HU226874B1 - Dna sequences coding for enzymes capable of facilitating the synthesis of linear alfa-1,4 glucans in plants, fungi and microorganisms - Google Patents
Dna sequences coding for enzymes capable of facilitating the synthesis of linear alfa-1,4 glucans in plants, fungi and microorganisms Download PDFInfo
- Publication number
- HU226874B1 HU226874B1 HU9603170A HU9603170A HU226874B1 HU 226874 B1 HU226874 B1 HU 226874B1 HU 9603170 A HU9603170 A HU 9603170A HU 9603170 A HU9603170 A HU 9603170A HU 226874 B1 HU226874 B1 HU 226874B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- glucans
- leu
- dna
- linear
- amylosaccharase
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
- C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
- C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis
- C12N15/8246—Non-starch polysaccharides, e.g. cellulose, fructans, levans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Physiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány tárgyát amiloszacharázaktivitást mutató és szacharózból lineáris a-1,4-glükánok szintézisét katalizáló fehérje intra- vagy extracelluláris kifejezésére képes növények és mikroorganizmusok előállítására irányuló rekombináns DNS-technikák képezik.
A találmány tárgyát képezik továbbá a nevezett DNS-szekvenciákat tartalmazó új DNS-szekvenciák és plazmidok, amelyek növény genomjába történő beépítés vagy mikroorganizmusokba - különösen baktériumokba vagy gombákba - történő transzformálás után szacharózból lineáris a-1,4-glükánok szintézisét katalizálóenzim kifejezését eredményezik, ugyanúgy, minta fent említett DNS-szekvenciákat tartalmazó transzgén szervezetek (azaz növények, gombák és mikroorganizmusok).
A lineáris a-1,4-glükánok glükóz monomereket tartalmazó poliszacharidok, ahol a monomerek kizárólag a-1,4-glikozidos kötésekkel kapcsolódnak egymáshoz. A leggyakrabban előforduló természetes a-1,4-glükán az amilóz, a növényi keményítő alkotórésze. Az utóbbi időben egyre nagyobb fontosságot tulajdonítanak a lineáris a-1,4-glükánok kereskedelmi felhasználásának. Fizikai-kémiai tulajdonságainak köszönhetően az amilóz felhasználható színtelen, szagtalan és íztelen, nem toxikus és biológiailag lebontható filmek előállítására. Már ma változatos lehetőségek vannak az alkalmazására például az élelmiszeriparban, textiliparban, üvegszáliparban és a papírgyártásnál.
Sikerült amilózból olyan szálakat készíteni, amelyeknek a sajátságai hasonlóak a természetes cellulózszálakéhoz, és amelyek részben vagy teljes egészében helyettesíthetik azokat a papírgyártásnál.
Az amilózt, lévén a lineáris a-1,4-glükánok legfontosabb képviselője, főleg tabletták előállításánál kötőanyagként, pudingok és krémek sűrítőjeként, zselatint helyettesítőként, hangszigetelő falelemek előállításánál kötőanyagként és viaszszerű olajok áramlási sajátságainak javítására használják.
Az a-1,4-glükánok egy másik olyan sajátsága amely mostanában növekvő figyelmet kapott - ezeknek a molekuláknak azon képessége, hogy helikális szerkezetük révén szerves komplexképzőkkel zárványvegyületeket képeznek. Ez a tulajdonság lehetővé teszi az a-1,4-glükánok felhasználását széles körű alkalmazásoknál. Jelen megfontolások éppúgy vonatkoznak vitaminok, gyógyszervegyületek és aromás anyagok molekuláris bezárására, mint anyagkeverékeknek immobilizált a-1,4-glükánokon való kromatográfiás szétválasztására történő felhasználásukra.
Az amilóz az úgynevezett ciklodextrinek (ciklo-amilózok, ciklo-maltózok elnevezésekkel is utalunk rá) előállításának kiindulási anyagaként is szolgál, amelyek széleskörűen használatosak a gyógyszerészeti iparban, élelmiszer-gyártási technológiában, kozmetikai iparban és analitikai szeparálás! technológiában. Ezek a ciklodextrinek 6-8 monoszacharid egységből álló ciklikus malto-oligoszacharidok, amelyek szabadon oldhatók vízben, viszont rendelkeznek hidrofób üreggel, amely zárványvegyületek képzésére használható.
Manapság lineáris a-1,4-glükánokat amilóz formájában keményítőből nyerünk. A keményítő maga két komponensből áll. Az egyik komponenst az amilóz alkotja, a-1,4-kötésű glükózegységek el nem ágazó láncaként. A másik komponenst amilopektin alkotja, glükózegységekből álló, erősen elágazó polimer, amelyben az a-1,4-kötésen felül a glükózláncok a-1,6-kötésekkel is elágazhatnak. Különböző szerkezetüknek és az általuk eredményezett fizikai-kémiai tulajdonságoknak köszönhetően a két komponenst szintén használják különböző alkalmazási területeken. Annak érdekében, hogy az egyes komponensek sajátságait közvetlenül felhasználhassuk, tiszta formában kell kinyernünk azokat. Mindkét komponenst megkaphatjuk keményítőből, az eljárás azonban néhány tisztítási lépést és tekintélyes időt, valamint pénzt igényel.
Ezért sürgető igény van arra, hogy a keményítő mindkét komponensének kinyerésére egységes módon lehetőségeket találjunk. E célból mindeddig termesztéssel vagy genetikai manipulációval módosították a keményítőt előállító növényeket, hogy megváltozott amilóz/amilopektin aránnyal termeljenek keményítőt. Miközben a magkeményítő normális amilopektinaránya például 70%, sikerült olyan kukoricaváltozatot (waxy maize; viaszos kukorica) termesztéssel létrehozni, amelynek a keményítője majdnem 100% amilopektint tartalmaz [Akatsuka és Nelson, J. Bioi. Chem. 241, 2280-2285 (1966)].
Továbbá néhány megnövekedett amilóztartalmú (60-70%) kukoricaváltozatot állítottak elő termesztéssel, például az amilózkiterjesztő és tompa változatokat [Wolf et al., J. Am. Chem. Soc. 77, 1654-1659 (1955); Boyer et al., Die Stárke, 28, 405-410 (1976)]. Más növényfajokat használtak olyan változatok nyerésére, amelyek egyöntetű keményítőket szintetizálnak amilopektin formájában, például rizst [Sano, Theor. Appl. Génét. 68, 467-473 (1984)] és árpát [Shannon és Garwood, in: Whistler, Bemiller, Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, Orlando, 2nd Ed. 25-86 (1984)] vagy amelyek magas amilóztartalmú keményítőt szintetizálnak (például borsót). A fenti klasszikus termesztéses megközelítéseken kívül beszámoltak a keményítőt termelő növények genetikai manipulációján alapuló megközelítésekről.
Visser és munkatársai [Mól. Gén. Génét. 255, 289-296 (1991)] például leírják, hogy lényegében tiszta amilopektin keményítőt szintetizáló burgonyaváltozatokat kaphatunk a keményítőszemcséhez kötött keményítőszintetázt kódoló gén antiszenz gátlásával.
A WO 92/14827 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés olyan burgonyanövények előállításáról számol be, amelyek az elágazásokért felelős enzim kifejeződésének anti-szenz gátlása révén megnövekedett amilóz/amilopektin aránnyal rendelkező keményítőt termelnek. A WO 92/14827 közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentésben leírt növények azonban nem termelnek magas amilóztartalmú keményítőt.
Számos kísérlet és különböző megközelítések ellenére mindeddig nem sikerült tiszta amilózkeményítőt
HU 226 874 Β1 termelő növényeket kapni. Tehát eddig nem írtak le lehetőséget magas tiszta amilóz vagy tiszta lineáris a-1,4glükánok termelésére más eljárások, például genetikailag manipulált mikroorganizmusok felhasználásával.
Továbbá eddig nem találtak olyan enzimeket kódoló DNS-szekvenciákat, amelyek in vitro képesek lennének lineáris a-1,4-glükánok szintézisének katalizálására növényekben, gombákban, mikroorganizmusokban.
Ezért a találmány tárgyát olyan DNS-szekvenciák és eljárások szolgáltatása képezi, amelyek képesek lehetővé tenni lineáris a-1,4-glükánok szintézisére képes növények, gombák és mikroorganizmusok előállítását.
A találmány tárgyát a szabadalmi igénypontokkal jellemzett megvalósítási formák rendelkezésre bocsátásával valósítjuk meg.
A találmány tehát lineáris a-1,4-glükánok szacharózból való szintézisét katalizáló amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező fehérjét kódoló,
a) egy Neisseria polysacchareábó\ származó amiloszacharázt kódoló kódolórégió által kódolt polipeptid aminosavszekvenciájával rendelkező fehérjét kódoló DNS-szekvenciák, ahogy a pNB2 (DSM 9196) plazmid DNS-inszertumában találhatók;
b) egy Neisseria polysacchareábó\ származó amiloszacharázt kódoló kódolórégió nukleotidszekvenciájával - ahogy az a pNB2 (DSM 9196) plazmid DNS-inszertumában található - rendelkező DNSszekvencia;
c) az a) vagy b) pont szerinti szekvenciák bármelyikével hibridizáló DNS-szekvenciák;
d) a b) pontban meghatározott DNS-szekvenciával legalább 40%-ban azonos DNS-szekvenciák; és
e) az a), b) vagy d) pontokban említett szekvenciákhoz képest a genetikai kód következtében degenerált DNS-szekvenciák által alkotott csoportból választható DNS-szekvenciákra vonatkozik.
Különösen egy Neisseria polysacchareábó\ származó amiloszacharázt kódoló kódolórégió - ahogy a pNB2 (DSM 9196) plazmid DNS-inszertumában található - által kódolt polipeptid aminosavszekvenciájával rendelkező fehérjét kódoló DNS-szekvenciákra és egy Neisseria polysacchareábó\ származó amiloszacharázt kódoló kódolórégió - ahogy a pNB2 (DSM 9196) plazmid DNS-inszertumában található - nukleotidszekvenciájával rendelkező DNS-szekvenciára vonatkozik. A találmány vonatkozik továbbá a fent említett, találmány szerinti szekvenciákkal hibridizáló és amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező fehérjéket kódoló DNS-szekvenciákra éppúgy, mint olyan DNS-szekvenciákra, amelyek a genetikai kódnak köszönhetően degeneráltak a fent említett, találmány szerinti DNS-szekvenciákhoz képest.
A „hibridizáció” kifejezés ebben a szövegösszefüggésben szokásos hibridizációs körülmények között végzett hibridizációt jelent, előnyösen szigorú körülmények között, ahogyan azt például Sambrook és munkatársai leírták [Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)].
Egy amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező fehérjét kódoló, találmány szerinti DNS-szekvenciák egy következő lépéseket tartalmazó eljárással nyerhetők:
a) genomiális vagy cDNS-könyvtár készítése egy szervezet sejtjeinek genomiális DNS-e vagy mRNS-e alapján;
b) megfelelő gazdaszervezet transzformálása az a) lépésben összeállított könyvtárral;
c) a transzformált sejtek alávetése jódgőznek;
d) a kékre színeződött sejtek azonosítása;
e) a d) lépésben azonosított sejtek izolálása és szaporítása; és
f) a genomiális DNS-inszertum vagy a cDNS-inszertum izolálása a transzformált sejtekből.
A b) lépésben említett megfelelő gazdaszervezet például E. coli.
Előnyben részesített megvalósítási formában a találmány tárgyát mikroorganizmusokból - különösen Gram-negatív mikroorganizmusokból, előnyösen a Neisseria species baktériumokból és különösen előnyösen a Neisseria polysacchareáhó\ - származó amiloszacharázt kódoló DNS-szekvenciák képezik.
Szintén lehetséges a találmány szerinti DNS-szekvenciák módosítása mutációval vagy beszúrással (inszercióval), kivágással (delécióval), helyettesítéssel (szubsztitúcióval) vagy rekombinációval történő szekvenciamódosítással annak érdekében, hogy a kifejezendőfehérje bizonyos tulajdonságait megváltoztassuk.
E módosítások egyike, többek között az enzim kiválasztását biztosító szignálszekvencia kivágása, és más szignálszekvenciák vagy tranzitpeptideket kódoló DNS-szekvenciák beszúrása és ezáltal a kifejezett fehérje lokalizációjának befolyásolása.
A találmány szerinti DNS-szekvenciák - különösen az 1. számú szekvenciavázlatban bemutatott találmány szerinti szekvencia vagy annak része - felhasználhatók annak meghatározására, vajon bizonyos mikroorganizmusokban jelen vannak-e vagy kifejeződnek-e homológ DNS-szekvenciák. E DNS vagy mRNS elérésére az egyes mikroorganizmus mintáit a találmány szerinti DNS-szekvenciával hibridizáljuk megfelelő hibridizációs körülmények között, szokásos módszerek szerint.
Standard technikák szerint a találmány szerinti DNS-szekvencia felhasználásával lehetséges különböző szervezetek genomjából olyan homológ szekvenciák izolálása is, amelyek úgyszintén amilo-szacharázt vagy hasonló tulajdonságokkal rendelkező enzimeket kódolnak. Ebben az összefüggésben a homológia legalább 40%-60% szekvenciaazonosságot jelent, előnyösen több, mint 60%, különösen több, mint 80%, még előnyösebben több, mint 95% szekvenciaazonosságot. A homológia továbbá azt jelenti, hogy az illető DNS-szekvenciák vagy kódolt aminosavszekvenciák működésükben és/vagy szerkezetileg ekvivalensek. Azok a szekvenciák, amelyek a találmány szerinti szekvenciákkal homológok és amelyek egy vagy több helyen eltérnek a találmány szerinti DNS-szekvenciától vagy kódolt aminosavszekvenciától, ténylegesen a ne3
HU 226 874 Β1 vezett szekvencia olyan változatai, amelyek ugyanazzal a funkcióval rendelkező módosulatokat képviselnek. Ezek lehetnek természetben előforduló változatok, úgymint más szervezetek szekvenciái vagy mutációk. Ezek a mutációk történhetnek természetesen vagy megvalósíthatók specifikus mutagenezissel. Továbbá ezek a változatok lehetnek szintetikusan előállított szekvenciák. Mindezeket a DNS-szekvenciákat szintén felöleli a találmány.
A találmány szerinti különböző DNS-szekvenciaváltozatok által kódolt fehérjék specifikus közös tulajdonságokkal rendelkeznek, úgymint enzimaktivitással, immunológiai reaktivitással, konformációval stb. ugyanúgy, mint fizikai tulajdonságokkal, úgymint elektroforetikus mobilitással, kromatográfiás viselkedéssel, szedimentációs koefficienssel, oldhatósággal, spektroszkópiai sajátságokkal, stabilitással stb.
Rokon DNS-szekvenciák meghatározása céljából ki kell nyernünk a vizsgálandó szervezet génkönyvtárait, amelyek jellemzőek a szervezet géntartalmára, vagy a gének kifejeződésére a szervezetben vagy a szervezet bizonyos szövetére. Az először említett típusba tartoznak a genomiális könyvtárak, az utóbbiak cDNS-könyvtárak.
Homológ DNS-szekvenciák azonosítását és izolálását ilyen könyvtárakból standard technikák szerinti hibridizációval érjük el [lásd például Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)]. Hibridizációs próbaként olyan DNS-molekulákat alkalmazhatunk, amelyek pontosan vagy lényegében az 1. számú szekvenciavázlatban jelzett DNS-szekvenciát vagy a nevezett szekvencia egy részét mutatják. A hibridizációs próbaként használt DNSfragmentumok lehetnek szintetikus DNS-fragmentumok, amelyeket a szokásos DNS-szintetizáló módszerek szerint állítottunk elő és lényegében azonosak a találmány szerinti szekvenciával. Amint a találmány szerinti DNS-szekvenciával hibridizáló géneket azonosítottuk és izoláltuk, szükséges a nevezett szekvencia által kódolt fehérjék szekvenciájának meghatározása és sajátságainak analízise.
Az amiloszacharáz (amelyet szacharóz-1,4-a-glükán 4-a-glükoziltranszferáznak is neveznek, E. C. 2.4.1.4.) olyan enzim, amelyre a következő reakcióvázlat áll:
szacharóz+(a-1,4-D-glükozil)n->
D-fruktóz+(a-1,4-D-glükozil)n+1
Ez a reakció transzglükozilálás. Ennek a reakciónak a termékei lineáris a-1,4-glükánok és fruktóz. Kofaktorok nem szükségesek. Amiloszacharázaktivitást mindeddig csak néhány baktériumfajban találtak, ezek közül főleg a Neisseria speciesek között [MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 24, 357-362 (1978)] és az enzimet csak enzimaktivitására nézve vizsgálták. Okada és munkatársai szerint a Neisseria perflavából származó részlegesen tisztított enzim szacharóz hozzáadására olyan glikogénhez hasonló poliszacharidok szintézisét eredményezi, amelyek kismértékben elágazóak [Okada et al., J. Bioi. Chem. 249, 126-135 (1974)]. A Neisseria perflava és
Neisseria polysaccharea intra- vagy extracellulárisan szintetizált glükánjai hasonlóan bizonyos fokú elágazottságot mutatnak [Riou et al., Can. J. Microbiol. 32, 909-911 (1986)]. Azt, hogy ezeket az elágazásokat vajon az amiloszacharáz viszi be vagy egy másik, a tisztított amiloszacharázkészítményekben szennyezőként jelen levő enzim útján kerülnek be, eddig még nem derítették ki. Mivel eddig elágazásokat beépítő enzimet még nem találtak, azt feltételezik, hogy mind a poiimerizációt, mind az elágazási reakciókat az amiloszacharáz katalizálja [Okada etal., J. Bioi. Chem. 249, 126-135 (1974)].
A Neisseriában konstitutív módon kifejeződő enzim rendkívül stabil, nagyon erősen kötődik a polimerizációs termékekhez és a keletkező fruktóz kompetitíven gátolja [MacKenzie et al., Can. J. Microbiol. 23, 1303-1307 (1977)]. A Neisseria polysaccharea kiválasztja az amiloszacharázt [Riou et al., Can. J. Microbiol. 32, 909-911 (1986)], míg más Neisseria specieseknél bent marad a sejtben.
Amiloszacharázaktivitással rendelkező enzimeket csak mikroorganizmusokban tudtak kimutatni. Nem ismeretesek amiloszacharázokkal rendelkező növények.
A találmány szerint megmutatható, hogy az amiloszacharáz által katalizált reakció termékei lineáris a1,4-glükánok, amelyek nem elágazóak, ahogyan azt eddig feltételezték (lásd fent).
Az amiloszacharáz enzim aktivitásának kimutatását a szintetizált glükánok kimutatásával végezhetjük, ahogyan azt az alábbiakban a 3. példában leírjuk. A kimutatást általában jódos színezéssel végezzük. Amiloszacharázt kifejező baktériumtelepek azonosítása lehetséges például jódos gőzzel történő kezeléssel. A lineáris a-1,4-glükánokat szintetizáló telepek kékre színeződnek.
A tisztított enzim aktivitása kimutatható például szacharóztartalmú agarlemezeken. Ha a fehérjét felvisszük egy ilyen lemezre és körülbelül 1 órán át vagy tovább inkubáljuk 37 °C-on, az bediffundál az agarózba és katalizálja lineáris glükánok szintézisét. Az utóbbiak kimutathatók jódgözös kezeléssel. Továbbá, a fehérje kimutatható natív poliakrilamid gélekben. Natív poliakrilamid gélelektroforézist követően a gélt nátrium-citrátpufferben (50 mM, pH=6,5) ekvilibráljuk és egy éjszakán keresztül szacharózoldatban (nátrium-citrát-pufferben 5%) inkubáljuk. Ha a gélt ezt követően Lugol-oldattal színezzük, azok a területek, amelyekben az amiloszacharázaktivitással rendelkező fehérjék helyezkednek el, lineáris a-1,4-glükánok szintézise következtében kékre színeződnek.
A találmány szerinti DNS-szekvenciák segítségével előállíthatok olyan növények, amelyek képesek tiszta amilózkeményítő, azaz lineáris a-1,4-glükánok termelésére, és keményítőt termelő növények módosíthatók olyan módon, hogy nagyobb mennyiségű keményítővel és egyidejűleg megnövekedett amilóz/amilopektin aránnyal rendelkezzenek. A találmány szerinti DNSszekvenciák felhasználhatók olyan mikroorganizmusok és gombák, különösen élesztők előállítására, amelyek képesek lineáris a-1,4-glükánok szacharózból történő szintézisét katalizáló enzim termelésére.
HU 226 874 Β1
Továbbá alacsony költséggel előállítható tiszta fruktóz szörp a találmány szerinti DNS-szekvenciák vagy az általuk kódolt fehérjék segítségével.
A találmány egy másik megvalósítási formája rekombináns DNS-molekulákra vonatkozik, úgymint a találmány szerinti DNS-szekvenciákat vagy azok részeit tartalmazó vektorokra, különösen plazmidokra, például a pNB2 plazmidra, amelyet DSM 9196 szám alatt helyeztünk letétbe. A találmány tárgyát különösen olyan rekombináns DNS-molekulák képezik, amelyekben egy találmány szerinti DNS-szekvencia egy lineáris a1,4-glükánok szacharózból való szintézisét katalizáló amiloszacharázaktivitással rendelkező fehérje mikroorganizmusokban, gombákban vagy növényekben való kifejeződését biztosító DNS-szekvenciákhoz kötődik, például a következő DNS-szekvenciákat tartalmazó plazmidok:
a) egy mikroorganizmusokban aktív megfelelő promoter, amely biztosítja, hogy a tőle downstream elhelyezkedő kódolószekvencia átíródik mikroorganizmusokban, és
b) egy lineáris a-1,4-glükánok szacharózból való szintézisét katalizáló amiloszacharázaktivitást kifejtő fehérjét kódoló és a promoterhez oly módon kapcsolódó DNS-szekvencia, hogy az lehetővé teszi egy polipeptidre lefordítható RNS képződését, vagy a következő DNS-szekvenciákat tartalmazó plazmidok:
a) egy növényekben aktív megfelelő promoter, amely biztosítja, hogy a tőle downstream elhelyezkedő kódolószekvencia a megfelelő időben vagy a transzgén növény vagy a transzgén növény bizonyos szöveteinek megfelelő fejlődési szakaszában átíródjon, és
b) egy lineáris a-1,4-glükánok szacharózból való szintézisét katalizáló amiloszacharázaktivitást kifejtő fehérjét kódoló és a promoterhez oly módon kapcsolódó DNS-szekvencia, hogy az lehetővé teszi egy polipeptidre lefordítható RNS képződését.
A találmány további tárgyát képezik a találmány szerinti rekombináns DNS-molekulákat tartalmazó mikroorganizmusok, gombák és növények.
A találmány még további tárgyát képezik egy lineáris a-1,4-glükánok szacharózból való szintézisét katalizáló amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező és a találmány szerinti DNS-szekvenciák egyike által kódolt fehérjék, különösen azok, amelyek mikroorganizmusokból származnak, előnyösen Gram-negatív mikroorganizmusokból, specifikusan a Neisseria nemzetség mikroorganizmusaiból, és különösen előnyösen Neisseria polysacchareábóí A találmány tárgyát képezik továbbá gélelektroforézisnél 63±20 kD, előnyösen 63±15 kD és még előnyösebben 63±10 kD molekulatömegű amiloszacharázok.
A találmány további tárgyát képezik különösen amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező olyan fehérjék, amelyek egy Neisseria polysacchareábó\ származó amiloszacharázt kódoló kódolórégió - ahogy az a pNB2 (DSN 9196) plazmid DNS-inszertumában található - által kódolt polipeptid aminosavszekvenciáját tartalmazzák. A találmány tárgyát képezik továbbá olyan fehérjék is, amelyek aminosavszekvenciája a fent említett aminosavszekvenciával lényegében azonos, vagy a nevezett szekvenciától egy vagy több helyzetben eltérő. Az eltérések előnyösen konzervatív aminosavcserék, és a fehérje amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkezik. Tehát a találmány továbbá olyan amiloszacharázokra vonatkozik, amelyeknek az aminosavszekvenciája magas homológiát mutat egy Neisseria polysacchareábóí származó amiloszacharázt kódoló kódolórégió - ahogy az a pNB2 (DSN 9196) plazmid DNS-inszertumában található - által kódolt polipeptid aminosavszekvenciájával, különösen legalább 70%-os homológiát, előnyösen több, mint 80%-os, még előnyösebben több, mint 90%-os és különösen előnyösen legalább 99%-os homológiát.
Egy további megvalósítási formában a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti DNS-szekvenciáknak és DNS-molekuláknak, különösen a nevezett szekvenciát tartalmazó plazmidok prokarióta vagy eukarióta sejtek transzformációjára való alkalmazása éppúgy, mint amiloszacharáz kifejezése prokarióta vagy eukarióta sejtekben, és a találmány szerinti fehérjék előállítására irányuló eljárás is, a találmány szerinti rekombináns DNS-molekulát tartalmazó mikroorganizmusnak megfelelő táptalajon történő tenyésztésével.
A találmány tárgyát különösképpen lineáris a-1,4glükánok szintézisére képes növények előállítására irányuló eljárás képezi, azzal jellemezve, hogy a növényi sejtekbe olyan találmány szerinti DNS-szekvenciát viszünk be, amely magában foglal amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező fehérjét kódoló régiót olyan DNS-szekvenciákkal kapcsoltan, amelyek biztosítják a növényi sejtben való kifejeződést és az egész növény újraképződését a transzformált sejtekből.
Ezenkívül a találmány lineáris a-1,4-glükánok szintézisére képes növényi sejtek és növények előállítására irányuló eljárásra vonatkozik, amely a következő lépéseket tartalmazza:
a) a következő részleges szekvenciákkal rendelkező expressziós kazetta előállítását:
(i) növényekben aktív és a megfelelő célszövetben vagy célsejtekben RNS képződését biztosító promoter;
(ii) legalább egy, amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező fehérjét kódoló DNS-szekvencia egyesítve a promoterrel szensz irányban;
(iii) RNS-molekula transzkripciós terminációjához és poliadenilációjához növényekben működőképes szignál;
b) az expressziós kazetta növényi sejtekbe történő átvitelét; és
c) intakt teljes növények újraképződését a transzformáit növényi sejtekből.
Használható promoterek azok, amelyek biztosítják a gén konstitutív kifejeződését a növények minden szövetében - úgymint a karfiol-mozaikvírus 35S promotere (cauliflower mosaic virus=CaMV) - éppúgy, mint azok, amelyek csak bizonyos szövetekben vagy a növény fejlődése során csak bizonyos időpontokban biz5
HU 226 874 Β1 tosítják a kifejeződést. Ismeretesek olyan promoterek, amelyek specifikus kifejeződést biztosítanak a burgonyanövények gumóiban - úgymint a B33 promoter [Liu et al., Mól. Gén. Génét. 223, 401^106 (1990)] vagy azok, amelyek specifikus kifejeződést tesznek lehetővé a cukorrépa gyökerében. Továbbá leírtak olyan DNSszekvenciákat, amelyek lehetővé teszik a tőlük downstream elhelyezkedő DNS-szekvenciák fénytől függő és szövetspecifikus kifejeződését levelekben [Orozco és Ogren, Plánt Mól. Bioi. 23, 1129-1138 (1993)].
Az a) (ii) eljárási lépésben említett DNS-szekvencia alapvetően bármilyen, amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező fehérjét kódoló régiót tartalmazó találmány szerinti DNS-szekvencia lehet. Alkalmas DNS-szekvenciák különösen a mikroorganizmusokból származó DNS-szekvenciák, előnyösen Gram-negatív mikroorganizmusokból, specifikusan a Neisseria nemzetségből és különösen - a Neisseria polysacchareából.
A találmány szerinti eljárás előnyben részesített megvalósítási formája amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező olyan fehérjét kódoló DNS-szekvenciák felhasználását tervezi, amely az 1. számú szekvenciavázlatban ábrázolt aminosavszekvenciát vagy azzal lényegében azonos aminosavszekvenciát mutat.
Előnyben részesítjük olyan DNS-szekvenciák alkalmazását, amelyek az 1. számú szekvenciavázlatban ábrázolt aminosavszekvenciával nagymértékben homológok és amelyek amiloszacharázt kódolnak. Olyan DNS-szekvenciák szintén felhasználhatók, amelyek a nevezett szekvenciákból oly mértékű helyettesítéssel, beszúrással vagy kivágással származtathatók, amely enzimaktivitásukat nem rontja.
Az eljárás különösen előnyben részesített megvalósítási formája olyan DNS-szekvencia alkalmazására vonatkozik, amely az 1. számú szekvenciavázlatban ábrázolt nukleotidszekvenciát vagy annak olyan részeit mutatja, amely részek elég hosszúak amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező fehérje kódolásához.
A találmány szerint az amiloszacharázt kódoló DNS-szekvencia szenz irányban (a promoter 3’ vége a kódolószekvencia 5’ végéhez) kapcsolódik a promoterhez. Ez a szekvencia módosítható a transzkripciós kontrollelemekhez (promoterhez és terminációs szignálhoz) történő kapcsolás előtt vagy után, a polipeptid sajátságainak vagy elhelyezkedésének megváltoztatása érdekében - ha szükséges - ahogyan azt az alábbiakban részletesebben leírjuk.
Annak érdekében, hogy az enzim a növényi sejt citoszoljában fejeződjön ki, a kiválasztódást befolyásoló szignálszekvenciát el kell távolítani. Ha a kifejezendő enzim bizonyos szubcelluláris sejtalkotókba, úgymint kloroplasztokba, amiloplasztokba, mitokondriumokba vagy vakuólumokba irányítandó, a kiválasztódást befolyásoló szignálszekvenciát ki kell cserélni a kifejeződött fehérjének a megfelelő sejtalkotóba történő szállítását biztosító tranzit peptidet kódoló szignálszekvenciával vagy szekvenciával. Ilyen szekvenciák ismertek. A plasztidokba történő szállításra felhasználható például a burgonyából származó ribulóz-biszfoszfát-karboxiláz (ribulose biphosphate carboxylase=RUBISCO) kis alegysége prekurzor fehérjéjének [Wolter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 846-850 (1988)] vagy az acilhordozó fehérjének (acyl carrier protein=ACP) a tranzitpeptidje. A vakuólumba történő szállításhoz például használható a patatin szignálszekvenciája [Sonnewald et al., Plánt J. 1, 95-106 (1991)]. Az alkalmazott szekvenciákat az enzimet kódoló DNS-szekvenciával egy leolvasási keretben kell egyesíteni.
Az eljárás a) lépésében összeállított expressziós kazetta bevitelét növényi sejtekbe előnyösen plazmidok felhasználásával végezzük, például kettős plazmidokkal.
Előnyben részesítjük olyan technikák használatát, amelyek biztosítják, hogy az expressziós kazetta stabilan épüljön be a transzformált növényi sejt genomjába.
A találmány szerinti eljárás alapjában véve bármilyen növényfajra alkalmazható. Mind egyszikű, mind kétszikű növények fontossággal bírnak. Transzformációs technikákat már leírtak különböző egyszikű és kétszikű növényfajokra.
A találmány szerinti DNS-szekvenciák lehetővé teszik növények módosítását oly módon, hogy azok amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező fehérjéket fejeznek ki, lehetővé téve ezáltal lineáris a-1,4-glükánok szintézisét növényekben. Mivel a lineáris a-1,4glükánok kémiai szerkezetükben azonosak a növényekben szintetizálódott amilózzal, ezért lehetőség van olyan növények előállítására, amelyek tiszta amilózt szintetizálnak, és keményítőt termelő növények átalakítására oly módon, hogy azok megnövekedett amilózaránnyal rendelkező keményítőt szintetizáljanak.
A legtöbb növényben a fotoszintézis útján képződött fotoasszimilált termékek a növényen belül cukrok formájában szállítódnak - specifikusabban főleg szacharóz formájában - a megfelelő célszervekhez. Mivel az amiloszacharáz polimerizációs reakciójának szubsztrátja szacharóz, a fent leírt eljárás alapjában véve lehetővé teszi minden növény módosítását mind kétszikűeket, mind egyszikűeket - tekintettel az amiloszacharázkifejeződésre. Előnyben részesülnek az aratónövények, úgymint kukorica, rizs, búza, árpa, cukorrépa, cukornád, dohány, burgonya vagy manióka, de gyümölcs- és zöldségfajok is, úgymint alma, szilva, répa vagy paradicsom.
Amiloszacharázaktivitás kifejeződése növényekben többek között felhasználható a növényekből nyert extraktumok viszkozitásának megváltoztatására lineáris a-1,4-glükánok szintézise révén. Ebben az összefüggésben a paradicsom bír fontossággal. Amiloszacharáz kifejeződése révén a paradicsomban lineáris a-1,4glükánok szintetizálódnak, amelyek az ezekből a gyümölcsökből kinyert extraktumok megnövekedett viszkozitásához vezetnek.
Amiloszacharáz kifejeződése továbbá különösen előnyös a növények olyan szerveiben, amelyek nagy mennyiségben tárolnak szacharózt. Ilyen szervek például a cukorrépa gyökere vagy a cukornád szára. Mivel ezek a növények normális esetben nem szintetizálnak mérhető mennyiségű keményítőt, az amiloszacharáz
HU 226 874 Β1 által szintetizált lineáris a-1,4-glükánok tiszta formában izolálhatok ezekből a növényekből.
A szacharóz bioszintézisének helye a növényi sejtekben a citoszol. A tárolás helye azonban a vakuólum. A cukorrépa vagy a burgonya tárolószövetébe való szállítás során, vagy a magok endospermjébe történő szállítás során a szacharóznak át kell haladnia az apoplaszton. Ezért mind a három sejtalkotó, azaz a citoszol, vakuólum és apoplaszt figyelembe vehető az amiloszacharáz kifejezésére, lineáris glükánok szintézisére.
Keményítőt termelő növényekben, úgymint burgonyában vagy kukoricában, amelyekben a keményítő szintézise és a keményítő tárolása normális esetben az amiloplasztokban történik, az amiloszacharáz kifejeződése az apoplasztban, citoszolban vagy a vakuólumban glükánok további szintéziséhez vezethet ezekben a sejtalkotókban, ily módon tekintélyes növekedést jelentve a hozamban.
Mivel a burgonya lehetővé teszi az amiloplasztokban szintetizálódott keményítő elkülönítését a keményítő izolációja során az amiloszacharáz által az apoplasztokban, a citoszolban vagy a vakuólumban szintetizált lineáris a-1,4-glükánoktól, egy és ugyanazon növény felhasználható mind keményítő, mind lineáris a1,4-glükánok kinyerésére.
Továbbá ismeretesek olyan transzgén burgonyaés kukoricanövények, amelyekben az ADP-glükóz-pirofoszforiláz egy antiszenz szerkezet általi gátlásának köszönhetően a keményítő szintézise a gumókban és gabonaszemekben teljesen gátolt. Ehelyett például burgonyában oldható cukrok, főleg szacharóz és glükóz halmozódik fel a gumókban [Müller-Röber et al., EMBOJ. 11, 1229-1238 (1992); EP-A-0 455316 számú európai szabadalmi irat]. Amiloszacharáz kifejezésével ezeknek a növényeknek a citoszoljában, vakuólumában vagy apoplasztjában - azaz olyan sejtalkotókban, amelyekben elágazást képző enzimek nincsenek jelen - magas amilóztartalmú keményítő szintézise, azaz főleg lineáris a-1,4-glükánokat tartalmazó keményítő érhető el. Az amiloszacharáz által katalizált reakció mechanizmusát a szacharózról közvetlenül a lineáris glükánra szállított glükóz maradék jellemzi. A lineáris glükánok szacharózból történő bioszintézisében növényekben a szacharóz először glükózra és fruktózra hasad, amely pedig az ADP-glükóz aktivált közbenső formává alakul. Az ADP-glükózról a glükózmaradék a keményítőszintetáz-enzim révén átszállítódik egy már meglévő glükánra, ezáltal elengedve az ADP-t. A szacharóz átalakulása két molekula ADP-glükózzá néhány energiát fogyasztó reakciót igényel.
Ezért az amiloszacharáz által katalizált reakció energiaegyensúlya Összevetve az amilóz szintézis energia-egyensúlyával növényi sejtekben lényegesen jobb, amely az amiloszacharázaktivitást kifejező növényekben a szintetizálódott glükánok megnövekedett hozamához vezet.
Sok £ coli replikációs szignált tartalmazó klónozó vektor és a transzformált baktériumsejtek kiválogatására való markergén áll rendelkezésre, amelyek felhasználhatók idegen gének magasabb rendű növényekbe való bevezetésének elkészítésére. Példák ilyen vektorokra a pBR322, pUC sorozat, M13mp sorozat, pACYC184 stb. A kívánt szekvencia bevezethető a vektorba megfelelő restrikciós helyen. A kapott plazmidot £ co//'-sejtek transzformálására használjuk. A transzformáit E. co//'-sejteket megfelelő táptalajban szaporítjuk, azután kinyerjük és lizáljuk. A plazmidot visszanyerjük. A kapott plazmid-DNS jellemzésére általában használt analitikai módszerek a restrikciós analízis, gélelektroforézis, szekvenáló reakciók és további, a biokémiában és molekuláris biológiában ismert módszerek. A plazmid-DNS minden manipuláció után hasítható, és hozzáköthető más DNS-szekvenciákhoz. Minden plazmid-DNS-szekvencia klónozható ugyanabba vagy más plazmidokba.
Sok technika áll rendelkezésre DNS-nek növényi gazdasejtbe történő bevezetésére. Ezek a technikák felölelik a növényi sejt transzformációját T-DNS-sel transzformáló ágensként Agrobacterium tumefaciens vagy Agrobacterium rhizogenes alkalmazásával, protoplasztok fúzióját, a DNS injektálását, elektroporációját, a DNS bevitelét a bioballasztikus módszerrel ugyanúgy, mint más lehetséges technikákat. A kívánt géneknek a növényi sejtekbe történő beviteli módszerétől függően további DNS-szekvenciákra lehet szükség. Ha például a Ti vagy Ri plazmidot használjuk a növényi sejt transzformációjához, a Ti és Ri plazmid T-DNS-nek legalább a jobb oldali határszekvenciáját, de gyakran a jobb és bal oldali határszekvenciáját, mint szegélyező régiót kell a bevezetendő génekkel összekapcsolni.
Ha Agrobacteriumokat használunk a transzformációhoz, a bevezetendő DNS-t speciális plazmidokba kell klónozni, vagy egy közbenső vektorba, vagy kettős vektorba. A közbenső vektorok homológ rekombinációval beépülhetnek az Agrobacteriumok Ti vagy Ri plazmidjaiba olyan szekvenciáknak köszönhetően, amelyek a T-DNS-ben levő szekvenciákkal homológok. A nevezett plazmid tartalmazza a T-DNS transzferéhez szükséges vir régiót. A közbenső vektorok nem képesek replikálódni Agrobacteriumokban. A közbenső vektor átvihető Agrobacterium tumefaciensbe segítő (helper) plazmid alkalmazásával (konjugációval). Kettős vektorok képesek replikálódni £. colban és Agrobacteriumokban egyaránt. Szelekciós markergént és a jobb és bal oldali T-DNS határ régiókkal szegélyezett linkért vagy polilinkert tartalmaznak. Közvetlenül átvihetők Agrobacteriumokba [Holsters et al., Mól. Gén. Génét. 163, 181-187 (1978)]. A gazdasejtként szolgáló Agrobacteriumnak vir régiót hordozó plazmidot kell tartalmaznia. A vir régió a T-DNS-nek a növényi sejtbe történő átviteléhez szükséges. További T-DNS jelen lehet. Az így transzformált Agrobacteriumol növényi sejtek transzformálására használjuk.
A T-DNS felhasználását növényi sejtek transzformálására alaposan megvizsgálták és kielégítően leírták [EP 120516 számú európai szabadalmi leírás; Hoekema, in: The Binary Plánt Vector System, Offsetdrukkerij Kanters Β. V., Alblasserdam, Chapter V (1985);
HU 226 874 Β1
Fraley et al., Crit. Rév. Plánt Sci. 4, 1—46 és An et al., EMBOJ. 4, 277-287 (1985)].
A DNS-nek a növényi sejtekbe történő átvitelére célszerűen növényi szövettenyészeteket (explantátumokat) tenyészthetünk együtt Agrobacterium tumefac/'ensszel vagy Agrobacterium rhizogenesszel. A fertőzött növényi anyagból (például levéldarabokból, szárdarabkákból, gyökerekből, de protoplasztokból vagy szuszpenzióban tenyésztett növényi sejtekből is) egész növények regenerálhatok megfelelő táptalajon, amely a transzformált sejtek kiválogatásához antibiotikumokat vagy biocideket tartalmazhat. Az így kapott növényeket screenelhetjük a bevitt DNS jelenlétére.
A DNS-nek növényi sejtekbe történő injektálásához és elektroporációjához alkalmazott plazmidokkal szemben nincsenek specifikus kívánalmak. Egyszerű plazmidok, úgymint pUC származékok használhatók. Ha azonban egész növényeket szándékozunk visszanyerni az ily módon transzformált sejtekből, szelekciós marker jelenléte szükséges.
Ha egyszer a bevezetett DNS beépült a növényi sejt genomjába, általában stabilan ott marad és az eredetileg transzformált sejt utódjában is megtalálható. Ez normális esetben szelekciós markert tartalmaz, amely a transzformált növényi sejteknek biociddal vagy antibiotikummal - úgymint kanamiginnel, G 418-cal, bleomicinnel, higromicinnel vagy glufozináttal stb. - szembeni rezisztenciát ad. Az egyedileg kiválasztott markernek ilyenformán kell lehetővé tennie a transzformált sejtek kiválasztását a bevitt DNS-sel nem rendelkező sejtek közül.
A transzformált sejtek a sejten belül a szokásos módon fejlődnek [például McCormick et al., Plánt Cell Reports 5, 81-84 (1986)]. Ezek a növények a szokásos módon termeszthetők és keresztezhetök ugyanazzal a transzformált genetikai anyaggal vagy más genetikai anyagokkal rendelkező növényekkel. Az eredményül kapott hibrid egyedek a megfelelő fenotípusos sajátságokkal rendelkeznek.
Két vagy több generációt kell szaporítanunk ahhoz, hogy megbizonyosodjunk, a fenotípusos jegyek stabilan megmaradtak és öröklődtek. Továbbá be kell gyűjteni a magokat annak érdekében, hogy biztosak lehessünk, a megfelelő fenotípus vagy más jellegzetességek megmaradtak.
A találmány további tárgyát a fent említett, találmány szerinti eljárás által eredményezett módosított növényi sejtek és növények képezik, különösen olyan növényi sejtek és növények, amelyek a találmány szerinti DNS-szekvenciát a találmány szerinti DNS-szekvencia kifejeződését növényi sejtekben lehetővé tevő DNS-szekvenciákkal kombinációban tartalmazzák. A nevezett növényi sejteket amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező fehérje kifejezése jellemzi, ezáltal lineáris a-1,4-glükánok szintézisét eredményezik a sejtekben vagy a növényekben. A transzgén növényi sejteket és növényeket továbbá az jellemzi, hogy olyan rekombináns DNS-molekulát tartalmaznak genomjukba stabilan beépülve, amely magában foglal egy expressziós kazettát, nevezett expressziós kazetta amiloszacharázt kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz.
A transzgén növényi sejtekben és növényekben az amiloszacharáz segítségével képződött lineáris a-1,4glükánok ugyanolyan módon választhatók el a transzgén növényi sejtektől vagy növényektől, mint a normális esetben képződött keményítő.
A találmány tárgyát képezi továbbá a találmány szerinti DNS-szekvenciák vagy azok részének felhasználása amiloszacharázaktivitással rendelkező polipeptid kifejezésére, előnyösen olyan mikroorganizmusokban, amelyek maguk nem rendelkeznek amiloszacharázaktivitással.
Ebben a vonatkozásban mikroorganizmusok alatt ugyanúgy értendők baktériumok, mint az összes protiszta, ahogyan azt például Schlegel az „Allgemeine Mikrobiologie” [Georg Thieme Verlag, p. 1-2 (1985)] című könyvében definiálja.
Manapság a biotechnológiai kutatás kiterjedten használ mikroorganizmusokat a legkülönbözőbb vegyületek szintézisére és feldolgozására. Ez a prokarióta és eukarióta géneknek mikroorganizmusokban történő hatékony kifejezésére szolgáló különböző rendszerek sokaságával való ellátottsággal vált lehetővé [áttekintéshez lásd például: Methods in Enzymology 153, 385-516]. Széles körben használatosak például a baktériumfajok közül az Escherichia coli és Bacillus subtilis törzsek. A találmány szerinti DNS-szekvenciák elkészítésével most lehetőség nyílik amiloszacharázaktivitással rendelkező fehérje kifejezésére olyan mikroorganizmusokban, amelyekre a megfelelő expressziós rendszerek rendelkezésre állnak.
A találmány tárgyát különösen lineáris a-1,4-gIükánok szintézisére - vagy intracellulárisan vagy extracellulárisan - képes mikroorganizmusok előállítására irányuló eljárás képezi, amelyben találmány szerinti DNSszekvenciát viszünk be és fejezünk ki a mikroorganizmusban. Egy ilyen eljárás például a következő lépéseket tartalmazhatja:
a) a következő részleges szekvenciákkal rendelkező expressziós kazetta előállítását:
(i) a kiválasztott mikroorganizmusban aktív és a tőle downstream elhelyezkedő DNS-szekvencia transzkripcióját biztosító promoter;
(ii) amiloszacharázt kódoló és a promoterrel szenz irányban egyesített találmány szerinti szekvencia;
(iii) mikroorganizmusokban működőképes transzkripciós terminációs szignál;
b) megfelelő mikroorganizmus transzformálását az a) lépésben összeállított expressziós kazettával. Expressziós vektorokat kiterjedten írnak le a szakmában. Szelekciós markergénen és a kiválasztott gazdaszervezetben replikációt megengedő replikációs eredőn kívül normális esetben bakteriális vagy virális promotert és transzkripciós terminációs szignált tartalmaznak. A promoter és a terminációs szignál között legalább egy restrikciós hely vagy egy polilinker van, amely lehetővé teszi a kódoló DNS-szekvencia beszúrását. Promoter szekvenciaként a megfelelő gén
HU 226 874 Β1 transzkripcióját normális esetben kontrolláló DNSszekvencia használható addig, amíg az aktív a kiválasztott szervezetben. Ez a szekvencia helyettesíthető más promoter szekvenciákkal. Használhatók olyan promoterek, amelyek a gén konstitutív kifejeződését eredményezik, vagy indukálható promoterek, amelyek lehetővé teszik a tőlük downstream elhelyezkedő gén kifejeződésének szelektív szabályozását. Ilyen tulajdonságokkal rendelkező bakteriális és virális promoter szekvenciákat kiterjedten ír le a szakma. Olyan promoterek, amelyek a tőlük downstream elhelyezkedő gén erős kifejeződését teszik lehetővé, például a T7 promoter [Studier et al., in: Methods in Enzymology 185, 60-89 (1990)], Iacuv5, trp, trp-lacUV5 [DeBoer et al., in: Rodriguez R. L. és Chamberlin M. J. eds. Promoters, Structure and Function; Praeger, New York, p. 462—481 (1982); DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 21-25 (1983)], lp3 rác [Boros et al., Gene 42, 97-100 (1986)] vagy az ompF promoter. Az eljárás a) (ii) lépésében említett DNS-szekvencia bármilyen, amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező fehérjét kódoló DNS-szekvencia lehet. Előnyösen mikroorganizmusokból, különösen Gram-negatív baktériumokból, előnyösen a Neisseria nemzetségből és különösen előnyösen Neisseria polysacchareábó\ származó DNSszekvenciákat használunk.
Az alkalmazott szekvencia - ha szükséges - módosítható az expressziós vektorba történő bevitel előtt vagy után a polipeptid sajátságainak vagy elhelyezkedésének megváltoztatása céljából, ahogyan azt alább részletesebben leírjuk.
Egy Neisseria polysacchareábóí származó amiloszacharázt kódoló szekvencia - ahogy a pNB2 (DSM 9196) plazmid tartalmazza - helyett alkalmazhatók az illető szekvenciából helyettesítéssel, beszúrással vagy kivágással származtatható szekvenciák mindaddig, amíg a kódolt fehérje enzimaktivitása nem gyengül. A mikroorganizmusok transzformációja a b) lépésben általában kivitelezhető standard technikák segítségével, úgymint Maniatis és munkatársai által leírtak szerint [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982)].
A transzformált mikroorganizmust olyan táptalajon tenyésztjük, amely megfelel az egyedi gazdaszervezet igényeinek. Különös figyelmet kell fordítani a pH-értékre, hőmérsékletre, levegőztetésre stb.
A találmány egy másik tárgyát a fentiekben leírt eljárásból eredményül kapott mikroorganizmusok képezik, amelyek amiloszacharázt kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak, ahol a nevezett szekvencia rekombináns DNS-molekula részét képezi. A nevezett rekombináns DNS-molekula - az alkalmazott transzformációs módszertől függően - jelen lehet az alkalmazott mikroorganizmus sejtjeiben a genomon kívül, vagy a sejtek genomjába stabilan beépülve.
A Neisseria polysaccharea által kifejezett amiloszacharáz egy extracelluláris enzim, amely a sejteken kívül szacharózalapon lineáris a-1,4-glükánokokat szintetizál. A poliszacharidok szintézisének legtöbb útvonalától eltérően - amelyek a sejten belül játszódnak le
- sem aktivált glükózszármazékokra, sem kofaktorokra nincs szükség. A kondenzált glükózmaradékok közötti a-1,4-glükozidos kötés létrejöttéhez szükséges energia a szacharózmolekulában levő glükóz- és fruktózegység közötti kötés hidrolíziséből közvetlenül adódik.
Ilyenformán lehetőség van a fent leírt eljárás lépéseivel kapott, amiloszacharázt kiválasztó mikroorganizmusok tenyésztésére szacharóztartalmú táptalajon, ahol a kiválasztott amiloszacharáz a táptalajban szacharózból lineáris a-1,4-glükánok szintéziséhez vezet. Ezeket a glükánokat izolálhatjuk a tenyésztő táptalajból.
Továbbá lehetőség van a-1,4-glükánok in vitro szintézisére sejtmentes enzimpreparátum segítségével. Ebben az esetben amiloszacharázt kiválasztó mikrobákat tenyésztünk szacharózmentes táptalajban, lehetővé téve az amiloszacharáz kifejeződését a növekedés stacioner szakaszának eléréséig. A sejteknek a táptalajból centrifugálással történő eltávolítása után a kiválasztott enzimet megkaphatjuk a felülúszóból. Az enzimet ezután szacharóztartalmú oldatokhoz adhatjuk lineáris a-1,4-glükánok szintézise céljából. Összehasonlítva a lineáris a-1,4-glükánoknak közvetlenül szacharóztartalmú szaporító táptalajban történő szintézisével, ez a módszer azért előnyös, mert a reakció körülményei jobban kontrollálhatók és a reakció termékei lényegesen tisztábbak és könnyebben tovább tisztíthatok.
Az enzim a szaporító táptalajtól hagyományos tisztítási technikákkal tisztítható meg, úgymint kicsapással, ioncserés kromatográfiával, affinitáskromatográfiával, gélszűréssel, reverz fázisú HPLC-vel stb.
Továbbá lehetőség van olyan polipeptid kifejezésére - az expressziós vektorba beszúrt, polipeptidet kódoló DNS-szekvencia módosításával - amely bizonyos sajátságoknak köszönhetően könnyebben izolálható a szaporító táptalajból. Az enzim kifejezése lehetséges fúziós fehérjeként együtt egy másik polipeptid-szekvenciával, amelynek specifikus kötési sajátságai megengedik a fúziós fehérje izolálását affinitáskromatográfiával.
Ismert technikák például a fúziós fehérjeként glutation S transzferázzal történő kifejezés és azt követő affinitáskromatográfiás tisztítás glutation oszlopon, ahol a glutation S transzferáznak a glutationhoz való affinitását használjuk ki [Smith és Johnson, Gene 67, 31—40 (1988)]. Egy másik ismert technika a maltózt kötő fehérjével (maltose binding protein=MBP) fúziós fehérjeként történő kifejezés és azt követő tisztítás amilózoszlopon [Guan et al., Gene 67, 21-30 (1988); Maina et al., Gene 74, 365-373 (1988)].
A tisztított enzimnek lineáris a-1,4-glükánok szintézise céljából szacharóztartalmú oldathoz történő közvetlen hozzáadásán kívül egy másik lehetőség is van, az enzim rögzítése hordozóanyagon. Az ilyen rögzítés kínálja azt az előnyt, hogy az enzim, mint a szintézis katalizátora könnyen visszanyerhető és több alkalommal felhasználható. Mivel az enzimek tisztítása általában nagyon idő- és költségigényes, az enzim rögzítése és újrafelhasználása hozzájárul a költségek jelentős csökkentéséhez. Egy másik előny a reakciótermékek tisztaságának magas foka, amely többek között annak
HU 226 874 Β1 köszönhető, hogy a reakció körülményei jobban kontrollálhatók rögzített enzimek alkalmazása esetén. A reakciótermékként keletkező oldhatatlan lineáris glükánok azután könnyen tisztíthatok.
Sok hordozóanyag áll rendelkezésre olyan fehérjék rögzítéséhez, amelyek a hordozóanyaghoz vagy kovalens, vagy nem kovalens kötésekkel hozzákapcsolhatók [áttekintéshez lásd: Methods in Enzymology 135, 136-137]. Széles körben használt hordozóanyagok például az agaróz, cellulóz, poliakrilamid, szilika vagy nejlon.
A tisztított enzimhez hasonlóan a kívánt polipeptidet kifejező vagy specifikus metabolitot kiválasztó mikroorganizmusok szintén rögzíthetők. A rögzítést általában a sejtnek egy megfelelő anyagba történő bezárásával érjük el, például alginátba, poliakrilamidba, zselatinba, cellulózba vagy citozánba. Lehetséges azonban a sejteknek hordozóanyaghoz történő adszorbeálása vagy kovalens hozzákötése is [Brodelius és Mosbach, in: Methods in Enzymology 135, 173-175], A sejtek rögzítésének előnye, hogy lényegesen magasabb sejtsűrűség érhető el, mint tápoldatban történő tenyésztéssel, nagyobb produktivitást eredményezve. A tenyészet keverésének és levegőztetésének költségei ugyanúgy, mint a sterilitás fenntartásának költségei is csökkennek. Fontos szempont, hogy a rögzítés lehetővé teszi a folyamatos termelést oly módon, hogy a fermentációs eljárásoknál általában előforduló hosszú, nem termelő szakaszok elkerülhetők, vagy legalábbis jelentősen csökkenthetők.
A találmány szerinti DNS-szekvenciák amiloszacharázaktivitás kifejezésére mikroorganizmusokhoz hasonlóan gombákban is alkalmazhatók, különösen élesztőkben, például Saccharomyces cerevisiae-ben. Heterológ gének élesztőkben történő kifejezésére szolgáló vektorokat írnak le például Bittér és munkatársai [Methods in Enzymology 153, 516-544 (1987)]. Ezek a vektorok a szelekciós markergénen és a baktériumokban történő szaporításhoz szükséges replikációs eredőn kívül tartalmaznak legalább egy további szelekciós markergént, amely lehetővé teszi a transzformált élesztősejtek azonosítását, az élesztőben való replikálódást megengedő DNS-szekvenciát és egy polilinkert a kívánt expressziós kazetta beszúrásához. Az expressziós kazettát promoterből, a kifejezendő DNSszekvenciából és a transzkripciós terminációt és a transzkriptum poliadenilációját megengedő DNS-szekvenciából állítjuk össze. Saccharomyces cerevisae-bö\ származó promotereket és transzkripciós terminációs szignálokat már leírtak és hozzáférhetők. Expressziós vektor bevihető élesztősejtekbe transzformációval standard technikák szerint [Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1990)]. A vektort tartalmazó sejteket megfelelő szelekciós táptalajokon válogatjuk ki és szaporítjuk. Élesztők továbbá lehetővé teszik az expressziós kazetta beépítését homológ rekombinációval a sejt genomjába megfelelő vektor alkalmazásával, amely a sajátság stabil öröklődéséhez vezet.
Amiloszacharázt kifejező élesztőtörzseket a mikroorganizmusokhoz hasonlóan felhasználhatunk kiválasztott amiloszacharáz kinyerésére. Élesztőkre vonatkozó tenyésztési módszereket kielégítően leírtak már [Methods in Yeast Genetics, A Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)]. Az élesztők rögzítése szintén lehetséges és már használják az etanol kereskedelmi célú előállításánál [Nagashima et al., Methods in Enzymology 136, 394-405; Nojima és Yamada, Methods in Enzymology 136, 380-394],
Élesztők felhasználása amiloszacharáz kiválasztására lineáris a-1,4-glükánok szintézise céljából szacharóztartalmú táptalajon azonban nem könnyű, mivel az élesztők invertázt választanak ki, amely hidrolizálja az extracelluláris szacharózt. Az élesztők a keletkezett hexózokat hexóz transzporter útján veszik fel. Gozalbo és Hohmann [Current Genetics 17, 77-79 (1990)] azonban olyan élesztőtörzset írnak le, amely hiányos suc2 gént hordoz és ezért nem tud invertázt kiválasztani. Ezek az élesztők sem tartalmaznak a sejtekbe történő szacharózbevitelre transzportrendszert. Ha ilyen törzset a találmány szerinti DNS-szekvenciával úgy módosítunk, hogy amiloszacharázt válasszon ki a szaporító táptalajba, az amiloszacharáz segítségével lineáris a-1,4-glükánok szintetizálódnak, amennyiben a tenyésztő táptalaj szacharózt tartalmaz. A képződött fruktózt, mint reakcióterméket azután fölvehetik az élesztők.
Tehát szintén a találmány tárgyát képezi lineáris a1,4-glükánokat intracellulárisan vagy extracellulárisan szintetizálni képes gombasejtek előállítására irányuló eljárás, amelyben a találmány szerinti DNS-szekvenciát viszünk be gombasejtekbe és az ott kifejeződik. Egy ilyen eljárás a következő lépéseket foglalhatja magában:
a) a következő részleges szekvenciákkal rendelkező expressziós kazetta előállítását:
(i) a kiválasztott gomba sejtjeiben aktív és a tőle downstream elhelyezkedő DNS-szekvencia transzkripcióját biztosító promoter;
(ii) egy amiloszacharázt kódoló találmány szerinti DNS-szekvencia egyesítve a nevezett promoterrel szenz irányban;
(iii) a nevezett gombasejtekben működőképes transzkripciós terminációs szignál; és
b) a gombasejtek transzformálását az a) lépésben összeállított expressziós kazettával.
A találmány másik vonatkozása a találmány szerinti DNS-szekvenciák alkalmazásával tiszta fruktózszörp olcsó módon történő előállításának lehetősége. Fruktóz előállítására szolgáló hagyományos módszerek vagy a szacharóz enzimes hidrolízise invertáz alkalmazásával, vagy a keményítő lebontása glükózegységekké gyakran savas hidrolízissel és azt követően a glükóznak fruktózzá történő enzimes átalakítása glükóz izomerázzal. Mindkét módszer glükóz és fruktóz keverékét eredményezi. A két komponenst kromatográfiás eljárásokkal kell elválasztani egymástól.
Tiszta fruktóz vagy tiszta fruktózszörp előállítását amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező fehérje alkalmazásával előnyösen sejtmentes rendszerben valósítjuk meg, a tisztított enzim felhasználásával. Az utóbbit rögzíthetjük megfelelő hordozóanyagon vagy
HU 226 874 Β1 jelen lehet oldott formában. Szacharóz jelenléte lineáris glükánok szintézisét és fruktóz szabaddá válását eredményezi. A szubsztrát elválasztását a reakció termékeitől vagy a két reakciótermék elválasztását például olyan membrán alkalmazásával érhetjük el, amely megengedi fruktóz átjutását, viszont szacharózét vagy glükánokét nem. Ha a fruktózt ilyen membránnal folyamatosan eltávolítjuk, a szacharóz többé-kevésbé teljesen átalakul fruktózzá és lineáris glükánokká.
Az amiloszacharázt előnyösen két membrán között elhelyezkedő hordozóanyagon is rögzíthetjük, amelyek közül az egyik a fruktóz átjutását engedi, a szacharózét vagy glükánokét nem, és a másik megengedi a szacharóz átjutását, de a glükánokét nem. A szubsztrátot azon a membránon keresztül pótoljuk, amelyik a szacharóz átjutását lehetővé teszi. A szintetizált glükánok a két membrán közötti térben maradnak, és a szabaddá vált fruktóz folyamatosan eltávolítható a reakcióelegyből azon a membránon keresztül, amely csak a fruktóz átjutását engedi. Egy ilyen elrendezés a reakciótermékek hatékony szétválasztását teszi lehetővé, tehát többek között tiszta fruktóz előállítását.
Amiloszacharázok felhasználása tiszta fruktóz előállítására azzal az előnnyel jár, hogy az összehasonlíthatóan olcsóbb szacharózszubsztrát használható kiindulási anyagként, és továbbá a fruktóz egyszerűen, kromatográfiás eljárások nélkül izolálható a reakciókeverékből.
Tehát amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező fehérjéknek fruktóz előállítására történő felhasználása szintén a találmány tárgyát képezi.
További lehetőség amiloszacharázaktivitással rendelkező fehérjék alkalmazására ciklodextrinek előállítására történő felhasználásuk. Ciklodextrineket a keményítő lebontásával, ciklodextrin transzglikoziláz enzim segítségével állítanak elő (EC 2.4.1.19), amelyet a Bacillus macerans baktériumból nyernek ki. A keményítő elágazásai miatt csak körülbelül 40% glükózegységet lehet ciklodextrinekké alakítani e rendszer alkalmazásával. Lényegében tiszta, amiloszacharázaktivitással rendelkező fehérje elkészítésével lehetőség van ciklodextrinek szacharózalapú szintézisére amiloszacharáz és ciklodextrin transzglikoziláz egyidejű működése révén, ahol az amiloszacharáz katalizálja lineáris glükánok képződését szacharózból és a ciklodextrin transzglikoziláz katalizálja e glükánok ciklodextrinekké alakulását.
A találmány szerinti pNB2 plazmidot 1994. május 6-án a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) (Braunschweig, Germany) gyűjteményben helyeztük letétbe a Budapesti Szerződés rendelkezéseinek megfelelően a DSM 9196 letéti szám alatt.
Az alkalmazott rövidítések IPTG izopropil-p-D-tiogalakto-piranozid
A felhasznált táptalajok és oldatok YT tápoldat: 8 g bacto-tripton g élesztőkivonat 5 g NaCI
1000 ml-re kiegészítve bideszt. vízzel.
YT lemezek: YT tápoldat 1000 ml-ként 15 g bacto-agarral
Lugol-oldat: 12gKI 6g l2
1,8 l-re kiegészítve bideszt. vízzel.
Az ábrák leírása
Az 1. ábra a pNB2 (DSM 9196) plazmidot mutatja.
A vékony vonal megfelel a pBluescript SK(-) klónozóvektor szekvenciájának. A vastag vonal ábrázolja a Neisseria polysaccharida genomiális DNS-ének körülbelül 4,2 kb hosszúságú inszertumát. Az amiloszacharázt kódoló régiót nyíl formájában jelezzük az inszertum alatt. Az inszertum fölött a szekvenált régiót mutatjuk. Minden számérték erre a 2883 bp hosszúságú régióra utal.
A 2. ábra amiloszacharázaktivitás kifejeződését mutatja transzformált E. co//'-sejtekben jódgöznek kitéve azokat.
pBluescript II SK plazmiddal (A) és pNB2 plazmiddal (B) transzformált E. co//'-sejteket szélesztettünk YT lemezekre (1,5% agar; 100 pg/ml ampicillin; 5% szacharóz; 0,2 mM IPTG), és egy éjszakán keresztül 37 °C-on inkubáltuk. Ezután a lemezeket jódgöznek tettük ki. A pNB2 plazmiddal transzformált sejtek telepei jól kivehető kék udvart mutattak.
A példák a találmány szemléltetését szolgálják.
1. példa
Amiloszacharázaktivitást kódoló genomiális DNSszekvencia izolálása Neisseria polysacchareából Neisseria polysacchareabó\ történő amiloszacharázaktivitást kódoló DNS-szekvencia izolálásához először genomiális DNS-könyvtárat hoztunk létre. Neisseria polysaccharea sejteket szaporítottunk „Columbia véragaron” (Difco) 2 napig 37 °C-on. A kapott telepeket összegyűjtöttük a lemezről. Genomiális DNS-t izoláltunk Ausubel és munkatársai [in: Current Protocols in Molecular Biology, J. Wiley & Sons, NY (1987)] szerint, és feldolgoztuk. Az így kapott DNS-t részlegesen emésztettük a Sau3A restrikciós endonukleázzal. Az eredményül kapott DNS-fragmentumokat ligáltuk a BamHI-gyel emésztett pBluescript SK(-) vektorba. A ligációs termékeket £ coli XL1-Blue sejtekbe transzformáltuk. A sejtek kiválogatásához szelekciós markerként ampicillint tartalmazó YT lemezekre szélesztettük azokat. A szelekciós táptalaj ezenkívül 5% szacharózt és 1 mM IPTG-t tartalmazott. Egy éjszakán át 37 °C-on történő inkubálás után a keletkezett baktériumtelepeket jóddal megszíneztük. Kristályos jódot helyeztünk Petricsésze felső részébe és a baktériumtelepeket tartalmazó tenyésztő csészéket megfordítva 10 percre a Petricsészére helyeztük. A szobahőmérsékleten párolgó jód a tenyésztő csészéknek némely régióját - amelyek amilózhoz hasonló glükánokat tartalmaztak - kékre színezte. A kék udvart mutató baktériumtelepekből plazmid-DNS-t izoláltunk Bimbóim és Doly módszere [Nucleic Acids Rés. 7, 1513-1523 (1979)] szerint. Nevezett DNS-t újra transzformáltuk £ coli SURE sejtekbe. A transzformált sejteket szelekciós markerként am11
HU 226 874 Β1 picillint tartalmazó YT lemezekre szélesztettük. A pozitív kiónokat izoláltuk.
2. példa
A pNB2 plazmid genomiális DNS-inszertjének szekvenciaanalízise
Az 1. példa szerint kapott E. co//-klónból rekombináns plazmidot izoláltunk. A restrikciós analízis azt mutatta, hogy a nevezett plazmid két vektor molekulából és körülbelül 4,2 kb hosszúságú genomiális fragmentumból álló ligációs termék. A plazmidot Pstl restrikciós endonukleázzal emésztettük és izoláltuk a genomiális fragmentumot (GeneClean, Bioi01). Az így kapott fragmentumot ligáltuk pBluescript II SK vektorba, Pstl-gyel linearizáltuk, amely a Pstl és Smal restrikciós helyek megkettőződését eredményezte. A ligációs terméket £ co//'-sejtekbe transzformáltuk, és az utóbbiakat szelekcióhoz ampicillintartalmú lemezekre szélesztettük. Izoláltuk a pozitív kiónokat. E kiónok egyikéből a pNB2 plazmidot (1. ábra) izoláltuk és genomiális DNS inszertje szekvenciájának egy részét meghatároztuk standard technikákkal, a didedoxi módszert[Sangeretal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467 (1977)] alkalmazva. A teljes inszert körülbelül 4,2 kbp hosszúságú.
3. példa
Extracelluláris amiloszacharáz kifejezése transzformált E. coli-sejtekben
a) Amiloszacharázaktivitás kimutatása YT lemezeken történő növekedés során Extracelluláris amiloszacharázaktivitás kifejezésére
E. co//'-sejteket transzformáltunk a pNB2 vektorral standard technikák szerint. A transzformált törzs telepeit YT lemezeken (1,5% agar; 100 pg/ml ampicillin; 5% szacharóz; 0,2 mM IPTG) inkubáltuk egy éjszakán át 37 °C-on. Az amiloszacharázaktivitást a telepeket jódgőznek kitéve mutattuk ki (2. ábra). Az amiloszacharázt kifejező telepek kék udvart mutatnak. Amiloszacharázaktivitás még akkor is megfigyelhető, ha IPTG nincs jelen, valószínűleg az endogén amiloszacharáz promoterek aktivitásának köszönhetően.
b) Amiloszacharázaktivitás kimutatása YT tápoldatban történő szaporodás során Extracelluláris amiloszacharázaktivitás kifejezésére
E. coli-t transzformáltunk a pNB2 vektorral standard technikák szerint. YT tápoldatot (100 pg/ml ampicillin; 5% szacharóz) oltottunk be a transzformált törzs telepével. A sejteket egy éjszakán keresztül 37 °C-on inkubáltuk állandó keverés mellett (rotációs mixer; 150-200 rpm). Az amiloszacharáz által katalizált reakció termékeit Lugol-oldatnak a tenyészet felülúszójához való hozzáadásával mutattuk ki, amely kék színeződéshez vezet.
c) Amiloszacharázaktivitás kimutatása szacharóz nélkül szaporított transzformált E. coli-sejtek tenyészetének felülúszójában
Extracelluláris amiloszacharázaktivitás kifejezésére E. co//'-sejteket transzformáltunk a pNB2 vektorral standard technikák szerint. YT tápoldatot (100 pg/ml ampicillin) oltottunk be a transzformált törzs telepével. A sejteket egy éjszakán keresztül 37 °C-on inkubáltuk állandó keverés mellett (rotációs mixer; 150-200 rpm). Ezután a sejteket centrifugálással (30 perc, 4 °C, 5500 rpm, JA10 Beckmann-rotor) eltávolítottuk. A felülúszót steril körülmények között 0,2 pm-es szűrőn szűrtük át (Schleicher & Schuell).
Az amiloszacharázaktivitás kimutatását a következők szerint végeztük:
(i) a felülúszót szacharóztartalmú agarlemezen inkubáltuk. A felülúszó 40 pl-ét az agar (5% szacharóz 50 mM nátrium-citrát-pufferben, pH=6,5) kilyukasztásával nyert mélyedésbe helyeztük, és legalább egy órán át 37 °C-on inkubáltuk. Az amiloszacharáz által katalizált reakció termékeit jódgözzel történő színezéssel mutattuk ki. A reakciótermékek jelenléte kék színt eredményez, (ii) vagy a felülúszó fehérjéit gélelektroforézissel szétválasztottuk natív gélen, és a reakciótermékeket szacharózzal történő inkubációt követően kimutattuk a gélben. A felülúszó 40-80 μΙ-ét 8%-os natív poliakrilamid gélen (0,375 M Tris pH=8,8) 100 V feszültségnél gélelektroforézissel szétválasztottuk. A gélt ezután kétszer 15 percig ekvilibráltuk 50 mM nátrium-citrát-puffer (pH=6,5) körülbelül 100 ml-ével, és egy éjszakán keresztül 37 °C-on inkubáltuk nátriumcitrát-puffer, pH=6,5/5% szacharóz keverékében. Annak érdekében, hogy az amiloszacharáz által katalizált reakció termékét láthatóvá tegyük, a gélt leöblítettük Lugol-oldattal. Az amiloszacharázaktivitással rendelkező sávok kékre színeződtek.
4. példa
Glükánok in vitro előállítása részlegesen tisztított amiloszacharázzal
Extracelluláris amiloszacharázaktivitás kifejezésére
£. co//'-sejteket transzformáltunk a pNB2 vektorral standard technikák szerint. YT tápoldatot (100 pg/ml ampicillin) oltottunk be a transzformált törzs telepével. A sejteket egy éjszakán keresztül 37 °C-on inkubáltuk állandó keverés mellett (rotációs mixer; 150-200 rpm). Ezután a sejteket centrifugálással (30 perc, 4 °C, 5500 rpm, JA10 Beckmann-rotor) eltávolítottuk. A felülúszót steril körülmények között 0,2 pm-es szűrőn szűrtük át (Schleicher & Schuell).
A felülúszót ezután 200-szorosára koncentráltuk
Amicon chamber (30 kD kizárási mérettel rendelkező YM30 membrán, Amicon Co.) alkalmazásával nyomás alatt (3 bar). A koncentrált felülúszót 50 ml szacharózoldathoz (5% szacharóz 50 mM nátrium-citrát pufferben pH=6,5) adtuk. A teljes oldatot inkubáltuk 37 °C-on. Fehéres oldhatatlan poliszacharidok képződtek.
5. példa
A 4. példában leírt amiloszacharáz által szintetizált reakciótermékek jellemzése A 4. példában leírt oldhatatlan reakciótermékek 1 M
NaOH-ban oldhatók. A reakciótermékeket az abszorpciós maximum mérésével jellemeztük. Az izolált reak12
HU 226 874 Β1 ciótermékek körülbelül 100 mg-ját (nedves tömeg) oldottuk fel 200 μΙ 1 M NaOH-ban és vízzel 1:10 arányban hígítottuk. Ezen oldat 100 μΙ-éhez 900 μΙ 0,1 M NaOH-t és 1 ml Lugol-oldatot adtunk. Az abszorpciós spektrumot 400 és 700 nm között vettük fel. A maximum 605 nm-nél van (az amilóz abszorpciós maximuma körülbelül 614 nm).
A 4. példában leírt reakcióelegy HPLC analízise CARBOPAC PA1 oszlopon (DIONEX) azt mutatta, hogy az oldhatatlan termékeken felül oldható termékek is keletkeztek. Ezek az oldható termékek rövid szénláncú poliszacharidok. A lánc hosszúsága körülbelül 5 és 60 glükózegység között volt. Kisebb mértékben azonban még rövidebb vagy hosszabb molekulákat is ki lehetett mutatni.
A rendelkezésre álló analitikai módszerekkel nem volt lehetőség elágazások kimutatására a szintézistermékekben.
6. példa
Intracelluláris amiloszacharázaktivitás kifejezése transzformált E. coli-sejtekben Polimeráz-láncreakció (polymerase chain reaction=PCR) alkalmazásával megsokszoroztunk egy olyan fragmentumot a pNB2 plazmidból, amely magában foglalja az 1. számú szekvenciavázlatban ábrázolt szekvencia 981-2871. terjedő nukleotidjait. A következő oligonukleotidokat használtuk primerekként:
TPN2 5’-CTC ACC ATG GGC ATC TTG GAC ATC-3’ (3. számú szekvenciavázlat)
TPC1 5’-CTG CCA TGG TTC AGA CGG CAT TTG G-3’ (4. számú szekvenciavázlat)
Az eredményül kapott fragmentum tartalmazza az amiloszacharáz kódolórégióját, kivéve a 16N terminális aminosavakat kódoló nukleotidokat. Ezek az aminosavak magukban foglalják az enzimnek a sejtből történő kiválasztásához szükséges szekvenciákat. Továbbá ez a PCR fragmentum tartalmazza a 3’ nem transziáit régió 88 bp-ját. A primereken keresztül alkalmazott Ncol restrikciós helyeket vezettünk be a fragmentum mindkét végébe.
Az Ncol restrikciós endonukleázzal történő emésztés után az eredményül kapott fragmentumot ligáltuk az Ncol-gyel emésztett pMex 7 expressziós vektorral. A ligációs termékeket E. co//'-sejtekbe transzformáltuk, és transzformált kiónokat szelektáltunk. A pozitív kiónokat egy éjszakán át 37 °C-on YT lemezeken (1,5% agar; 100 pg/ml ampicillin; 5% szacharóz; 0,2 mM IPTG) inkubáltuk. A lemezeket jódgőznek kitéve nem lehetett kék színeződést megfigyelni a baktériumtelepek környezetében, de az intracelluláris glikogéntermelődést ki lehetett mutatni (a transzformált sejtek barna színeződését a nem transzformált XL1-Blue sejtek színtelenségével ellentétben). A fehérje működőképességének vizsgálata céljából az YT táptalajon szaporított transzformált sejteket ultrahanggal szétroncsoltuk és a kapott durva kivonatot szacharóztartalmú agarlemezekre pipettáztuk. A lemezeket jódgőznek kitéve kék színeződés volt megfigyelhető.
Szekvenciák jegyzéke
Az 1. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 2883 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: ismeretlen (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomiális) (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszenz: nem (vi) Eredeti forrás:
(A) Szervezet: Neisseria polysaccharea (vii) Közvetlen forrás:
(A) Könyvtár: genomiális könyvtár Bluescript II SK-ban (B) Klón: pNB2 (ix) Jellemzők:
(A) Név/kulcs: CDS (B) Elhelyezkedés: 939..2780 (xi) Az 1. számú szekvencia leírása:
GAGTTTTGCG TTCCCGAACC GAACGTGATG CTTGAGCCGA ACACCTGTCG GCAAGCGCTG ACCGCCTTTT GCCCCATCGA CATCGTAACA ATCGGTTTGG TGGCAAGCTC TTTCGCTTTG
120
HU 226 874 Β1
AGCGTGGCAG AAAGCAAAGT CAGCACGTCT TCCGGCCTTT CGGCATCACC GCAATTTTGC AGATGTCCGC GCCGCAGTCC TCCATCTGTT TCAGACGGCA TACGATTTCT TCTTGCGGCG GCGTGCGGTG AAACTCATGA TTGCAGAGCA GGGCGATGCC GTTTTTTTGA GCATGCCACG GCGCCGGAGC GGTTTCGCCG GAAAAAAGCT CGATATCGAT AATGTCGGGC AGGCGGCTTT CAATCAGCGA GTCGAGCAGT TCAAAATAAT AATCGTCCGA ACACGGGAAC GAGCCGCCTT CGCCATGCCG TCTGAACGTA AACAGCAGCG GCTTGTCGGG CAGCGCGTCG CGGACGGTCT GCGTGTGGCG CAATACTTCG CCGATGCTGC CCGCGCATTC CAAAAAATCG GCGCGGAACT CGACGATATC GAAGGGCAGG TTTTTGATTT GGTCAAGTAC GGCGGAAAGT ACGGCGGCAT CGCGGGCGAC AAGCGGCACG GCGATTTTGG TGCGTCCGCT TCCGATAACG GTGTTTTTGA CGGTCAGGGC TGGTGTGCAT GGCGGTTGTT GCGGCTGAAA GGAACGGTAA AGACGCAATT ATAGCAAAGG CACAGGCAAT GTTTCAGACG GCATTTCTGT GCGGCCGGCT TGATATGAAT CAAGCAGCAT CCGCATATCG GAATGCAGAC TTGGCACAAG CCTGTCTTTT CTAGTCAGTC CGCAGTTCTT GCAGTATGAT TGCACGACAC GCCCTACACG GCATTTGCAG GATACGGCGG CAGACCGCGT CGGAAACTTC AGAATCGGAG CAGGCATC ATG TTG ACC CCC ACG
Met Leu Thr Pro Thr 1 5
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
953
| CAG CAA GTC | GGT Gly | TTG ATT | TTA Leu | CAG Gin | TAC Tyr | CTC Leu 15 | AAA Lys | ACA Thr | CGC Arg | ATC Ile | TTG Leu 20 | GAC Asp | |||
| Gin | Gin | Val | Leu 10 | Ile | |||||||||||
| ATC | TAC | ACG | CCC | GAA | CAG | CGC | GCC | GGC | ATC | GAA | AAA | TCC | GAA | GAC | TGG |
| Ile | Tyr | Thr | Pro | Glu | Gin | Arg | Alá | Gly | Ile | Glu | Lys | Ser | Glu | Asp | Trp |
| 25 | 30 | 35 | |||||||||||||
| CGG | CAG | TTT | TCG | CGC | CGC | ATG | GAT | ACG | CAT | TTC | CCC | AAA | CTG | ATG | AAC |
| Arg | Gin | Phe | Ser | Arg | Arg | Met | Asp | Thr | His | Phe | Pro | Lys | Leu | Met | Asn |
| 40 | 45 | 50 | |||||||||||||
| GAA | CTC | GAC | AGC | GTG | TAC | GGC | AAC | AAC | GAA | GCC | CTG | CTG | CCT | ATG | CTG |
| Glu | Leu | Asp | Ser | Val | Tyr | Gly | Asn | Asn | Glu | Alá | Leu | Leu | Pro | Met | Leu |
| 55 | 60 | 65 | |||||||||||||
| GAA | ATG | CTG | CTG | GCG | CAG | GCA | TGG | CAA | AGC | TAT | TCC | CAA | CGC | AAC | TCA |
| Glu | Met | Leu | Leu | Alá | Gin | Alá | Trp | Gin | Ser | Tyr | Ser | Gin | Arg | Asn | Ser |
| 70 | 75 | 80 | 85 | ||||||||||||
| TCC | TTA | AAA | GAT | ATC | GAT | ATC | GCG | CGC | GAA | AAC | AAC | CCC | GAT | TGG | ATT |
| Ser | Leu | Lys | Asp | Ile | Asp | Ile | Alá | Arg | Glu | Asn | Asn | Pro | Asp | Trp | Ile |
| 90 | 95 | 100 | |||||||||||||
| TTG | TCC | AAC | AAA | CAA | GTC | GGC | GGC | GTG | TGC | TAC | GTT | GAT | TTG | TTT | GCC |
| Leu | Ser | Asn | Lys | Gin | Val | Gly | Gly | Val | Cys | Tyr | Val | Asp | Leu | Phe | Alá |
| 105 | 110 | 115 | |||||||||||||
| GGC | GAT | TTG | AAG | GGC | TTG | AAA | GAT | AAA | ATT | CCT | TAT | TTT | CAA | GAG | CTT |
| Gly | Asp | Leu | Lys | Gly | Leu | Lys | Asp | Lys | Ile | Pro | Tyr | Phe | Gin | Glu | Leu |
| 120 | 125 | 130 | |||||||||||||
| GGT | TTG | ACT | TAT | CTG | CAC | CTG | ATG | CCG | CTG | TTT | AAA | TGC | CCT | GAA | GGC |
| Gly | Leu | Thr | Tyr | Leu | His | Leu | Met | Pro | Leu | Phe | Lys | Cys | Pro | Glu | Gly |
| 135 | 140 | 145 | |||||||||||||
| AAA | AGC | GAC | GGC | GGC | TAT | GCG | GTC | AGC | ACG | TAC | CGC | GAT | GTC | AAT | CCG |
| Lys | Ser | Asp | Gly | Gly | Tyr | Alá | Val | Ser | Thr | Tyr | Arg | Asp | Val | Asn | Pro |
| 150 | 155 | 160 | 165 | ||||||||||||
| GCA | CTG | GGC | ACA | ATA | GGC | GAC | TTG | CGC | GAA | GTC | ATT | GCT | GCG | CTG | CAC |
| Alá | Leu | Gly | Thr | Ile | Gly | Asp | Leu | Arg | Glu | Val | Ile | Alá | Alá | Leu | His |
| 170 | 175 | 180 |
1001
1049
1097
1145
1193
1241
1289
1337
1385
1433
1481
HU 226 874 Β1
| GAA Glu | TCG CAT Ser His | TTC Phe 185 | CGC Arg | CGT Arg | CGT Arg | CGA Arg | TTT Phe 190 | TAT Tyr | CTT Leu | CAA CCA | CAC His 195 | CTC Leu | CAA Gin | 1529 | ||
| Gin | Pro | |||||||||||||||
| CGA | ACA | CGA | ATG | GCG | CAA | CGC | TGC | GCC | GGC | GAC | CCG | CTT | TTC | GAC | AAT | 1577 |
| Arg | Thr | Arg | Met | Alá | Gin | Arg | Cys | Alá | Gly | Asp | Pro | Leu | Phe | Asp | Asn | |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||||
| TTC | TAC | TAT | ATT | TTC | CCC | GAC | CGC | CGG | ATG | CCC | GAC | CAA | TAC | GAC | CGC | 1625 |
| Phe | Tyr | Tyr | He | Phe | Pro | Asp | Arg | Arg | Met | Pro | Asp | Gin | Tyr | Asp | Arg | |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||||
| ACC | CTG | CGC | GAA | ATC | TTC | CCC | GAC | CAG | CAC | CCG | GGC | GGC | TTC | TCG | CAA | 1673 |
| Thr | Leu | Arg | Glu | lle | Phe | Pro | Asp | Gin | His | Pro | Gly | Gly | Phe | Ser | Gin | |
| 230 | 235 | 240 | 245 | |||||||||||||
| CTG | GAA | GAC | GGA | CGC | TGG | GTG | TGG | ACG | ACC | TTC | AAT | TCC | TTC | CAA | TGG | 1721 |
| Leu | Glu | Asp | Gly | Arg | Trp | Val | Trp | Thr | Thr | Phe | Asn | Ser | Phe | Gin | Trp | |
| 250 | 255 | 260 | ||||||||||||||
| GAC | TTG | AAT | TAC | AGC | AAC | CCG | TGG | GTA | TTC | GCG | CAA | TGG | CGG | GCG | AAA | 1769 |
| Asp | Leu | Asn | Tyr | Ser | Asn | Pro | Trp | Val | Phe | Alá | Gin | Trp | Arg | Alá | Lys | |
| 265 | 270 | 275 | ||||||||||||||
| TGC | TGT | TCC | TTG | CCA | ACT | TGG | GCG | TTG | ACA | TCC | TGC | GTA | TGG | ATG | CGG | 1817 |
| Cys | Cys | Ser | Leu | Pro | Thr | Trp | Alá | Leu | Thr | Ser | Cys | Val | Trp | Met | Arg | |
| 280 | 285 | 290 | ||||||||||||||
| TTG | CCT | TTA | TTT | GGA | AAC | AAA | TGG | GGA | CAA | GCT | GCG | AAA | ACC | TGC | GCA | 1865 |
| Leu | Pro | Leu | Phe | Gly | Asn | Lys | Trp | Gly | Gin | Alá | Alá | Lys | Thr | Cys | Alá | |
| 295 | 300 | 305 | ||||||||||||||
| GCG | CAC | GCC | CTC | ATC | CGC | GCG | TTC | AAT | GCC | GTT | ATG | CGT | ATT | GCC | GCG | 1913 |
| Alá | His | Alá | Leu | He | Arg | Alá | Phe | Asn | Alá | Val | Met | Arg | He | Alá | Alá | |
| 310 | 315 | 320 | 325 | |||||||||||||
| CCC | GCC | GTG | TTC | TTC | AAA | TCC | GAA | GCC | ATC | GTC | CAC | CCC | GAC | CAA | GTC | 1961 |
| Pro | Alá | Val | Phe | Phe | Lys | Ser | Glu | Alá | lle | Val | His | Pro | Asp | Gin | Val | |
| 330 | 335 | 340 | ||||||||||||||
| GTC | CAA | TAC | ATC | GGG | CAG | GAC | GAA | TGC | CAA | ATC | GGT | TAC | AAC | CCC | CTG | 2009 |
| Val | Gin | Tyr | lle | Gly | Gin | Asp | Glu | Cys | Gin | He | Gly | Tyr | Asn | Pro | Leu | |
| 345 | 350 | 355 | ||||||||||||||
| CAA | ATG | GCA | TTG | TTG | TGG | AAC | ACC | CTT | GCC | ACG | CGC | GAA | GTC | AAC | CTG | 2057 |
| Gin | Met | Alá | Leu | Leu | Trp | Asn | Thr | Leu | Alá | Thr | Arg | Glu | Val | Asn | Leu | |
| 360 | 365 | 370 | ||||||||||||||
| CTC | CAT | CAG | GCG | CTG | ACC | TAC | CGC | CAC | AAC | CTG | CCC | GAG | CAT | ACC | GCC | 2105 |
| Leu | His | Gin | Alá | Leu | Thr | Tyr | Arg | His | Asn | Leu | Pro | Glu | His | Thr | Alá | |
| 375 | 380 | 385 | ||||||||||||||
| TGG | GTC | AAC | TAC | GTC | CGC | AGC | CAC | GAC | GAC | ATC | GGC | TGG | ACG | TTT | GCC | 2153 |
| Trp | Val | Asn | Tyr | Val | Arg | Ser | His | Asp | Asp | lle | Gly | Trp | Thr | Phe | Alá | |
| 390 | 395 | 400 | 405 | |||||||||||||
| GAT | GAA | GAC | GCG | GCA | TAT | CTG | GGC | ATA | AGC | GGC | TAC | GAC | CAC | CGC | CAA | 2201 |
| Asp | Glu | Asp | Alá | Alá | Tyr | Leu | Gly | He | Ser | Gly | Tyr | Asp | His | Arg | Gin | |
| 410 | 415 | 420 |
HU 226 874 Β1
| TTC Phe | CTC Leu | AAC Asn | CGC Arg 425 | TTC Phe | TTC Phe | GTC AAC | CGT Arg 430 | TTC Phe | GAC Asp | GGC Gly | ACG Thr | TTC Phe 435 | GCT Alá | CGT Arg | 2249 | |
| Val | Asn | |||||||||||||||
| GGC | GTA | CCG | TTC | CAA | TAC | AAC | CCA | AGC | ACA | GGC | GAC | TGC | CGT | GTC | AGT | 2297 |
| Gly | Val | Pro | Phe | Gin | Tyr | Asn | Pro | Ser | Thr | Gly | Asp | Cys | Arg | Val | Ser | |
| 440 | 445 | 450 | ||||||||||||||
| GGT | ACA | GCC | GCG | GCA | TTG | GTC | GGC | TTG | GCG | CAA | GAC | GAT | CCC | CAC | GCC | 2345 |
| Gly | Thr | Alá | Alá | Alá | Leu | Val | Gly | Leu | Alá | Gin | Asp | Asp | Pro | His | Alá | |
| 455 | 460 | 465 | ||||||||||||||
| GTT | GAC | CGC | ATC | AAA | CTC | TTG | TAC | AGC | ATT | GCT | TTG | AGT | ACC | GGC | GGT | 2393 |
| Val | Asp | Arg | Ile | Lys | Leu | Leu | Tyr | Ser | Ile | Alá | Leu | Ser | Thr | Gly | Gly | |
| 470 | 475 | 480 | 485 | |||||||||||||
| CTG | CCG | CTG | ATT | TAC | CTA | GGC | GAC | GAA | GTG | GGT | ACG | CTC | AAT | GAC | GAC | 2441 |
| Leu | Pro | Leu | Ile | Tyr | Leu | Gly | Asp | Glu | Val | Gly | Thr | Leu | Asn | Asp | Asp | |
| 490 | 495 | 500 | ||||||||||||||
| GAC | TGG | TGC | CAA | GCA | GCA | ATA | AGA | GCG | ACG | ACA | GCC | GTT | GGG | CCA | CCG | 2489 |
| Asp | Trp | Cys | Gin | Alá | Alá | Ile | Arg | Alá | Thr | Thr | Alá | Val | Gly | Pro | Pro | |
| 505 | 510 | 515 | ||||||||||||||
| TCC | GCG | CTA | CAA | CGA | AGC | CCT | GTA | CGC | GCA | ACC | GAA | CGA | TCC | GTC | GAC | 2537 |
| Ser | Alá | Leu | Gin | Arg | Ser | Pro | Val | Arg | Alá | Thr | Glu | Arg | Ser | Val | Asp | |
| 520 | 525 | 530 | ||||||||||||||
| CGC | AGC | CGG | CAA | ATC | TAT | CAG | GGC | TTG | CGC | CAT | ATG | ATT | GCC | GTC | CGC | 2585 |
| Arg | Ser | Arg | Gin | Ile | Tyr | Gin | Gly | Leu | Arg | His | Met | Ile | Alá | Val | Arg | |
| 535 | 540 | 545 | ||||||||||||||
| CAA | AGC | AAT | CCG | CGC | TTC | GAC | GGC | GGC | AGG | CTG | GTT | ACA | TTC | AAC | ACC | 2633 |
| Gin | Ser | Asn | Pro | Arg | Phe | Asp | Gly | Gly | Arg | Leu | Val | Thr | Phe | Asn | Thr | |
| 550 | 555 | 560 | 565 | |||||||||||||
| AAC | AAC | AAG | CAC | ATC | ATC | GGC | TAC | ATC | GCA | ACA | ATG | CGC | TTT | TGG | CAT | 2681 |
| Asn | Asn | Lys | His | Ile | Ile | Gly | Tyr | Ile | Alá | Thr | Met | Arg | Phe | Trp | His | |
| 570 | 575 | 580 | ||||||||||||||
| TCG | GTA | ACT | TCA | GCG | AAT | ATC | CGC | AAA | CCG | TTA | CCG | CGC | ATA | CCC | TGC | 2729 |
| Ser | Val | Thr | Ser | Alá | Asn | Ile | Arg | Lys | Pro | Leu | Pro | Arg | Ile | Pro | Cys | |
| 585 | 590 | 595 | ||||||||||||||
| AAG | CCA | TGC | CCT | TCA | AGG | CGC | ACG | ACC | TCA | TCG | GTG | GCA | AAA | CTG | TCA | 2777 |
| Lys | Pro | Cys | Pro | Ser | Arg | Arg | Thr | Thr | Ser | Ser | Val | Alá | Lys | Leu | Ser | |
| 600 | 605 | 610 |
GCC TGAATCAGGA TTTGACGCTT CAGCCCTATC AGGTCATGTG GCTCGAAATC 2830
Alá
GCCTGACGCA CGCTTCCCAA ATGCCGTCTG AACCGTTTCA GACGGCATTT GCG 2883
A 2. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 614 aminosav (B) Típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris
HU 226 874 Β1
| (ii | ) Mole | ikulatípus: fe | hérje | ||||||||||||
| (X | i) A2. | számú szék' | i/encia | leírás: | a: | ||||||||||
| Met | Leu | Thr | Pro | Thr | Gin | Gin | Val | Gly | Leu | Ile | Leu | Gin | Tyr | Leu | Lys |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Thr | Arg | Ile | Leu | Asp | Ile | Tyr | Thr | Pro | Glu | Gin | Arg | Alá | Gly | Ile | Glu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Lys | Ser | Glu | Asp | Trp | Arg | Gin | Phe | Ser | Arg | Arg | Met | Asp | Thr | His | Phe |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Pro | Lys | Leu | Met | Asn | Glu | Leu | Asp | Ser | Val | Tyr | Gly | Asn | Asn | Glu | Alá |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Leu | Leu | Pro | Met | Leu | Glu | Met | Leu | Leu | Alá | Gin | Alá | Trp | Gin | Ser | Tyr |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Ser | Gin | Arg | Asn | Ser | Ser | Leu | Lys | Asp | Ile | Asp | Ile | Alá | Arg | Glu | Asn |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Asn | Pro | Asp | Trp | Ile | Leu | Ser | Asn | Lys | Gin | Val | Gly | Gly | Val | Cys | Tyr |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Val | Asp | Leu | Phe | Alá | Gly | Asp | Leu | Lys | Gly | Leu | Lys | Asp | Lys | Ile | Pro |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Tyr | Phe | Gin | Glu | Leu | Gly | Leu | Thr | Tyr | Leu | His | Leu | Met | Pro | Leu | Phe |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Lys | Cys | Pro | Glu | Gly | Lys | Ser | Asp | Gly | Gly | Tyr | Alá | Val | Ser | Thr | Tyr |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Arg | Asp | Val | Asn | Pro | Alá | Leu | Gly | Thr | Ile | Gly | Asp | Leu | Arg | Glu | Val |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Ile | Alá | Alá | Leu | His | Glu | Ser | His | Phe | Arg | Arg | Arg | Arg | Phe | Tyr | Leu |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Gin | Pro | His | Leu | Gin | Arg | Thr | Arg | Met | Alá | Gin | Arg | Cys | Alá | Gly | Asp |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Pro | Leu | Phe | Asp | Asn | Phe | Tyr | Tyr | Ile | Phe | Pro | Asp | Arg | Arg | Met | Pro |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Asp | Gin | Tyr | Asp | Arg | Thr | Leu | Arg | Glu | Ile | Phe | Pro | Asp | Gin | His | Pro |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Gly | Gly | Phe | Ser | Gin | Leu | Glu | Asp | Gly | Arg | Trp | Val | Trp | Thr | Thr | Phe |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Asn | Ser | Phe | Gin | Trp | Asp | Leu | Asn | Tyr | Ser | Asn | Pro | Trp | Val | Phe | Alá |
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| Gin | Trp | Arg | Alá | Lys | Cys | Cys | Ser | Leu | Pro | Thr | Trp | Alá | Leu | Thr | Ser |
| 275 | 280 | 285 | |||||||||||||
| Cys | Val | Trp | Met | Arg | Leu | Pro | Leu | Phe | Gly | Asn | Lys | Trp | Gly | Gin | Alá |
| 290 | 295 | 300 |
HU 226 874 Β1
Alá Lys Thr Cys Alá Alá His Alá Leu Lle Arg Alá Phe Asn Alá Val
305 310 315 320
Met Arg Ile Alá Alá Pro Alá Val Phe Phe Lys Ser Glu Alá Ile Val
325 330 335
His Pro Asp Gin Val Val Gin Tyr Ile Gly Gin Asp Glu Cys Gin Ile 340 345 350
Gly Tyr Asn Pro Leu Gin Met Alá Leu Leu Trp Asn Thr Leu Alá Thr 355 360 365
Arg Glu Val Asn Leu Leu His Gin Alá Leu Thr Tyr Arg His Asn Leu 370 375 380
Pro Glu His Thr Alá Trp Val Asn Tyr Val Arg Ser His Asp Asp Ile
385 390 395 400
Gly Trp Thr Phe Alá Asp Glu Asp Alá Alá Tyr Leu Gly Ile Ser Gly
405 410 415
Tyr Asp His Arg Gin Phe Leu Asn Arg Phe Phe Val Asn Arg Phe Asp 420 425 430
Gly Thr Phe Alá Arg Gly Val Pro Phe Gin Tyr Asn Pro Ser Thr Gly 435 440 445
Asp Cys Arg Val Ser Gly Thr Alá Alá Alá Leu Val Gly Leu Alá Gin 450 455 460
Asp Asp Pro His Alá Val Asp Arg Ile Lys Leu Leu Tyr Ser Lle Alá
465 470 475 480
Leu Ser Thr Gly Gly Leu Pro Leu Lle Tyr Leu Gly Asp Glu Val Gly
485 490 495
Thr Leu Asn Asp Asp Asp Trp Cys Gin Alá Alá Ile Arg Alá Thr Thr 500 505 510
Alá Val Gly Pro Pro Ser Alá Leu Gin Arg Ser Pro Val Arg Alá Thr 515 520 525
Glu Arg Ser Val Asp Arg Ser Arg Gin Ile Tyr Gin Gly Leu Arg His 530 535 540
Met Ile Alá Val Arg Gin Ser Asn Pro Arg Phe Asp Gly Gly Arg Leu
545 550 555 560
Val Thr Phe Asn Thr Asn Asn Lys His Ile Ile Gly Tyr Ile Alá Thr
565 570 575
Met Arg Phe Trp His Ser Val Thr Ser Alá Asn Ile Arg Lys Pro Leu 580 585 590
Pro Arg Lle Pro Cys Lys Pro Cys Pro Ser Arg Arg Thr Thr Ser Ser 595 600 605
Val Alá Lys Leu Ser Alá 610
HU 226 874 Β1
A 3. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 24 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: más nukleinsav (A) Leírás: /desc=,,oligonukleotid” (vi) Eredeti forrás:
(A) Szervezet: Neisseria polysaccharea (xi) A 3. számú szekvencia leírása:
CTCACCATGG GCATCTTGGA CATC
A 4. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 25 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: egyszálú (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: más nukleinsav (A) Leírás: /desc=,,oligonukleotid” (vi) Eredeti forrás:
(A) Szervezet: Neisseria polysaccharea (xi) A4. számú szekvencia leírása:
CTGCCATGGT TCAGACGGCA TTTGG
Az 5. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 636 aminosav (B) Típusa: aminosav (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: fehérje (xi) Az 5. számú szekvencia leírása:
| Met 1 | Leu | Thr | Pro | Thr 5 | Gin | Gin | Val | Gly | Leu 10 | Ile | Leu | Gin | Tyr | Leu 15 | Lys |
| Thr | Arg | Ile | Leu | Asp | Ile | Tyr | Thr | Pro | Glu | Gin | Arg | Alá | Gly | Ile | Glu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Lys | Ser | Glu | Asp | Trp | Arg | Gin | Phe | Ser | Arg | Arg | Met | Asp | Thr | His | Phe |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Pro | Lys | Leu | Met | Asn | Glu | Leu | Asp | Ser | Val | Tyr | Gly | Asn | Asn | Glu | Alá |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Leu | Leu | Pro | Met | Leu | Glu | Met | Leu | Leu | Alá | Gin | Alá | Trp | Gin | Ser | Tyr |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
HU 226 874 Β1
Ser Gin Arg Asn Ser Ser Leu Lys Asp Ile Asp Ile Alá Arg Glu Asn 85 90 95
Asn Pro Asp Trp Ile Leu Ser Asn Lys Gin Val Gly Gly Val Cys Tyr 100 105 110
Val Asp Leu Phe Alá Gly Asp Leu Lys Gly Leu Lys Asp Lys Ile Pro 115 120 125
Tyr Phe Gin Glu Leu Gly Leu Thr Tyr Leu His Leu Met Pro Leu Phe 130 135 140
Lys Cys Pro Glu Gly Lys Ser Asp Gly Gly Tyr Alá Val Ser Ser Tyr
145 150 155 160
Arg Asp Val Asn Pro Alá Leu Gly Thr Ile Gly Asp Leu Arg Glu Val
165 170 175
Ile Alá Alá Leu His Glu Alá Gly Ile Ser Alá Val Val Asp Phe Ile 180 185 190
Phe Asn His Thr Ser Asn Glu His Glu Trp Alá Gin Arg Cys Alá Alá 195 200 205
Gly Asp Pro Leu Phe Asp Asn Phe Tyr Tyr Ile Phe Pro Asp Arg Arg 210 215 220
Met Pro Asp Gin Tyr Asp Arg Thr Leu Arg Glu Ile Phe Pro Asp Gin
225 230 235 240
His Pro Gly Gly Phe Ser Gin Leu Glu Asp Gly Arg Trp Val Trp Thr
245 250 255
Thr Phe Asn Ser Phe Gin Trp Asp Leu Asn Tyr Ser Asn Pro Trp Val 260 265 270
Phe Arg Alá Met Alá Gly Glu Met Leu Phe Leu Alá Asn Leu Gly Val 275 280 285
Asp Ile Leu Arg Met Asp Alá Val Alá Phe Ile Trp Lys Gin Met Gly 290 295 300
Thr Ser Cys Glu Asn Leu Pro Gin Alá His Alá Leu Ile Arg Alá Phe
305 310 315 320
Asn Alá Val Met Arg Ile Alá Alá Pro Alá Val Phe Phe Lys Ser Glu
325 330 335
Alá Ile Val His Pro Asp Gin Val Val Gin Tyr Ile Gly Gin Asp Glu 340 345 350
Cys Gin Ile Gly Tyr Asn Pro Leu Gin Met Alá Leu Leu Trp Asn Thr 355 360 365
Leu Alá Thr Arg Glu Val Asn Leu Leu His Gin Alá Leu Thr Tyr Arg 370 375 380
His Asn Leu Pro Glu His Thr Alá Trp Val Asn Tyr Val Arg Ser His 385 390 395 400
HU 226 874 Β1
| Asp Asp | Ile | Gly | Trp 405 | Thr | Phe | Alá | Asp | Glu 410 | Asp Alá Alá | Tyr | Leu 415 | Gly | |||
| Ile | Ser | Gly | Tyr | Asp | His | Arg | Gin | Phe | Leu | Asn | Arg | Phe | Phe | Val | Asn |
| 420 | 425 | 430 | |||||||||||||
| Arg | Phe | Asp | Gly | Ser | Phe | Alá | Arg | Gly | Val | Pro | Phe | Gin | Tyr | Asn | Pro |
| 435 | 440 | 445 | |||||||||||||
| Ser | Thr | Gly | Asp | Cys | Arg | Val | Ser | Gly | Thr | Alá | Alá | Alá | Leu | Val | Gly |
| 450 | 455 | 460 | |||||||||||||
| Leu | Alá | Gin | Asp | Asp | Pro | His | Alá | Val | Asp | Arg | Ile | Lys | Leu | Leu | Tyr |
| 465 | 470 | 475 | 480 | ||||||||||||
| Ser | Ile | Alá | Leu | Ser | Thr | Gly | Gly | Leu | Pro | Leu | Ile | Tyr | Leu | Gly | Asp |
| 485 | 490 | 495 | |||||||||||||
| Glu | Val | Gly | Thr | Leu | Asn | Asp | Asp | Asp | Trp | Ser | Gin | Asp | Ser | Asn | Lys |
| 500 | 505 | 510 | |||||||||||||
| Ser | Asp | Asp | Ser | Arg | Trp | Alá | His | Arg | Pro | Arg | Tyr | Asn | Glu | Alá | Leu |
| 515 | 520 | 525 | |||||||||||||
| Tyr | Alá | Gin | Arg | Asn | Asp | Pro | Ser | Thr | Alá | Alá | Gly | Gin | Ile | Tyr | Gin |
| 530 | 535 | 540 | |||||||||||||
| Gly | Leu | Arg | His | Met | Ile | Alá | Val | Arg | Gin | Ser | Asn | Pro | Arg | Phe | Asp |
| 545 | 550 | 555 | 560 | ||||||||||||
| Gly | Gly | Arg | Leu | Val | Thr | Phe | Asn | Thr | Asn | Asn | Lys | His | Ile | Ile | Gly |
| 565 | 570 | 575 | |||||||||||||
| Tyr | Ile | Arg | Asn | Asn | Alá | Leu | Leu | Alá | Phe | Gly | Asn | Phe | Ser | Glu | Tyr |
| 580 | 585 | 590 | |||||||||||||
| Pro | Gin | Thr | Val | Thr | Alá | His | Thr | Leu | Gin | Alá | Met | Pro | Phe | Lys | Alá |
| 595 | 600 | 605 | |||||||||||||
| His | Asp | Leu | Ile | Gly | Gly | Lys | Thr | Val | Ser | Leu | Asn | Gin | Asp | Leu | Thr |
| 610 | 615 | 620 | |||||||||||||
| Leu | Gin | Pro | Tyr | Gin | Val | Met | Trp | Leu | Glu | Ile | Alá | * |
625 630 635
A 6. számú szekvencia adatai:
(i) A szekvencia jellemzői:
(A) Hossza: 2914 bázispár (B) Típusa: nukleinsav (C) Szálasság: ismeretlen (D) Topológia: lineáris (ii) Molekulatípus: DNS (genomiális) (iii) Hipotetikus: nem (iv) Antiszensz: nem (vi) Eredeti forrás:
(A) Szervezet: Neisseria polysaccharea
HU 226 874 Β1 (vii) Közvetlen forrás:
(A) Könyvtár: genomiális könyvtár Bluescript II SK-ban (B) Klón: pNB2 (xi) A 6. számú szekvencia leírása:
GAGTTTTGCG
CTGACCGCCC
GCTTTGAGCG
ATTTTGCAGA
TGCGGCGGCG
GCATGCGCCA
TCGGGCAGGC
GGGAACGAGC
GCGTCGCGGA
AAATCGGCGC
GAAAGTACGG
ATAACGGTGT
GGTAAAGACG
CGGCTTGATA
TCTTTTCTAG
TTGCAGGATA
TTCCCGAACC
CCTTTTGCCC
TGGCAGAAAG
TGTCCGCGCC
TGCGGTGAAA
CGGCGCGCCG
GGCTTTCAAT
CGCCTTCGCC
CGGTCTGCGT
GGAACTCGAC
CGGCATCGCG
TTTTGACGGT
CAATTATAGC
TGAATCAAGC
TCAGTCCGCA
CGGCGGCAGA
GAACGTGATG
CATCGACATC
CAAAGTCAGC
GCAGTCCTCC
CTCATGATTG
GACGGCGGTT
CAGCGAGTCG
ATGCCGTCTG
GTGGCGCAAT
GATATCGAAG
GGCGACAAGC
CAGGCTGGTG
AAAGGCACAG
AGCATCCGCA
GTTCTTGCAG
CCGCCGGTCG
CTTGAGCCGA
GTAACAATCG
ACGTCTTCCG
ATCTGTTTCA
CAGAGCAGGG
TCGCCGGAAA
AGCAGTTCAA
AACGTAAACA
ACTTCGCCGA
GGCAGGTTTT
GGCACGGCGA
TGCATGGCGG
GCAATGTTTC
TATCGGAATG
TATGATTGCA
GAAACTTCAG
ACACCTGTCC
GTTTGGTGGC
CGCTTTGCGG
GACGGCATAC
CGGCGATGCC
AAAGCTCGAT
AATAATAATC
GCAGCGGCTT
TGCTGCCCGC
TGATTTGGTC
TTTTGGTGCG
TTGTTGCGGC
AGACGGCATT
CAGACTTGGC
CGACACGCCC
AATCGGAGCA
GGCAAGGCGG
AAGCTCTTTC
CATCACCGCA
GATTTCTTCT
GTTTTTTTGA
ATCGATAATG
GTCCGAACAC
GTCGGGCAGC
GCATTCCAAA
AAGTACGGCG
TCCGCTTCCG
TGAAAGGAAC
TCTGTGCGGC
ACAAGCCCTG
TACACGGCAT
GGCATC
| ATG | TTG | ACC | CCC | ACG | CAG | CAA | GTC | GGT | TTG | ATT | TTA | CAG | TAC | CTC | AAA |
| Met 1 | Leu | Thr | Pro | Thr 5 | Gin | Gin | Val | Gly | Leu 10 | Lle | Leu | Gin | Tyr | Leu 15 | Lys |
| ACA | CGC | ATC | TTG | GAC | ATC | TAC | ACG | CCC | GAA | CAG | CGC | GCC | GGC | ATC | GAA |
| Thr | Arg | Ile | Leu 20 | Asp | Ile | Tyr | Thr | Pro 25 | Glu | Gin | Arg | Alá | Gly 30 | Ile | Glu |
| AAA | TCC | GAA | GAC | TGG | CGG | CAG | TTT | TCG | CGC | CGC | ATG | GAT | ACG | CAT | TTC |
| Lys | Ser | Glu 35 | Asp | Trp | Arg | Gin | Phe 40 | Ser | Arg | Arg | Met | Asp 45 | Thr | His | Phe |
| CCC | AAA | CTG | ATG | AAC | GAA | CTC | GAC | AGC | GTG | TAC | GGC | AAC | AAC | GAA | GCC |
| Pro | Lys 50 | Leu | Met | Asn | Glu | Leu 55 | Asp | Ser | Val | Tyr | Gly 60 | Asn | Asn | Glu | Alá |
| CTG | CTG | CCT | ATG | CTG | GAA | ATG | CTG | CTG | GCG | CAG | GCA | TGG | CAA | AGC | TAT |
| Leu 65 | Leu | Pro | Met | Leu | Glu 70 | Met | Leu | Leu | Alá | Gin 75 | Alá | Trp | Gin | Ser | Tyr 80 |
| TCC | CAA | CGC | AAC | TCA | TCC | TTA | AAA | GAT | ATC | GAT | ATC | GCG | CGC | GAA | AAC |
| Ser | Gin | Arg | Asn | Ser 85 | Ser | Leu | Lys | Asp | Ile 90 | Asp | Ile | Alá | Arg | Glu 95 | Asn |
| AAC | CCC | GAT | TGG | ATT | TTG | TCC | AAC | AAA | CAA | GTC | GGC | GGC | GTG | TGC | TAC |
| Asn | Pro | Asp | Trp 100 | Lle | Leu | Ser | Asn | Lys 105 | Gin | Val | Gly | Gly | Val 110 | Cys | Tyr |
| GTT | GAT | TTG | TTT | GCC | GGC | GAT | TTG | AAG | GGC | TTG | AAA | GAT | AAA | ATT | CCT |
| Val | Asp | Leu 115 | Phe | Alá | Gly | Asp | Leu 120 | Lys | Gly | Leu | Lys | Asp 125 | Lys | Ile | Pro |
| TAT | TTT | CAA | GAG | CTT | GGT | TTG | ACT | TAT | CTG | CAC | CTG | ATG | CCG | CTG | TTT |
| Tyr | Phe 130 | Gin | Glu | Leu | Gly | Leu 135 | Thr | Tyr | Leu | His | Leu 140 | Met | Pro | Leu | Phe |
120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 95 6 1004
1052
1100
1148
1196
1244
1292
1340
1388
HU 226 874 Β1
| AAA Lys 145 | TGC Cys | CCT Pro | GAA Glu | GGC AAA AGC | GAC Asp | GGC Gly | GGC Gly | TAT Tyr 155 | GCG Alá | GTC AGC AGC | TAC Tyr 160 | 1436 | ||||
| Gly | Lys 150 | Ser | Val | Ser | Ser | |||||||||||
| CGC | GAT | GTC | AAT | CCG | GCA | CTG | GGC | ACA | ATA | GGC | GAC | TTG | CGC | GAA | GTC | 1484 |
| Arg | Asp | Val | Asn | Pro | Alá | Leu | Gly | Thr | Ile | Gly | Asp | Leu | Arg | Glu | Val | |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||||
| ATT | GCT | GCG | CTG | CAC | GAA | GCC | GGC | ATT | TCC | GCC | GTC | GTC | GAT | TTT | ATC | 1532 |
| Ile | Alá | Alá | Leu | His | Glu | Alá | Gly | Ile | Ser | Alá | Val | Val | Asp | Phe | Ile | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| TTC | AAC | CAC | ACC | TCC | AAC | GAA | CAC | GAA | TGG | GCG | CAA | CGC | TGC | GCC | GCC | 1580 |
| Phe | Asn | His | Thr | Ser | Asn | Glu | His | Glu | Trp | Alá | Gin | Arg | Cys | Alá | Alá | |
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| GGC | GAC | CCG | CTT | TTC | GAC | AAT | TTC | TAC | TAT | ATT | TTC | CCC | GAC | CGC | CGG | 1628 |
| Gly | Asp | Pro | Leu | Phe | Asp | Asn | Phe | Tyr | Tyr | Ile | Phe | Pro | Asp | Arg | Arg | |
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
| ATG | CCC | GAC | CAA | TAC | GAC | CGC | ACC | CTG | CGC | GAA | ATC | TTC | CCC | GAC | CAG | 1676 |
| Met | Pro | Asp | Gin | Tyr | Asp | Arg | Thr | Leu | Arg | Glu | Ile | Phe | Pro | Asp | Gin | |
| 225 | 230 | 235 | 240 | |||||||||||||
| CAC | CCG | GGC | GGC | TTC | TCG | CAA | CTG | GAA | GAC | GGA | CGC | TGG | GTG | TGG | ACG | 1724 |
| His | Pro | Gly | Gly | Phe | Ser | Gin | Leu | Glu | Asp | Gly | Arg | Trp | Val | Trp | Thr | |
| 245 | 250 | 255 | ||||||||||||||
| ACC | TTC | AAT | TCC | TTC | CAA | TGG | GAC | TTG | AAT | TAC | AGC | AAC | CCG | TGG | GTA | 1772 |
| Thr | Phe | Asn | Ser | Phe | Gin | Trp | Asp | Leu | Asn | Tyr | Ser | Asn | Pro | Trp | Val | |
| 260 | 265 | 270 | ||||||||||||||
| TTC | CGC | GCA | ATG | GCG | GGC | GAA | ATG | CTG | TTC | CTT | GCC | AAC | TTG | GGC | GTT | 1820 |
| Phe | Arg | Alá | Met | Alá | Gly | Glu | Met | Leu | Phe | Leu | Alá | Asn | Leu | Gly | Val | |
| 275 | 280 | 285 | ||||||||||||||
| GAC | ATC | CTG | CGT | ATG | GAT | GCG | GTT | GCC | TTT | ATT | TGG | AAA | CAA | ATG | GGG | 1868 |
| Asp | Ile | Leu | Arg | Met | Asp | Alá | Val | Alá | Phe | Ile | Trp | Lys | Gin | Met | Gly | |
| 290 | 295 | 300 | ||||||||||||||
| ACA | AGC | TGC | GAA | AAC | CTG | CCG | CAG | GCG | CAC | GCC | CTC | ATC | CGC | GCG | TTC | 1916 |
| Thr | Ser | Cys | Glu | Asn | Leu | Pro | Gin | Alá | His | Alá | Leu | Ile | Arg | Alá | Phe | |
| 305 | 310 | 315 | 320 | |||||||||||||
| AAT | GCC | GTT | ATG | CGT | ATT | GCC | GCG | CCC | GCC | GTG | TTC | TTC | AAA | TCC | GAA | 1964 |
| Asn | Alá | Val | Met | Arg | Ile | Alá | Alá | Pro | Alá | Val | Phe | Phe | Lys | Ser | Glu | |
| 325 | 330 | 335 | ||||||||||||||
| GCC | ATC | GTC | CAC | CCC | GAC | CAA | GTC | GTC | CAA | TAC | ATC | GGG | CAG | GAC | GAA | 2012 |
| Alá | Ile | Val | His | Pro | Asp | Gin | Val | Val | Gin | Tyr | Ile | Gly | Gin | Asp | Glu | |
| 340 | 345 | 350 | ||||||||||||||
| TGC | CAA | ATC | GGT | TAC | AAC | CCC | CTG | CAA | ATG | GCA | TTG | TTG | TGG | AAC | ACC | 2060 |
| Cys | Gin | Ile | Gly | Tyr | Asn | Pro | Leu | Gin | Met | Alá | Leu | Leu | Trp | Asn | Thr | |
| 355 | 360 | 365 | ||||||||||||||
| CTT | GCC | ACG | CGC | GAA | GTC | AAC | CTG | CTC | CAT | CAG | GCG | CTG | ACC | TAC | CGC | 2108 |
| Leu | Alá | Thr | Arg | Glu | Val | Asn | Leu | Leu | His | Gin | Alá | Leu | Thr | Tyr | Arg | |
| 370 | 375 | 380 |
HU 226 874 Β1
| CAC AAC | CTG Leu | CCC Pro | GAG Glu | CAT His 390 | ACC Thr | GCC Alá | TGG GTC AAC Trp Val Asn 395 | TAC Tyr | GTC Val | CGC Arg | AGC Ser | CAC His 400 | 2156 | |||
| His 385 | Asn | |||||||||||||||
| GAC | GAC | ATC | GGC | TGG | ACG | TTT | GCC | GAT | GAA | GAC | GCG | GCA | TAT | CTG | GGC | 2204 |
| Asp | Asp | Ile | Gly | Trp | Thr | Phe | Alá | Asp | Glu | Asp | Alá | Alá | Tyr | Leu | Gly | |
| 405 | 410 | 415 | ||||||||||||||
| ATA | AGC | GGC | TAC | GAC | CAC | CGC | CAA | TTC | CTC | AAC | CGC | TTC | TTC | GTC | AAC | 2252 |
| Ile | Ser | Gly | Tyr | Asp | His | Arg | Gin | Phe | Leu | Asn | Arg | Phe | Phe | Val | Asn | |
| 420 | 425 | 430 | ||||||||||||||
| CGT | TTC | GAC | GGC | AGC | TTC | GCT | CGT | GGC | GTA | CCG | TTC | CAA | TAC | AAC | CCA | 2300 |
| Arg | Phe | Asp | Gly | Ser | Phe | Alá | Arg | Gly | Val | Pro | Phe | Gin | Tyr | Asn | Pro | |
| 435 | 440 | 445 | ||||||||||||||
| AGC | ACA | GGC | GAC | TGC | CGT | GTC | AGT | GGT | ACA | GCC | GCG | GCA | TTG | GTC | GGC | 2348 |
| Ser | Thr | Gly | Asp | Cys | Arg | Val | Ser | Gly | Thr | Alá | Alá | Alá | Leu | Val | Gly | |
| 450 | 455 | 4 60 | ||||||||||||||
| TTG | GCG | CAA | GAC | GAT | CCC | CAC | GCC | GTT | GAC | CGC | ATC | AAA | CTC | TTG | TAC | 2396 |
| Leu | Alá | Gin | Asp | Asp | Pro | His | Alá | Val | Asp | Arg | Ile | Lys | Leu | Leu | Tyr | |
| 465 | 470 | 475 | 480 | |||||||||||||
| AGC | ATT | GCT | TTG | AGT | ACC | GGC | GGT | CTG | CCG | CTG | ATT | TAC | CTA | GGC | GAC | 2444 |
| Ser | Ile | Alá | Leu | Ser | Thr | Gly | Gly | Leu | Pro | Leu | Ile | Tyr | Leu | Gly | Asp | |
| 485 | 490 | 495 | ||||||||||||||
| GAA | GTG | GGT | ACG | CTC | AAT | GAC | GAC | GAC | TGG | TCG | CAA | GAC | AGC | AAT | AAG | 2492 |
| Glu | Val | Gly | Thr | Leu | Asn | Asp | Asp | Asp | Trp | Ser | Gin | Asp | Ser | Asn | Lys | |
| 500 | 505 | 510 | ||||||||||||||
| AGC | GAC | GAC | AGC | CGT | TGG | GCG | CAC | CGT | CCG | CGC | TAC | AAC | GAA | GCC | CTG | 2540 |
| Ser | Asp | Asp | Ser | Arg | Trp | Alá | His | Arg | Pro | Arg | Tyr | Asn | Glu | Alá | Leu | |
| 515 | 520 | 525 | ||||||||||||||
| TAC | GCG | CAA | CGC | AAC | GAT | CCG | TCG | ACC | GCA | GCC | GGG | CAA | ATC | TAT | CAG | 2588 |
| Tyr | Alá | Gin | Arg | Asn | Asp | Pro | Ser | Thr | Alá | Alá | Gly | Gin | Ile | Tyr | Gin | |
| 530 | 535 | 540 | ||||||||||||||
| GGC | TTG | CGC | CAT | ATG | ATT | GCC | GTC | CGC | CAA | AGC | AAT | CCG | CGC | TTC | GAC | 2636 |
| Gly | Leu | Arg | His | Met | Ile | Alá | Val | Arg | Gin | Ser | Asn | Pro | Arg | Phe | Asp | |
| 545 | 550 | 555 | 560 | |||||||||||||
| GGC | GGC | AGG | CTG | GTT | ACA | TTC | AAC | ACC | AAC | AAC | AAG | CAC | ATC | ATC | GGC | 2684 |
| Gly | Gly | Arg | Leu | Val | Thr | Phe | Asn | Thr | Asn | Asn | Lys | His | Ile | Ile | Gly | |
| 565 | 570 | 575 | ||||||||||||||
| TAC | ATC | CGC | AAC | AAT | GCG | CTT | TTG | GCA | TTC | GGT | AAC | TTC | AGC | GAA | TAT | 2732 |
| Tyr | Ile | Arg | Asn | Asn | Alá | Leu | Leu | Alá | Phe | Gly | Asn | Phe | Ser | Glu | Tyr | |
| 580 | 585 | 590 | ||||||||||||||
| CCG | CAA | ACC | GTT | ACC | GCG | CAT | ACC | CTG | CAA | GCC | ATG | CCC | TTC | AAG | GCG | 2780 |
| Pro | Gin | Thr | Val | Thr | Alá | His | Thr | Leu | Gin | Alá | Met | Pro | Phe | Lys | Alá | |
| 595 | 600 | 605 | ||||||||||||||
| CAC | GAC | CTC | ATC | GGT | GGC | AAA | ACT | GTC | AGC | CTG | AAT | CAG | GAT | TTG | ACG | 2828 |
| His | Asp | Leu | Ile | Gly | Gly | Lys | Thr | Val | Ser | Leu | Asn | Gin | Asp | Leu | Thr | |
| 610 | 615 | 620 |
HU 226 874 Β1
CTT CAG CCC TAT CAG GTC ATG TGG CTC GAA ATC GCC TGA CGCACGCTTC Leu Gin Pro Tyr Gin Val Met Trp Leu Glu Ile Alá *
625 630 635
2877
CCAAATGCCG TCTGAACCGT TTCAGACGGC ATTTGCG
2914
Claims (34)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező, lineáris a-1,4-glükánok szacharózból való szintézisét katalizáló fehérjét kódoló,a) egy Neisseria polysacchareából származó amiloszacharázt kódoló kódolórégió által kódolt polipep- 15 tid aminosavszekvenciájával rendelkező fehérjét kódoló DNS-szekvenciák, ahogy a pNB2 (DSM 9196) plazmid DNS-inszertumában találhatók;b) egy Neisseria polysacchareából származó amiloszacharázt kódoló kódolórégió nukleotidszekven- 20 ciáját - ahogy az a pNB2 (DSM 9196) plazmid DNS-inszertumában található - tartalmazó DNSszekvencia;c) az a) vagy b) pont szerinti szekvenciák bármelyikével hibridizáló DNS-szekvenciák; 25d) a b) pontban meghatározott DNS-szekvenciával legalább 40%-ban azonos DNS-szekvenciák; ése) az a), b) vagy d) pontokban említett szekvenciákhoz képest a genetikai kód következtében degenerált DNS-szekvenciák által alkotott csoportból vá- 30 lasztható izolált DNS-szekvencia.
- 2. Az 1. igénypont d) pontja szerinti izolált DNSszekvencia, amelyben a szekvenciaazonosság legalább 60%.
- 3. Az 1. igénypont d) pontja szerinti izolált DNS-szek- 35 vencia, amelyben a szekvenciaazonosság legalább 80%.
- 4. Az 1. igénypont d) pontja szerinti izolált DNSszekvencia, amelyben a szekvenciaazonosság legalább 95%.
- 5. Az 1. igénypont c) pontja szerinti izolált DNS- 40 szekvencia, amelynél a hibridizációs körülmények szigorú hibridizációs körülmények.
- 6. Rekombináns DNS-molekula, amely egy 1-5.igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmaz. 45
- 7. A 6. igénypont szerinti rekombináns DNS-molekula, amelyben a lineáris a-1,4-glükánok szacharózból való szintézisét katalizáló amiloszacharáz enzimaktivitásával rendelkező fehérjét kódoló DNS-szekvencia prokarióta vagy eukarióta sejtekben való traszkripciót 50 lehetővé tevő DNS-szekvenciákkal kapcsolódik.
- 8. A DSM 9196 számon letétbe helyezett pNB2 plazmid.
- 9. Mikroorganizmus, amely egy 6-8. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-molekulát tártál- 55 máz.
- 10. Gomba, amely egy 6-8. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-molekulát tartalmaz.
- 11. Eljárás lineáris a-1,4-glükánok szacharózból való szintézisét katalizáló amiloszacharázaktivitással 60 rendelkező fehérje termelésére, azzal jellemezve, hogy egy 9. igénypont szerinti mikroorganizmust vagy egy 10. igénypont szerinti gombát alkalmas táptalajban tenyésztünk, és a fehérjét izoláljuk a tenyészetből.
- 12. Amiloszacharáz enzimaktivitásával rendelkező izolált fehérje, amely katalizálja lineáris a-1,4-glükánok szacharózból való szintézisét, és amelyet egy 1-5. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvencia kódol.
- 13. Eljárás lineáris a-1,4-glükánok szintézisére képes növények előállítására, azzal jellemezve, hogy növényi sejtekbe beviszünk egy 1-5. igénypontok bármelyike szerinti olyan DNS-szekvenciát, amely ezen DNSszekvencia kifejezését biztosító DNS-szekvenciákhoz kacsolódik, és a növényi sejtekből teljes növényeket regenerálunk.
- 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő műveleti lépéseket tartalmazza:a) egy olyan expressziós kazetta előállítása, amely a következő részszekvenciákat tartalmazza:i) egy növényekben aktív és a megfelelő célszövetben vagy célsejtekben RNS képződését biztosító promoter;ii) legalább egy, a 13. igénypontban említett DNSszekvencia, amely egy, a lineáris a-1,4-glükánok szacharózból való szintézisét katalizáló amiloszacharáz enzimaktivitásával rendelkező fehérjét kódol, és a promoterhoz szensz orientációban fuzionált;iii) egy növényekben egy RNS-molekula transzkripciós terminációjához és poliadenilációjához működőképes szignál;b) az expressziós kazetta bevitele növényi sejtekbe; ésc) intakt teljes növények regenerálása a transzformált növényi sejtekből.
- 15. Eljárás lineáris a-1,4-glükánok szintézisére képes mikroorganizmusok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1-5. igénypontok bármelyike szerinti olyan DNS-szekvenciát viszünk be a mikroorganizmusba, amely ott kifejeződik.
- 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő műveleti lépéseket tartalmazza: a) egy olyan expressziós kazetta előállítása, amely a következő részszekvenciákat tartalmazza:i) egy, a kiválasztott mikroorganizmusban aktív és a tőle downstream elhelyezkedő DNS-szekvencia transzkripcióját biztosító promoter;ii) egy, a lineáris a-1,4-glükánok szacharózból való szintézisét katalizáló amiloszacharázt kódoló és a promoterhoz szensz irányban fuzionált DNS-szekvencia;HU 226 874 Β1 iii) egy mikroorganizmusokban működőképes transzkripciós terminációs szignál; ésb) egy megfelelő mikroorganizmus transzformálása az a) lépésben összeállított expressziós kazettával.
- 17. Eljárás lineáris a-1,4-glükánok szintézisére képes gombasejtek előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1-5. igénypontok bármelyike szerinti olyan DNSszekvenciát viszünk be gombasejtekbe, amely ott kifejeződik.
- 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a következő műveleti lépéseket tartalmazza:a) egy olyan expressziós kazetta előállítása, amely a következő részszekvenciákat tartalmazza:i) egy, a kiválasztott gomba sejtjeiben aktív és a tőle downstream elhelyezkedő DNS-szekvencia transzkripcióját biztosító promoter;ii) egy, a lineáris a-1,4-glükánok szacharózból való szintézisét katalizáló amiloszacharázt kódoló és a promoterhoz szensz orientációban fuzionált DNS-szekvencia;iii) egy, az illető gombasejtekben működőképes transzkripciós terminációs szignál; ésb) gombasejtek transzformálása az a) lépésben összeállított expressziós kazettával.
- 19. Növényi sejtek, amelyek egy 1-5. igénypontok bármelyike szerinti DNS-szekvenciát tartalmaznak a DNS-szekvencia növényi sejtekben való kifejeződését lehetővé tevő DNS-szekvenciákkal kombinálva.
- 20. Növény, amely a 19. igénypont szerinti növényi sejteket tartalmaz.
- 21. A 20. igénypont szerinti növény, amely haszonnövény.
- 22. A 20. vagy 21. igénypont szerinti növény, amely kukorica, rizs, búza, árpa, cukorrépa, cukornád, dohány, paradicsom vagy burgonyanövény.
- 23. Eljárás lineáris a-1,4-glükánok előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 9. igénypont szerinti mikroorganizmust vagy egy 10. igénypont szerinti gombát szacharózt tartalmazó táptalajban tenyésztünk, és a termelt glükánokat kinyerjük a tenyészetből.
- 24. Eljárás lineáris a-1,4-glükánok in vitro termelésére, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti fehérjét érintkezésbe hozzuk egy szacharóztartalmú oldattal, és a termelt a-1,4-glükánokat kinyerjük az oldatból.
- 25. Eljárás fruktóz termelésére, azzal jellemezve, hogy a 12. igénypont szerinti fehérjét érintkezésbe hozzuk egy szacharóztartalmú oldattal, és a termelt fruktózt kinyerjük az oldatból.
- 26. A 24. vagy 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immobilizált fehérjét alkalmazunk.
- 27. Eljárás ciklodextrin termelésére, azzal jellemezve, hogy egy szacharóztartalmú oldatot a 12. igénypont szerinti fehérjével és egy ciklodextrin transzglükozilázzal hozunk érintkezésbe, és a termelt ciklodextrint kinyerjük az oldatból.
- 28. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti izolált DNS-szekvencia vagy ebből származtatott szondamolekula alkalmazása amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező, lineáris a-1,4-glükánok szacharózból való szintézisét katalizáló fehérjét kódoló homológ DNSvagy RNS-szekvenciák izolálására.
- 29. A 12. igénypont szerinti fehérje alkalmazása lineáris a-1,4-glükánok előállítására.
- 30. A 12. igénypont szerinti fehérje alkalmazása fruktóz előállítására.
- 31. Eljárás lineáris a-1,4-glükánok előállítására, azzal jellemezve, hogy végrehajtjuk a 13. vagy 14. igénypont szerinti eljárás műveleti lépéseit, továbbá izoláljuk a növényekben szintetizált lineáris a-1,4-glükánokat a növényekből.
- 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, amelyben az expressziós kazetta egy olyan tranzitpeptidet kódoló szekvenciát tartalmaz, amely biztosítja az amiloszacharáz proteinnek a vakuólumba vagy az apoplasztba való transzportját.
- 33. A 31. igénypont szerinti eljárás, amelyben a ii) pontban jelzett DNS-szekvenciából, amely egy, a lineáris a-1,4-glükánok szacharózból való szintézisét katalizáló amiloszacharáz enzimaktivitással rendelkező proteint kódol, hiányzik az apoplasztba való szekretálást biztosító szignálszekvencia.
- 34. A 31. igénypont szerinti eljárás, amelyben az i) pontban meghatározott promoter biztosítja az amiloszacharáz kifejeződését a növény azon szerveiben, amelyek szacharózt tárolnak.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19944417879 DE4417879A1 (de) | 1994-05-18 | 1994-05-18 | DNA-Sequenzen die die Synthese linearer alpha-1,4-Glukane in Pflanzen, Pilzen und Mikroorganismen ermöglichen |
| DE19944447388 DE4447388A1 (de) | 1994-12-22 | 1994-12-22 | DNA-Sequenzen, die die Synthese linearer alpha-1,4-Glukane in Pflanzen, Pilzen und Mikroorganismen ermöglichen |
| PCT/EP1995/001893 WO1995031553A1 (en) | 1994-05-18 | 1995-05-18 | DNA SEQUENCES CODING FOR ENZYMES CAPABLE OF FACILITATING THE SYNTHESIS OF LINEAR α-1,4 GLUCANS IN PLANTS, FUNGI AND MICROORGANISMS |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9603170D0 HU9603170D0 (en) | 1997-01-28 |
| HUT76087A HUT76087A (en) | 1997-06-30 |
| HU226874B1 true HU226874B1 (en) | 2010-01-28 |
Family
ID=25936786
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9603170A HU226874B1 (en) | 1994-05-18 | 1995-05-18 | Dna sequences coding for enzymes capable of facilitating the synthesis of linear alfa-1,4 glucans in plants, fungi and microorganisms |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6265635B1 (hu) |
| EP (1) | EP0759993B1 (hu) |
| JP (2) | JP3555086B2 (hu) |
| KR (1) | KR100352532B1 (hu) |
| AT (1) | ATE368118T1 (hu) |
| AU (1) | AU699552B2 (hu) |
| CA (1) | CA2190149C (hu) |
| DE (1) | DE69535543T2 (hu) |
| DK (1) | DK0759993T3 (hu) |
| ES (1) | ES2287935T3 (hu) |
| HU (1) | HU226874B1 (hu) |
| IL (1) | IL113776A (hu) |
| PT (1) | PT759993E (hu) |
| RU (1) | RU2201963C2 (hu) |
| WO (1) | WO1995031553A1 (hu) |
Families Citing this family (225)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19729273C2 (de) * | 1997-07-09 | 2000-08-17 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Thermoplastische Mischung auf 1,4-alpha-D-Polyglucanbasis, Verfahren zu deren Herstellung und Verwendung |
| DE19737481A1 (de) * | 1997-08-28 | 1999-03-04 | Hoechst Ag | Sphärische lineare Polysaccharide enthaltende Mikropartikel |
| DE19827978C2 (de) * | 1998-06-24 | 2000-11-30 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Verfahren zur Herstellung wasserunlöslicher alpha-1,4 Glucane |
| DE19830618A1 (de) * | 1998-07-09 | 2000-01-13 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | alpha-Amylase resistente Polysaccharide, Herstellungsverfahren, Verwendung und Lebensmittel mit diesen Polysacchariden |
| WO2000014249A1 (en) * | 1998-09-02 | 2000-03-16 | Planttec Biotechnologie Gmbh | Nucleic acid molecules encoding an amylosucrase |
| DE59913391D1 (de) * | 1998-10-09 | 2006-06-08 | Suedzucker Ag | Herstellung von polyglucanen durch amylosucrase in gegenwart einer transferase |
| DE19846635A1 (de) * | 1998-10-09 | 2000-05-11 | Planttec Biotechnologie Gmbh | Verfahren zur Herstellung von alpha-1,6-verzweigten alpha-1,4-Glucanen sowie Nucleinsäuremoleküle codierend ein Verzweigungsenzym aus Bakterien der Gattung Neisseria |
| KR20010099681A (ko) * | 1998-10-09 | 2001-11-09 | 추후제출 | 나이세리아속 세균에서 가지화 효소를 코딩하는 핵산분자및 α-1,6-가지화 α-1,4-글루칸을 제조하는 방법 |
| DE19924342A1 (de) * | 1999-05-27 | 2000-11-30 | Planttec Biotechnologie Gmbh | Genetisch modifizierte Pflanzenzellen und Pflanzen mit erhöhter Aktivität eines Amylosucraseproteins und eines Verzweigungsenzyms |
| DE19847593A1 (de) * | 1998-10-15 | 2000-04-20 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Zusammensetzung für die parenterale Applikation von Wirkstoffen |
| DE19852826A1 (de) * | 1998-11-17 | 2000-05-18 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Poly(alpha-1,4-D-Glucan) |
| DE19857654A1 (de) | 1998-12-14 | 2000-06-15 | Max Planck Gesellschaft | Beeinflussung des Blühverhaltens von Pflanzen durch Expression Saccharose-spaltender Proteine |
| DE19860371A1 (de) | 1998-12-28 | 2000-06-29 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Kosmetische oder medizinische Zubereitung für die topische Anwendung |
| DE19860366A1 (de) * | 1998-12-28 | 2000-06-29 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Kosmetische oder medizinische Zubereitung für die topische Anwendung |
| DE19860374A1 (de) * | 1998-12-28 | 2000-07-06 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Verwendung von resistenter Stärke als Mehlersatzstoff für Nahrungsmittel und Nahrungsmittelinhaltsstoffe |
| DE19860375A1 (de) * | 1998-12-28 | 2000-07-06 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Alpha Amylase-resistente Stärke zur Herstellung von Nahrungs- und Arzneimittel |
| DE19860367A1 (de) * | 1998-12-28 | 2000-08-03 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Mundpflegemittel enthaltend ein lineares wasserunlösliches Poly-alpha-glucan |
| DE19860376A1 (de) * | 1998-12-28 | 2000-07-06 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Alpha-1,4 Glucanketten enthaltende Polysaccharide sowie Verfahren zu ihrer Herstellung |
| DE19902917C2 (de) * | 1999-01-26 | 2001-03-29 | Aventis Res & Tech Gmbh & Co | Wasserunlösliche lineare Polysaccharide zur Filtration |
| DE19948408A1 (de) * | 1999-10-07 | 2001-05-03 | Axiva Gmbh | Neue immobilisierbare Amylosucrase und dessen Verwendung sowie Verfahren zur Herstellung von Poly(1,4-alpha-glucan) |
| JP2004518777A (ja) * | 2000-11-30 | 2004-06-24 | チェラネーゼ ベンツレス ゲーエムベーハー | 生化学触媒反応により製造される、直鎖状、水不溶性、ポリサッカライド及び脂肪酸またはその誘導体からなる分子包接化合物 |
| ATE396744T1 (de) * | 2001-10-23 | 2008-06-15 | Innogel Ag | Netzwerk auf polysaccharidbasis und verfahren zu dessen herstellung |
| JP4989855B2 (ja) * | 2005-02-04 | 2012-08-01 | 三和澱粉工業株式会社 | ガラス繊維集束剤およびガラス繊維 |
| EP1897954A1 (en) * | 2006-09-11 | 2008-03-12 | Wageningen Universiteit | Methods and means for producing starch having at least one altered characteristic |
| CL2007003744A1 (es) | 2006-12-22 | 2008-07-11 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende un derivado 2-piridilmetilbenzamida y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos. |
| CL2007003743A1 (es) * | 2006-12-22 | 2008-07-11 | Bayer Cropscience Ag | Composicion que comprende fenamidona y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos. |
| JP2010520899A (ja) | 2007-03-12 | 2010-06-17 | バイエル・クロツプサイエンス・アクチエンゲゼルシヤフト | ジハロフェノキシフェニルアミジン及び殺真菌剤としてのその使用 |
| JP2010520900A (ja) | 2007-03-12 | 2010-06-17 | バイエル・クロツプサイエンス・アクチエンゲゼルシヤフト | フェノキシ置換されたフェニルアミジン誘導体及び殺真菌剤としてのその使用 |
| EP1969934A1 (de) | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience AG | 4-Cycloalkyl-oder 4-arylsubstituierte Phenoxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP1969929A1 (de) | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience AG | Substituierte Phenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP1969931A1 (de) * | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience Aktiengesellschaft | Fluoalkylphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP1969930A1 (de) | 2007-03-12 | 2008-09-17 | Bayer CropScience AG | Phenoxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP2120558B1 (de) * | 2007-03-12 | 2016-02-10 | Bayer Intellectual Property GmbH | 3,4-Disubstituierte Phenoxyphenylamidin-Derivate und deren Verwendung als Fungizide |
| US8168567B2 (en) * | 2007-04-19 | 2012-05-01 | Bayer Cropscience Ag | Thiadiazolyl oxyphenyl amidines and the use thereof as a fungicide |
| WO2008151149A2 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Solazyme, Inc. | Production of oil in microorganisms |
| US8039214B2 (en) * | 2007-06-29 | 2011-10-18 | Cellscript, Inc. | Synthesis of tagged nucleic acids |
| DE102007045920B4 (de) | 2007-09-26 | 2018-07-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Synergistische Wirkstoffkombinationen |
| DE102007045953B4 (de) | 2007-09-26 | 2018-07-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| DE102007045919B4 (de) | 2007-09-26 | 2018-07-05 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| DE102007045922A1 (de) | 2007-09-26 | 2009-04-02 | Bayer Cropscience Ag | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| DE102007045956A1 (de) | 2007-09-26 | 2009-04-09 | Bayer Cropscience Ag | Wirkstoffkombination mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| EP2090168A1 (de) | 2008-02-12 | 2009-08-19 | Bayer CropScience AG | Methode zur Verbesserung des Pflanzenwachstums |
| EP2072506A1 (de) | 2007-12-21 | 2009-06-24 | Bayer CropScience AG | Thiazolyloxyphenylamidine oder Thiadiazolyloxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide |
| EP2168434A1 (de) | 2008-08-02 | 2010-03-31 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Azolen zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress |
| CA2733958A1 (en) | 2008-08-14 | 2010-02-18 | Bayer Cropscience Ag | Insecticidal 4-phenyl-1h-pyrazoles |
| DE102008041695A1 (de) | 2008-08-29 | 2010-03-04 | Bayer Cropscience Ag | Methoden zur Verbesserung des Pflanzenwachstums |
| ES2583639T3 (es) | 2008-11-28 | 2016-09-21 | Terravia Holdings, Inc. | Producción de aceites específicos en microorganismos heterótrofos |
| EP2201838A1 (de) | 2008-12-05 | 2010-06-30 | Bayer CropScience AG | Wirkstoff-Nützlings-Kombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften |
| EP2198709A1 (de) | 2008-12-19 | 2010-06-23 | Bayer CropScience AG | Verfahren zur Bekämpfung resistenter tierischer Schädlinge |
| EP2223602A1 (de) | 2009-02-23 | 2010-09-01 | Bayer CropScience AG | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials genetisch modifizierter Pflanzen |
| EP2204094A1 (en) | 2008-12-29 | 2010-07-07 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants Introduction |
| EP2381781B1 (de) | 2008-12-29 | 2016-06-08 | Bayer Intellectual Property GmbH | Verfahren zur verbesserten nutzung des produktionspotentials genetisch modifizierter pflanzen |
| EP2039771A2 (en) | 2009-01-06 | 2009-03-25 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| EP2039772A2 (en) | 2009-01-06 | 2009-03-25 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants introduction |
| EP2039770A2 (en) | 2009-01-06 | 2009-03-25 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| WO2010081689A2 (en) | 2009-01-19 | 2010-07-22 | Bayer Cropscience Ag | Cyclic diones and their use as insecticides, acaricides and/or fungicides |
| EP2227951A1 (de) | 2009-01-23 | 2010-09-15 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Enaminocarbonylverbindungen zur Bekämpfung von durch Insekten übertragenen Viren |
| CN102300852B (zh) | 2009-01-28 | 2015-04-22 | 拜尔农科股份公司 | 杀真菌剂 n-环烷基-n-双环亚甲基-羧酰胺衍生物 |
| AR075126A1 (es) | 2009-01-29 | 2011-03-09 | Bayer Cropscience Ag | Metodo para el mejor uso del potencial de produccion de plantas transgenicas |
| JP5728735B2 (ja) | 2009-02-17 | 2015-06-03 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | 殺菌性ｎ−（フェニルシクロアルキル）カルボキサミド、ｎ−（ベンジルシクロアルキル）カルボキサミド及びチオカルボキサミド誘導体 |
| EP2218717A1 (en) | 2009-02-17 | 2010-08-18 | Bayer CropScience AG | Fungicidal N-((HET)Arylethyl)thiocarboxamide derivatives |
| TW201031331A (en) | 2009-02-19 | 2010-09-01 | Bayer Cropscience Ag | Pesticide composition comprising a tetrazolyloxime derivative and a fungicide or an insecticide active substance |
| MX2011009916A (es) | 2009-03-25 | 2011-10-06 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de principios activos con propiedades insecticidas y acaricidas. |
| EP2232995A1 (de) | 2009-03-25 | 2010-09-29 | Bayer CropScience AG | Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen |
| AP3073A (en) | 2009-03-25 | 2014-12-31 | Bayer Cropscience Ag | Active ingredient combinations with insecticidal and acaricidal properties |
| UA104887C2 (uk) | 2009-03-25 | 2014-03-25 | Баєр Кропсаєнс Аг | Синергічні комбінації активних речовин |
| WO2010108505A1 (de) | 2009-03-25 | 2010-09-30 | Bayer Cropscience Ag | Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden eigenschaften |
| JP5462354B2 (ja) | 2009-03-25 | 2014-04-02 | バイエル・クロップサイエンス・アーゲー | 殺虫特性及び殺ダニ特性を有する活性成分組合せ |
| EP2239331A1 (en) | 2009-04-07 | 2010-10-13 | Bayer CropScience AG | Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants |
| CN102458125B (zh) | 2009-05-06 | 2015-04-29 | 拜尔农作物科学股份公司 | 环戊二酮化合物及其用作杀昆虫剂、杀螨剂和/或杀菌剂的用途 |
| EP2251331A1 (en) | 2009-05-15 | 2010-11-17 | Bayer CropScience AG | Fungicide pyrazole carboxamides derivatives |
| AR076839A1 (es) | 2009-05-15 | 2011-07-13 | Bayer Cropscience Ag | Derivados fungicidas de pirazol carboxamidas |
| EP2255626A1 (de) | 2009-05-27 | 2010-12-01 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Succinat Dehydrogenase Inhibitoren zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress |
| WO2010139410A2 (de) | 2009-06-02 | 2010-12-09 | Bayer Cropscience Ag | Verwendung von succinat dehydrogenase inhibitoren zur kontrolle von sclerotinia ssp |
| BR112012001080A2 (pt) | 2009-07-16 | 2015-09-01 | Bayer Cropscience Ag | Combinações de substâncias ativas sinérgicas contendo feniltriazóis |
| WO2011015524A2 (en) | 2009-08-03 | 2011-02-10 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide heterocycles derivatives |
| EP2292094A1 (en) | 2009-09-02 | 2011-03-09 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| EP2343280A1 (en) | 2009-12-10 | 2011-07-13 | Bayer CropScience AG | Fungicide quinoline derivatives |
| JP5894928B2 (ja) | 2009-12-28 | 2016-03-30 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | 殺菌剤ヒドロキシモイル−ヘテロ環誘導体 |
| CN102725282B (zh) | 2009-12-28 | 2015-12-16 | 拜尔农科股份公司 | 杀真菌剂肟基-四唑衍生物 |
| CN102724879B (zh) | 2009-12-28 | 2015-10-21 | 拜尔农科股份公司 | 杀真菌剂肟基-四唑衍生物 |
| EP2525658B1 (de) | 2010-01-22 | 2017-03-01 | Bayer Intellectual Property GmbH | Akarizide und/oder insektizide wirkstoffkombinationen |
| AR080443A1 (es) | 2010-03-04 | 2012-04-11 | Bayer Cropscience Ag | 2-amidobencimidazoles sustituidos con fluruoalquilo |
| EP2555619A2 (de) | 2010-04-06 | 2013-02-13 | Bayer Intellectual Property GmbH | Verwendung der 4-phenylbuttersäure und/oder ihrer salze zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen |
| WO2011124553A2 (de) | 2010-04-09 | 2011-10-13 | Bayer Cropscience Ag | Verwendung von derivaten der (1-cyancyclopropyl)phenylphosphinsäure, deren ester und/oder deren salze zur steigerung der toleranz in pflanzen gegenüber abiotischem stress |
| BR112012027558A2 (pt) | 2010-04-28 | 2015-09-15 | Bayer Cropscience Ag | ''composto da fórmula (i), composição fungicida e método para o controle de fungos fitogênicos de colheitas'' |
| WO2011134911A2 (en) | 2010-04-28 | 2011-11-03 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| BR112012027559A2 (pt) | 2010-04-28 | 2015-09-08 | Bayer Cropscience Ag | composto, composição fungicida e método para controlar os fungos fitopatogênicos de culturas |
| JP5996527B2 (ja) | 2010-05-28 | 2016-09-21 | テラヴィア ホールディングス， インコーポレイテッド | 用途に応じた油を含む食品成分 |
| CN102933556B (zh) | 2010-06-03 | 2015-08-26 | 拜尔农科股份公司 | N-[(杂)芳基乙基]吡唑(硫代)羧酰胺及其杂取代的类似物 |
| UA110703C2 (uk) | 2010-06-03 | 2016-02-10 | Байєр Кропсайнс Аг | Фунгіцидні похідні n-[(тризаміщений силіл)метил]-карбоксаміду |
| PL2576517T3 (pl) | 2010-06-03 | 2015-06-30 | Bayer Ip Gmbh | N-[(het)aryloalkilo)]pirazolo(tio)karboksyamidy i ich analogi heteropodstawione |
| US9574201B2 (en) | 2010-06-09 | 2017-02-21 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| US9593317B2 (en) | 2010-06-09 | 2017-03-14 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering |
| EP3181550B1 (en) | 2010-07-20 | 2019-11-20 | Bayer Intellectual Property GmbH | Benzocycloalkenes as antifungal agents |
| WO2012019168A2 (en) | 2010-08-06 | 2012-02-09 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| RU2013114710A (ru) | 2010-09-03 | 2014-10-10 | Байер Интеллектуэль Проперти Гмбх | Замещенные конденсированные пиримидиноны и дигидропиримидиноны |
| EP2460406A1 (en) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Bayer CropScience AG | Use of fluopyram for controlling nematodes in nematode resistant crops |
| EP2618667A2 (en) | 2010-09-22 | 2013-07-31 | Bayer Intellectual Property GmbH | Use of biological or chemical control agents for controlling insects and nematodes in resistant crops |
| CA2821992A1 (en) | 2010-10-01 | 2012-04-05 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| WO2012045798A1 (en) | 2010-10-07 | 2012-04-12 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide composition comprising a tetrazolyloxime derivative and a thiazolylpiperidine derivative |
| WO2012052490A1 (en) | 2010-10-21 | 2012-04-26 | Bayer Cropscience Ag | N-benzyl heterocyclic carboxamides |
| BR112013009590B8 (pt) | 2010-10-21 | 2019-03-19 | Bayer Ip Gmbh | composto, composição fungicida e método |
| UA109460C2 (uk) | 2010-11-02 | 2015-08-25 | Байєр Інтелекчуал Проперті Гмбх | N-гетарилметилпіразолілкарбоксаміди |
| KR101177218B1 (ko) | 2010-11-02 | 2012-08-27 | 세종대학교산학협력단 | 아밀로수크라제를 이용한 투라노즈의 제조방법 및 상기 투라노즈를 이용한 감미료 |
| SG10201509035WA (en) | 2010-11-03 | 2015-12-30 | Solazyme Inc | Microbial Oils With Lowered Pour Points, Dielectric Fluids Produced Therefrom, And Related Methods |
| BR112013012080A2 (pt) | 2010-11-15 | 2016-07-19 | Bayer Ip Gmbh | n-aril pirazol (tio) carboxamidas |
| CN103369962A (zh) | 2010-11-15 | 2013-10-23 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 5-卤代吡唑(硫代)甲酰胺 |
| WO2012065947A1 (en) | 2010-11-15 | 2012-05-24 | Bayer Cropscience Ag | 5-halogenopyrazolecarboxamides |
| CN103281900A (zh) | 2010-12-01 | 2013-09-04 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 氟吡菌酰胺用于防治作物中的线虫以及提高产量的用途 |
| EP2460407A1 (de) | 2010-12-01 | 2012-06-06 | Bayer CropScience AG | Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe |
| EP2658853A1 (en) | 2010-12-29 | 2013-11-06 | Bayer Intellectual Property GmbH | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| EP2474542A1 (en) | 2010-12-29 | 2012-07-11 | Bayer CropScience AG | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| EP2471363A1 (de) | 2010-12-30 | 2012-07-04 | Bayer CropScience AG | Verwendung von Aryl-, Heteroaryl- und Benzylsulfonamidocarbonsäuren, -carbonsäureestern, -carbonsäureamiden und -carbonitrilen oder deren Salze zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen |
| JP6071904B2 (ja) | 2011-02-02 | 2017-02-01 | テラヴィア ホールディングス， インコーポレイテッド | 組み換え油産生微生物から生成される用途に応じた油 |
| EP2494867A1 (de) | 2011-03-01 | 2012-09-05 | Bayer CropScience AG | Halogen-substituierte Verbindungen in Kombination mit Fungiziden |
| EP2683239A1 (en) | 2011-03-10 | 2014-01-15 | Bayer Intellectual Property GmbH | Use of lipochito-oligosaccharide compounds for safeguarding seed safety of treated seeds |
| US20140005230A1 (en) | 2011-03-14 | 2014-01-02 | Juergen Benting | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| DE12722942T1 (de) | 2011-03-31 | 2021-09-30 | Modernatx, Inc. | Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren |
| WO2012136581A1 (en) | 2011-04-08 | 2012-10-11 | Bayer Cropscience Ag | Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives |
| AR090010A1 (es) | 2011-04-15 | 2014-10-15 | Bayer Cropscience Ag | 5-(ciclohex-2-en-1-il)-penta-2,4-dienos y 5-(ciclohex-2-en-1-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas, usos y metodos de tratamiento |
| AR085568A1 (es) | 2011-04-15 | 2013-10-09 | Bayer Cropscience Ag | 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-penta-2,4-dienos y 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas |
| AR085585A1 (es) | 2011-04-15 | 2013-10-09 | Bayer Cropscience Ag | Vinil- y alquinilciclohexanoles sustituidos como principios activos contra estres abiotico de plantas |
| EP2511255A1 (de) | 2011-04-15 | 2012-10-17 | Bayer CropScience AG | Substituierte Prop-2-in-1-ol- und Prop-2-en-1-ol-Derivate |
| EA029682B1 (ru) | 2011-04-22 | 2018-04-30 | Байер Интеллекчуал Проперти Гмбх | Комбинации активных соединений, содержащие производное соединение (тио)карбоксамида и фунгицидное соединение |
| BR112013028621A2 (pt) | 2011-05-06 | 2016-11-29 | Solazyme Inc | "microalgas oleaginosas recombinantes, método para produzir biomassa de microalga ou um produto produzido da biomassa, e método para produzir uma composição lipídica de microalga". |
| WO2012168124A1 (en) | 2011-06-06 | 2012-12-13 | Bayer Cropscience Nv | Methods and means to modify a plant genome at a preselected site |
| CN103957711A (zh) | 2011-07-04 | 2014-07-30 | 拜耳知识产权有限责任公司 | 取代的异喹啉酮、异喹啉二酮、异喹啉三酮和二氢异喹啉酮或其各自的盐作为活性剂对抗植物非生物胁迫的用途 |
| AU2012293636B2 (en) | 2011-08-10 | 2015-12-03 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives |
| JP2014524455A (ja) | 2011-08-22 | 2014-09-22 | バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー | 殺真菌性ヒドロキシモイル−テトラゾール誘導体 |
| CN103890181A (zh) | 2011-08-22 | 2014-06-25 | 拜尔作物科学公司 | 修饰植物基因组的方法和手段 |
| EP2561759A1 (en) | 2011-08-26 | 2013-02-27 | Bayer Cropscience AG | Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth |
| BR112014005262A2 (pt) | 2011-09-09 | 2017-04-04 | Bayer Ip Gmbh | método para aprimorar um vegetal e utilização de um composto de fórmula (i) ou (ii) |
| US9464124B2 (en) | 2011-09-12 | 2016-10-11 | Moderna Therapeutics, Inc. | Engineered nucleic acids and methods of use thereof |
| US9090600B2 (en) | 2011-09-12 | 2015-07-28 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fungicidal 4-substituted-3-{phenyl[(heterocyclylmethoxy)imino]methyl}-1,2,4-oxadizol-5(4H)-one derivatives |
| AR087873A1 (es) | 2011-09-16 | 2014-04-23 | Bayer Ip Gmbh | Uso de fenilpirazolin-3-carboxilatos para mejorar el rendimiento de las plantas |
| EP2755484A1 (en) | 2011-09-16 | 2014-07-23 | Bayer Intellectual Property GmbH | Use of 5-phenyl- or 5-benzyl-2 isoxazoline-3 carboxylates for improving plant yield |
| UA115971C2 (uk) | 2011-09-16 | 2018-01-25 | Байєр Інтеллектуал Проперті Гмбх | Застосування ацилсульфонамідів для покращення врожайності рослин |
| BR112014006940A2 (pt) | 2011-09-23 | 2017-04-04 | Bayer Ip Gmbh | uso de derivados de ácido 1-fenilpirazol-3-carboxílico 4-substituído como agentes contra estresse abiótico em plantas |
| EP3492109B1 (en) | 2011-10-03 | 2020-03-04 | ModernaTX, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
| PL2764101T3 (pl) | 2011-10-04 | 2017-09-29 | Bayer Intellectual Property Gmbh | RNAi do kontroli grzybów i lęgniowców poprzez hamowanie genu dehydrogenazy sacharopinowej |
| WO2013050324A1 (de) | 2011-10-06 | 2013-04-11 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Abiotischen pflanzenstress-reduzierende kombination enthaltend 4- phenylbuttersäure (4-pba) oder eines ihrer salze (komponente (a)) und eine oder mehrere ausgewählte weitere agronomisch wirksame verbindungen (komponente(n) (b) |
| MX2014005976A (es) | 2011-11-21 | 2014-08-27 | Bayer Ip Gmbh | Derivados de n-[(silil trisustituido)metil]-carboxamida fungicidas. |
| CA2857438A1 (en) | 2011-11-30 | 2013-06-06 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Fungicidal n-bicycloalkyl and n-tricycloalkyl (thio)carboxamide derivatives |
| JP2015501844A (ja) | 2011-12-16 | 2015-01-19 | モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． | 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物 |
| CA2859467C (en) | 2011-12-19 | 2019-10-01 | Bayer Cropscience Ag | Use of anthranilic acid diamide derivatives for pest control in transgenic crops |
| EP2797891B1 (en) | 2011-12-29 | 2015-09-30 | Bayer Intellectual Property GmbH | Fungicidal 3-[(pyridin-2-ylmethoxyimino)(phenyl)methyl]-2-substituted-1,2,4-oxadiazol-5(2h)-one derivatives |
| TWI558701B (zh) | 2011-12-29 | 2016-11-21 | 拜耳知識產權公司 | 殺真菌之３－［（１，３－噻唑－４－基甲氧基亞胺）（苯基）甲基］－２－經取代之－１，２，４－二唑－５（２ｈ）－酮衍生物 |
| CN104244714B (zh) | 2012-02-22 | 2018-02-06 | 拜耳农作物科学股份公司 | 琥珀酸脱氢酶抑制剂(sdhi)用于防治葡萄中的木材病害的用途 |
| JP6093381B2 (ja) | 2012-02-27 | 2017-03-08 | バイエル・インテレクチュアル・プロパティ・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツングＢａｙｅｒ Ｉｎｔｅｌｌｅｃｔｕａｌ Ｐｒｏｐｅｒｔｙ ＧｍｂＨ | チアゾリルイソオキサゾリンと殺菌剤を含んでいる活性化合物組合せ |
| WO2013139949A1 (en) | 2012-03-23 | 2013-09-26 | Bayer Intellectual Property Gmbh | Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield |
| EP2833923A4 (en) | 2012-04-02 | 2016-02-24 | Moderna Therapeutics Inc | MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS |
| US9878056B2 (en) | 2012-04-02 | 2018-01-30 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides |
| US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
| US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
| EP2836489B1 (en) | 2012-04-12 | 2016-06-29 | Bayer Cropscience AG | N-acyl-2-(cyclo) alkylpyrrolidines and piperidines useful as fungicides |
| US9719114B2 (en) | 2012-04-18 | 2017-08-01 | Terravia Holdings, Inc. | Tailored oils |
| SG11201406711TA (en) | 2012-04-18 | 2014-11-27 | Solazyme Inc | Tailored oils |
| JP6109295B2 (ja) | 2012-04-20 | 2017-04-05 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | Ｎ−シクロアルキル−ｎ−［（ヘテロシクリルフェニル）メチレン］−（チオ）カルボキサミド誘導体 |
| JP2015516396A (ja) | 2012-04-20 | 2015-06-11 | バイエル・クロップサイエンス・アーゲーＢａｙｅｒ Ｃｒｏｐｓｃｉｅｎｃｅ Ａｇ | Ｎ−シクロアルキル−ｎ−［（三置換シリルフェニル）メチレン］−（チオ）カルボキサミド誘導体 |
| CA2871008C (en) | 2012-04-23 | 2022-11-22 | Bayer Cropscience Nv | Targeted genome engineering in plants |
| EP2662360A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides |
| US9375005B2 (en) | 2012-05-09 | 2016-06-28 | Bayer Cropscience Ag | 5-halogenopyrazole indanyl carboxamides |
| EP2662363A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides |
| EP2662370A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides |
| WO2013167545A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-14 | Bayer Cropscience Ag | Pyrazole indanyl carboxamides |
| EP2662362A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole indanyl carboxamides |
| EP2662364A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides |
| EP2662361A1 (en) | 2012-05-09 | 2013-11-13 | Bayer CropScience AG | Pyrazol indanyl carboxamides |
| AR091104A1 (es) | 2012-05-22 | 2015-01-14 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida |
| AU2013289301A1 (en) | 2012-07-11 | 2015-01-22 | Bayer Cropscience Ag | Use of fungicidal combinations for increasing the tolerance of a plant towards abiotic stress |
| AU2013311826A1 (en) | 2012-09-05 | 2015-03-26 | Bayer Cropscience Ag | Use of substituted 2-amidobenzimidazoles, 2-amidobenzoxazoles and 2-amidobenzothiazoles or salts thereof as active substances against abiotic plant stress |
| CA2888600C (en) | 2012-10-19 | 2021-08-10 | Bayer Cropscience Ag | Active compound combinations comprising carboxamide derivatives |
| PL2908642T3 (pl) | 2012-10-19 | 2022-06-13 | Bayer Cropscience Ag | Sposób wzmacniania tolerancji roślin na stres abiotyczny z zastosowaniem pochodnych karboksyamidowych lub tiokarboksyamidowych |
| AU2013333847B2 (en) | 2012-10-19 | 2017-04-20 | Bayer Cropscience Ag | Method for treating plants against fungi resistant to fungicides using carboxamide or thiocarboxamide derivatives |
| WO2014060518A1 (en) | 2012-10-19 | 2014-04-24 | Bayer Cropscience Ag | Method of plant growth promotion using carboxamide derivatives |
| WO2014079957A1 (de) | 2012-11-23 | 2014-05-30 | Bayer Cropscience Ag | Selektive inhibition der ethylensignaltransduktion |
| EP2735231A1 (en) | 2012-11-23 | 2014-05-28 | Bayer CropScience AG | Active compound combinations |
| LT2922554T (lt) | 2012-11-26 | 2022-06-27 | Modernatx, Inc. | Terminaliai modifikuota rnr |
| BR112015012055B1 (pt) | 2012-11-30 | 2021-01-12 | Bayer Cropscience Ag | composição fungicida ternária, seu processo de preparação, método para controlar um ou mais microrganismos nocivos, semente resistente a microrganismos nocivos e seu método de tratamento |
| WO2014083088A2 (en) | 2012-11-30 | 2014-06-05 | Bayer Cropscience Ag | Binary fungicidal mixtures |
| BR112015012519A2 (pt) | 2012-11-30 | 2017-07-11 | Bayer Cropscience Ag | misturas ternárias fungicidas e pesticidas |
| EP2925135A2 (en) | 2012-11-30 | 2015-10-07 | Bayer CropScience AG | Binary pesticidal and fungicidal mixtures |
| US9775349B2 (en) | 2012-11-30 | 2017-10-03 | Bayer Cropscience Ag | Binary fungicidal or pesticidal mixture |
| EP2740356A1 (de) | 2012-12-05 | 2014-06-11 | Bayer CropScience AG | Substituierte (2Z)-5(1-Hydroxycyclohexyl)pent-2-en-4-insäure-Derivate |
| EP2740720A1 (de) | 2012-12-05 | 2014-06-11 | Bayer CropScience AG | Substituierte bicyclische- und tricyclische Pent-2-en-4-insäure -Derivate und ihre Verwendung zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen |
| WO2014086751A1 (de) | 2012-12-05 | 2014-06-12 | Bayer Cropscience Ag | Verwendung substituierter 1-(arylethinyl)-, 1-(heteroarylethinyl)-, 1-(heterocyclylethinyl)- und 1-(cyloalkenylethinyl)-cyclohexanole als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress |
| WO2014090765A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | Bayer Cropscience Ag | Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops |
| AR093996A1 (es) | 2012-12-18 | 2015-07-01 | Bayer Cropscience Ag | Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias |
| EP2935218A1 (en) | 2012-12-19 | 2015-10-28 | Bayer CropScience AG | Difluoromethyl-nicotinic- tetrahydronaphtyl carboxamides |
| CN105705490A (zh) | 2013-03-07 | 2016-06-22 | 拜耳作物科学股份公司 | 杀真菌的3-{苯基[(杂环基甲氧基)亚氨基]甲基}-杂环衍生物 |
| US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
| WO2014161821A1 (en) | 2013-04-02 | 2014-10-09 | Bayer Cropscience Nv | Targeted genome engineering in eukaryotes |
| JP2016522800A (ja) | 2013-04-12 | 2016-08-04 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | 新規トリアゾリンチオン誘導体 |
| MX2015014365A (es) | 2013-04-12 | 2015-12-07 | Bayer Cropscience Ag | Derivados de triazol novedosos. |
| BR112015026235A2 (pt) | 2013-04-19 | 2017-10-10 | Bayer Cropscience Ag | método para melhorar a utilização do potencial de produção de plantas transgênicas envolvendo a aplicação de um derivado de ftaldiamida |
| KR20150144779A (ko) | 2013-04-19 | 2015-12-28 | 바이엘 크롭사이언스 악티엔게젤샤프트 | 살충성 또는 농약성 2성분 혼합물 |
| WO2014177514A1 (en) | 2013-04-30 | 2014-11-06 | Bayer Cropscience Ag | Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides |
| TW201507722A (zh) | 2013-04-30 | 2015-03-01 | Bayer Cropscience Ag | 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類 |
| BR112015031235A2 (pt) | 2013-06-26 | 2017-07-25 | Bayer Cropscience Ag | derivados de n-cicloalquil-n-[(biciclil-fenil)metileno]-(tio)carboxamida |
| EA201600097A1 (ru) | 2013-07-09 | 2016-06-30 | Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт | Применение выбранных пиридон карбоксамидов или их солей в качестве активных веществ против абиотического стресса растений |
| EP3052521A1 (en) | 2013-10-03 | 2016-08-10 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
| WO2015051319A2 (en) | 2013-10-04 | 2015-04-09 | Solazyme, Inc. | Tailored oils |
| JP6507165B2 (ja) | 2013-12-05 | 2019-04-24 | バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト | Ｎ−シクロアルキル−ｎ−｛［２−（１−置換シクロアルキル）フェニル］メチレン｝−（チオ）カルボキサミド誘導体 |
| WO2015082587A1 (en) | 2013-12-05 | 2015-06-11 | Bayer Cropscience Ag | N-cycloalkyl-n-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives |
| CN106574255A (zh) | 2014-07-10 | 2017-04-19 | 泰拉瑞亚控股公司 | 酮脂酰acp合酶基因及其用途 |
| AR101214A1 (es) | 2014-07-22 | 2016-11-30 | Bayer Cropscience Ag | Ciano-cicloalquilpenta-2,4-dienos, ciano-cicloalquilpent-2-en-4-inas, ciano-heterociclilpenta-2,4-dienos y ciano-heterociclilpent-2-en-4-inas sustituidos como principios activos contra el estrés abiótico de plantas |
| AR103024A1 (es) | 2014-12-18 | 2017-04-12 | Bayer Cropscience Ag | Piridoncarboxamidas seleccionadas o sus sales como sustancias activas contra estrés abiótico de las plantas |
| BR112017022000A2 (pt) | 2015-04-13 | 2018-07-03 | Bayer Cropscience Ag | derivados de n-cicloalquil-n-(biheterocicliletileno)-(tio)carboxamida. |
| EP3436575A1 (en) | 2015-06-18 | 2019-02-06 | The Broad Institute Inc. | Novel crispr enzymes and systems |
| US10266861B2 (en) | 2015-12-14 | 2019-04-23 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Production and composition of fructose syrup |
| WO2018019676A1 (en) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Active compound combinations and methods to protect the propagation material of plants |
| WO2018054832A1 (en) | 2016-09-22 | 2018-03-29 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Novel triazole derivatives |
| US20190281828A1 (en) | 2016-09-22 | 2019-09-19 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Novel triazole derivatives |
| US20190225974A1 (en) | 2016-09-23 | 2019-07-25 | BASF Agricultural Solutions Seed US LLC | Targeted genome optimization in plants |
| RU2019115286A (ru) | 2016-10-26 | 2020-11-27 | Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт | Применение ниразифлумида для борьбы с sclerotinia spp при обработке семян |
| RU2755433C2 (ru) | 2016-12-08 | 2021-09-16 | Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт | Применение инсектицидов для борьбы с проволочниками |
| EP3332645A1 (de) | 2016-12-12 | 2018-06-13 | Bayer Cropscience AG | Verwendung substituierter pyrimidindione oder jeweils deren salze als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress |
| WO2018108627A1 (de) | 2016-12-12 | 2018-06-21 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Verwendung substituierter indolinylmethylsulfonamide oder deren salze zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen |
| US11591601B2 (en) | 2017-05-05 | 2023-02-28 | The Broad Institute, Inc. | Methods for identification and modification of lncRNA associated with target genotypes and phenotypes |
| WO2019025153A1 (de) | 2017-07-31 | 2019-02-07 | Bayer Cropscience Aktiengesellschaft | Verwendung von substituierten n-sulfonyl-n'-aryldiaminoalkanen und n-sulfonyl-n'-heteroaryldiaminoalkanen oder deren salzen zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen |
| CA3073848A1 (en) | 2017-09-21 | 2019-03-28 | The Broad Institute, Inc. | Systems, methods, and compositions for targeted nucleic acid editing |
| US10968257B2 (en) | 2018-04-03 | 2021-04-06 | The Broad Institute, Inc. | Target recognition motifs and uses thereof |
| JP2021525774A (ja) | 2018-06-04 | 2021-09-27 | バイエル アクチェンゲゼルシャフトＢａｙｅｒ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 除草活性二環式ベンゾイルピラゾール |
| US11384344B2 (en) | 2018-12-17 | 2022-07-12 | The Broad Institute, Inc. | CRISPR-associated transposase systems and methods of use thereof |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1989012386A1 (en) | 1988-06-21 | 1989-12-28 | Calgene, Inc. | Methods and compositions for altering physical characteristics of fruit and fruit products |
| DE68929405T2 (de) | 1988-09-06 | 2003-02-06 | Washington University, St. Louis | Orale-immunisierung durch verwendung von transgenen pflanzen |
| SE9004095L (sv) * | 1990-12-21 | 1992-06-01 | Amylogene Hb | Genetisk foeraendring av potatis foer bildning av staerkelse av amylostyp |
| DE4104782B4 (de) * | 1991-02-13 | 2006-05-11 | Bayer Cropscience Gmbh | Neue Plasmide, enthaltend DNA-Sequenzen, die Veränderungen der Karbohydratkonzentration und Karbohydratzusammensetzung in Pflanzen hervorrufen, sowie Pflanzen und Pflanzenzellen enthaltend dieses Plasmide |
| DE4227061A1 (de) | 1992-08-12 | 1994-02-17 | Inst Genbiologische Forschung | DNA-Sequenzen, die in der Pflanze die Bildung von Polyfructanen (Lävanen) hervorrufen, Plasmide enthaltend diese Sequenzen sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen |
| DE4420223C1 (de) | 1994-06-06 | 1995-05-04 | Inst Genbiologische Forschung | Verfahren zur Kombination der intrazellulären Polyhydroxyalkanoat-Synthese in Mikroorganismen mit einer extrazellulären Polysaccharid-Synthese |
-
1995
- 1995-05-18 AT AT95920833T patent/ATE368118T1/de active
- 1995-05-18 WO PCT/EP1995/001893 patent/WO1995031553A1/en active IP Right Grant
- 1995-05-18 PT PT95920833T patent/PT759993E/pt unknown
- 1995-05-18 KR KR1019960706453A patent/KR100352532B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-05-18 JP JP52937795A patent/JP3555086B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-18 DE DE69535543T patent/DE69535543T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-18 US US08/737,752 patent/US6265635B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-18 AU AU26141/95A patent/AU699552B2/en not_active Expired
- 1995-05-18 IL IL113776A patent/IL113776A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-05-18 ES ES95920833T patent/ES2287935T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-18 HU HU9603170A patent/HU226874B1/hu unknown
- 1995-05-18 CA CA2190149A patent/CA2190149C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-18 DK DK95920833T patent/DK0759993T3/da active
- 1995-05-18 RU RU96124069/13A patent/RU2201963C2/ru active
- 1995-05-18 EP EP95920833A patent/EP0759993B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-04-26 US US09/843,007 patent/US6818421B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-05-06 JP JP2003127694A patent/JP3511027B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2004
- 2004-10-15 US US10/966,523 patent/US7456003B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL113776A0 (en) | 1995-08-31 |
| AU699552B2 (en) | 1998-12-10 |
| CA2190149A1 (en) | 1995-11-23 |
| US6265635B1 (en) | 2001-07-24 |
| HUT76087A (en) | 1997-06-30 |
| JP3511027B2 (ja) | 2004-03-29 |
| PT759993E (pt) | 2007-08-10 |
| US7456003B2 (en) | 2008-11-25 |
| JP3555086B2 (ja) | 2004-08-18 |
| AU2614195A (en) | 1995-12-05 |
| US6818421B2 (en) | 2004-11-16 |
| IL113776A (en) | 2008-12-29 |
| EP0759993B1 (en) | 2007-07-25 |
| US20050227319A1 (en) | 2005-10-13 |
| KR100352532B1 (ko) | 2004-02-18 |
| KR970703427A (ko) | 1997-07-03 |
| JP2003325067A (ja) | 2003-11-18 |
| DE69535543D1 (de) | 2007-09-06 |
| ES2287935T3 (es) | 2007-12-16 |
| ATE368118T1 (de) | 2007-08-15 |
| DE69535543T2 (de) | 2008-04-30 |
| HU9603170D0 (en) | 1997-01-28 |
| US20020092040A1 (en) | 2002-07-11 |
| JPH10500297A (ja) | 1998-01-13 |
| WO1995031553A1 (en) | 1995-11-23 |
| CA2190149C (en) | 2011-01-04 |
| RU2201963C2 (ru) | 2003-04-10 |
| DK0759993T3 (da) | 2007-11-12 |
| EP0759993A1 (en) | 1997-03-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6265635B1 (en) | DNA sequences coding for enzymes capable of facilitating the synthesis of linear α-1,4 glucans in plants, fungi and microorganisms | |
| US6559356B1 (en) | Nucleic acid molecules which encode proteins having fructosyl transferase activity and methods for producing long-chain inulin | |
| Ebskamp et al. | Accumulation of fructose polymers in transgenic tobacco | |
| EP2121908B1 (en) | Truncated alternansucrase coding nucleic acid molecules | |
| HUT70977A (en) | Dna sequences waich lead to the formation of polyfructans (levans) plasmids containing these sequences as' wells as a process for preparing transgenic plants | |
| HU227302B1 (en) | Dna molecules that code for enzymes involved in strach synthesis, vectors, bacteria, transgenic plant cells and plants containing said molecules | |
| US7906707B2 (en) | Nucleic acid molecules encoding enzymes having fructosyltransferase activity, and their use | |
| RU2272842C2 (ru) | Линейные альфа-1,4-глюканы и способ их получения | |
| US7495152B2 (en) | Identification and characterization of a novel alpha-amylase from maize endosperm | |
| WO1999066056A1 (fr) | Procede d'obtention de polysaccharides modifies | |
| MXPA01003625A (en) | NUCLEIC ACID MOLECULES WHICH CODE A BRANCHING ENZYME FROM BACTERIA OF THE GENUS NEISSERIA, AND A METHOD FOR PRODUCING&agr;-1,6-BRANCHED&agr;-1,4-GLUCANS |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: PLANTTEC BIOTECHNOLOG GMBH, DE |
|
| DGB9 | Succession in title of applicant |
Owner name: PLANTTEC BIOTECHNOLOGIE GMBH, DEGB9A CT UMWELTTECH |
|
| GB9A | Succession in title |
Owner name: BAYER CROPSCIENCE AKTIENGESELLSCHAFT, DE Free format text: FORMER OWNER(S): BAYER BIOSCIENCE GMBH, DE; HOECHST SCHERING AGREVO GMBH., DE; PLANTTEC BIOTECHNOLOGIE GMBH, DE |