al., J. Mol. Biol.
256 (1996), 279-291) o de un péptido señal tal como
el mismo es codificado por los nucleótidos
11529-11618 de la secuencia que tiene el número de
acceso en el banco de genes X 86014.
En una realización particularmente preferida, la
invención se refiere a los plásmidos p35-csFFT y
p33-csFFT, cuya construcción se describe en los
Ejemplos (Fig. 2 y 4).
En una realización adicional, la invención se
refiere a células hospedadoras, que contienen transitoria o
establemente las moléculas o vectores de ácido nucleico de la
invención o se derivan de tales células, en donde dichas células
derivadas contienen dichas moléculas o vectores de ácido
nucleico.
En este contexto, una célula hospedadora es un
organismo capaz de capturar el DNA recombinado in vitro y,
en caso aplicable, de sintetizar las proteínas codificadas por las
moléculas de ácido nucleico de la invención. Las células
hospedadoras pueden ser procariotas o bien eucariotas. Las mismas
pueden ser particularmente microorganismos. En el contexto de la
presente invención, éstos son todas las bacterias y protistas (tales
como hongos, en particular levaduras y algas) como se definen los
mismos v.g. en Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Georg
Thieme Verlag (1985), 1-2). En conexión con los
organismos hospedadores procariotas, debe indicarse que la
influencia positiva de la inulina sobre el crecimiento de ciertos
microorganismos, tales como bacterias Bífido del tracto intestinal
humano, se ha demostrado con éxito. Se ha adscrito a las bacterias
Bífido un efecto saludable (véase v.g. Gibson et al., Int.
Sugar J. 96 (1994), 381-386; Roberfroid et
al., J. of Nutrition 128 (1998), 11-19). Un
efecto inhibidor de los tumores ha sido discutido también (véase
v.g. Reddy et al., Carcinogenesis 18 (1997),
1371-1374; Singh et al., Carcinogenesis 18
(1997), 833-841). Por esta razón, las células
hospedadoras de la invención tales como levadura (pan) o bacterias
de ácido láctico (yogurt, leche de mantequilla, etc.) son adecuadas
para uso en la industria procesadora de
alimentos.
alimentos.
En una realización particularmente preferida,
una célula hospedadora de la invención contiene adicionalmente un
gen que codifica una
sacarosa-fructosil-transferasa (SST)
dependiente de sacarosa. Tales secuencias fueron aisladas, por
ejemplo, de la alcachofa (solicitud de Patente Alemana
DE-A1 197 08 774, Cichorium intibus (de
Halleux et al., Plant Physiol. 113 (1997),
1003-1013), Helianthus tuberosus (WO
96/21023) y Allium cepa (Vijn et al., Plant Physiol.
117 (1998), 1507-1513).
La invención se refiere particularmente a
células de plantas transgénicas transformadas con una molécula de
ácido nucleico de la invención o que contienen los sistemas vectores
de la invención o derivados o partes de los mismos, en donde dichas
células derivadas contienen las moléculas o vectores de ácido
nucleico. Éstos son capaces de sintetizar enzimas para la
producción de inulina de cadena larga debido a la introducción de
los sistemas vectores de la invención, derivados o partes del
sistema vector. Las células de la invención se caracterizan
preferiblemente porque la molécula de ácido nucleico introducida de
la invención es o bien heteróloga con respecto a la célula
transformada, es decir, no existe naturalmente en estas células, o
bien está localizada en una posición diferente dentro del genoma
distinta de la de la secuencia respectiva existente naturalmente.
Además, una célula de planta transgénica de la invención de este
tipo contiene preferiblemente una secuencia de DNA que codifica una
SST.
La presente invención se refiere adicionalmente
a proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de la
invención, así como a métodos para su producción en donde la célula
hospedadora de la invención se cultiva en condiciones que permiten
la síntesis de la proteína. La proteína se aísla subsiguientemente
de las células cultivadas y/o del medio de cultivo. La invención se
refiere adicionalmente a una FFT que puede obtenerse a partir de la
célula hospedadora de la invención o por un método de la
invención.
La descripción se refiere adicionalmente a
moléculas de ácido nucleico que se hibridan específicamente a una
molécula de ácido nucleico de la invención, a una molécula
complementaria de las mismas o a una parte de tales moléculas.
Éstas son preferiblemente oligonucleótidos que tienen una longitud
de al menos 10, en particular de al menos 15 y de modo
particularmente preferido de al menos 50 nucleótidos. Los
nucleótidos de la invención pueden utilizarse por ejemplo como
iniciadores para una reacción PCR. Los mismos pueden ser también
componentes de constructos antisentido o de moléculas de DNA que
codifican ribozimas adecuadas.
La presente invención se refiere también a un
método para la producción de células de plantas transgénicas,
tejidos vegetales y plantas que comprenden la introducción de una
molécula de ácido nucleico o vector de la invención en células de
plantas, tejidos de plantas y plantas.
Al proporcionar las moléculas de ácido nucleico
de la invención, es posible, por medio de técnicas de DNA
recombinante, producir inulina de cadena larga en diversos
organismos, en particular en plantas, lo que era imposible hasta
ahora por medio de métodos convencionales, v.g. de mejora genética.
Al aumentar la actividad de la FFT de la invención, por ejemplo por
sobreexpresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención,
o por el hecho de proporcionar mutantes que ya no están sujetos a
los mecanismos de regulación específicos de la célula y/o exhiben
dependencias distintas de la temperatura con respecto a su
actividad, es posible aumentar el rendimiento de plantas
modificadas correspondientemente por medio de técnicas de DNA
recombinante.
Así, es posible expresar las moléculas de ácido
nucleico de la invención en células de plantas a fin de aumentar la
actividad de la FFT correspondiente, o introducirlas en células que
no expresan normalmente esta enzima. Adicionalmente, es posible
modificar las moléculas de ácido nucleico de la invención de acuerdo
con métodos conocidos por las personas expertas, a fin de obtener
las FFTs de la invención que ya no están sujetas a los mecanismos
de regulación específicos de la célula o que exhiben dependencias de
la temperatura modificadas, o especificidades modificadas de
sustrato o producto.
Para este propósito, los expertos pueden
utilizar diversos sistemas de transformación de plantas. Así, el
uso de T-DNA para transformar células de plantas ha
sido examinado intensamente y descrito en
EP-A-120516; Hoekema: The Binary
Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam
(1985), Capítulo V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4,
1-46 y An, EMBO J. 4 (1985),
277-287.
Para transferir el DNA a las células de plantas,
pueden co-cultivarse adecuadamente explantes de
plantas con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium
rhizogenes. A partir del material infectado de la planta (v.g.
piezas de hojas, segmentos de tallos, raíces, pero también
protoplastos o células de plantas cultivadas en suspensión), pueden
regenerarse luego plantas enteras en un medio adecuado que puede
contener antibióticos o biocidas para la selección de células
transformadas. Las plantas obtenidas de este modo pueden examinarse
luego en cuanto a si está presente o no el DNA introducido. Otras
posibilidades con objeto de introducir DNA extraño por utilización
del método biolístico o por transformación de protoplastos son
conocidas por las personas expertas ((cf. v.g. Willmitzer, L., 1993
Transgenic plants. En: Biotechnology, A Multi-Volume
Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler,
editores), Vol. 2, 627-659, VCH
Weinheim-Nueva
York-Basilea-Cambridge).
Sistemas alternativos para la transformación de
plantas monocotiledóneas son la transformación por el método
biolístico, la absorción de DNA en protoplastos inducida eléctrica o
químicamente, la electroporación de células parcialmente
permeabilizadas, la macro-inyección de DNA en
inflorescencias, la microinyección de DNA en microsporas y
proembriones por medio de hinchamiento (véase v.g. Lusardi, Plant J.
5 (1994), 571-582; Paszkowski, Biotechnology 24
(1992), 387-392). Si bien la transformación de
plantas dicotiledóneas por sistemas plásmido
Ti-vector por medio de Agrobacterium
tumefaciens es un método bien establecido, estudios más
recientes indican que la transformación con vectores basados en
Agrobacterium puede utilizarse también en el caso de plantas
monocotiledóneas (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993),
491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994),
271-282; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84 (1987), 5345-5349; Raineri et
al., Bio/Technology 8 (1990), 33-38; Gould et
al., Plant Physiol. 95 (1991), 426-434; Mooney
et al., Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991),
209-218; Li et al., Plant Mol. Biol. 20
(1992), 1037-1048).
Tres de los sistemas de transformación arriba
mencionados han sido establecidos tiempo atrás para diversos tipos
de cereales: electroporación de tejido vegetal, transformación de
protoplastos y la transferencia de DNA por bombardeo con partículas
en tejidos y células regenerables (revisión efectuada en: Jähne
et al., Euphytica 85 (1995), 35-44). En la
bibliografía correspondiente, se describe la transformación del
trigo de diversas maneras (revisado en Maheshwari et al.,
Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995),
149-178).
Cuando se expresan las moléculas de ácido
nucleico de la invención en plantas, en principio es posible que la
proteína sintetizada pueda estar localizada en el interior de
cualquier compartimiento deseado de la célula vegetal. Con objeto
de conseguir la localización en un compartimiento particular, la
secuencia que asegura la localización en el interior de la vacuola
debe delecionarse y la región codificante remanente tiene que
enlazarse, opcionalmente, a secuencias de DNA que aseguren la
localización en el interior del compartimiento respectivo. Tales
secuencias son conocidas en la técnica (véase por ejemplo Braun,
EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald, Plant
J. 1 (1991), 95-106; Rocha-Sosa,
EMBO J. 8 (1989),
23-29).
23-29).
La presente invención se refiere también a
células de plantas transgénicas, tejidos de plantas y plantas que
han sido transformadas con una o varias de las moléculas de ácido
nucleico de la invención, así como a células de plantas
transgénicas derivadas de células transformadas de dicho modo. Tales
células contienen una o varias de las moléculas de ácido nucleico
de la invención, con lo cual esta(n) enlazada(s)
preferiblemente a elementos reguladores de DNA que aseguran la
transcripción en células de plantas, en particular con un promotor.
Tales células difieren de las células de plantas existentes
naturalmente por el hecho de que contienen al menos una molécula de
ácido nucleico de la invención que no existe naturalmente en estas
células o por el hecho de que una molécula de este tipo está
integrada en una posición dentro del genoma de la célula en la que
no se encuentra naturalmente, es decir en otro ambiente genómico.
Dado que la 1-kestosa es el sustrato natural de FFT
y se forma a sí misma en la reacción de una
sacarosa-fructosil-transferasa (SST)
dependiente de sacarosa con la sacarosa, es particularmente
ventajoso y probablemente necesario proporcionar una SST aparte de
la molécula de ácido nucleico, vector o FFT de la invención. Por
ello, en una realización preferida, la presente invención se
refiere a células de plantas, tejidos de plantas o plantas
transgénicas que contienen adicionalmente un gen codificante de una
sacarosa-fructosil-transferasa (SST)
dependiente de sacarosa. Éstas pueden ser por ejemplo plantas o
células de plantas que expresan ya naturalmente una SST tales como
achicoria, Helianthus tuberosus, o dalia o plantas en las
cuales se introdujo una secuencia de DNA codificante de SST por
medio de técnicas de DNA recombinante. Dicha secuencia puede haber
sido introducida independiente o simultáneamente con una molécula
de ácido nucleico o vector de la invención.
Las células de plantas y los tejidos de plantas
transgénicas pueden regenerarse para producir plantas completas por
medio de técnicas conocidas por las personas expertas. Las plantas
que pueden obtenerse por regeneración de las células de plantas
transgénicas de la invención son también materia que constituye el
objeto de la presente invención. Una materia adicional que
constituye objeto de la invención son plantas que contienen las
células de plantas transgénicas descritas anteriormente. Las células
de plantas transgénicas pueden ser en principio cualquier clase
deseada de especies de plantas, es decir tanto plantas
monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las mismas son
preferiblemente plantas útiles, en particular plantas que contienen
sacarosa, tales como arroz, maíz, remolacha azucarera, caña de
azúcar o patata, hortalizas (v.g. tomate, zanahoria, puerro,
achicoria, etc.), hierbas de pienso o pasto, batata, trigo, cebada,
colza o soja.
La invención se refiere también a material de
propagación y productos de cosecha de las plantas de la invención
tales como frutos, semillas, tubérculos, plantones, plantas de
semillero, esquejes, callos, cultivos de células, etc., en donde
dicho material de propagación y productos de cosecha contienen
células de plantas de la presente inven-
ción.
ción.
Una materia adicional que constituye objeto de
la descripción es la inulina de cadena larga que puede obtenerse a
partir de las células hospedadoras de la invención, en particular a
partir de células de plantas, tejidos de plantas, o plantas
transgénicas así como del material de propagación y de los productos
de cosecha.
En otra realización, la invención se refiere a
métodos para obtención de inulina de alta molecularidad, cuyas
moléculas contienen como promedio más de 20 residuos fructosilo,
comprendiendo dicho método:
- (a)
- cultivar una célula hospedadora, particularmente una célula de planta, tejido de planta o una planta de la invención, en condiciones que permiten la producción de FFT y la conversión de 1-kestosa, suministrada opcionalmente del exterior, o de un sustrato equivalente en dicha inulina de alta molecularidad; y
- (b)
- recuperar la inulina así producida a partir de las células hospedadoras cultivadas, en particular células de plantas, tejidos o plantas, o del medio.
En una realización adicional, la invención se
refiere a un método para la producción de inulina de alta
molecularidad, cuyas moléculas contienen como promedio más de 20
residuos fructosilo, comprendiendo dicho método:
- (a)
- poner 1-kestosa o un sustrato equivalente en contacto con una FFT de la invención en condiciones que permiten la conversión en dicha inulina de alta molecularidad; y
- (b)
- recuperar la inulina así producida.
La recuperación de inulina de diversas fuentes,
en particular de tejidos de plantas, ha sido descrita por ejemplo
en Gibson et al., Int. Sugar J. 96 (1994),
381-386; Baxa, Czech J. Food Sci. 16 (1998),
72-76; EP-A-787
745; De Leenheer, Carbohydr. Org. Raw Mater. III, Workshop
(1996), Meeting Date 1994, 67-92, Verlag VCH
Weinheim, Alemania y en la patente de Rusia RU 2001621C1.
La presente invención se refiere adicionalmente
a un método in vitro para producir inulina de alta
molecularidad, cuyas moléculas contienen como promedio más de 20
residuos fructosilo por utilización del sustrato sacarosa y una
combinación enzimática de una SST y una FFT de la invención. En una
realización adicional, la presente invención se refiere a un método
in vitro para producir inulina por utilización de una mezcla
que contiene oligómeros de fructosilo y una FFT de la invención. En
este contexto, un oligómero de fructosilo es un oligómero
constituido por unidades fructosa con un DP de aproximadamente 2 a
7, que puede exhibir un residuo glucosa en su extremo. Cuando se
lleva a cabo el método de la invención, se utilizan preferiblemente
proteínas producidas por recombinación. En el contexto de la
presente invención, éstas son proteínas que fueron producidas por
introducción de la secuencia de DNA codificante de la proteína
respectiva en una célula hospedadora y expresión de la misma en
dicho lugar. La proteína puede recuperarse subsiguientemente de la
célula hospedadora y/o del medio de cultivo. La célula hospedadora
es preferiblemente una célula hospedadora de la invención como se
define arriba. En una realización preferida del método de la
invención, se utilizan enzimas que fueron producidas
recombinantemente y secretadas en el medio de cultivo por la célula
hospedadora, de tal modo que no es necesario disgregar las células
o purificar ulteriormente la proteína dado que la proteína secretada
puede obtenerse del sobrenadante. Con objeto de eliminar los
residuos del medio de cultivo, pueden utilizarse técnicas de
procesamiento convencionales tales como diálisis, ósmosis inversa,
métodos cromatográficos, etc. Lo mismo es cierto para concentrar la
proteína secretada en el medio de cultivo. La secreción de proteínas
por microorganismos está mediada normalmente por péptidos señal
N-terminales (secuencia señal, péptido conductor).
Proteínas con esta secuencia señal pueden atravesar la membrana
celular del microorganismo. Una secreción de proteínas puede
conseguirse enlazando la secuencia de DNA que codifica este péptido
señal con la región codificante de la enzima correspondiente.
Preferiblemente se hace uso del péptido señal de la
\alpha-CGTasa de Klebsiella oxytoca M5A1
(Fiedler et al., J. Mol. Biol. 256 (1996),
279-291) o de un péptido señal como el codificado
por los nucleótidos 11529-11618 de la secuencia
depositada en el banco de genes con el número de acceso
X86014.
X86014.
Las enzimas utilizadas en el método de la
invención pueden producirse alternativamente no por utilización de
microorganismos sino por medio de un sistema de transcripción y
traducción in vitro que conduce a la expresión de las
proteínas. En una realización particularmente preferida de la
invención, la FFT es producida por los protoplastos del tejido de
hojas en plantas.
La invención se refiere adicionalmente al uso de
inulina que puede formarse a partir de una célula hospedadora, en
particular una célula de planta, tejido de planta o una planta de la
invención o a partir del material de propagación del producto de
cosecha de las plantas y células de plantas de la invención o que
puede obtenerse por uno de los métodos de la invención arriba
descritos a fin de producir agentes tensioactivos para aumentar la
viscosidad en sistemas acuosos, como detergente, como agente de
suspensión, para aceleración de la sedimentación, para complejación
o para fijación de agua.
Estas y otras realizaciones han sido expuestas y
son evidentes para las personas expertas. Las mismas están
comprendidas por la descripción y los ejemplos de la presente
invención. Bibliografía adicional que se refiere a uno de los
métodos, medios o usos arriba mencionados y que puede aplicarse en
el sentido de la presente invención, puede deducirse de la técnica
anterior, v.g. de bibliotecas públicas o por utilización de medios
electrónicos. Para este propósito sirven bases de datos públicas,
como v.g. "Medline" a la que puede accederse por Internet,
v.g. bajo la dirección
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Bases de datos y
direcciones adicionales son conocidas por las personas expertas en
la técnica y pueden tomarse de Internet, v.g. bajo la dirección
http://www.lycos.com. Una revisión de fuentes de información
concerniente a patentes o solicitudes de patente de biotecnología
puede encontrarse en Berks, TIBTECH 12 (1994),
352-364.
Las figuras muestran:
Figura 1. Muestra el análisis HPLC de un
extracto de protoplastos completo. Los protoplastos se transformaron
con diversos vectores: A: la transformación se llevó a cabo con el
vector pA7 que no contiene una región codificante fusionada al
promotor CaMV 35S. B: la transformación tuvo lugar con el vector
pA7-csFFT que contiene la región codificante de la
fructano:fructano:fructosil-transferasa de alcachofa
fusionado al promotor CaMV 35S. C: la transformación se llevó a
cabo con el vector pA7/htFFT que contiene la región codificante de
la
fructano:fructano-fructosil-transferasa
de Helianthus tuberosus como una fusión con el promotor CaMV 35S.
Antes del análisis, los extractos de protoplastos completos se
incubaron en una mezcla de oligómeros de fructosilo durante 12 h
cada uno. El análisis se llevó a cabo como se describe en el
Ejemplo 1.
Figura 2. Muestra la construcción del plásmido
p35-csFFT.
Figura 3. Muestra el análisis el HPLC de plantas
transgénicas que fueron transformadas con el constructo de
p35-csFFT. El análisis muestra que se formaban
moléculas de inulina de cadena larga en plantas transgénicas que
expresan una SST así como una FFT a partir de alcachofa
(35S-SST/FFT 22-19).
Figura 4. Muestra la construcción del plásmido
p33csFFT.
Figura 5. Muestra el análisis HPLC de plantas
transgénicas que se transformaron con el constructo
p33-csFFT. El análisis muestra que se formaron
moléculas de inulina de cadena larga en plantas transgénicas que
expresan una SST así como una FFT a partir de alcachofa
(B33-SST/FFT 47).
\newpage
Los ejemplos ilustran la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se aisló RNA total a partir de los receptáculos
de alcachofa (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, NY, EE.UU.). Se aisló mRNA Poli(A)+ por
medio del sistema de aislamiento de mRNA PoliATract (Promega
Corporation, Madison, WI, EE.UU.). Se produjo DNA complementario
(cDNA) a partir de 5 \mug de este RNA por medio del kit de
síntesis ZAP-cDNA de Stratagene (Heidelberg) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se obtuvieron 2 x
10^{6} clones de fago recombinantes independientes. La biblioteca
de cDNA amplificada se cribó de acuerdo con métodos estándar en
condiciones de baja severidad por medio del fragmento de DNA marcado
con ^{32}P correspondiente al cDNA de la SST de alcachofa
(fragmento Not I del plásmido pCy21 como se describe en DE 197 08
774.4). La secuencia de la SST de alcachofa ha sido descrita en DE
197 08 774.4. Los clones positivos se cribaron por medio de la
sonda SST en condiciones de severidad alta. Los clones que
reaccionaban positivamente durante este cribado se abandonaron,
dado que los mismos eran evidentemente cDNA de SSC. A partir de los
clones residuales se aisló la inserción de cDNA por escisión del
DNA plasmídico aislado en rutinas estándar por medio de la enzima de
restricción Not I y se clonó en el vector pA7. Los extremos
cohesivos del fragmento Not I se rellenaron por medio de la
polimerasa T4. Subsiguientemente, el fragmento se ligó en el sitio
Sma I de pA7. El vector pA7 es un derivado de pUC18
(Yanish-Perron, Gene 33 (1985),
103-119) que contiene una inserción del promotor 35S
del virus del mosaico de la coliflor (nucleótidos 7146 a 7464 de
acuerdo con Gardner, Nucleic Acids Res. 9 (1981),
2871-2888) entre los sitios EcoRI y SacI del
polienlazador. Aparte del promotor 35S, pA7 contiene la señal de
poliadenilación del gen 3 del T-DNA del plásmido Ti,
pTiACH5 (Gielen, EMBO J. 3 (1984), 835-846),
nucleótidos 11749 a 11939, que se aisló como un fragmento Pvu
II-Hind III del plásmido pAGV 40
(Herrera-Estrella, Nature 303 (1983),
209-213) y se clonó entre los sitios Sph I y Hind
III del polienlazador después de añadir enlazadores Sph I al sitio
Pvu II.
Por medio de los derivados de pA7 que contenían
un cDNA de alcachofa, se transformaron protoplastos de tabaco de
acuerdo con el método de Negrutiu (Plant Mol. Biol. 8, 1987,
363-373). Los protoplastos transformados se
cultivaron en medio K3 (Nagy y Maliga, Z. Pflanzenphysiologie 78
(1976), 453-455) a 25ºC durante 2 días en la
oscuridad. Subsiguientemente, los extractos celulares se obtuvieron
por congelación y descongelación repetidas. Los extractos se
incubaron con oligofructanos (67,5% 1-kestosa, 28,4%
nystosa, 3,6% fructosil-nystosa, 0,5% sacarosa)
durante 12 h a 28ºC y se analizaron subsiguientemente por HPLC. El
análisis HPLC se llevó a cabo con una columna de intercambio
aniónico CarboPac PA 100, que estaba conectada a un sistema de
cromatografía en gradiente Dionex DX-300 (Dionex,
Sunnyvale, CA, EE.UU.). Monómeros, oligómeros y polímeros de
azúcares se detectaron por medio de detección pulsamperométrica. El
ajuste del detector para este propósito era: T_{1} = 0,48 s;
T_{2} = 0,12 s; T_{3} = 0,12 s; E_{1} = 0,05 V; E_{2} = 0,65
V; E_{3} = -0,95 V; sensibilidad = 0,1 \muC; integración =
0,28-0,48 s; medio de flujo A = NaOH 0,15M; medio de
flujo B = NaAc 1M en NaOH 0,15M; gradiente = 10 min 100% A; 2 min
aumento lineal desde 0% B a 100% B; 2 min 100% B; 2 min aumento
lineal desde 0% A a 100% A; 5 min A. Las muestras se desalaron y se
filtraron (Microcon 10, Amicon, Beverly, EE.UU.) antes de su
aplicación. La velocidad de flujo era 1 ml.min^{-1}. En un pequeño
número de extractos, podía encontrarse inulina de alta
molecularidad (véase Figura 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Una inserción de cDNA de un derivado de pA7
(pCy3) que había mediado la síntesis de inulina de alta
molecularidad en el ensayo de protoplastos se secuenció por medio
de la técnica de didexosinucleótidos (Sanger, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). La inserción del
clon pCy3 es un DNA con una longitud de 2073 pb. La secuencia de
nucleótidos se indica bajo SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos
correspondiente se indica bajo SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 3 es una
variante de SEQ ID NO: 1 que codifica la misma proteína codificada
por SEQ ID NO: 1.
Un análisis de secuencia y una comparación con
secuencias ya publicadas ha demostrado que la secuencia indicada
bajo SEQ ID NO: 1 es nueva y comprende una región codificante que
exhibe homologías con las FFTs de otros organismos.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
El plásmido p35-csFFT (Figura 2)
contiene tres fragmentos A, B y C dentro del vector binario pBin19
(Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711, modificado de acuerdo con
Becker, Nucleic Acids Res. 18 (1990), 203).
El fragmento A contiene el promotor 35S del
virus del mosaico de la coliflor (CaMV). El mismo contiene los
nucleótidos 7146 a 7464 (Gardner, Nucleic Acids Res. 9 (1981),
2871-2888) como inserción entre los sitios EcoRI y
SacI del polienlazador de pBin19-Hyg.
El fragmento B contiene los nucleótidos 1 a 2073
de la secuencia SEQ ID NO: 1. El fragmento B se obtuvo como un
fragmento Not I a partir del vector pBK-CMV en el
cual se insertó en el sitio EcoRI por la vía de una secuencia
enlazadora EcoRI/NotI. El fragmento C contiene la señal de
poliadenilación del gen 3 del T-DNA del plásmido Ti
ACH5 (Gielen, EMBO J. 3 (1984), 835-846),
nucleótidos 11749 a 11939, que se aisló como un fragmento Pvu
II-Hind III a partir del plásmido pAGV40
(Herrera-Estrella, Nature 303 (1983),
209-213) y se clonó entre los sitios Sph I y Hind
III del polienlazador de pBin19-Hyg después de
añadir enlazadores Sph I al sitio Pvu II.
El plásmido p35-csSST se
introdujo en Agrobacterias (Höfgen y Willmitzer, Nucleic Acids Res.
16 (1988), 9877) y se introdujo subsiguientemente en plantas de
patata por la vía de la transferencia de genes mediada por
Agrobacterium de acuerdo con las técnicas estándar arriba descritas.
Dichas plantas de patata se transformaron con una secuencia de DNA
que codificaba una SST de alcachofa (véase la solicitud de Patente
Alemana DE-A1 197 08 774) y que expresa estas
secuencias bajo el control del promotor 35S. Se regeneraron plantas
intactas a partir de las células transformadas. Se obtuvieron
extractos a partir de las hojas de las plantas regeneradas y se
examinaron con respecto a la presencia de polímeros de fructosilo.
El análisis se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1. El
análisis de las hojas de una serie de plantas transformadas con este
sistema vector demostró inequívocamente la existencia de inulina de
alta molecularidad, que es resultado de la expresión del gen FFT de
la alcachofa contenido en p35-csFFT (véase la Figura
3).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
El plásmido p33-csFFT (Figura 4)
es idéntico al plásmido p35-csFFT, con la excepción
de que el fragmento A contiene el promotor B33 del gen patatín
b33 de la patata en lugar del promotor 35S de CaMV. El mismo
contiene un fragmento DraI (posición -1512 a posición +14) del gen
patatín b33 (Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989),
23-29), que se insertó entre los sitios EcoRI y
SacI del polienlazador de pBin19-Hyg. El plásmido
p33-csFFT tiene un tamaño de aproximadamente 14 kb.
El plásmido p33-csSST se introdujo en las plantas de
patata por la vía de transferencia de genes mediada por
Agrobacterium, como se describe en el Ejemplo 3. Dichas plantas de
patata se transformaron con una secuencia de DNA que codificaba una
SST de alcachofa (véase la Solicitud de Patente Alemana
E-A1 197 08 774) y que expresaba estas secuencias
bajo el control del promotor B33. A partir de las células
transformadas se regeneraron plantas intactas. El análisis de los
tubérculos de una serie de plantas transformadas por este sistema
vector demostró inequívocamente la existencia de inulina de
alta molecularidad, que es el resultado de la expresión del gen FFT
de la alcachofa contenido en p33-csFFT (véase Figura
5).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften, e.V.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: ninguna
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Berlín
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: ninguno
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: ninguno
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas que tienen actividad {}\hskip4,57cm de fructosil-transferasa y métodos para producir inulina de cadena larga
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- VERSIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPA)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2073 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: monocatenario
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cDNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 21..1872
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 617 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1,6cm
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2073 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASE DE CADENA: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: SÍ
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 21..1872
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 617 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (29)
1. Moléculas de ácido nucleico que codifican una
proteína que tiene la actividad enzimática de una
fructosil-transferasa (FFT) que conduce a la
síntesis de polímeros de fructano de alta molecularidad, cuyas
moléculas contienen por término medio más de 20 residuos
fructosilo, seleccionadas del grupo constituido por:
- (a)
- moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 4;
- (b)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos que se indica bajo SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 3 o una secuencia de ribonucleótidos correspondiente;
- (c)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 80% a la secuencia codificante indicada en SEQ ID No. 1;
- (d)
- moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 85% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2; y
- (e)
- moléculas de ácido nucleico que comprenden un fragmento de la secuencia de nucleótidos de (a), (b), (c), o (d).
2. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que
tiene una identidad mayor que 90% con la secuencia codificante
indicada en SEQ ID NO: 1.
3. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la
proteína codificada tiene una identidad mayor que 90% con la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
4. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la
proteína codificada tiene una identidad mayor que 95% con la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
5. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la
proteína codificada tiene una identidad mayor que 97% con la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
6. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la
proteína codificada tiene una identidad mayor que 99% con la
secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
7. La molécula de ácido nucleico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es una molécula de
DNA.
8. La molécula de ácido nucleico de la
reivindicación 7, que es una molécula de cDNA.
9. La molécula de ácido nucleico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es una molécula de
RNA.
10. La molécula de ácido nucleico de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que se deriva de
alcachofa.
11. Un vector que contiene una molécula de ácido
nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
12. El vector de la reivindicación 11, en donde
la molécula de ácido nucleico está enlazada operativamente a
elementos reguladores que aseguran la transcripción y síntesis de un
RNA traducible en células procariotas y/o
eucariotas.
eucariotas.
13. El vector de la reivindicación 12, en donde
los elementos reguladores se derivan del promotor patatín B33 o el
promotor CaMV 35S.
14. Una célula hospedadora que está transformada
con una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 o con un vector de una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13 o que se deriva de una célula de este
tipo, conteniendo dichas células derivadas dicha molécula de ácido
nucleico o dicho vector.
15. La célula hospedadora de la reivindicación
14, que contiene adicionalmente un gen que codifica una
sacarosa-fructosil-transferasa
(SST) dependiente de sacarosa.
16. Un método para la producción de una FFT, en
el cual la célula hospedadora de la reivindicación 14 se cultiva en
condiciones que permiten la síntesis de la FFT y en el cual la FFT
se aísla a partir de las células cultivadas y/o del medio de
cultivo.
17. Una FFT, codificada por la molécula de ácido
nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o
producida por el método de la reivindicación 16.
18. Un método para la producción de una célula
hospedadora transformada de la reivindicación 14 ó 15, en
particular de una célula de planta transgénica, tejido de planta
transgénica y plantas transgénicas, que comprenden la introducción
de una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 o de un vector de una cualquiera de las
reivindicaciones 11 a 13 en la célula hospedadora, la célula de
planta, tejido de planta o la planta.
19. Una célula hospedadora transformada, célula
de planta, tejido de planta o planta transgénica que contiene una
molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones
1 a 10 o un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a
13 o que puede obtenerse por el método de la reivindicación 18, o
que se deriva de una célula, tejido o planta de este tipo, en donde
dicha célula, tejido o planta derivado(a) contiene dicha
molécula de ácido nucleico o dicho vector.
20. Una célula hospedadora transformada, célula
de planta, tejido de planta o planta transgénica de la
reivindicación 19, que contiene adicionalmente un gen que codifica
una sacarosa-fructosil-transferasa
dependiente de sacarosa.
21. Una planta que contiene células de planta o
tejidos de planta de la reivindicación 19 ó 20.
22. La planta de una cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21, que es una planta útil.
23. La planta de la reivindicación 22, en donde
la planta útil es una planta que contiene sacarosa.
24. Material de propagación de una planta de una
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, que contiene las
células de planta de la reivindicación 19 ó 20.
25. Productos de cosecha de una planta de una
cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 que contienen una célula
de planta de la reivindicación 19 ó 20.
26. Un método para la producción de inulina de
alta molecularidad, cuyas moléculas contienen como promedio más de
20 residuos fructosilo, comprendiendo dicho método
- (a)
- cultivar una célula hospedadora transformada, célula de planta o tejido de planta transgénica de la reivindicación 19 ó 20 o una planta de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 en condiciones que permiten la producción de una FFT y la conversión de 1-kestosa, suministrada opcionalmente del exterior, o de un sustrato equivalente en dicha inulina de alta molecularidad; y
- (b)
- recuperar la inulina así producida a partir de las células, tejidos o plantas cultivadas, o del medio.
27. Un método para la producción de inulina de
alta molecularidad, cuyas moléculas contienen como promedio más de
20 residuos fructosilo, comprendiendo dicho método:
- (a)
- poner 1-kestosa o un sustrato equivalente en contacto con una FFT de la reivindicación 17 en condiciones que permiten la conversión en dicha inulina de alta molecularidad; y
- (b)
- recuperar la inulina así producida.
28. Un método in vitro para producir
inulina de alta molecularidad, cuyas moléculas contienen como
promedio más de 20 residuos fructosilo, en donde el sustrato
sacarosa se convierte en dicha inulina de alta molecularidad por
una combinación de enzimas constituidas por una SST y una FFT de la
reivindicación 17.
29. Uso de inulina de alta molecularidad, cuyas
moléculas contienen como promedio más de 20 residuos fructosilo,
que puede obtenerse a partir de una célula hospedadora, célula de
planta o tejido de planta de la reivindicación 19 ó 20, a partir de
una planta de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, del
material de propagación de la reivindicación 24 o del producto de
cosecha de la reivindicación 25 o por medio de un método de una
cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 a fin de producir agentes
tensioactivos para aumentar la viscosidad en sistemas acuosos, como
detergente, como agente de suspensión, para aceleración de la
sedimentación y para complejación o para retención de agua.
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