ES2324188T3

ES2324188T3 - Moleculas de acido nucleico que codifican proteinas que tienen actividad de fructosil-transferasa, y metodos para producir inulina de cadena larga.

Info

Publication number: ES2324188T3
Application number: ES98961152T
Authority: ES
Inventors: Arnd G. Heyer; Elke W. Hellwege; Dominique Gritscher
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1997-11-06
Filing date: 1998-11-06
Publication date: 2009-07-31
Anticipated expiration: 2018-11-06
Also published as: CZ299825B6; CA2309133C; WO1999024593A1; CN1202255C; AU753390B2; JP4287046B2; EP1029067A1; US6559356B1; HUP0100111A3; DE19749122A1; BR9813968A; EP1029067B1; BR9813968B1; DE69840704D1; BRPI9816319B1; AU1667499A; JP2001521757A; US20040014092A1; US7083963B2; HU226813B1

Abstract

Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que tiene la actividad enzimática de una fructosiltransferasa (FFT) que conduce a la síntesis de polímeros de fructano de alta molecularidad, cuyas moléculas contienen por término medio más de 20 residuos fructosilo, seleccionadas del grupo constituido por: (a) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 4; (b) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos que se indica bajo SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 3 o una secuencia de ribonucleótidos correspondiente; (c) moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 80% a la secuencia codificante indicada en SEQ ID No. 1; (d) moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 85% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2; y (e) moléculas de ácido nucleico que comprenden un fragmento de la secuencia de nucleótidos de (a), (b), (c), o (d).

Description

Moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas que tienen actividad de fructosil-transferasa, y métodos para producir inulina de cadena larga.

La presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas que tienen la actividad enzimática de una fructosil-transferasa (FFT). La invención se refiere también a vectores que contienen tales moléculas de ácido nucleico así como a células hospedadoras transformadas con dichas moléculas de ácido nucleico, en particular células de plantas, tejidos de plantas y plantas. Además, se describen métodos para la producción de plantas transgénicas que sintetizan inulina de cadena larga debido a la introducción de moléculas de ácido nucleico que codifican una FFT. La presente invención se refiere también a métodos de producción de FFT y a la producción de inulina de cadena larga en diversos organismos hospedadores, en particular plantas, así como a métodos in vitro para la producción de inulina de cadena larga por medio de la FFT de la invención. La presente invención se refiere adicionalmente a las células hospedadoras de la

\hbox{invención
y a usos de la  inulina que puede obtenerse por los procesos de la
presente invención.}

Los polímeros lineales solubles en agua son aptos para una diversidad de aplicaciones, por ejemplo para aumentar la viscosidad en sistemas acuosos, como detergentes, como agentes de suspensión o para acelerar la sedimentación, para complejación y también para la fijación de agua. Los polímeros que están basados en sacáridos, tales como fructosil-polisacáridos, son materias primas particularmente interesantes, dado que son biodegradables.

Aparte de su aplicación como materias primas regenerables para la producción y el procesamiento industriales, los polímeros de fructosilo deben considerarse también como aditivos en alimentos, por ejemplo como edulcorantes. Para diversos usos, se precisan polímeros con longitudes de cadena variables. En tanto que los polímeros de cadena corta y cadena media se prefieren particularmente en la industria de procesamiento de alimentos, polímeros con un alto grado de polimerización (DP) se precisan para usos técnicos, tales como la producción de agentes tensioactivos.

Hasta ahora, únicamente se han descrito métodos para producción de polisacáridos de fructano de cadena larga en las plantas, en los cuales se expresan fructosil-transferasas de origen bacteriano. La mayoría de las fructosil-transferasas bacterianas sintetizan levano, un polímero de fructosilo con enlaces \beta-2,6 que tiene numerosas ramificaciones \beta-2,1. Debido a sus numerosas ramificaciones, el levano tiene desventajas decisivas cuando se trata de procesamiento industrial y es por esta razón considerablemente menos importante como materia prima técnica que la inulina. Hasta ahora, únicamente se conoce un gen bacteriano, cuyo producto génico está implicado en la síntesis de la inulina, a saber el gen ftf de Streptococcus mutans. En principio es posible expresar el gen en plantas si el gen ha sido modificado con anterioridad genéticamente. No obstante, el rendimiento de inulina obtenido a partir de plantas transgénicas es tan bajo que la utilización económica de las plantas transgénicas es imposible.

Adicionalmente, se conoce un método para producir plantas transgénicas que expresan fructosil-transferasas a partir de Helianthus tuberosus. La expresión de estos genes en plantas transgénicas conduce a la producción de inulina con un grado de polimerización medio comprendido en DP = 6 y DP = 10. Los polímeros que tienen este grado de polimerización no pueden considerarse como inulina de cadena larga. La inulina con un DP medio = 6 a DP = 10 es inadecuada para la mayoría de los usos industriales.

No se conocen métodos para producción económica de inulina de cadena larga en plantas o para la síntesis de enzimas para la producción de inulina de cadena larga.

PCT/US 89/02729 describe la posibilidad de sintetizar polímeros de carbohidratos, en particular dextrano o polifructosa, en células de plantas transgénicas, específicamente en los frutos de plantas transgénicas. Con objeto de producir plantas modificadas de este modo, se ha propuesto el uso de levano-sacarasas a partir de microorganismos, en particular de Aerobacter levanicum, Streptococcus salivarius y Bacillus subtilis, o de dextrano-sacarasas de Leuconostoc mesenteroides. No se describe la formación de las enzimas activas ni la de levano o dextrano o la producción de plantas transgénicas. PCT/EP 93/02110 describe un método para producir plantas transgénicas que expresan el gen lsc de la levano-sacarasa de la bacteria gram-negativa Erwinia amylovora. Las plantas producen un levano de alto peso molecular, fuertemente ramificado. PCT/NL93/00279 describe la transformación de plantas con genes quiméricos que contienen el gen sacB de Bacillus subtilis o el gen ftf de Streptococcus mutans. Las plantas transgénicas que expresan el gen sacB producen un levano ramificado. Las plantas que expresan el gen ftf sintetizan inulina de alta molecularidad; sin embargo, el rendimiento es tan bajo que una utilización económica está fuera de cuestión. PCT/NL96/00012 describe secuencias de DNA que codifican enzimas que sintetizan polímeros de carbohidrato así como la producción de plantas transgénicas por medio de estas secuencias de DNA. Las secuencias descritas se derivan de Helianthus tuberosus. De acuerdo con PCT/NL96/00012, las secuencias descritas pueden utilizarse para modificar el perfil de fructanos de petunia y patata, pero también de Helianthus tuberosus propiamente dicho. Cuando se expresan los genes SST y FFT en plantas transgénicas, es posible producir inulina. Sin embargo, el grado de polimerización medio de la inulina, oscila entre DP = 6 y DP = 10. La producción de inulina de alta molecularidad no es posible por medio del método descrito en PCT/NL96/00012. PCT/EP 97/02195 describe un método para producir plantas transgénicas productoras de inulina por medio del gen ftf a partir de Streptococcus mutans. El rendimiento de inulina de alta molecularidad es bajo, como ocurre con las plantas descritas en PCT/NL93/00279. DE 197 08 774.4 describe la producción de inulina de cadena corta por medio de enzimas que exhiben actividad de fructosil-polimerasa. La inulina de cadena corta puede producirse en plantas transgénicas. El rendimiento de inulina de cadena corta es alto y en la patata corresponde al contenido celular de sacarosa. Sin embargo, no se describe la producción de inulina de cadena larga.

La síntesis de inulina en plantas ha sido examinada concienzudamente (Pollock & Chatterton, Fructans, The Biochemistry of Plants, vol. 14 (1988), Academic Press, pp. 109-140). Sin embargo, la inulina existente naturalmente en las plantas es fructano de cadena corta con un grado de polimerización máximo de aproximadamente DP = 35 (Pollock & Chatterton, 1988, loc. cit.). La síntesis y el metabolismo de los fructanos en las plantas se basan en la actividad de al menos tres enzimas: una sacarosa-fructosil-transferasa (SST) dependiente de sacarosa que forma el trisacárido kestosa, una fructan-fructosil-transferasa (FFT) dependiente de fructano que transfiere residuos fructosilo de las moléculas de fructano con un grado de polimerización mínimo de DP = 3 (kestosa) a sacarosa y fructanos superiores, y una fructano-exohidrolasa (FEH) que elimina residuos fructosa de las moléculas de fructano. Se desconoce si las diferencias en el peso molecular medio de la inulina en diversas especies de plantas, por ejemplo aproximadamente 2 x 10^{3} en el caso de Allium cepa y 5 x 10^{3} en el caso de Helianthus tuberosus, están basadas en las diferentes propiedades de sus SST, FFT o FEH.

Por esta razón no es posible, teniendo en cuenta el conocimiento actual con relación a la síntesis de inulina en las plantas, identificar secuencias de DNA adecuadas por medio de las cuales pudiera sintetizarse inulina de alta molecularidad en plantas en cantidades económicamente interesantes.

Así pues, el problema técnico subyacente en la presente invención es proporcionar moléculas de ácido nucleico y métodos que permitan la producción de organismos genéticamente modificados, en particular plantas, capaces de formar inulina de cadena larga.

Este problema se resuelve por la provisión de las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas que tienen la actividad enzimática de una FFT, seleccionadas del grupo constituido por:

(a): moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 4;

(b): moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de nucleótidos que se indica bajo SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 3 o una secuencia de ribonucleótidos correspondiente;

(c): moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 80% a la secuencia codificante indicada en SEQ ID No. 1;

(d): moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en un 85% a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2; y

(e): moléculas de ácido nucleico que comprenden un fragmento de la secuencia de nucleótidos de (a), (b), (c), o (d).

En el contexto de la presente invención, una fructosil-transferasa (FFT) es una proteína capaz de catalizar la formación de enlaces glicosídicos \beta-2,1 y/o enlaces glicosídicos \beta-2,6 entre unidades de fructosa. De este modo, un residuo fructosilo a transferir puede derivarse de 1-kestosa o de un polímero de fructano. En conexión con la presente invención, un fructano de alta molecularidad es un polímero cuyas moléculas contienen un número medio mayor que 20, preferiblemente mayor que 25 y todavía más preferiblemente al menos 32 residuos fructosilo. Adicionalmente, el fructano de alta molecularidad es preferiblemente un polímero cuyas moléculas contienen como promedio menos de 3000, más preferiblemente menos de 300 y de modo particularmente preferible menos de 100 residuos fructosilo. Los residuos fructosilo pueden estar enlazados glicosídicamente por enlaces \beta-2,1 o por enlaces \beta-2,6. En el caso de la inulina, los residuos están unidos generalmente por enlaces glicosídicos \beta-2,1. En un menor grado, pueden existir también enlaces \beta-2,6, en particular en proporción inferior a 5%, preferiblemente en proporción inferior a 3%, más preferiblemente en proporción inferior a 1,5% y muy preferiblemente en proporción inferior a 0,5%. El polímero de fructosilo puede llevar en su extremo un residuo glucosa que está unido por el grupo OH C-1 de la glucosa y el grupo OH C-2 de un residuo fructosilo. En este caso, está contenida también una molécula de sacarosa en el polímero de fructosilo.

Sorprendentemente, se forman altas cantidades de inulina de alta molecularidad durante la expresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención en plantas transformadas. Esto resultó inesperado, dado que una enzima similar de Helianthus tuberosus está implicada en la síntesis de la inulina con un grado de polimerización medio inferior a DP = 20 en plantas transgénicas (WO 96/21023).

Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden ser moléculas tanto de DNA como de RNA. Las moléculas de DNA correspondientes son por ejemplo moléculas de DNA genómico o cDNA. Las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden aislarse de fuentes naturales, preferiblemente de la alcachofa, o pueden sintetizarse de acuerdo con métodos conocidos. Por medio de técnicas convencionales de biología molecular es posible (véase v.g. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Col Spring Harbor, NY) para introducir diversas mutaciones en las moléculas de ácido nucleico de la invención, lo que conduce a la síntesis de proteínas con propiedades biológicas probablemente modificadas. A este respecto, es posible por una parte producir mutantes de deleción, en los cuales se producen moléculas de ácido nucleico por deleciones progresivas en el extremo 5' o 3' de la secuencia de DNA codificante. Estas moléculas de ácido nucleico conducen a la síntesis de proteínas correspondientemente acortadas. Por medio de tales deleciones en el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos es posible por ejemplo identificar secuencias de aminoácidos que son responsables de la translocación de la enzima a la vacuola (péptidos de tránsito). Esto permite la producción direccionada de enzimas que, debido a la eliminación de las secuencias correspondientes, ya no están localizadas en el interior de la vacuola sino en el interior del citosol, o en el interior de otros compartimientos debido a la adición de otras secuencias señal.

Por otra parte, es imaginable también introducir mutaciones puntuales en posiciones en las cuales una modificación de la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, influye en la actividad enzimática o la regulación de la enzima. De este modo, v.g. pueden producirse mutantes que exhiben un valor K_{m} modificado o que ya no están sometidos a los mecanismos de regulación que tienen lugar en la célula, tales como regulación alostérica o modificación covalente.

Adicionalmente, pueden producirse mutantes que exhiben una especificidad de sustrato o producto modificada. Adicionalmente, pueden producirse mutantes con un perfil actividad-temperatura modificado.

Para la manipulación del DNA recombinante en células procariotas, las moléculas de ácido nucleico de la invención o partes de estas moléculas pueden insertarse en plásmidos que permiten una mutagénesis o una modificación de la secuencia por recombinación de secuencias de DNA. Por medio de técnicas estándar (véase Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, EE.UU.) pueden realizarse intercambios de bases o pueden añadirse secuencias naturales o sintéticas. Con objeto de unir entre sí los fragmentos de DNA, pueden conectarse adaptadores o enlazadores con los fragmentos. Adicionalmente, pueden utilizarse manipulaciones que proporcionan sitios de restricción adecuados o que eliminan DNA o sitios de restricción superfluos. Si puede hacerse uso de inserciones, deleciones o sustituciones, pueden utilizarse mutagénesis in vitro, reparación de iniciadores, restricción o ligación. Como método de análisis, se hace uso habitualmente de análisis de secuencia, análisis de restricción, u otros métodos bioquímico-biológico-moleculares.

En el contexto de la presente invención, el término "hibridación" significa hibridación en condiciones convencionales, preferiblemente condiciones severas, como se describe por ejemplo en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. Un ejemplo de condiciones de hibridación severas es una hibridación en formamida al 50%, 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt, fosfato de sodio 40 mM, pH 6,8; 0,5% (p/v) BSA, 1% (p/v) SDS, 0,1 mg/ml de DNA de esperma de arenque a 42ºC. Un ejemplo para condiciones de hibridación no severa convencionales es una hibridación en las condiciones arriba descritas en las cuales, sin embargo, se utiliza formamida al 30% en lugar del 50%. Las condiciones de lavado en el caso de las condiciones severas son preferiblemente 0,5 x SSC/0,5% SDS a 60ºC, y en el caso de las condiciones no severas, preferiblemente 2 x SSC/0,5% SDS a 56ºC.

Moléculas de ácido nucleico que se hibridan a las moléculas de la invención pueden aislarse v.g. de genotecas genómicas o de cDNA producidas a partir de los organismos correspondientes, tales como la alcachofa.

Tales moléculas de ácido nucleico pueden identificarse y aislarse por utilización de las moléculas de la invención o partes de estas moléculas o, según sea el caso, los complementos inversos de estas moléculas, v.g. por hibridación de acuerdo con técnicas estándar (véase, v.g. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Como sonda de hibridación, pueden utilizarse v.g. moléculas de ácido nucleico que exhiban exacta o básicamente la secuencia de nucleótidos indicada bajo SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 3 o partes de las mismas. Los fragmentos utilizados como sonda de hibridación pueden ser también fragmentos sintéticos producidos por medio de las técnicas de síntesis usuales y cuya secuencia es básicamente similar a la de una molécula de ácido nucleico de la invención.

Las moléculas que se hibridan a las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden también fragmentos, derivados y variantes alélicas de las moléculas de ácido nucleico arriba descritas que codifican una proteína de la invención. Se supone que los "fragmentos" son partes de las moléculas de ácido nucleico que son suficientemente largas para codificar una proteína de la invención. En este contexto, el término "derivado" significa que las secuencias de estas moléculas difieren en una o más posiciones de las secuencias de las moléculas de ácido nucleico arriba descritas. Sin embargo, los mismos exhiben un alto grado de homología con estas secuencias. Homología significa una identidad de secuencia mayor que 80% y preferiblemente mayor que 90%. Las proteínas codificadas por estas moléculas de ácido nucleico exhiben una identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos indicada en SEQ ID NO: 2 de al menos 85% y preferiblemente mayor que 90%, más preferiblemente mayor que 95%, aún más preferiblemente mayor que 97% y todavía más preferiblemente, mayor que 99%. Las desviaciones de las moléculas de ácido nucleico arriba descritas pueden ser resultado, por ejemplo, de deleción, sustitución, inserción y/o recombinación.

Las moléculas de ácido nucleico que son homólogas a las moléculas arriba descritas y representan derivados de estas moléculas, son usualmente variaciones de estas moléculas que representan modificaciones con la misma función biológica. Estas pueden ser variaciones existentes naturalmente, por ejemplo secuencias de otros organismos, o mutaciones, en cuyo caso estas mutaciones pueden haberse producido naturalmente o pueden haber sido introducidas por medio de mutagénesis direccionada. Adicionalmente, las variaciones pueden ser secuencias producidas sintéticamente. Las variantes alélicas pueden ser variantes existentes naturalmente o variantes producidas por síntesis o recombinantemente.

Las proteínas codificadas por las diversas variantes de las moléculas de ácido nucleico de la invención exhiben ciertas características comunes tales como la actividad enzimática, peso molecular, reactividad inmunológica o conformación o propiedades físicas tales como la movilidad en electroforesis en gel, características cromatográficas, coeficientes de sedimentación, solubilidad, propiedades espectroscópicas; estabilidad, pH óptimo, temperatura óptima, etc.

En una realización preferida, las secuencias de ácido nucleico de la invención se derivan de alcachofa (Cynara scolymus).

La invención se refiere adicionalmente a vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico de la invención. Éstos son preferiblemente plásmidos, cósmicos, virus, bacteriófagos y otros vectores comunes en tecnología de genes.

Dentro del vector de la invención, la molécula de ácido nucleico de la invención está enlazada operativamente de modo preferible a elementos reguladores que aseguran la transcripción y síntesis de un RNA traducible en células procariotas y/o eucariotas.

Los vectores de expresión de la invención permiten la producción de inulina de cadena larga en diversos organismos hospedadores, en particular en células procariotas o eucariotas tales como bacterias, hongos, algas, células animales y preferiblemente células de plantas y plantas. Organismos hospedadores preferidos son en particular levaduras tales como v.g. S. cerevisiae, y bacterias de ácido láctico tales como Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus lactis, S. cremoris, Lactobacillus acidophilus y Leuconostoc cremoris. Las enzimas codificadas pueden utilizarse también probablemente fuera de los organismos hospedadores para la producción de inulina de cadena larga. Se prefieren particularmente células de plantas.

Una revisión concerniente a diversos sistemas de expresión pueden encontrarse p.ej. en Methods in Enzymology 153 (1987), 385-516, en Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544), Sawers et al., Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996), 1-9, Billmann-Jacobe, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 500-504, Hockney, Trends in Biotechnology 12 (1994), 456-463, y Griffiths et al., Methods in Molecular Biology 75 (1997), 427-440. Sistemas de expresión para levadura han sido descritos en Hensing et al., Antonie van Leuwenhoek 67 (1995) 261-279, Bussineau et al., Developments in Biological Standardization 83 (1994), 13-19, Gellissen et al., Antonie van Leuwenhoek 62 (1992), 79-93, Fleer, Current Opinion in Biotechnology 3 (1992), 486-496, Vedvick, Current Opinion in Biotechnology 2 (1991), 742-745, y en Buckholz, Bio/Technology 9 (1991), 1067-1072. Vectores de expresión han sido descritos con gran extensión en la técnica anterior. Aparte de un gen marcador de selección y un origen de replicación que asegura la replicación en el hospedador seleccionado, los mismos contienen usualmente un promotor bacteriano o viral y en la mayoría de los casos una señal de terminación para la transcripción. Existe al menos un sitio de restricción o un polienlazador entre el promotor y la señal de terminación que permite insertar una secuencia de DNA codificante. Si la misma es activa en el organismo hospedador seleccionado, la secuencia de DNA que controla naturalmente la transcripción del gen correspondiente puede utilizarse como secuencia promotora. Esta secuencia puede intercambiarse también con otras secuencias promotoras. Puede también hacerse uso de promotores que conducen a una expresión constitutiva del gen así como de promotores inducibles que permiten una regulación direccionada de la expresión del gen situado aguas abajo. Secuencias promotoras bacterianas y virales con estas propiedades han sido descritas extensamente en la técnica anterior. Secuencias reguladoras para la expresión en microorganismos (tales como E. coli, S. cerevisiae) han sido descritas suficientemente en la técnica anterior. Promotores que permiten una expresión particularmente fuerte del gen situado aguas abajo son, v.g. el promotor T7 (Studier et al., Methods in Enzymology 185 (1990), 60-89), lacuv5, trp, trp-lacUV5 (DeBoer et al., en Rodriguez y Chamberlin (eds.), Promoters, Structure and Function; Praeger, Nueva York (1982), 462-481; DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983), 21-25), \lambdap1, rac (Boros et al., Gene 42 (1986), 97-100). Usualmente, las cantidades de proteína son máximas desde el punto medio hacia el final de la fase logarítmica del ciclo de crecimiento de los microorganismos. Por esta razón, se utilizan preferiblemente promotores inducibles para la síntesis de proteínas. Éstos conducen frecuentemente a mayores rendimientos de proteína que los promotores constitutivos. El uso de promotores fuertemente constitutivos conduce a menudo, por la vía de la transcripción y traducción permanentes del gen clonado, a la pérdida de energía para otras funciones celulares esenciales, lo que ralentiza el crecimiento de la célula (Bernard R. Glick, Jack J. Pasternak, Molekulare Biotechnologie (1995), Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg-Berlin-Oxford, p. 342). Así pues, con objeto de alcanzar una cantidad óptima de proteína se utiliza a menudo un proceso en dos etapas. En la primera, se cultivan células hospedadoras en condiciones óptimas hasta que se alcanza una densidad de células relativamente alta. En la segunda etapa, se induce la transcripción dependiendo de la clase de promotor utilizada. En este contexto, es particularmente adecuado un promotor tac inducible por lactosa o IPTG (= isopropil-\beta-D-tiogalacto-piranosido) (deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 21-25). Señales de terminación para la transcripción se describen también en la técnica anterior.

La transformación de la célula hospedadora con el DNA correspondiente que codifica la proteína puede llevarse a cabo generalmente por medio de técnicas estándar, tal como se describe por Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Course Manual, 2nd edition (1989), Cold Spring Harbor Press, Nueva York). El cultivo de la célula hospedadora tiene lugar en medios nutrientes que corresponden a los requerimientos respectivos de las células hospedadoras utilizadas, considerando particularmente el valor de pH, la temperatura, la concentración de sales, el aireado, antibióticos, vitaminas, elementos traza, etc.

La purificación de la enzima producida por las células hospedadoras puede llevarse a cabo por medio de técnicas de purificación convencionales tales como precipitación, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, filtración en gel, cromatografía HPLC en fase inversa, etc.

Por modificación del DNA expresado en las células hospedadoras, puede producirse en la célula hospedadora un polipéptido que puede aislarse más fácilmente del medio de cultivo debido a ciertas propiedades. Así, existe la posibilidad de expresar la proteína a expresar como una proteína de fusión con una secuencia polipeptídica adicional, cuyas propiedades de fijación específicas permiten el aislamiento de la proteína de fusión por cromatografía de afinidad (v.g. Hopp et al., Bio/Technology 6 (1988), 1204-1210; Sassenfeld, Trends Biotechnol. 8 (1990), 88-93).

Para expresión en células de plantas, se prefieren elementos reguladores del promotor patatín B33. Otros promotores preferidos son el promotor 35S CaMV y el promotor del gen de alcohol-deshidrogenasa de Saccharomyces cerevisiae. Los vectores de la invención pueden poseer otras unidades funcionales que estabilizan el vector dentro de un organismo hospedador, v.g. un origen de replicación bacteriano o el DNA de 2 micrómetros para estabilización en Saccharomyces cerevisiae. Adicionalmente, aquéllos pueden contener secuencias de borde izquierda y derecha de T-DNA de agrobacterias, permitiendo así una integración estable en el genoma de las plantas.

Los vectores de la invención pueden contener adicionalmente terminaciones funcionales, tales como el terminador del gen de octopina-sintasa de Agrobacterias.

En otra realización, la molécula de ácido nucleico de la invención está enlazada a una molécula de ácido nucleico dentro del vector de la invención, codificando dicha molécula de ácido nucleico una secuencia señal funcional con objeto de dirigir la enzima a diversos compartimientos celulares. Esta modificación puede consistir por ejemplo en una adición de una secuencia señal N terminal para la secreción en el apoplasto de las plantas superiores; sin embargo, cualquier otra modificación que conduzca a la fusión de una secuencia señal a la FFT codificada es también una materia objeto de la invención. La molécula de ácido nucleico contenida en el vector de la invención puede contener en particular una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos causante de secreción. En este contexto, se hace uso preferiblemente del péptido señal de la \alpha-CGTasa de Klebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler et al., J. Mol. Biol. 256 (1996), 279-291) o de un péptido señal tal como el mismo es codificado por los nucleótidos 11529-11618 de la secuencia que tiene el número de acceso en el banco de genes X 86014.

En una realización particularmente preferida, la invención se refiere a los plásmidos p35-csFFT y p33-csFFT, cuya construcción se describe en los Ejemplos (Fig. 2 y 4).

En una realización adicional, la invención se refiere a células hospedadoras, que contienen transitoria o establemente las moléculas o vectores de ácido nucleico de la invención o se derivan de tales células, en donde dichas células derivadas contienen dichas moléculas o vectores de ácido nucleico.

En este contexto, una célula hospedadora es un organismo capaz de capturar el DNA recombinado in vitro y, en caso aplicable, de sintetizar las proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de la invención. Las células hospedadoras pueden ser procariotas o bien eucariotas. Las mismas pueden ser particularmente microorganismos. En el contexto de la presente invención, éstos son todas las bacterias y protistas (tales como hongos, en particular levaduras y algas) como se definen los mismos v.g. en Schlegel "Allgemeine Mikrobiologie" (Georg Thieme Verlag (1985), 1-2). En conexión con los organismos hospedadores procariotas, debe indicarse que la influencia positiva de la inulina sobre el crecimiento de ciertos microorganismos, tales como bacterias Bífido del tracto intestinal humano, se ha demostrado con éxito. Se ha adscrito a las bacterias Bífido un efecto saludable (véase v.g. Gibson et al., Int. Sugar J. 96 (1994), 381-386; Roberfroid et al., J. of Nutrition 128 (1998), 11-19). Un efecto inhibidor de los tumores ha sido discutido también (véase v.g. Reddy et al., Carcinogenesis 18 (1997), 1371-1374; Singh et al., Carcinogenesis 18 (1997), 833-841). Por esta razón, las células hospedadoras de la invención tales como levadura (pan) o bacterias de ácido láctico (yogurt, leche de mantequilla, etc.) son adecuadas para uso en la industria procesadora de
alimentos.

En una realización particularmente preferida, una célula hospedadora de la invención contiene adicionalmente un gen que codifica una sacarosa-fructosil-transferasa (SST) dependiente de sacarosa. Tales secuencias fueron aisladas, por ejemplo, de la alcachofa (solicitud de Patente Alemana DE-A1 197 08 774, Cichorium intibus (de Halleux et al., Plant Physiol. 113 (1997), 1003-1013), Helianthus tuberosus (WO 96/21023) y Allium cepa (Vijn et al., Plant Physiol. 117 (1998), 1507-1513).

La invención se refiere particularmente a células de plantas transgénicas transformadas con una molécula de ácido nucleico de la invención o que contienen los sistemas vectores de la invención o derivados o partes de los mismos, en donde dichas células derivadas contienen las moléculas o vectores de ácido nucleico. Éstos son capaces de sintetizar enzimas para la producción de inulina de cadena larga debido a la introducción de los sistemas vectores de la invención, derivados o partes del sistema vector. Las células de la invención se caracterizan preferiblemente porque la molécula de ácido nucleico introducida de la invención es o bien heteróloga con respecto a la célula transformada, es decir, no existe naturalmente en estas células, o bien está localizada en una posición diferente dentro del genoma distinta de la de la secuencia respectiva existente naturalmente. Además, una célula de planta transgénica de la invención de este tipo contiene preferiblemente una secuencia de DNA que codifica una SST.

La presente invención se refiere adicionalmente a proteínas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de la invención, así como a métodos para su producción en donde la célula hospedadora de la invención se cultiva en condiciones que permiten la síntesis de la proteína. La proteína se aísla subsiguientemente de las células cultivadas y/o del medio de cultivo. La invención se refiere adicionalmente a una FFT que puede obtenerse a partir de la célula hospedadora de la invención o por un método de la invención.

La descripción se refiere adicionalmente a moléculas de ácido nucleico que se hibridan específicamente a una molécula de ácido nucleico de la invención, a una molécula complementaria de las mismas o a una parte de tales moléculas. Éstas son preferiblemente oligonucleótidos que tienen una longitud de al menos 10, en particular de al menos 15 y de modo particularmente preferido de al menos 50 nucleótidos. Los nucleótidos de la invención pueden utilizarse por ejemplo como iniciadores para una reacción PCR. Los mismos pueden ser también componentes de constructos antisentido o de moléculas de DNA que codifican ribozimas adecuadas.

La presente invención se refiere también a un método para la producción de células de plantas transgénicas, tejidos vegetales y plantas que comprenden la introducción de una molécula de ácido nucleico o vector de la invención en células de plantas, tejidos de plantas y plantas.

Al proporcionar las moléculas de ácido nucleico de la invención, es posible, por medio de técnicas de DNA recombinante, producir inulina de cadena larga en diversos organismos, en particular en plantas, lo que era imposible hasta ahora por medio de métodos convencionales, v.g. de mejora genética. Al aumentar la actividad de la FFT de la invención, por ejemplo por sobreexpresión de las moléculas de ácido nucleico de la invención, o por el hecho de proporcionar mutantes que ya no están sujetos a los mecanismos de regulación específicos de la célula y/o exhiben dependencias distintas de la temperatura con respecto a su actividad, es posible aumentar el rendimiento de plantas modificadas correspondientemente por medio de técnicas de DNA recombinante.

Así, es posible expresar las moléculas de ácido nucleico de la invención en células de plantas a fin de aumentar la actividad de la FFT correspondiente, o introducirlas en células que no expresan normalmente esta enzima. Adicionalmente, es posible modificar las moléculas de ácido nucleico de la invención de acuerdo con métodos conocidos por las personas expertas, a fin de obtener las FFTs de la invención que ya no están sujetas a los mecanismos de regulación específicos de la célula o que exhiben dependencias de la temperatura modificadas, o especificidades modificadas de sustrato o producto.

Para este propósito, los expertos pueden utilizar diversos sistemas de transformación de plantas. Así, el uso de T-DNA para transformar células de plantas ha sido examinado intensamente y descrito en EP-A-120516; Hoekema: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Capítulo V, Fraley, Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 y An, EMBO J. 4 (1985), 277-287.

Para transferir el DNA a las células de plantas, pueden co-cultivarse adecuadamente explantes de plantas con Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes. A partir del material infectado de la planta (v.g. piezas de hojas, segmentos de tallos, raíces, pero también protoplastos o células de plantas cultivadas en suspensión), pueden regenerarse luego plantas enteras en un medio adecuado que puede contener antibióticos o biocidas para la selección de células transformadas. Las plantas obtenidas de este modo pueden examinarse luego en cuanto a si está presente o no el DNA introducido. Otras posibilidades con objeto de introducir DNA extraño por utilización del método biolístico o por transformación de protoplastos son conocidas por las personas expertas ((cf. v.g. Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. En: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H.J. Rehm, G. Reed, A. Pühler, P. Stadler, editores), Vol. 2, 627-659, VCH Weinheim-Nueva York-Basilea-Cambridge).

Sistemas alternativos para la transformación de plantas monocotiledóneas son la transformación por el método biolístico, la absorción de DNA en protoplastos inducida eléctrica o químicamente, la electroporación de células parcialmente permeabilizadas, la macro-inyección de DNA en inflorescencias, la microinyección de DNA en microsporas y proembriones por medio de hinchamiento (véase v.g. Lusardi, Plant J. 5 (1994), 571-582; Paszkowski, Biotechnology 24 (1992), 387-392). Si bien la transformación de plantas dicotiledóneas por sistemas plásmido Ti-vector por medio de Agrobacterium tumefaciens es un método bien establecido, estudios más recientes indican que la transformación con vectores basados en Agrobacterium puede utilizarse también en el caso de plantas monocotiledóneas (Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282; Bytebier et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 5345-5349; Raineri et al., Bio/Technology 8 (1990), 33-38; Gould et al., Plant Physiol. 95 (1991), 426-434; Mooney et al., Plant, Cell Tiss. & Org. Cult. 25 (1991), 209-218; Li et al., Plant Mol. Biol. 20 (1992), 1037-1048).

Tres de los sistemas de transformación arriba mencionados han sido establecidos tiempo atrás para diversos tipos de cereales: electroporación de tejido vegetal, transformación de protoplastos y la transferencia de DNA por bombardeo con partículas en tejidos y células regenerables (revisión efectuada en: Jähne et al., Euphytica 85 (1995), 35-44). En la bibliografía correspondiente, se describe la transformación del trigo de diversas maneras (revisado en Maheshwari et al., Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178).

Cuando se expresan las moléculas de ácido nucleico de la invención en plantas, en principio es posible que la proteína sintetizada pueda estar localizada en el interior de cualquier compartimiento deseado de la célula vegetal. Con objeto de conseguir la localización en un compartimiento particular, la secuencia que asegura la localización en el interior de la vacuola debe delecionarse y la región codificante remanente tiene que enlazarse, opcionalmente, a secuencias de DNA que aseguren la localización en el interior del compartimiento respectivo. Tales secuencias son conocidas en la técnica (véase por ejemplo Braun, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewald, Plant J. 1 (1991), 95-106; Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989),
23-29).

La presente invención se refiere también a células de plantas transgénicas, tejidos de plantas y plantas que han sido transformadas con una o varias de las moléculas de ácido nucleico de la invención, así como a células de plantas transgénicas derivadas de células transformadas de dicho modo. Tales células contienen una o varias de las moléculas de ácido nucleico de la invención, con lo cual esta(n) enlazada(s) preferiblemente a elementos reguladores de DNA que aseguran la transcripción en células de plantas, en particular con un promotor. Tales células difieren de las células de plantas existentes naturalmente por el hecho de que contienen al menos una molécula de ácido nucleico de la invención que no existe naturalmente en estas células o por el hecho de que una molécula de este tipo está integrada en una posición dentro del genoma de la célula en la que no se encuentra naturalmente, es decir en otro ambiente genómico. Dado que la 1-kestosa es el sustrato natural de FFT y se forma a sí misma en la reacción de una sacarosa-fructosil-transferasa (SST) dependiente de sacarosa con la sacarosa, es particularmente ventajoso y probablemente necesario proporcionar una SST aparte de la molécula de ácido nucleico, vector o FFT de la invención. Por ello, en una realización preferida, la presente invención se refiere a células de plantas, tejidos de plantas o plantas transgénicas que contienen adicionalmente un gen codificante de una sacarosa-fructosil-transferasa (SST) dependiente de sacarosa. Éstas pueden ser por ejemplo plantas o células de plantas que expresan ya naturalmente una SST tales como achicoria, Helianthus tuberosus, o dalia o plantas en las cuales se introdujo una secuencia de DNA codificante de SST por medio de técnicas de DNA recombinante. Dicha secuencia puede haber sido introducida independiente o simultáneamente con una molécula de ácido nucleico o vector de la invención.

Las células de plantas y los tejidos de plantas transgénicas pueden regenerarse para producir plantas completas por medio de técnicas conocidas por las personas expertas. Las plantas que pueden obtenerse por regeneración de las células de plantas transgénicas de la invención son también materia que constituye el objeto de la presente invención. Una materia adicional que constituye objeto de la invención son plantas que contienen las células de plantas transgénicas descritas anteriormente. Las células de plantas transgénicas pueden ser en principio cualquier clase deseada de especies de plantas, es decir tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. Las mismas son preferiblemente plantas útiles, en particular plantas que contienen sacarosa, tales como arroz, maíz, remolacha azucarera, caña de azúcar o patata, hortalizas (v.g. tomate, zanahoria, puerro, achicoria, etc.), hierbas de pienso o pasto, batata, trigo, cebada, colza o soja.

La invención se refiere también a material de propagación y productos de cosecha de las plantas de la invención tales como frutos, semillas, tubérculos, plantones, plantas de semillero, esquejes, callos, cultivos de células, etc., en donde dicho material de propagación y productos de cosecha contienen células de plantas de la presente inven-
ción.

Una materia adicional que constituye objeto de la descripción es la inulina de cadena larga que puede obtenerse a partir de las células hospedadoras de la invención, en particular a partir de células de plantas, tejidos de plantas, o plantas transgénicas así como del material de propagación y de los productos de cosecha.

En otra realización, la invención se refiere a métodos para obtención de inulina de alta molecularidad, cuyas moléculas contienen como promedio más de 20 residuos fructosilo, comprendiendo dicho método:

(a): cultivar una célula hospedadora, particularmente una célula de planta, tejido de planta o una planta de la invención, en condiciones que permiten la producción de FFT y la conversión de 1-kestosa, suministrada opcionalmente del exterior, o de un sustrato equivalente en dicha inulina de alta molecularidad; y

(b): recuperar la inulina así producida a partir de las células hospedadoras cultivadas, en particular células de plantas, tejidos o plantas, o del medio.

En una realización adicional, la invención se refiere a un método para la producción de inulina de alta molecularidad, cuyas moléculas contienen como promedio más de 20 residuos fructosilo, comprendiendo dicho método:

(a): poner 1-kestosa o un sustrato equivalente en contacto con una FFT de la invención en condiciones que permiten la conversión en dicha inulina de alta molecularidad; y

(b): recuperar la inulina así producida.

La recuperación de inulina de diversas fuentes, en particular de tejidos de plantas, ha sido descrita por ejemplo en Gibson et al., Int. Sugar J. 96 (1994), 381-386; Baxa, Czech J. Food Sci. 16 (1998), 72-76; EP-A-787 745; De Leenheer, Carbohydr. Org. Raw Mater. III, Workshop (1996), Meeting Date 1994, 67-92, Verlag VCH Weinheim, Alemania y en la patente de Rusia RU 2001621C1.

La presente invención se refiere adicionalmente a un método in vitro para producir inulina de alta molecularidad, cuyas moléculas contienen como promedio más de 20 residuos fructosilo por utilización del sustrato sacarosa y una combinación enzimática de una SST y una FFT de la invención. En una realización adicional, la presente invención se refiere a un método in vitro para producir inulina por utilización de una mezcla que contiene oligómeros de fructosilo y una FFT de la invención. En este contexto, un oligómero de fructosilo es un oligómero constituido por unidades fructosa con un DP de aproximadamente 2 a 7, que puede exhibir un residuo glucosa en su extremo. Cuando se lleva a cabo el método de la invención, se utilizan preferiblemente proteínas producidas por recombinación. En el contexto de la presente invención, éstas son proteínas que fueron producidas por introducción de la secuencia de DNA codificante de la proteína respectiva en una célula hospedadora y expresión de la misma en dicho lugar. La proteína puede recuperarse subsiguientemente de la célula hospedadora y/o del medio de cultivo. La célula hospedadora es preferiblemente una célula hospedadora de la invención como se define arriba. En una realización preferida del método de la invención, se utilizan enzimas que fueron producidas recombinantemente y secretadas en el medio de cultivo por la célula hospedadora, de tal modo que no es necesario disgregar las células o purificar ulteriormente la proteína dado que la proteína secretada puede obtenerse del sobrenadante. Con objeto de eliminar los residuos del medio de cultivo, pueden utilizarse técnicas de procesamiento convencionales tales como diálisis, ósmosis inversa, métodos cromatográficos, etc. Lo mismo es cierto para concentrar la proteína secretada en el medio de cultivo. La secreción de proteínas por microorganismos está mediada normalmente por péptidos señal N-terminales (secuencia señal, péptido conductor). Proteínas con esta secuencia señal pueden atravesar la membrana celular del microorganismo. Una secreción de proteínas puede conseguirse enlazando la secuencia de DNA que codifica este péptido señal con la región codificante de la enzima correspondiente. Preferiblemente se hace uso del péptido señal de la \alpha-CGTasa de Klebsiella oxytoca M5A1 (Fiedler et al., J. Mol. Biol. 256 (1996), 279-291) o de un péptido señal como el codificado por los nucleótidos 11529-11618 de la secuencia depositada en el banco de genes con el número de acceso
X86014.

Las enzimas utilizadas en el método de la invención pueden producirse alternativamente no por utilización de microorganismos sino por medio de un sistema de transcripción y traducción in vitro que conduce a la expresión de las proteínas. En una realización particularmente preferida de la invención, la FFT es producida por los protoplastos del tejido de hojas en plantas.

La invención se refiere adicionalmente al uso de inulina que puede formarse a partir de una célula hospedadora, en particular una célula de planta, tejido de planta o una planta de la invención o a partir del material de propagación del producto de cosecha de las plantas y células de plantas de la invención o que puede obtenerse por uno de los métodos de la invención arriba descritos a fin de producir agentes tensioactivos para aumentar la viscosidad en sistemas acuosos, como detergente, como agente de suspensión, para aceleración de la sedimentación, para complejación o para fijación de agua.

Estas y otras realizaciones han sido expuestas y son evidentes para las personas expertas. Las mismas están comprendidas por la descripción y los ejemplos de la presente invención. Bibliografía adicional que se refiere a uno de los métodos, medios o usos arriba mencionados y que puede aplicarse en el sentido de la presente invención, puede deducirse de la técnica anterior, v.g. de bibliotecas públicas o por utilización de medios electrónicos. Para este propósito sirven bases de datos públicas, como v.g. "Medline" a la que puede accederse por Internet, v.g. bajo la dirección http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html. Bases de datos y direcciones adicionales son conocidas por las personas expertas en la técnica y pueden tomarse de Internet, v.g. bajo la dirección http://www.lycos.com. Una revisión de fuentes de información concerniente a patentes o solicitudes de patente de biotecnología puede encontrarse en Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364.

Las figuras muestran:

Figura 1. Muestra el análisis HPLC de un extracto de protoplastos completo. Los protoplastos se transformaron con diversos vectores: A: la transformación se llevó a cabo con el vector pA7 que no contiene una región codificante fusionada al promotor CaMV 35S. B: la transformación tuvo lugar con el vector pA7-csFFT que contiene la región codificante de la fructano:fructano:fructosil-transferasa de alcachofa fusionado al promotor CaMV 35S. C: la transformación se llevó a cabo con el vector pA7/htFFT que contiene la región codificante de la fructano:fructano-fructosil-transferasa de Helianthus tuberosus como una fusión con el promotor CaMV 35S. Antes del análisis, los extractos de protoplastos completos se incubaron en una mezcla de oligómeros de fructosilo durante 12 h cada uno. El análisis se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1.

Figura 2. Muestra la construcción del plásmido p35-csFFT.

Figura 3. Muestra el análisis el HPLC de plantas transgénicas que fueron transformadas con el constructo de p35-csFFT. El análisis muestra que se formaban moléculas de inulina de cadena larga en plantas transgénicas que expresan una SST así como una FFT a partir de alcachofa (35S-SST/FFT 22-19).

Figura 4. Muestra la construcción del plásmido p33csFFT.

Figura 5. Muestra el análisis HPLC de plantas transgénicas que se transformaron con el constructo p33-csFFT. El análisis muestra que se formaron moléculas de inulina de cadena larga en plantas transgénicas que expresan una SST así como una FFT a partir de alcachofa (B33-SST/FFT 47).

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Los ejemplos ilustran la invención.

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Ejemplo 1

Identificación, aislamiento y caracterización de un cDNA que codifica una fructosil-transferasa a partir de alcachofa (Cynara scolymus)

Se aisló RNA total a partir de los receptáculos de alcachofa (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, EE.UU.). Se aisló mRNA Poli(A)+ por medio del sistema de aislamiento de mRNA PoliATract (Promega Corporation, Madison, WI, EE.UU.). Se produjo DNA complementario (cDNA) a partir de 5 \mug de este RNA por medio del kit de síntesis ZAP-cDNA de Stratagene (Heidelberg) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se obtuvieron 2 x 10^{6} clones de fago recombinantes independientes. La biblioteca de cDNA amplificada se cribó de acuerdo con métodos estándar en condiciones de baja severidad por medio del fragmento de DNA marcado con ^{32}P correspondiente al cDNA de la SST de alcachofa (fragmento Not I del plásmido pCy21 como se describe en DE 197 08 774.4). La secuencia de la SST de alcachofa ha sido descrita en DE 197 08 774.4. Los clones positivos se cribaron por medio de la sonda SST en condiciones de severidad alta. Los clones que reaccionaban positivamente durante este cribado se abandonaron, dado que los mismos eran evidentemente cDNA de SSC. A partir de los clones residuales se aisló la inserción de cDNA por escisión del DNA plasmídico aislado en rutinas estándar por medio de la enzima de restricción Not I y se clonó en el vector pA7. Los extremos cohesivos del fragmento Not I se rellenaron por medio de la polimerasa T4. Subsiguientemente, el fragmento se ligó en el sitio Sma I de pA7. El vector pA7 es un derivado de pUC18 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119) que contiene una inserción del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (nucleótidos 7146 a 7464 de acuerdo con Gardner, Nucleic Acids Res. 9 (1981), 2871-2888) entre los sitios EcoRI y SacI del polienlazador. Aparte del promotor 35S, pA7 contiene la señal de poliadenilación del gen 3 del T-DNA del plásmido Ti, pTiACH5 (Gielen, EMBO J. 3 (1984), 835-846), nucleótidos 11749 a 11939, que se aisló como un fragmento Pvu II-Hind III del plásmido pAGV 40 (Herrera-Estrella, Nature 303 (1983), 209-213) y se clonó entre los sitios Sph I y Hind III del polienlazador después de añadir enlazadores Sph I al sitio Pvu II.

Por medio de los derivados de pA7 que contenían un cDNA de alcachofa, se transformaron protoplastos de tabaco de acuerdo con el método de Negrutiu (Plant Mol. Biol. 8, 1987, 363-373). Los protoplastos transformados se cultivaron en medio K3 (Nagy y Maliga, Z. Pflanzenphysiologie 78 (1976), 453-455) a 25ºC durante 2 días en la oscuridad. Subsiguientemente, los extractos celulares se obtuvieron por congelación y descongelación repetidas. Los extractos se incubaron con oligofructanos (67,5% 1-kestosa, 28,4% nystosa, 3,6% fructosil-nystosa, 0,5% sacarosa) durante 12 h a 28ºC y se analizaron subsiguientemente por HPLC. El análisis HPLC se llevó a cabo con una columna de intercambio aniónico CarboPac PA 100, que estaba conectada a un sistema de cromatografía en gradiente Dionex DX-300 (Dionex, Sunnyvale, CA, EE.UU.). Monómeros, oligómeros y polímeros de azúcares se detectaron por medio de detección pulsamperométrica. El ajuste del detector para este propósito era: T_{1} = 0,48 s; T_{2} = 0,12 s; T_{3} = 0,12 s; E_{1} = 0,05 V; E_{2} = 0,65 V; E_{3} = -0,95 V; sensibilidad = 0,1 \muC; integración = 0,28-0,48 s; medio de flujo A = NaOH 0,15M; medio de flujo B = NaAc 1M en NaOH 0,15M; gradiente = 10 min 100% A; 2 min aumento lineal desde 0% B a 100% B; 2 min 100% B; 2 min aumento lineal desde 0% A a 100% A; 5 min A. Las muestras se desalaron y se filtraron (Microcon 10, Amicon, Beverly, EE.UU.) antes de su aplicación. La velocidad de flujo era 1 ml.min^{-1}. En un pequeño número de extractos, podía encontrarse inulina de alta molecularidad (véase Figura 1).

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Ejemplo 2

Análisis de la secuencia de la inserción de cDNA del plásmido pCy3

Una inserción de cDNA de un derivado de pA7 (pCy3) que había mediado la síntesis de inulina de alta molecularidad en el ensayo de protoplastos se secuenció por medio de la técnica de didexosinucleótidos (Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). La inserción del clon pCy3 es un DNA con una longitud de 2073 pb. La secuencia de nucleótidos se indica bajo SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos correspondiente se indica bajo SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 3 es una variante de SEQ ID NO: 1 que codifica la misma proteína codificada por SEQ ID NO: 1.

Un análisis de secuencia y una comparación con secuencias ya publicadas ha demostrado que la secuencia indicada bajo SEQ ID NO: 1 es nueva y comprende una región codificante que exhibe homologías con las FFTs de otros organismos.

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Ejemplo 3

Síntesis del plásmido p35-csFFT e integración del plásmido en el genoma de la patata

El plásmido p35-csFFT (Figura 2) contiene tres fragmentos A, B y C dentro del vector binario pBin19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711, modificado de acuerdo con Becker, Nucleic Acids Res. 18 (1990), 203).

El fragmento A contiene el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). El mismo contiene los nucleótidos 7146 a 7464 (Gardner, Nucleic Acids Res. 9 (1981), 2871-2888) como inserción entre los sitios EcoRI y SacI del polienlazador de pBin19-Hyg.

El fragmento B contiene los nucleótidos 1 a 2073 de la secuencia SEQ ID NO: 1. El fragmento B se obtuvo como un fragmento Not I a partir del vector pBK-CMV en el cual se insertó en el sitio EcoRI por la vía de una secuencia enlazadora EcoRI/NotI. El fragmento C contiene la señal de poliadenilación del gen 3 del T-DNA del plásmido Ti ACH5 (Gielen, EMBO J. 3 (1984), 835-846), nucleótidos 11749 a 11939, que se aisló como un fragmento Pvu II-Hind III a partir del plásmido pAGV40 (Herrera-Estrella, Nature 303 (1983), 209-213) y se clonó entre los sitios Sph I y Hind III del polienlazador de pBin19-Hyg después de añadir enlazadores Sph I al sitio Pvu II.

El plásmido p35-csSST se introdujo en Agrobacterias (Höfgen y Willmitzer, Nucleic Acids Res. 16 (1988), 9877) y se introdujo subsiguientemente en plantas de patata por la vía de la transferencia de genes mediada por Agrobacterium de acuerdo con las técnicas estándar arriba descritas. Dichas plantas de patata se transformaron con una secuencia de DNA que codificaba una SST de alcachofa (véase la solicitud de Patente Alemana DE-A1 197 08 774) y que expresa estas secuencias bajo el control del promotor 35S. Se regeneraron plantas intactas a partir de las células transformadas. Se obtuvieron extractos a partir de las hojas de las plantas regeneradas y se examinaron con respecto a la presencia de polímeros de fructosilo. El análisis se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1. El análisis de las hojas de una serie de plantas transformadas con este sistema vector demostró inequívocamente la existencia de inulina de alta molecularidad, que es resultado de la expresión del gen FFT de la alcachofa contenido en p35-csFFT (véase la Figura 3).

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TABLA I

1

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Ejemplo 4

Producción del plásmido p33-csFFT e integración del plásmido en el genoma de la patata

El plásmido p33-csFFT (Figura 4) es idéntico al plásmido p35-csFFT, con la excepción de que el fragmento A contiene el promotor B33 del gen patatín b33 de la patata en lugar del promotor 35S de CaMV. El mismo contiene un fragmento DraI (posición -1512 a posición +14) del gen patatín b33 (Rocha-Sosa, EMBO J. 8 (1989), 23-29), que se insertó entre los sitios EcoRI y SacI del polienlazador de pBin19-Hyg. El plásmido p33-csFFT tiene un tamaño de aproximadamente 14 kb. El plásmido p33-csSST se introdujo en las plantas de patata por la vía de transferencia de genes mediada por Agrobacterium, como se describe en el Ejemplo 3. Dichas plantas de patata se transformaron con una secuencia de DNA que codificaba una SST de alcachofa (véase la Solicitud de Patente Alemana E-A1 197 08 774) y que expresaba estas secuencias bajo el control del promotor B33. A partir de las células transformadas se regeneraron plantas intactas. El análisis de los tubérculos de una serie de plantas transformadas por este sistema vector demostró inequívocamente la existencia de inulina de alta molecularidad, que es el resultado de la expresión del gen FFT de la alcachofa contenido en p33-csFFT (véase Figura 5).

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften, e.V.

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(B): CALLE: ninguna

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(C): CIUDAD: Berlín

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(D): ESTADO: ninguno

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(E): PAÍS: Alemania

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(F): CÓDIGO POSTAL: ninguno

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas que tienen actividad {}\hskip4,57cm de fructosil-transferasa y métodos para producir inulina de cadena larga

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(ii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 4

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(iii): VERSIÓN LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): SOPORTE DE DATOS: disco flexible

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(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (EPA)

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 2073 pares de bases

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(B): TIPO: nucleótido

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(C): CLASE DE CADENA: monocatenario

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

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(iii): HIPOTÉTICO: NO

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): POSICIÓN: 21..1872

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

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2

3

4

5

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 617 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

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6

7

\hskip1,6cm

100

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 2073 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: nucleótido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA genómico

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(iii): HIPOTÉTICO: SÍ

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(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

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(B): POSICIÓN: 21..1872

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

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8

9

10

11

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 617 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

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12

13

14

Claims

1. Moléculas de ácido nucleico que codifican una proteína que tiene la actividad enzimática de una fructosil-transferasa (FFT) que conduce a la síntesis de polímeros de fructano de alta molecularidad, cuyas moléculas contienen por término medio más de 20 residuos fructosilo, seleccionadas del grupo constituido por:

2. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad mayor que 90% con la secuencia codificante indicada en SEQ ID NO: 1.

3. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada tiene una identidad mayor que 90% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

4. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada tiene una identidad mayor que 95% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

5. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada tiene una identidad mayor que 97% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

6. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada tiene una identidad mayor que 99% con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

7. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es una molécula de DNA.

8. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 7, que es una molécula de cDNA.

9. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que es una molécula de RNA.

10. La molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que se deriva de alcachofa.

11. Un vector que contiene una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12. El vector de la reivindicación 11, en donde la molécula de ácido nucleico está enlazada operativamente a elementos reguladores que aseguran la transcripción y síntesis de un RNA traducible en células procariotas y/o
eucariotas.

13. El vector de la reivindicación 12, en donde los elementos reguladores se derivan del promotor patatín B33 o el promotor CaMV 35S.

14. Una célula hospedadora que está transformada con una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o con un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 o que se deriva de una célula de este tipo, conteniendo dichas células derivadas dicha molécula de ácido nucleico o dicho vector.

15. La célula hospedadora de la reivindicación 14, que contiene adicionalmente un gen que codifica una sacarosa-fructosil-transferasa (SST) dependiente de sacarosa.

16. Un método para la producción de una FFT, en el cual la célula hospedadora de la reivindicación 14 se cultiva en condiciones que permiten la síntesis de la FFT y en el cual la FFT se aísla a partir de las células cultivadas y/o del medio de cultivo.

17. Una FFT, codificada por la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o producida por el método de la reivindicación 16.

18. Un método para la producción de una célula hospedadora transformada de la reivindicación 14 ó 15, en particular de una célula de planta transgénica, tejido de planta transgénica y plantas transgénicas, que comprenden la introducción de una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o de un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 en la célula hospedadora, la célula de planta, tejido de planta o la planta.

19. Una célula hospedadora transformada, célula de planta, tejido de planta o planta transgénica que contiene una molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o un vector de una cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 o que puede obtenerse por el método de la reivindicación 18, o que se deriva de una célula, tejido o planta de este tipo, en donde dicha célula, tejido o planta derivado(a) contiene dicha molécula de ácido nucleico o dicho vector.

20. Una célula hospedadora transformada, célula de planta, tejido de planta o planta transgénica de la reivindicación 19, que contiene adicionalmente un gen que codifica una sacarosa-fructosil-transferasa dependiente de sacarosa.

21. Una planta que contiene células de planta o tejidos de planta de la reivindicación 19 ó 20.

22. La planta de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, que es una planta útil.

23. La planta de la reivindicación 22, en donde la planta útil es una planta que contiene sacarosa.

24. Material de propagación de una planta de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, que contiene las células de planta de la reivindicación 19 ó 20.

25. Productos de cosecha de una planta de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 que contienen una célula de planta de la reivindicación 19 ó 20.

26. Un método para la producción de inulina de alta molecularidad, cuyas moléculas contienen como promedio más de 20 residuos fructosilo, comprendiendo dicho método

(a): cultivar una célula hospedadora transformada, célula de planta o tejido de planta transgénica de la reivindicación 19 ó 20 o una planta de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23 en condiciones que permiten la producción de una FFT y la conversión de 1-kestosa, suministrada opcionalmente del exterior, o de un sustrato equivalente en dicha inulina de alta molecularidad; y

(b): recuperar la inulina así producida a partir de las células, tejidos o plantas cultivadas, o del medio.

27. Un método para la producción de inulina de alta molecularidad, cuyas moléculas contienen como promedio más de 20 residuos fructosilo, comprendiendo dicho método:

(a): poner 1-kestosa o un sustrato equivalente en contacto con una FFT de la reivindicación 17 en condiciones que permiten la conversión en dicha inulina de alta molecularidad; y

(b): recuperar la inulina así producida.

28. Un método in vitro para producir inulina de alta molecularidad, cuyas moléculas contienen como promedio más de 20 residuos fructosilo, en donde el sustrato sacarosa se convierte en dicha inulina de alta molecularidad por una combinación de enzimas constituidas por una SST y una FFT de la reivindicación 17.

29. Uso de inulina de alta molecularidad, cuyas moléculas contienen como promedio más de 20 residuos fructosilo, que puede obtenerse a partir de una célula hospedadora, célula de planta o tejido de planta de la reivindicación 19 ó 20, a partir de una planta de una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 23, del material de propagación de la reivindicación 24 o del producto de cosecha de la reivindicación 25 o por medio de un método de una cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28 a fin de producir agentes tensioactivos para aumentar la viscosidad en sistemas acuosos, como detergente, como agente de suspensión, para aceleración de la sedimentación y para complejación o para retención de agua.