WO1999066056A1 - Procede d'obtention de polysaccharides modifies - Google Patents

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WO1999066056A1
WO1999066056A1 PCT/FR1999/001446 FR9901446W WO9966056A1 WO 1999066056 A1 WO1999066056 A1 WO 1999066056A1 FR 9901446 W FR9901446 W FR 9901446W WO 9966056 A1 WO9966056 A1 WO 9966056A1
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glucanotransferase
glycogen
plants
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Steven Ball
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Biogemma
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis

Definitions

  • the present invention relates to a process for obtaining plants producing modified polysaccharides (such as starch or glycogen), these modified polysaccharides extracted from these plants and the products prepared from these modified polysaccharides.
  • modified polysaccharides such as starch or glycogen
  • Starch is the energy storage polysaccharide in plants. It constitutes the main caloric intake of animal and human food and is also a major source of vegetable raw material for non-food uses. Starch is composed of two distinct polysaccharide fractions: amylose and amylopectin. Amylose, which represents the minority fraction of starch, consists of glucose residues united by ⁇ -1, 4 bonds, and has less than 1% of branches. Amylopectin, which represents the majority fraction of starch, consists of glucose residues united by ⁇ -1, 4 bonds, and has about 5% of branches, formed by glucose residues linked to the main polymer by a bond ⁇ -1, 6. The asymmetric distribution of the branching of amylopectin is responsible for the unlimited growth of molecules and consequently of starch grains, and also accounts for most of the physicochemical properties of starch.
  • the biosynthesis of starch depends on a pathway, the main biochemical steps of which are the synthesis of ADP-glucose followed by the transfer of this precursor in position ⁇ -1, 4 onto a glucan by (ADP-glucose: 1, 4- ⁇ - D-glucan 4- ⁇ -D-glucosyl) transferases, the polymer formed being branched by the action of enzymes called branching or "branching": the 1,4- ⁇ -D-glucan 6- ⁇ -D- (1, 4- ⁇ -D-glucano) -transferases.
  • Figure 1 attached is a simplified diagram of the metabolism of starch hitherto known to those skilled in the art.
  • the known plant ⁇ -1, 4 glucanotransferases (or 4- ⁇ -D-glucanotransferases) are commonly referred to as “enzymes D” for “disproportionating enzymes". They catalyze the transfer of glucan from one 1,4- ⁇ -glucan molecule to another (intermolecular transglycosylation).
  • Enzymes D catalyze the transfer of glucan from one 1,4- ⁇ -glucan molecule to another (intermolecular transglycosylation).
  • the rules of action of the enzyme D on oligosaccharide substrates are schematized as follows:
  • Maltose cannot serve as a donor substrate and only a bond at the end of the maltotriose can be attacked.
  • the first bond on the non-reducing side and the penultimate bond on the reducing side are resistant to the action of the enzyme.
  • the enzyme D does not have a direct role on the structures and the quantities of starch produced but plays a role in the growth of the plant and its development, amylopectin and amylose serving as donor molecules for the transfer of maltooligosaccharide to glucose, thus allowing the dislocation and the solubilization of the starch grains (Takada et al, 1998).
  • the authors of the present invention have discovered that the ⁇ -1, 4 glucanotransferases, and in particular the enzymes D are in fact involved in the biosynthesis of starch, by transferring oligosaccharides on a precursor of amylopectin.
  • These enzymes can in particular transfer the oligosaccharides from the pool of oligosaccharides produced in vivo by debranching of the precursor of amylopectin during the maturation of amylopectin. They can in particular transfer the oligosaccharides which may contain, for example from 2 to 20, in particular from 2 to 6, glucose residues.
  • Figure 2 attached shows the role of the enzyme D in the cycle of starch metabolism, as discovered by the authors of the present invention.
  • This discovery was used to modify, as a function of the level of enzyme ⁇ -1,4 active glucanotransferase present, the distribution of the lengths of the chains of amylopectin, present in particular in the reserve organs of plants.
  • the invention also applies to glycogen, present in a smaller amount than amylopectin in plants but which can be found, for example, in sweet corn kernels, allowing in the same way the modification of the distribution of the length of the glycogen chains.
  • the present invention therefore relates to the use of a nucleic acid coding for an enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase glucanotransferase or an antisense sequence of said sequence coding for an enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase, to modify the distribution of the length of the external chains of starch (i.e. amylopectin and / or amylose) or glycogen.
  • a nucleic acid coding for an enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase glucanotransferase or an antisense sequence of said sequence coding for an enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase to modify the distribution of the length of the external chains of starch (i.e. amylopectin and / or amylose) or glycogen.
  • the present invention relates more particularly to a process for modifying the distribution of the length of the chains of amylopectin in a starch or of the chains of a glycogen in which the activity of an enzyme ⁇ is increased or decreased -1,4 glucanotransferase in the cells of a plant so that said plant produces a modified starch different from the starch produced naturally by plants by distribution of the length of the chains of amylopectin or produce a modified glycogen different from the glycogen produced naturally by the distribution of the length of its external chains.
  • the level of expression of enzyme ⁇ -1, 4 endogenous glucanotransferase is reduced, so as to lead to the production of a starch comprising an amylopectin having an enrichment in chains comprising less of 6 glucose residues compared to a naturally produced starch.
  • the reduction of the expression of an endogenous ⁇ -1,4 glucanotransferase enzyme can be carried out in particular according to the method comprising the steps consisting in: a) constructing an expression vector comprising an antisense nucleotide sequence of the gene coding for said enzyme ⁇ -1, 4 endogenous glucanotransferase; b) transforming a plant cell with said expression vector; c) regenerating the plant from the cell transformed in step b, said transgenic plant thus obtained producing a starch comprising an amylopectin whose distribution of chain lengths is altered, in particular in the sense of an enrichment in chains comprising less of 6 glucose residues.
  • said plant cell transformed according to step b) is also transformed by antisense nucleotide sequences of the genes coding for enzymes affecting the length distribution of the oligosaccharides produced during the metabolism of starch, such as phosphorylases. and amylases.
  • ribozymes which are RNA molecules which act as enzymes which specifically catalyze the cleavage of transcripts encoding l the enzyme the ⁇ -1,4 glucanotransferase enzyme, by techniques known to those skilled in the art (EP 321,021). It is also possible to obtain a plant exhibiting an alteration in the expression of the enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase by the process known as "transwitch" described in WO90 / 12084.
  • the activity of the enzyme endogenous ⁇ -1,4 glucanotransferase can also be reduced by mutagenesis of plant cells either by U.V irradiation or by a chemical mutagenic agent, or by insertion of transposons.
  • Transposable elements have the ability to disrupt the expression of genes into which they are inserted and to generate deletions, rearrangements, and mutations at the target locus (McClintock et al., 1950).
  • mutagenesis by transposon Mutator confirmed by a screening in reverse genetics (Bensen et a I., 1995) (Das et al., 1995). This technique implements the steps consisting in crossing a “Mutator” line with hybrids of the plants of interest then in screening the F1 plants obtained by PCR with a primer specific for transposons and a primer specific for the nucleotide sequence coding for enzyme ⁇ -1, 4 glucanotransferase. The seeds F2 obtained from the plants screened F1 make it possible to obtain plants whose phenotype is then analyzed.
  • the level of expression of enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase in the plant is increased, so as to lead to the production of a starch comprising an amylopectin having an enrichment in chains. comprising at least 9 glucose residues relative to a naturally produced starch, said enzyme ⁇ -1, 4 glucanotransferase being identical to the enzyme ⁇ -1, 4 glucanotransferase endogenous or being of heterologous origin.
  • the increase in the level of enzyme ⁇ -1, 4 glucanotransferase can in particular be carried out according to the method comprising the steps consisting in: a) constructing an expression vector comprising a nucleotide sequence coding for an enzyme ⁇ -1, 4 glucanotransferase, who may be an enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase identical to the enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase endogenous or which may be of heterologous origin; b) transforming a plant cell with said expression vector; c) regenerating the plant from the cell transformed in step b), said transgenic plant thus obtained producing a starch comprising an amylopectin whose distribution of chain lengths is altered, in particular in the sense of an enrichment in chains comprising at least 9 glucose residues.
  • said plant cell transformed according to step b) is also transformed by nucleotide sequences coding for enzymes affecting the length distribution of the oligosaccharides produced during the metabolism of starch, such as phosphorylases and amylases .
  • the enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase targeted is an enzyme D.
  • Said nucleotide sequence coding for an enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase may be of heterologous origin. It can thus correspond in particular to an enzyme chosen from the enzyme D of the potato (Takaha et al, 1993) or the enzyme D of Chlamydomonas reinhardtii.
  • nucleic acid comprising a nucleotide sequence chosen from the sequence SEQ ID No. 1, a homologous sequence and a fragment of this sequence coding for a protein having an enzymatic activity of ⁇ -1,4 glucanotransferase.
  • the invention also comprises the sequences complementary to the sequence SEQ ID No. 1 or of its homologs and fragment, which can serve as antisense sequences in the method of the invention.
  • sequence SEQ ID No. 1 represents a genomic DNA fragment of the gene coding for the enzyme D of Chlamydomonas reinhardtii.
  • homologous nucleotide sequence is meant any nucleotide sequence which differs from the sequence SEQ ID No. 1 by substitution, deletion, and / or insertion of a nucleotide or of a reduced number of nucleotides, at positions such as these nucleotide sequences homologs code for homologous polypeptides as defined below.
  • such a homologous nucleotide sequence is identical to at least 75% of the sequence SEQ ID No. 1, preferably at least 85%, more preferably at least 95%.
  • such a homologous nucleotide sequence specifically hybridizes to the sequence complementary to the sequence SEQ ID No. 1, under stringent conditions.
  • the parameters defining the stringency conditions depend on the temperature at which 50% of the paired strands separate (Tm).
  • Tm 81.5 + 0.41 (% G + C) +16.6Log (cation concentration) -
  • Tm 4 (G + C) + 2 (A + T).
  • the hybridization temperature is approximately 5 to 30 ° C, preferably 5 to 10 ° C below Tm, and the hybridization buffers used are preferably solutions of high ionic strength such as a 6xSSC solution for example.
  • nucleotide fragment is meant any fragment of the sequence SEQ ID No. 1, or nucleotide sequences homologous to the sequence SEQID No. 1, which codes for a peptide or a protein having an enzymatic activity of ⁇ -1, 4 glucanotransferase, as defined above.
  • the present invention also relates to a cloning and / or expression vector comprising a nucleotide sequence as defined above.
  • an expression vector mentioned above is within the reach of those skilled in the art according to standard techniques.
  • said expression vector can contain an antisense nucleotide sequence of the gene coding for the said endogenous ⁇ -1,4 glucanotransferase enzyme, according to the first embodiment of the invention, or a nucleotide sequence coding for an ⁇ -1,4 glucanotransferase enzyme, according to the second embodiment of the invention.
  • the nucleotide sequence coding for an enzyme ⁇ -1, 4 glucanotransferase is associated with the elements allowing its expression in the plant, namely in particular a promoter and a transcription terminator.
  • the transformation of plant cells can be carried out by transfer of the abovementioned vectors into the protoplasts, in particular after incubation of the latter in a polyethylene glycol solution in the presence of divalent cations (Ca 2+ ).
  • the transformation of plant cells can also be carried out by electroporation, in particular according to the method described in the article by Fromm et al., 1986.
  • the transformation of plant cells can also be carried out by using a gene gun allowing the projection, at very high speed, of metallic particles covered with the DNA sequences of interest, thus delivering genes inside the cell nucleus , in particular according to the technique described in the article by Sanford, (1988).
  • Another method of transforming plant cells is that of cytoplasmic or nuclear micro-injection.
  • the plant cells are transformed by biolistics, that is to say by projection, by means of a particle gun, of microparticles covered with the nucleotide sequences to be transferred ( J. Finner, 1992).
  • the plant cells are transformed by a vector according to the invention, said cellular host being capable of infecting said plant cells by allowing the integration into the genome of the latter, DNA sequences of interest originally contained in the genome of the above vector.
  • the above-mentioned cell host used is Agrobacterium tumefaciens, in particular according to the method described in the article. d'An et al., 1986, or Agrobacterium rhizogenes, in particular according to the method described in the article by Jouanin et al., 1987.
  • the transformation of plant cells is carried out by the transfer of the T region of the extra chromosomal circular piasmide inducing Ti tumors of Agrobacterium tumefaciens, using a binary system (Watson et al.).
  • T-DNA region was deleted, with the exception of the right and left edges, a marker gene being inserted between them to allow selection in plant cells.
  • the other partner of the binary system is an auxiliary Ti piasmide, a modified piasmide which no longer has T-DNA but still contains the vir virulence genes, necessary for the transformation of the plant cell. This piasmid is maintained in Agrobacterium.
  • transcription terminators which can be used, mention may be made of the polyA 35S terminator of the cauliflower mosaic virus
  • NOS which corresponds to the 3 'non-coding region of the nopaline synthase gene from the piasmid Ti to' Agrobacterium tumefaciens nopaline strain
  • transcription promoters which can be used, there may be mentioned in particular:
  • 35S promoter or advantageously the constitutive double 35S promoter (pd35S) of CaMV, described in the article by Kay et al., 1987;
  • the chimeric PSP super-promoter (Ni M et al., 1995), consisting of the fusion of a triple repetition of a transcriptional activator element of the promoter of the octopine synthase gene from Agrobacterium tumefaciens, a transcriptional activating element of the promoter of the mannopine synthase gene and of the mannopine synthase promoter of Agrobacterium tumefaciens;
  • the present invention also relates to a plant or part of a plant such as in particular potato, wheat, corn or rice, producing a modified starch different from the starch produced naturally by plants by the distribution of the lengths of its external chains or producing modified glycogen different from the glycogen produced naturally by the distribution of the length of its external chains, said plant or part of plant being obtained by the method of the invention as described above.
  • plant part in particular the reserve organs naturally rich in starch, such as seeds or tubers, or the organs naturally rich in glycogen, for example cornflour grains.
  • plant part is also meant the cells of said plant.
  • the invention also relates to a process for obtaining modified starch or modified glycogen in which a starch or a glycogen is brought into contact with an enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase.
  • a more particular subject of the present invention is a process for obtaining modified starch which differs from the starch produced. naturally by plants by the distribution of the lengths of its external chains, in which: the modified starch is extracted from the plants or parts of plants obtained according to the method of the invention, as described above. or a starch, previously extracted from plants or parts of plants and then solubilized, is brought into contact with an enzyme ⁇ -1, 4 glucanotransferase, in the presence of optionally modified polysaccharides or oligosaccharides.
  • the extraction of this starch is carried out according to standard techniques known to those skilled in the art.
  • starch The solubilization of starch is also known to those skilled in the art and can be carried out by soaking and fractionating the starch grain (Whistler et al, (1967)), or for example by heating.
  • enzymes destructuring starch can be used, such as amylases.
  • said solubilized starch is brought into contact with an enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase, such as an enzyme D, in the presence of saccharides.
  • Said saccharides can in particular be chemically modified oligosaccharides, so as to modify the properties of starch, for example its digestibility.
  • ⁇ -1,4 glucanotransferase enzymes affecting the length distribution of the oligosaccharides produced during the metabolism of starch such as phosphorylases and amylases.
  • the present invention also relates to a process for obtaining modified glycogen different from the glycogen produced naturally (by plants or by an animal organism) by the distribution of the lengths of its external chains, in which: - the modified glycogen is extracted with starting from the plants or parts of plants obtained according to the method of the invention, as described above. or a glycogen (of plant or animal origin) is brought into contact with an ⁇ -1, 4 glucanotransferase enzyme, in the presence of optionally modified polysaccharides or oligosaccharides.
  • Said enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase such as an enzyme D, brought into contact with starch or glycogen, can come from the same species of plant as that from which the starch is extracted or can have a heterologous origin.
  • the enzyme D used is thermostable.
  • the enzyme D of Chlamydomonas reinhardtii is purified by the process comprising the steps consisting in: - centrifuging the strain Chlamydomonas reinhardtii;
  • the purified Chlamydomonas reinhardtii enzyme D thus obtained has a molecular weight of 62kD. More generally, it is possible to use, as protein exhibiting an ⁇ -1, 4 glucanotransferase enzymatic activity, a protein or a peptide encoded by a nucleic acid comprising a nucleotide sequence chosen from the sequence SEQ ID No. 1, a homologous sequence or a fragment of this sequence.
  • the present invention also relates to modified starch which differs from the starch produced naturally by plants by the distribution lengths of its chains, said modified starch being obtained by the process of the invention.
  • the modified starch obtained by extraction and solubilization of starch from plants or parts of plants, then contacting said solubilized starch with an enzyme ⁇ -1,4 glucanotransferase, optionally in the presence of saccharides, comprises an amylopectin, the distribution of the lengths of the external chains is modified compared to a naturally produced starch.
  • the present invention also relates to the modified glycogen which differs from the glycogen produced naturally (for example by plants, but also from the glycogen of animal origin), by the distribution of the lengths of its chains, said modified glycogen being obtained by the process of the invention.
  • the starch modified in accordance with the present invention can be used directly or hydrolyzed in order to produce oligosaccharides of interest
  • starch modified in accordance with the invention can make it possible to reduce the quantities of enzymes necessary for such hydrolysis.
  • starch modified in accordance with the invention can be used during the manufacture of various foods, in particular as an additive which increases the viscosity or promotes the formation of a gel.
  • the starch modified according to the invention can also be used in many industries: paper and cardboard industry, adhesive industry, textile industry, pharmaceutical industry (for the formulation of drugs), etc.
  • the starch modified in accordance with the invention may also undergo other modifications, in particular chemical modifications such as acid treatment, oxidation, esterification, etc. before its use.
  • the present invention also relates to the use of this modified starch or of this modified glycogen for the preparation of derived products, in particular food products.
  • the present invention also relates to the products thus prepared comprising modified starch differing from starch produced naturally by plants by the length of its external chains or modified glycogen differing from glycogen produced naturally by the length of its external chains .
  • FIG. 1 represents a simplified diagram of the metabolism of starch hitherto known to a person skilled in the art. All the stages described are compartmentalized in the plastid.
  • Glc glucose
  • FIG. 2 represents a simplified diagram of the synthesis of amylopectin, in which the role of the enzyme D is highlighted.
  • BE branching by branching enzymes
  • DBE isoamylase disconnection
  • MOS release of oligosaccharides
  • G-6-P glucose-6-phosphate
  • Glc glucose
  • the energy cost of splicing with DBE and the enzyme D described in this invention is 2 ATP per glucan cleaved and reintroduced into amylopectin in ⁇ (WSP 111 ). This cost stems from the reactivation of the glucose produced by the enzyme D into ADP-glucose.
  • the dotted line drawn from WSP 1 "illustrates the possibility offered to the polysaccharide of reserving elongation substrate as long as the structure required for insolubilization in the grain has not been reached.
  • the entry and exit of the cycle are illustrated by the arrows in bold lines and are formed on the one hand by the synthesis of ADP-glucose and on the other hand by the crystallization and insolubilization of the polysaccharide on the surface of the grain.
  • amyloidosis occurs after insolubilization and is carried out exclusively in the granule.
  • FIG. 3A represents the length distribution of the non-disconnected soluble oligosaccharides accumulated by the mutant strain JV45J of Chlamydomonas reinhardtii.
  • FIG. 3B represents the length distribution of the chains of the amylopectin disconnected from the wild Chlamydomonas reinhardtii strain.
  • FIG. 3C represents the distribution of lengths of the chains of the amylopectin disconnected from the mutant strain JV45J Chlamydomonas reinhardtii.
  • FIG. 3D represents the distribution of chain lengths of the amylopectin disconnected from “waxy” maize with the pure enzyme D from Chlamydomonas reinhardtii in the absence of oligosaccharides.
  • FIG. 4 represents the incorporation of maltooligosaccharides on the amylopectin of the wild strain of Chlamydomonas reinhardtii.
  • FIG. 5 represents the separation of amylopectin and amylose from the starches of JV45J (sta11-1) and 137C (wt) on filtration chromatography on CL-2B gel.
  • the JV45J mutant is represented by radiolabelled starch (DPM) and the 137C strain is represented by absorbance.
  • the residual starch has a new modified structure characterized by an amylose enrichment and by an amylopectin whose ultra-short chains (approximately 2, 3, or 4 glucose residues) are superabundant relative to the chains of medium length (approximately from 9 to 18 glucose residues) (Examples 2 and 31
  • this mutant lacks a 62kD protein normally present in wild strains of Chlamydomonas reinhardtii, identified this protein as being a 4- ⁇ -D-glucanotransferase (enzyme D), and have demonstrated new functions of this enzyme D with respect to the polysaccharides (Example 4). These results can be used to obtain transgenic plants producing polysaccharides (starch, glycogen) modified (Example 5). The authors of the present invention have further demonstrated the role of the enzyme D in the degradation of malto-oligosaccharides by phosphorylase (Example 6).
  • the yellow areas contain less than 12% of the amount of starch accumulated by the black areas.
  • the olive color observed in certain sparsely colored areas suggests the existence of a residual starch enriched in amylose.
  • those which displayed complementation in trans were selected with mutants carrying sta-1, sta6-1 :: ARG7, sta7-1 :: ARG7, sta5-1 which are defective for the loci coding for the large and the small AGPase subunit (STA1 and STA6) for the 88 kDa isoamylase (STA7) or for plastid phosphoglucomutase (STA5).
  • JV45J A new type of mutant (JV45J), which accumulates 4% of the normal amount of starch, has thus been isolated.
  • the character responsible for the defective phenotype behaves like a recessive Mendelian character in view of segregation after crossing, and defines a new genetic locus named STA11, since the mutation complements in trans and recombines with all of the defects tested.
  • the polysaccharides present in strains carrying
  • Granular starch Granular starch and soluble glucans were analyzed separately. The starch dispersed in aqueous DMSO and defatted by precipitation with four volumes of ethanol was resuspended in 10 mM NaOH to then be fractionated by molecular sieving chromatography on CL2B sepharose gel.
  • Amylose and amlyopectin composition (gel filtration). The separation of amylopectin and amylose is effected by gel filtration of the mutant strain JV45J and the wild-type reference 137C. The starch dissolved in 10 mM NaOH was fractionated by molecular sieving chromatography according to the method described by Delrue et al. (1992). A sample of each fraction was stained with iodine and the full spectrum of the polysaccharide-iodine complex was recorded. Amyloglucosidase assays revealed the presence of 30% amylose (15% for the wild reference).
  • amylopectin is characterized by a ⁇ max of the polysaccharide-iodine complex which increased from 20 to 30 nm (from 550 to 570-580 nm). This last characteristic is found in a large number of starches enriched in amylose.
  • the gel filtration profiles described show a doubling of the amount of amyloidosis in the mutant compared to the wild type as well as an apparent modification of the chain length distribution of the amylosic fraction.
  • a new analysis of segregation of amylopectin and amylose on filtration chromatography on CL-2B gel was carried out using 500 ⁇ g of starch from JV45J (sta11-1) labeled with 14 C and 10 mg of starch of 137C.
  • the results (Fig. 5) tend to confirm the data from the co-segregation study, that is to say a reduction in the length of the amylose chains produced by the strain JV45J; amyloidosis therefore appears to be more abundant and of less mass.
  • a radioactive count and absorbance are determined for each fraction.
  • the column is eluted in 10 mM sodium hydroxide.
  • X-ray diffractograms show a change in the crystalline lattice of the wild type A of high crystallinity towards a mixture of types A and B of much weaker crystallinities.
  • the shape of the granules is particularly altered and their overall size is reduced.
  • the wild strain generally has grains with a smooth surface while the mutant has grains of smaller size with a rough and irregular grain surface.
  • Soluble glucans small malto-oligosaccharide
  • the fraction of soluble glucans (WSP) was subjected to a triple extraction with chloroform methanol. The aqueous phase was lyophilized and the dry pellet redissolved in a buffer and fractionated by molecular sieving chromatography on a TSK-HW-50 column as described by Mouille et al., 1996.
  • WSP soluble fractions purified at From mutants deficient in isoamylase, no phytoglycogen or other soluble polysaccharide of significant mass was found.
  • the WSP fraction accumulated by the sta11 mutants consists exclusively of low-branched oligosaccharides (less than 1.5% of branches) of low mass (FIG. 3A).
  • amylose and amylopectin fractions obtained by molecular sieving chromatography were then subjected to an enzymatic disconnection with isoamylase followed by an electrophoretic separation of the disconnected chains.
  • the results illustrated in FIG. 3 establish the novelty of the structure presented by the amylopectin of the JV45J strain. Indeed, amylopectin has an increase in chains traditionally absent from the structure.
  • This study involves quantitative and qualitative measurements of enzymatic activities, in parallel with kinetic characterizations and analyzes of the elution profiles on Mono-Q anion exchange columns (FLPC chromatography).
  • the enzymes tested are as follows: ADP- glucose pyrophosphorylase, phosphoglucomutase, soluble starch synthetase I, soluble starch synthetase II, granule-linked starch synthetase, branching enzymes (two types), branching enzymes (pullulanase and isoamylase), phosphorylases and all starch hydrolases which can be detected in zymogram gels containing starch. No qualitative or quantitative difference in these enzymatic activities co-aggregated with the mutant gene.
  • Purification of the enzyme and glucan transfer activity requires 20 liters of culture of a wild strain of Chlamydomonas reinhardtii in TAP medium (Harris, 1989) for three days in order to obtain a cell density of 2 ⁇ 10 6 cells per ml. After centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, the cell pellet is passed twice to the French press and immediately frozen at -80 ° C. This raw thawed extract is centrifuged for 20 minutes at 1000 rpm at 4 ° C. The proteins in the extract (350 to 500 mg) are dosed by the Bradford method (Bio-rad assay kit).
  • the supernatant is precipitated with 5% protamine sulfate (40 ⁇ l per ml of extract 15 minutes in ice) then centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant (200 to 400 mg of protein) is injected using a multi-injection program on a MonoQ ion exchange column (Pharmacia HR 10/10 with a volume of 9 ml, flow rate: 2 ml. Min "1 ) balanced in a 50 mM sodium acetate buffer, 2 mM DTT (pH 6 with acetic acid).
  • the fraction not retained (40 to 70 mg) undergoes a first precipitation with 30% ammonium sulphate (176 mg / ml) 45 minutes at 4 ° C. and is then centrifuged at 1000 rpm for 20 minutes.
  • the supernatant (30 to 60 mg) is then precipitated at 50% 45 minutes at 4 ° C (126 mg / ml) and is then centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes.
  • the pellet (10 to 20 mg of protein) is resuspended in 2 ml of 50 mM sodium acetate buffer, 2 mM DTT pH 6 and then injected on filtration gel
  • ⁇ -amylases are processive enzymes which selectively digest the outer chains of polysaccharides, the result obtained shows that major modifications are restricted to chains external of the polymer. It is important to note that no oligosaccharide is released in the process while the amount of ⁇ -1, 6 bonds remains constant.
  • the 62kD enzyme is therefore an ⁇ -1,4 glucanotransferase, the function of which is to cleave the ⁇ -1,4 bonds present on the external chains of the amylopectin donor in order to transfer them to the non-reducing ends of chains neighboring the outside of the acceptor. .
  • the only ⁇ -1, 4 glucanotransferases known to be present during the synthesis of starch are commonly called enzymes D.
  • the reaction consists of cleavage of a donor glucan and a transfer to a receptor chain.
  • the action of the identified 62 kD enzyme was also tested on glucose, maltose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose and maltoheptaose the enzyme successfully disproportionates all oligosaccharides longer than maltose and glucose, on which it has no action. Its effects on maltotriose have been described in Figure 3E. The very small amounts of maltose in all cases confirm that the enzyme obeys the rules presented above defining the action of disproportionate enzymes.
  • the purification protocol for enzyme D can be modified, for example according to the following variant:
  • the supernatant obtained after centrifugation of the crude extract as described in Example 3 is precipitated with protamine sulfate (50 ⁇ l of 10% protamine sulfate per ml of extract 15 minutes in ice) and then centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes at 4 ° C.
  • the supernatant (200 to 400 mg of protein) is then injected using a multi-injection program on a MonoQ anion exchange column (Pharmacia HR10 / 10 with a volume of 9 ml, flow rate: 2 ml. Min “1 ) coupled to a UNO-S12 cation exchange column (BIO-RAD with a volume of 12 ml, flow rate: 2 ml. min "1 ).
  • a MonoQ anion exchange column Pharmacia HR10 / 10 with a volume of 9 ml, flow rate: 2 ml. Min "1
  • UNO-S12 cation exchange column BIO-RAD with a volume of 12 ml, flow rate: 2 ml. min "1 ).
  • These two columns are balanced in a 50 mM sodium acetate buffer, 2 mM DTT (pH 6 with acetic acid).
  • the elution is carried out in a 30 min level at 5% NaCl.
  • the fractions of interest
  • the activity thus purified manifests itself at an optimum pH between pH5 and pH7.5 and decreases significantly above pH9.
  • the zymogram system fairly well mimics the synthesis of polysaccharide on the surface of the starch granule in that it allows the oligosaccharides to diffuse freely in a large volume of buffer while the polysaccharide is retained in a small volume of the gel, where a strong specific enzymatic activity is manifested.
  • Oligosaccharides are radioactively labeled with 14 C by in vivo disconnection of the labeled amylopectin. It was verified that the distribution of the length of the chains in the mixture of disconnected chains corresponded to that presented in FIG. 3B.
  • calluses are obtained from immature embryos of genotype H1 II or (A188 x B73) according to the method and on the media described by Armstrong (1994). The calluses thus obtained are multiplied and maintained by successive subcultures every fortnight on the initiation environment.
  • Seedlings are then regenerated from these calluses by modifying the hormonal and osmotic balance of the cells according to the method described by Vain et al (1989). These plants are then acclimatized in the greenhouse where they can be crossed or self-fertilized.
  • the previous paragraph describes obtaining and regenerating cell lines for transformation.
  • a method of genetic transformation leading to the stable integration of the modified genes into the genome of the plant is based on the use of a particle gun.
  • the target cells are fragments of calluses described in the paragraph A. These fragments with a surface of 10 to 20 mm 2 were placed, 4 hours before bombardment, at the rate of 16 fragments per dish in the center of a Petri dish containing a culture medium identical to the initiation medium , supplemented with 0.2 M mannitol + 0.2 M sorbitol.
  • the plasmids carrying the nucleotide sequences to be introduced such as the cDNA coding for the potato enzyme D (Takada et al., 1993) or the antisense sequences obtained from this cDNA are purified on a Qiagen column, following manufacturer's instructions. They are then precipitated on tungsten particles (M10) following the protocol described by Klein et al (1987). The particles thus coated are projected towards the target cells using the cannon and according to the protocol described by J. Finner (1992).
  • the callus boxes thus bombarded are then sealed using ®Scellofrais, then grown in the dark at 27 ° C.
  • the first subculture takes place 24 hours later, then every fortnight for three months on medium identical to the initiation medium added with a selective agent.
  • the selective agents which can be used generally consist of active compounds of certain herbicides (®Basta, ®Roundup) or certain antibiotics (Hygromycin, kanamycin, etc.).
  • Calls are obtained after three months or sometimes earlier, calluses whose growth is not inhibited by the selection agent, usually and mainly composed of cells resulting from the division of a cell having integrated into its genetic heritage one or more copies of the selection gene.
  • the frequency of obtaining such calluses is about 0.8 cal for bombarded can.
  • These calluses are identified, individualized, amplified and then cultivated so as to regenerate seedlings. In order to avoid any interference with untransformed cells, all of these operations are carried out on culture media containing the selective agent.
  • the plants thus regenerated are acclimatized and then cultivated in a greenhouse where they can be crossed or self-fertilized.
  • amylomaltase an ⁇ -1,4 glucanotranferase similar to enzyme D, increases the production of glucose-
  • JV45J from Chlamydomonas, demonstrated a stimulation of at least a factor of 5, in the presence of enzyme D, of the degradation of maltotetraose and maltotriose by phosphorylase. Knowing that the production of glucose-1-phosphate from glucan of length DP5 is found in both bacteria and plants, the enzyme D could also facilitate the action of phosphorylase in plants.
  • the isolation of genomic sequences coding for the enzyme D of Chlamydomonas followed the following protocol: a sequence alignment carried out between Solanum tuberosum, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis and Clostridium butyricum, made it possible to choose oligonucleotides corresponding to the conserved regions (regions 1 and 2), to serve as primers for PCR reactions.
  • a 16-nucleotide extension containing the restriction sequences of 3 different enzymes was added in 5 '[EcoRI, Sacll, Notf].
  • This PCR product is extracted from a 0.8% TAE gel according to the PROLABO "DNA Purification Kit” protocol, and placed in the multiple cloning site of the pBlueskipt II SK piasmide at the NotI site.
  • a transformation of the Escherichia coli XL1-Blue strain made competent then allows the amplification of the clone.
  • a rapid sequencing of 1.6 kb (between primers T3 and T7) according to the Sanger method was then carried out (SEQ ID No. 1).
  • the cloning in the mutant sta11-1 of the region corresponding to the gene for the enzyme D can be carried out, to determine the nature of the mutation leading to the absence of the protein in the mutant cell.
  • a comparative analysis of the wild and mutant sta11-1 strains under nitrogen deficient or normal conditions shows that the expression of the mutant sta11-1 phenotype is partially conditional. This indicates that the expressiveness of the mutation on the phenotype can vary depending on physiological conditions for the same organism. It is possible that these variations in expressiveness of the phenotype can be found from one plant species to another. It is possible to find conditions in which the decrease in the amount of starch does not occur while phenotypic modifications are observed (presence of oligosaccharides, modification of the structure of amylopectin).
  • a Ap ⁇ max, wavelength of the maximum absorbance of an iodized polysaccharide complex of amylopectin purified by gel filtration.
  • b quantity of insoluble polysaccharide, expressed in ⁇ g. 10 "6 cells, purified by sedimentation (measurement by standard assay of Pamyloglucosidase).
  • MOS quantity of soluble malto-oligosaccharides, expressed ⁇ g. 10 " 6 cells. 0.5 ⁇ g. 10 "6 cells corresponds to a plastid concentration of 10 mM if all the MOS were to be considered as maltotriose
  • d The percentage of amylose in the purified starch was calculated by gel filtration of the dispersed polysaccharides.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'obtention de plantes produisant des polysaccharides modifiés (tels que de l'amidon ou du glycogène), ces polysaccharides modifiés extraits de ces plantes et les produits préparés à partir de ces polysaccharides modifiés. L'invention concerne également un procédé d'obtention d'amidon modifié ou de glycogène modifié dans lequel on met en contact un amidon ou un glycogène avec une enzyme α-1,4 glucanotransférase.

Description

Procédé d'obtention de polysaccharides modifiés
La présente invention concerne un procédé d'obtention de plantes produisant des polysaccharides modifiés (tels que de l'amidon ou du glycogène), ces polysaccharides modifiés extraits de ces plantes et les produits préparés à partir de ces polysaccharides modifiés.
L'amidon est le polyoside de stockage énergétique chez les végétaux. Il constitue le principal apport calorique de l'alimentation animale et humaine et est également une source majeure de matière première végétale pour des utilisations non alimentaires. L'amidon est composé de deux fractions polysaccharidiques distinctes : l'amylose et l'amylopectine. L'amylose, qui représente la fraction minoritaire de l'amidon, est constitué de résidus glucose unis par des liaisons α-1 ,4, et présente moins de 1 % de ramifications. L'amylopectine, qui représente la fraction majoritaire de l'amidon, est constituée de résidus glucose unis par des liaisons α-1 ,4, et présente environ 5% de ramifications, constituées par des résidus de glucose liés au polymère principal par une liaison α-1 ,6. La distribution asymétrique de la ramification de l'amylopectine est responsable de la croissance illimitée des molécules et par conséquent des grains d'amidon, et rend également compte de la plupart des propriétés physico-chimiques de l'amidon.
La biosynthèse de l'amidon dépend d'une voie dont les étapes biochimiques principales sont la synthèse d'ADP-glucose suivie par le transfert de ce précurseur en position α-1 ,4 sur un glucane par des (ADP-glucose :1 ,4-α- D-glucane 4-α-D-glucosyl)transférases, le polymère formé étant ramifié par l'action des enzymes dites de ramification ou de « branchement » : les 1 ,4-α-D- glucane 6-α-D-(1 ,4-α-D-glucano)-transférases. La figure 1 annexée est un schéma simplifié du métabolisme de l'amidon jusqu'à présent connu de l'homme du métier. Les α-1 ,4 glucanotransférases (ou 4-α-D-glucanotransférases) végétales connues sont communément désignées par "enzymes D" pour "disproportionating enzymes" ("enzymes disproportionnantes "). Elles catalysent le transfert de glucane d'une molécule 1 ,4-α-glucane vers une autre (transglycosylation intermoléculaire). Les règles d'action de l'enzyme D sur des substrats oligosaccharidiques sont schématisées comme suit :
Schéma : Exemple d'activité disproportionnante par l'enzyme D sur le maltotriose
Accepteur (n) Donneur (x) <-> Produit (n + 2) + Donneur -2
*G~G~GOH + *G~G~GOH + *G~G~G~G~G0H + *G0H *G~G~G~G~GOH + *G~G~GOH <-> *G~G~G~G~G~G~G OH + *G0H
*G~G~GOH + *G~G~G~G~G~G~G OH <-> *G~G~G~G~G 0H + *G~G~G~G~G
OH
*G~G~G~G~GOH + *G~G~G~G~GOH <- *G~G~G~G~G~G~G OH + *G~G~G 0H
Le maltose ne peut servir de substrat donneur et seule une liaison à l'extrémité du maltotriose peut être attaquée. En outre, la première liaison du côté non-réducteur et l'avant-dernière liaison du côté réducteur sont résistantes à l'action de l'enzyme.
Takaha et al. ont rapporté au Congrès de l'AAB (Association of Applied Biologists) qui s'est tenu du 6 au 8 avril 1998, à Edinburgh, UK, (congrès sur le thème : « production et utilisation de l'amidon ») que des pommes de terre sans enzyme D poussaient plus lentement que les pommes de terre contrôles et que, malgré cela, la teneur en amidon présent dans les tubercules et sa composition apparaissaient normales en ce qui concerne notamment l'aspect des grains d'amidon en microscopie optique ou électronique, les proportions en amylose et amylopectine, le poids moléculaire de l'amylopectine débranchée et le nombre et la longueur des ramifications α- 1 ,6. Takaha et al. en ont conclu que l'enzyme D n'a pas un rôle direct sur les structures et les quantités d'amidon produit mais joue un rôle dans la croissance de la plante et son développement, l'amylopectine et l'amylose servant de molécules donneuses pour le transfert de maltooligosaccharide vers le glucose, permettant ainsi la dislocation et la solubilisation des grains d'amidon (Takada et al, 1998). De manière surprenante, les auteurs de la présente invention ont découvert que les α-1 ,4 glucanotransférases, et notamment les enzymes D sont en fait impliquées dans la biosynthèse de l'amidon, en transférant des oligosaccharides sur un précurseur de l'amylopectine. Ces enzymes peuvent en particulier transférer les oligosaccharides provenant du pool d'oligosaccharides produits in vivo par déramification du précurseur de l'amylopectine lors de la maturation de l'amylopectine. Elles peuvent notamment transférer les oligosaccharides pouvant contenir par exemple de 2 à 20, en particulier de 2 à 6, résidus de glucose. La figure 2 annexée présente le rôle de l'enzyme D dans le cycle du métabolisme de l'amidon, tel que découvert par les auteurs de la présente invention.
Cette découverte a été mise à profit pour modifier, en fonction du taux d'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase active présent, la distribution des longueurs des chaînes de l'amylopectine, présent en particulier dans les organes de réserve des plantes. L'invention s'applique aussi au glycogène, présent en plus faible quantité que l'amylopectine dans les plantes mais que l'on peut trouver par exemple dans les grains de maïs doux, en permettant de la même façon la modification de la distribution de la longueur des chaînes de glycogène.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un acide nucléique codant pour une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase glucanotransferase ou une séquence antisens de ladite séquence codant pour une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase, pour modifier la distribution de la longueur des chaînes externes de l'amidon (à savoir de l'amylopectine et/ou de l'amylose) ou du glycogène.
La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé de modification de la distribution de la longueur des chaînes de l'amylopectine d'un amidon ou des chaînes d'un glycogène dans lequel on augmente ou on diminue l'activité d'une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase dans les cellules d'une plante de telle sorte que ladite plante produise un amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la distribution de la longueur des chaînes de l'amylopectine ou produise un glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement par la distribution de la longueur de ses chaînes externes.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, on diminue le taux d'expression d'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase endogène, de façon à conduire à la production d'un amidon comprenant une amylopectine présentant un enrichissement en chaînes comportant moins de 6 résidus de glucose par rapport à un amidon produit naturellement. La diminution de l'expression d'une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase endogène peut être notamment réalisée selon le procédé comprenant les étapes consistant à : a) construire un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique antisens du gène codant pour ladite enzyme α-1 ,4 glucanotransferase endogène; b) transformer une cellule de plante avec ledit vecteur d'expression ; c) régénérer la plante à partir de la cellule transformée à l'étape b, ladite plante transgénique ainsi obtenue produisant un amidon comprenant une amylopectine dont la distribution des longueurs de chaînes est altérée, notamment dans le sens d'un enrichissement en chaînes comportant moins de 6 résidus de glucose.
De manière avantageuse, ladite cellule de plante transformée selon l'étape b) est également transformée par des séquences nucléotidiques antisens des gènes codant pour des enzymes affectant la répartition de la longueur des oligosaccharides produits lors du métabolisme de l'amidon, telles que les phosphorylases et les amylases.
Une autre possibilité pour réduire l'activité de l'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase dans les cellules des plantes est d'exprimer des ribozymes qui sont des molécules d'ARN qui agissent comme des enzymes catalysant spécifiquement le clivage des transcrits codant pour l'enzyme l'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase, par des techniques connues de l'homme du métier (EP 321 021 ). Il est également possible d'obtenir une plante présentant une altération de l'expression d'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase par le procédé dit "transwitch" décrit dans WO90/12084.
L'activité de l'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase endogène peut également être réduite par mutagénèse des cellules de plante soit par irradiation U.V ou par un agent mutagène chimique, soit par insertion de transposons. Les éléments transposables ont la capacité de perturber l'expression de gènes dans lesquels ils sont insérés et de générer des délétions, réarrangements, et mutations au locus cible (McClintock et al., 1950).
Une technique de mutagénèse par transposons qui peut être avantageusement utilisée est la mutagénèse par transposon Mutator confirmée par un criblage en génétique inverse (Bensen et a I., 1995) (Das et al., 1995). Cette technique met en œuvre les étapes consistant à croiser une lignée "Mutator" avec des hybrides des plantes d'intérêt puis à cribler les plantes F1 obtenues par PCR avec une amorce spécifique des transposons et une amorce spécifique de la séquence nucléotidique codant pour l'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase. Les graines F2 obtenues à partir des plantes criblées F1 permettent d'obtenir des plantes dont le phénotype est alors analysé.
Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, on augmente le taux d'expression d'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase dans la plante, de façon à conduire à la production d'un amidon comprenant une amylopectine présentant un enrichissement en chaînes comportant au moins 9 résidus de glucose par rapport à un amidon produit naturellement, ladite enzyme α-1 ,4 glucanotransferase étant identique à l'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase endogène ou étant d'origine hétérologue.
L'augmentation du taux d'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase peut être notamment réalisée selon le procédé comprenant les étapes consistant à : a) construire un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase, qui peut être une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase identique à l'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase endogène ou qui peut être d'origine hétérologue ; b) transformer une cellule de plante avec ledit vecteur d'expression ; c) régénérer la plante à partir de la cellule transformée à l'étape b), ladite plante transgénique ainsi obtenue produisant un amidon comprenant une amylopectine dont la distribution des longueurs de chaînes est altérée, notamment dans le sens d'un enrichissement en chaînes comportant au moins 9 résidus de glucose. De manière avantageuse, ladite cellule de plante transformée selon l'étape b) est également transformée par des séquences nucléotidiques codant pour des enzymes affectant la répartition de la longueur des oligosaccharides produits lors du métabolisme de l'amidon, telles que les phosphorylases et les amylases. De manière préférentielle, l'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase visée est une enzyme D.
Ladite séquence nucléotidique codant pour une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase peut être d'origine hétérologue. Elle peut ainsi correspondre notamment à une enzyme choisie parmi l'enzyme D de la pomme de terre (Takaha et al, 1993) ou l'enzyme D de Chlamydomonas reinhardtii.
Est également compris dans l'invention un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi la séquence SEQ ID n° 1 , une séquence homologue et un fragment de cette séquence codant pour une protéine présentant une activité enzymatique d'α-1 ,4 glucanotransferase. L'invention comprend encore les séquences complémentaires de la séquence SEQ ID n°1 ou de ses homologues et fragment, pouvant servir de séquences antisens dans le procédé de l'invention.
La séquence SEQ ID n° 1 représente un fragment d'ADN génomique du gène codant pour l'enzyme D de Chlamydomonas reinhardtii. Par "séquence nucléotidique homologue", on entend toute séquence nucléotidique qui diffère de la séquence SEQ ID n° 1 par substitution, délétion, et/ou insertion d'un nucléotide ou d'un nombre réduit de nucléotides, à des positions telles que ces séquences nucléotidiques homologues codent pour des polypeptides homologues tels que définis ci- après.
De préférence, une telle séquence nucléotidique homologue est identique à au moins 75 % de la séquence SEQ ID n° 1 , de préférence moins 85 %, de préférence encore au moins 95 %.
De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement à la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID n° 1 , dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à laquelle 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm=81 , 5+0,41 (%G+C)+16, 6Log(concentration en cations) —
0,63(%formamide) -(600/nombre de bases) (Sambrook et al, Molecular
Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989, pages 9.54-9.62).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4(G+C) + 2 (A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspécifiques n'hybrident pas, la température d'hybridation est approximativement de 5 à 30°C, de préférence de 5 à 10°C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple.
Par « fragment nucléotidique », on entend tout fragment de la séquence SEQ ID n° 1 , ou des séquences nucléotidiques homologues de la séquence SEQID n° 1 , qui code pour un peptide ou une protéine présentant une activité enzymatique d'α-1 ,4 glucanotransferase, telle que définie précédemment.
La présente invention a également pour objet un vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant une séquence nucléotidique telle que définie précédemment.
La construction d'un vecteur d'expression mentionné ci-dessus est à la portée de l'homme du métier suivant les techniques standard. Ledit vecteur d'expression peut contenir une séquence nucléotidique antisens du gène codant pour ladite enzyme α-1 ,4 glucanotransferase endogène, selon le premier mode de réalisation de l'invention, ou une séquence nucléotidique codant pour une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase, selon le deuxième mode de réalisation de l'invention. La séquence nucléotidique codant pour une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase est associée aux éléments permettant son expression dans la plante, à savoir notamment un promoteur et un terminateur de transcription.
La transformation de cellules végétales peut être réalisée par transfert des vecteurs susmentionnés dans les protoplastes, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol en présence de cations divalents (Ca2+).
La transformation des cellules végétales peut également être réalisée par électroporation notamment selon la méthode décrite dans l'article de Fromm et al., 1986.
La transformation des cellules végétales peut également être réalisée par utilisation d'un canon à gène permettant la projection, à très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes des séquences d'ADN d'intérêt, délivrant ainsi des gènes à l'intérieur du noyau cellulaire, notamment selon la technique décrite dans l'article de Sanford, (1988).
Une autre méthode de transformation des cellules végétales, est celle de la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transformées par biolistique, c'est-à- dire par projection, au moyen d'un canon à particules, de microparticules recouvertes des séquences nucléotidiques à transférer (J. Finner, 1992).
Selon un autre mode de réalisation du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transformées par un vecteur selon l'invention, ledit hôte cellulaire étant susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences d'ADN d'intérêt initialement contenues dans le génome du vecteur susmentionné.
Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans l'article d'An et al., 1986, ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Jouanin et al., 1987.
De manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du piasmide circulaire extra-chromosomique inducteur de tumeurs Ti d' 'Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (Watson et al.).
Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un piasmide Ti auxiliaire, piasmide modifié qui n'a plus d'ADN-T mais contient toujours les gènes de virulence vir, nécessaires à la transformation de la cellule végétale. Ce piasmide est maintenu dans Agrobacterium.
Parmi les terminateurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer le terminateur polyA 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur
(CaMV), décrit dans l'article de Franck et al., (1980), ou le terminateur polyA
NOS, qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase du piasmide Ti à' Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline
(Depicker et al., 1982). Parmi les promoteurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer notamment :
- le promoteur 35S, ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (pd35S) du CaMV, décrits dans l'article de Kay et al., 1987 ;
- le promoteur PCRU du gène de la cruciférine de radis permettant l'expression des séquences associées uniquement dans les semences (ou graines) de la plante transgénique obtenue ;
- les promoteurs PGEA1 et PGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEA1 et GEA6, respectivement, d'Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993) et permettant une expression spécifique dans les graines ;
- le promoteur chimérique super-promoteur PSP (Ni M et al., 1995), constitué de la fusion d'une triple répétition d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de l'octopine synthase d'Agrobacterium tumefaciens, d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de mannopine synthase et du promoteur mannopine synthase d'Agrobacterium tumefaciens ;
- le promoteur actine du riz suivi de l'intron actine de riz (PAR- IAR) contenu dans le piasmide pAct1-F4 décrit par Me Elroy et al., 1991 ;
- le promoteur HMGW (High Molecular Weight Glutenine) d'orge ;
- le promoteur du gène de γzéine de maïs (Pγzéine) contenu dans le piasmide pγ63, et permettant l'expression dans l'albumen des semences de maïs.
Parmi les cellules végétales susceptibles d'être transformées conformément à la présente invention, on peut citer celles de la pomme de terre, du blé, du maïs et du riz.
La présente invention a également pour objet une plante ou partie de plante telle que notamment la pomme de terre, le blé, le maïs ou le riz, produisant un amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la distribution des longueurs de ses chaînes externes ou produisant du glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement par la distribution de la longueur de ses chaînes externes, ladite plante ou partie de plante étant obtenue par le procédé de l'invention tel que décrit précédemment.
Par « partie de plante », on entend notamment les organes de réserve naturellement riches en amidon, tels que les graines ou les tubercules, ou les organes naturellement riches en glycogène, par exemple les grains de maïVdoux. Par « partie de plante », on entend également les cellules de ladite plante.
L'invention concerne également un procédé d'obtention d'amidon modifié ou de glycogène modifié dans lequel on met en contact un amidon ou un glycogène avec une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase.
La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'obtention d'amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la distribution des longueurs de ses chaînes externes, dans lequel : on extrait l'amidon modifié à partir des plantes ou parties de plantes obtenues selon le procédé de l'invention, tel que décrit précédemment. ou on met en contact un amidon, préalablement extrait de plantes ou parties de plantes puis solubilisé, avec une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase, en présence de polysaccharides ou d'oligosaccharides éventuellement modifiés. L'extraction de cet amidon est réalisée selon les techniques standard connues de l'homme du métier. La solubilisation de l'amidon est également connue de l'homme du métier et peut être réalisée par trempage et fractionnement du grain d'amidon (Whistler et al, (1967)), ou par exemple par chauffage. De manière alternative, on peut utiliser des enzymes déstructurant l'amidon, telles que les amylases.
Selon un mode de réalisation de l'invention, on met en contact ledit amidon solubilisé avec une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase, telle qu'une enzyme D, en présence de saccharides. Lesdits saccharides peuvent être en particulier des oligosaccharides modifiés chimiquement, de façon à modifier les propriétés de l'amidon, par exemple sa digestibilité.
De manière avantageuse, on peut ajouter à l'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase des enzymes affectant la répartition de la longueur des oligosaccharides produits lors du métabolisme de l'amidon, telles que les phosphorylases et les amylases.
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention de glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement (par les plantes ou par un organisme animal) par la distribution des longueurs de ses chaînes externes, dans lequel : - on extrait le glycogène modifié à partir des plantes ou parties de plantes obtenues selon le procédé de l'invention, tel que décrit précédemment. ou on met en contact un glycogène (d'origine végétale ou animale) avec une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase, en présence de polysaccharides ou d'oligosaccharides éventuellement modifiés.
Ladite enzyme α-1 ,4 glucanotransferase, telle qu'une enzyme D, mise en contact avec l'amidon ou le glycogène, peut provenir de la même espèce de plante que celle dont on extrait l'amidon ou peut avoir une origine hétérologue. On peut en particulier choisir l'enzyme D parmi l'enzyme D de la pomme de terre (Takaha et al, 1993) ou l'enzyme D de Chlamydomonas reinhardtii de 62 kD telle que définie ci-après. De manière avantageuse l'enzyme D utilisée est thermostable.
L'enzyme D de Chlamydomonas reinhardtii est purifiée par le procédé comprenant les étapes consistant à : - centrifuger la souche Chlamydomonas reinhardtii;
- précipiter la fraction acellulaire au sulfate de protamine ;
- passer le surnageant obtenu à l'étape précédente sur une chromatographie d'échange d'anions ;
- soumettre la fraction non retenue à l'étape précédente à une précipitation différentielle au sulfate d'ammonium ;
- soumettre le surnageant obtenu à l'étape précédente à une chromatographie de tamisage moléculaire ;
- concentrer par une chromatographie d'échange de cations le culot obtenu à l'étape précédente. L'enzyme D de Chlamydomonas reinhardtii purifiée ainsi obtenue a un poids moléculaire de 62kD. Plus généralement, on peut utiliser, comme protéine présentant une activité enzymatique α-1 ,4 glucanotransferase, une protéine ou un peptide codé par un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi la séquence SEQ ID n° 1 , une séquence homologue ou un fragment de cette séquence.
La présente invention a également pour objet l'amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la distribution des longueurs de ses chaînes, ledit amidon modifié étant obtenu par le procédé de l'invention. En particulier l'amidon modifié obtenu par extraction et solubilisation de l'amidon de plantes ou parties de plantes, puis mise en contact dudit amidon solubilisé avec une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase, éventuellement en présence de saccharides, comporte une amylopectine dont la distribution des longueurs des chaînes externes est modifiée par rapport à un amidon produit naturellement.
La présente invention a également pour objet le glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement (par exemple par les plantes, mais aussi du glycogène d'origine animale), par la distribution des longueurs de ses chaînes, ledit glycogène modifié étant obtenu par le procédé de l'invention.
L'amidon modifié conformément à la présente invention peut être utilisé directement ou hydrolyse afin de produire des oligosaccharides d'intérêt
(en particulier le glucose). L'obtention d'amidon modifié conformément à l'invention peut permettre de diminuer les quantités d'enzymes nécessaires pour une telle hydrolyse.
Par ailleurs, l'amidon modifié conformément à l'invention peut être utilisé lors de la fabrication de divers aliments, en particulier en tant qu'additif augmentant la viscosité ou favorisant la formation d'un gel.
L'amidon modifié conformément à l'invention peut également être utilisé dans de nombreuses industries : industrie du papier et du carton, industrie des adhésifs, industrie textile, industrie pharmaceutique (pour la formulation des médicaments), etc.
L'amidon modifié conformément à l'invention peut également subir d'autres modifications, en particulier des modifications chimiques telles qu'un traitement acide, une oxydation, une estérification, etc avant son utilisation. La présente invention a également pour objet l'utilisation de cet amidon modifié ou de ce glycogène modifié pour la préparation de produits dérivés, notamment de produits alimentaires. La présente invention a également pour objet les produits ainsi préparés comprenant de l'amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la longueur de ses chaînes externes ou du glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement par la longueur de ses chaînes externes.
Les figures et exemples ci-après illustrent l'invention sans en limiter la portée.
LEGENDES DES FIGURES :
La figure 1 représente un schéma simplifié du métabolisme de l'amidon jusqu'à présent connu de l'homme du métier. Toutes les étapes décrites sont compartimentées dans le plaste.
©. Phosphoglucomutase
©. ADP-glucose pyrophosphorylase
®. Amidon synthétases solubles et liées
®. Enzymes de branchement ©. Phosphorylase
©. Amylases, enzymes de débranchement, maltases
®. Hexokinase
Glc=glucose ; Pi≈phosphate inorganique
La figure 2 représente un schéma simplifié de la synthèse d'amylopectine, dans lequel est mis en évidence le rôle de l'enzyme D.
Toutes les étapes décrites sont compartimentées dans le plaste :
©.Conversion du G-6-P en G-1 P par la phosphoglucomutase plastidiale
©.Synthèse du glycosylnucléotide précurseur ADP-glucose par l'ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase)
®. Elongation par les amidons synthétases solubles (SS)
©. ramification par les enzymes de branchement (BE) ©. débranchement par l'isoamylase (DBE) et libération d'oligosaccharides (MOS)
©. réinsertion des oligosaccharides produits par débranchement par l'enzyme D. WSP≈Polysaccharides solubles dans l'eau ;
MOS≈Maltooligosaccharides; G-6-P= glucose-6-phosphate ; Glc≈glucose.
Le coût énergétique d'épissage par le DBE et l'enzyme D décrite dans cette invention est de 2 ATP par glucane clivé et réintroduit dans l'amylopectine en © (WSP111). Ce coût découle de la réactivation du glucose produit par l'enzyme D en ADP-glucose. Le pointillé tracé à partir de WSP1" illustre la possibilité offerte au polysaccharide de reservir de substrat d'élongation tant que la structure requise pour l'insolubilisation dans le grain n'aura pas été atteinte. L'entrée et la sortie du cycle sont illustrées par les flèches en traits gras et sont constituées d'une part par la synthèse d'ADP- glucose et d'autre part par la cristallisation et l'insolubilisation du polysaccharide à la surface du grain.
La synthèse d'amylose est postérieure à l'insolubilisation et se réalise exclusivement dans le granule.
La figure 3A représente la distribution des longueurs des oligosaccharides solubles non débranchés accumulés par la souche mutante JV45J de Chlamydomonas reinhardtii.
La figure 3B représente la distribution de longueurs des chaînes de l'amylopectine débranchée de la souche Chlamydomonas reinhardtii sauvage. La figure 3C représente la distribution de longueurs des chaînes de l'amylopectine débranchée de la souche mutante JV45J Chlamydomonas reinhardtii.
La figure 3D représente la distribution de longueurs des chaînes de l'amylopectine débranchée de maïs « waxy » avec l'enzyme D pure de Chlamydomonas reinhardtii en l'absence d'oligosaccharides.
La figure 3E représente la distribution de longueurs du maltotriose incubé avec l'enzyme D pure de Chlamydomonas reinhardtii. La figure 4 représente l'incorporation de maltooligosaccharides sur l'amylopectine de la souche sauvage de Chlamydomonas reinhardtii.
La figure 5 représente la séparation de l'amylopectine et de l'amylose des amidons de JV45J (sta11-1) et de 137C (wt) sur chromatographie de filtration sur gel CL-2B. Le mutant JV45J est représenté par l'amidon radiomarqué (DPM) et la souche 137C est représentée par l'absorbance.
EXEMPLES : Les auteurs de la présente invention ont étudié la biosynthèse de l'amidon à partir d'un modèle approprié : l'algue Chlamydomonas reinhardtii (Buléon et al, 1997). En effet cet organisme unicellulaire stocke un amidon qui est identique à celui stocké dans l'albumen des céréales et contient en outre les mêmes enzymes de biosynthèse de l'amidon. Les auteurs de la présente invention ont sélectionné un nouveau mutant de l'algue Chlamydomonas reinhardtii accumulant de petits oligosaccharides linéaires et présentant un taux de synthèse d'amidon réduit de 90% (Exemple 1 ).
L'amidon résiduel comporte une structure modifiée nouvelle caractérisée par un enrichissement en amylose et par une amylopectine dont les chaînes ultra-courtes (environ 2, 3, ou 4 résidus de glucose) sont surabondantes relativement aux chaînes de longueur moyenne (environ de 9 à 18 résidus de glucose) (Exemples 2 et 31
Les auteurs de la présente invention ont en outre montré que ce mutant était dépourvu d'une protéine de 62kD normalement présente chez les souches sauvages de Chlamydomonas reinhardtii, ont identifié cette protéine comme étant une 4-α-D-glucanotransférase (enzyme D), et ont mis en évidence de nouvelles fonctions de cette enzyme D vis-à-vis des polysaccharides (Exemple 4). Ces résultats peuvent être mis à profit pour obtenir des plantes transgéniques productrice de polysaccharides (amidon, glycogène) modifiés (Exemple 5). Les auteurs de la présente invention ont en outre mis en évidence le rôle de l'enzyme D dans la dégradation de malto-oligosaccharides par la phosphorylase (Exemple 6).
Les auteurs de la présente invention sont par ailleurs parvenus à cloner les séquences codant pour l'enzyme D de Chlamydomonas reinhardtii (Exemple 7).
Ils ont enfin montré que l'expression de la mutation pouvait varier en fonction des conditions physiologiques (Exemple 8).
EXEMPLE 1 :
Isolement du mutant sta 11 de Chlamydomonas reinhardtii
Sélection de la souche JV45J de Chlamydomonas reinhardti Au cours d'une mutagénèse UV (12 % de survie) réalisée sur la souche sauvage de référence 137C de Chlamydomonas reinhardtii, 5.104 plages cellulaires carencées en azote ont été criblées par une méthode de vaporisation d'iode (Delrue et al., 1992). Toutes les souches renfermant moins de 20 % de la quantité normale d'amidon accumulée par la souche 137C sont repérées par leur coloration jaune et ont été caractérisées. Un échantillon de cinq souches sauvages et sept mutants est inoculé en plage cellulaire sur un milieu carence en azote. Les plages ont été vaporisées à deux reprises après cinq jours d'incubation en lumière vive continue. Les plages jaunes contiennent moins de 12 % de la quantité d'amidon accumulées par les plages noires. La teintσ olive observée chez certaines plages peu colorées suggèrent l'existence d'un amidon résiduel enrichi en amylose. Parmi ces souches, ont été sélectionnées celles qui affichaient une complémentation en trans avec des mutants porteurs de sta-1, sta6-1 :: ARG7, sta7-1::ARG7, sta5-1 qui sont défectueux pour les loci codant pour la grosse et la petite sous-unité de l'AGPase (STA1 et STA6) pour l'isoamylase de 88 kDa (STA7) ou pour la phosphoglucomutase plastidiale (STA5). Seule une souche parmi les 5.104 colonies (JV45J) faisant preuve d'une réduction de 90 à 95 % de la quantité d'amidon synthétisée en conditions d'accumulation (carence en azote) a été retenue après cette sélection. Ce mutant a ensuite été croisé avec une souche sauvage et 257 produits de méiose ont respectivement classé en 1 19 souches de phénotype mutant pour 128 clones d'aspect sauvage.
Un nouveau type de mutant (JV45J), qui accumule 4 % de la quantité normale en amidon, a ainsi pu être isolé. Le caractère responsable du phénotype défectueux se comporte comme un caractère récessif mendélien au vu de la ségrégation après croisement, et définit un nouveau locus génétique nommé STA11, puisque la mutation complémente en trans et recombine avec l'ensemble des défectuosités testées.
EXEMPLE 2 :
Caractérisation des polysaccharides du mutant sta11
Les polysaccharides présents dans les souches porteuses de
STA11 ont été isolés. En plus de l'amidon granulaire, les mutants sta11-1 accumulent une quantité équivalente (5 %) de glucanes solubles, les malto- oligosaccharides de petite taille (figure 3A).
La présence simultanée d'une fraction d'oligosaccharides et du phénotype "pauvre en amidon" a été retrouvée dans toutes les souches portant la mutation sta11-1 (n=50). La structure résiduelle de l'amidon granulaire a été mesurée par différentes techniques incluant l'analyse d'une diffraction grand- angle aux rayons X , la microscopie électronique à transmission (TEM) et la microscopie électronique à balayage (SEM), la séparation de l'amylose et l'amytopectine par chromatographie sur gel filtration, la RMN (Résonnance Magnétique Nucléaire) du proton et le débranchement enzymatique sur l'amylose et l'amylopectine ainsi purifiées.
1. L'amidon granulaire L'amidon granulaire et les glucanes solubles ont été analysés séparément. L'amidon dispersé dans le DMSO aqueux et délipidé par une précipitation avec quatre volumes d'éthanol a été resuspendu dans 10 mM NaOH pour être ensuite fractionné par chromatographie de tamisage moléculaire sur gel de sépharose CL2B.
a) Composition en amylose et amlyopectine (filtration sur gel). La séparation de l'amylopectine et de l'amylose est opérée par gel filtration de la souche mutante JV45J et la référence sauvage 137C. L'amidon dissous dans 10 mM NaOH a été fractionné par chromatographie de tamisage moléculaire selon la méthode décrite par Delrue et al. (1992). Un échantillon de chaque fraction a été coloré à l'iode et le spectre complet du complexe polysaccharide-iode a été enregistré. Des dosages à l'amyloglucosidase ont révélé la présence de 30 % d'amylose (15 % pour la référence sauvage). Relativement à la souche sauvage, l'amylopectine est caractérisée par une λmax du complexe polysaccharide-iode qui s'est accru de 20 à 30 nm (de 550 à 570-580 nm). Cette dernière caractéristique est retrouvée dans un grand nombre d'amidons enrichis en amylose.
Les profils de filtration sur gel décrits montrent un doublement de la quantité d'amylose chez le mutant par rapport au sauvage ainsi qu'une modification apparente de la distribution en longueur de chaînes de la fraction amylosique. Une nouvelle analyse de ségrégation de l'amylopectine et de l'amylose sur chromatographie de filtration sur gel CL-2B a été réalisée à partir de 500μg d'amidon de JV45J (sta11-1) marqué au 14C et 10 mg d'amidon de 137C. Les résultats (Fig. 5) tendent à confirmer les données de l'étude de co- ségrégation, c'est-à-dire une diminution de la longueur des chaînes d'amylose produites par la souche JV45J ; l'amylose apparaît donc comme plus abondante et de moindre masse.
Un comptage radioactif et l'absorbance sont déterminés pour chaque fraction. L'élution de la colonne s'effectue dans de la soude 10 mM.
b) forme des granules et structure cristalline
Les diffractogrammes des rayons X montrent un changement du réseau cristallin du type A sauvage de forte cristallinité vers un mélange de types A et B de cristallinités beaucoup plus faibles. La forme des granules est particulièrement altérée et leur taille globale est réduite. En fait, la souche sauvage présente globalement des grains à surface lisse tandis que le mutant présente des grains de taille plus réduite avec une surface de grains rugueuse et irrégulière.
2. Les glucanes solubles : malto-oligosaccharide de petite taille La fraction des glucanes solubles (WSP) a été soumise à une triple extraction au méthanol chloroforme. La phase aqueuse a été lyophilisée et le culot sec redissous dans un tampon et fractionné par chromatographie de tamisage moléculaire sur colonne de TSK-HW-50 comme l'ont décrit Mouille et al., 1996. Contrairement aux fractions solubles (WSP) purifiées à partir de mutants déficients en isoamylase, aucun phytoglycogène ou autre polysaccharide soluble de masse importante n'a été trouvé. Par contre, la fraction WSP accumulée par les mutants sta11 est constituée exclusivement par des oligosacharides peu ramifiés (moins de 1 , 5 % de branchements) de faible masse (figure 3A).
EXEMPLE 3 : Mise en évidence d'une modification de l'amylopectine.
Débranchement enzymatique à l'isoamylase et examen de la distribution de longueur de chaînes :
Les fractions amylose et amylopectine obtenues par chromatographie de tamisage moléculaire ont ensuite subi un débranchement enzymatique à l'isoamylase suivi d'une séparation électrophorétique des chaînes débranchées. Les résultats illustrés par la figure 3 établissent la nouveauté de la structure présentée par l'amylopectine de la souche JV45J. En effet, l'amylopectine présente un accroissement en chaînes traditionnellement absent de la structure.
Un marquage par l'APTS (acide 8-amino-1 ,3,6- pyrènetrisulfonique) a été effectué sur les extrémités réductrices avant de séparer les chaînes en fonction de leur longueur sur gel de séquence. Alors qu'aucun changement n'est détecté au niveau de la distribution des longueurs de chaînes de l'amylose, une modification significative de la distribution des très courtes longueurs de chaînes est observée pour l'amylopectine (figure 3C comparée à figure 3B). La distribution de la longueur des chaînes de l'amylopectine des souches sauvage et mutante après débranchement à l'isoamylase, a été confirmée par électrophorèse capillaire des glucanes marqués à l'APTS selon la méthode décrite par O'Shea et al., 1996. Une modification significative de la distribution des très courtes chaînes est observée chez le mutant JV45J, comparativement à la souche sauvage. Une analyse soustractive, dans laquelle le pourcentage différentiel de la masse totale de chaque oligosaccharide est obtenu par soustraction de la distribution de longueur de chaîne des amylopectines débranchées, confirme l'enrichissement trouvé dans les mutants de la gamme des glucanes extra-courts (DP 3, 4, 5 aux dépends de DP6 à DP1 1 ). Ces données confirment l'action de l'enzyme D in vivo sur la structure de l'amylopectine.
EXEMPLE 4 : Nouvelles fonctions de l'enzyme D
1 . Détection de la défectuosité enzvmologique dans les mutants et action de l'enzyme D sur les polysaccharides.
La détection de la défectuosité a été réalisée selon une technique de zymogramme sous conditions dénaturantes (Mouille et al., 1996). De plus, une étude enzymologique détaillée a été effectuée en extraits bruts et semi- purifiés pour toutes les enzymes connues susceptibles de participer à la biosynthèse de l'amidon.
Cette étude implique des mesures quantitatives et qualitatives des activités enzymatiques, parallèlement à des caractérisations cinétiques et des analyses des profils d'élution sur colonnes Mono-Q échangeuse d'anion (chromatographie FLPC). Les enzymes testées sont les suivantes : ADP- glucose pyrophosphorylase, phosphoglucomutase, amidon synthétase soluble I, amidon synthétase soluble II, amidon synthétase liée au granule, enzymes de branchement (deux types), enzymes de débranchement (pullulanase et isoamylase), phosphorylases et toutes les hydrolases de l'amidon qui peuvent être détectées dans des gels de zymogramme contenant de l'amidon. Aucune différence qualitative ou quantitative de ces activités enzymatiques n'a co- ségrégé avec le gène mutant.
Lors de la réalisation de zymogrammes en conditions dénaturantes, l'absence d'une bande de 62 kD se colorant en rouge foncé à l'iode a été visualisée dans les produits de méiose portant la mutation sta11-1 sur zymogramme en présence d'amidon ou d'amylopectine alors que cette bande de 62 kD apparaît distinctement chez les ségrégeants sauvages (n=75). Selon la technique mise au point par Mouille et al., 1996), le polysaccharide d'une bande de gel a été élue, le produit a été soumis à une analyse RMN. Le spectre du proton de l'amylopectine incubée s'était considérablement modifiée. En fait, le signal bimodal du proton, initialement de 5,3 à 5,2 ppm a été remplacé par un signal monomodal à la même position de 5,2 ppm, dans les conditions standard de RMN.
2. Purification de l'enzyme et activité de transfert de glucanes. Une purification nécessite 20 litres de culture d'une souche sauvage de Chlamydomonas reinhardtii en milieu TAP (Harris, 1989) pendant trois jours afin d'obtenir une densité cellulaire de 2 x 106 cellules par ml. Après centrifugation à 3000 rpm pendant 10 minutes, le culot cellulaire est passé deux fois à la presse de French et immédiatement congelé à -80°C. Cet extrait brut décongelé est centrifugé 20 minutes à 1000 rpm à 4°C. Les protéines de l'extrait (350 à 500 mg) sont dosées par la méthode de Bradford (kit de dosage Bio-rad).
Le surnageant est précipité par de la protamine sulfate 5 % (40 μl par ml d'extrait 15 minutes dans la glace) puis centrifugé à 10000 rpm pendant 20 minutes à 4°C.
Le surnageant (200 à 400 mg de protéines) est injecté grâce à un programme de multi-injections sur une colonne échangeuse d'ions MonoQ (Pharmacia HR 10/10 d'un volume de 9 ml, débit : 2 ml. min"1) équilibrée dans un tampon acétate de sodium 50 mM, DTT 2 mM (pH 6 par l'acide acétique).
La fraction non retenue (40 à 70 mg) subit une première précipitation au sulfate d'ammonium 30 % (176 mg/ml) 45 minutes à 4°C puis est centrifugée à 1 000 rpm pendant 20 minutes.
Le surnageant (30 à 60 mg) est ensuite précipité à 50 % 45 minutes à 4°C (126 mg/ml) puis est centrifugé à 10000 rpm pendant 20 minutes.
Le culot (10 à 20 mg de protéines) est resuspendu dans 2 ml de tampon acétate de sodium 50 mM, DTT 2 mM pH 6 puis injecté sur gel filtration
S 100 (FPLC ; Pharmacia séphacryl 2,6 x 60 cm ; débit : 2 ml. min"1 ; volume de fraction : 2 ml ; support alkyl dextran ponté par du N,N' méthylène bisacrylamide ; gel sphérique d'un diamètre de 25 à 75 μm ; gamme de fractionnement : 1000 à 10000) équilibrée dans le même tampon. Les fractions d'intérêt sont collectées 30 minutes après l'injection puis repérées par révélation de l'activité sur zymogrammes selon la technique décrite par Mouille et al., (1996). L'enzyme d'intérêt est retrouvée dans les fractions 14 à 26. Ces fractions sont rassemblées et concentrées à l'aide d'une colonne échangeuse de cations UnoS12 commercialisée par Bio-Rad (gel d'un volume de 15 x 68 mm greffé de groupes d'acide sulfonique) dans un tampon acétate de sodium
50mM, DTT 2 mM. L'enzyme disproportionnante est éluée par un gradient continu de NaCI (tampon acétate de sodium 50 mM, NaCI 1 M) et l'enzyme est récupérée dans les fractions correspondant à l'élution par le NaCI 50 %.
Toutes les colonnes sont effectuées en FPLC sur un appareil Pharmacia LCC-500.
L'enzyme pure a reproduit les effets observés sur l'amylopectine par RMN du proton. L'incubation d'amylopectine avec l'enzyme pure a conduit des changements importants dans la distribution des chaînes longues de l'amylopectine (figure 3D). L'action sur l'amylopectine a pu être précisée par débranchement du produit incubé avant et après traitement à la β-amylase.
Comme les β-amylases sont des enzymes processives qui digèrent sélectivement les chaînes extérieures des polysaccharides, le résultat obtenu montre que les modifications majeures sont restreintes aux chaînes externes du polymère. Il est important de noter qu'aucun oligosaccharide n'est libéré dans le processus alors que la quantité de liaisons α-1 ,6 reste constante. L'enzyme de 62kD est donc une α-1 ,4 glucanotransferase dont la fonction est de cliver les liaisons α-1 ,4 présentes sur les chaînes externes du donneur amylopectine pour les transférer aux extrémités non réductrices de chaînes voisines extérieures de l'accepteur. Dans les plantes, les seules α-1 ,4 glucanotransférases connues pour être présentes lors de la synthèse de l'amidon, sont communément appelées enzymes D. Elles sont connues pour agir sur des oligosaccharides solubles longs d'au moins trois résidus glucose (maltotriose) pour donner des oligosaccharides de longueurs variables aux dépends de la formation du glucose. La réaction consiste en un clivage d'un glucane donneur et un transfert sur une chaîne récepteur.
L'action de l'enzyme de 62 kD identifiée a parallèlement été testée sur le glucose, le maltose, le maltotriose, le maltotetraose, le maltopentaose, le maltohexaose et le maltoheptaose l'enzyme disproportionne avec succès tous les oligosaccharides plus longs que le maltose et le glucose, sur lesquels elle n'a aucune action. Ses effets sur le maltotriose ont été décrits à la figure 3E. Les très faibles quantités de maltose dans tous les cas confirment que l'enzyme obéit aux règles présentées précédemment définissant l'action des enzymes disproportionnantes.
Le protocole de purification de l'enzyme D peut être modifié, par exemple selon la variante suivante :
Le surnageant obtenu après centrifugation de l'extrait brut tel que décrit à l'exemple 3 est précipité par de la protamine sulfate (50 μl de protamine sulfate 10% par ml d'extrait 15 minutes dans la glace) puis centrifugé à 10000 rpm pendant 20 minutes à 4°C.
Le surnageant (200 à 400 mg de protéines) est ensuite injecté grâce à un programme de multi-injections sur une colonne échangeuse d'anions MonoQ (Pharmacia HR10/10 d'un volume de 9 ml, débit : 2ml. min"1) couplée à une colonne échangeuse de cations UNO-S12 (BIO-RAD d'un volume de 12 ml, débit : 2 ml. min"1). Ces deux colonnes sont équilibrées dans un tampon acétate de sodium 50mM, DTT 2mM (pH 6 par acide acétique). L'élution se fait par un palier de 30 mn à 5% NaCI. Les fractions d'intérêt sont recueillies puis repérées par révélation de l'activité sur zymogrammes amidon. 300 μl d'échantillon sont déposés sur colonne d'affinité maltotriose (SIGMA : Maltotriose immobilisé sur de l'agarose. Volume : 1ml) équilibrée dans un tampon acétate de Sodium 50mM, DTT 2mM (pH 6 par acide acétique). La colonne est lavée par 2 ml de ce même tampon et l'élution se fait par un tampon acétate de sodium 50 mM, NaCI 1M.
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L'activité ainsi purifiée se manifeste à un pH optimum entre pH5 et pH7.5 et diminue de façon significative au-dessus de pH9.
3. Incorporation d'oligosaccharides sur les chaînes externes de glycogène L'incorporation de maltooligosaccharides marqués sur le glycogène, donne un exemple supplémentaire de l'activité de l'enzyme D mise en évidence sur l'amylopectine, avec la procédure du zymogramme. La co- élution de la bande à 62kD (enzyme-D) manifeste une activité enzymatique retrouvée dans les procédures zymogramme et tests quantitatifs de purification de l'enzyme. Une coségrégation entre la présence des 3 activités (production de glucose à partir de maltotriose, modification de l'amylopectine et incorporation de glucanes débranchés dans le glycogène) et l'allèle sauvage STA11 dans les individus issus des croisements entre les souches sauvage et mutante de Chlamydomonas a également été démontrée. Pour la mise en évidence de l'incorporation de maltooligosaccharides marqués de longueur contrôlée (DP1 : glucose à DP7 : maltoheptaose), la procédure de zymogramme décrite à l'exemple 3 a été suivie : 100 et 300 μg d'extraits bruts de protéines ont été chargés sur des gels contenant du glycogène et mis à incuber séparément avec 2mM DP1 (glucose) à DP7 (maltoheptaose) ou sans malto-oligosaccharides (témoin négatif), pendant la nuit à température ambiante. L'apparition d'une bande à 62 kD avec la longueur croissante du substrat donneur montre que l'efficacité de transfert sur les chaînes externes de glycogène augmente avec la longueur de la chaîne donneuse. Aucun marquage n'est observé lorsque le maltotriose est utilisé comme substrat donneur, même à très forte concentration de substrat (20mM) et après une incubation prolongée (48h). Les glucanes plus longs que le maltotetraose définissent donc le substrat actuel préféré pour la réaction d'incorporation. Ceux-ci seraient produits in vivo au cours de la maturation de la pré-amylopectine par les isoamylases.
Le système zymogramme mime assez bien la synthèse de polysaccharide à la surface du granule d'amidon en ce qu'il permet aux oligosaccharides de diffuser librement dans un large volume de tampon tandis que le polysaccharide est retenu dans un petit volume du gel, là où se manifeste une forte activité enzymatique spécifique.
4. Nouvelle fonction polvmérase de l'enzvme P. Des oligosaccharides sont marqués radioactivement au 14C par débranchement in vivo de l'amylopectine marquée. Il a été vérifié que la distribution de la longueur des chaînes dans le mélange des chaînes débranchées correspondait à celle présentée à la figure 3B.
L'incorporation des oligosaccharides dans l'amylopectine (figure 4) oα le glycogène de foie de lapin a été mesurée avec succès, à des concentrations physiologiques en maltooligosaccharides. En effet, l'enzyme D a manifesté une activité polymerase très efficace sur le glycogène et sur l'amylopectine. Les substrats et produits de la réaction ont été séparés par chromatographie de tamisage moléculaire en gel de TSK-HW-50 (glycogène) ou en sépharose CL2B.
L'incorporation du marquage des maltooligosaccharides sur l'amylopectine fournit un essai plus fiable sur l'activité de l'enzyme D comparativement à la production de glucose. Il a par ailleurs été mis en évidence que la polymérisation in vitro était localisée sur les chaînes externes de l'amylopectine. En effet, le signal de radioactivité incorporée dans le polysaccharide disparaît lorsque l'amylopectine qui a subi l'incorporation des oligosaccharides est mise en présence de β- amylase, enzyme spécifique des chaînes externes de l'amylopectine.
EXEMPLE 5 :
Obtention de plantes de maïs transgéniques
A. Obtention et utilisation de cal de maïs comme cible pour la transformation génétique.
La transformation génétique du maïs, quelle que soit la méthode employée (électroporation ; biolistique, microfibres, canon à particules), requiert généralement l'utilisation de cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal friable embryogène (dit de type II) de maïs.
Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype H1 II ou (A188 x B73) selon la méthode et sur les milieux décrits par Armstrong (1994).Les cals ainsi obtenus sont multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les quinze jours sur le milieu d'initiation.
Des plantules sont ensuite régénérées à partir de ces cals en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles~peuvent être croisées ou autofécondées.
B. Utilisation du canon à particules pour la transformation génétique du maïs.
Le paragraphe précédent décrit l'obtention et la régénération des lignées cellulaires à la transformation. On décrit ici une méthode de transformation génétique conduisant à l'intégration stable des gènes modifiés dans le génome de la plante. Cette méthode repose sur l'utilisation d'un canon à particules. Les cellules cibles sont des fragments de cals décrits dans le paragraphe A. Ces fragments d'une surface de 10 à 20 mm2 ont été disposés, 4 heures avant bombardement, à raison de 16 fragments par boîte au centre d'une boîte de Pétri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides portant les séquences nucléotidiques à introduire telles que l'ADNc codant pour l'enzyme D de la pomme de terre (Takada et al., 1993) ou les séquences antisens obtenues à partir de cet ADNc sont purifiées sur colonne Qiagen, en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungsten (M10) en suivant le protocole décrit par Klein et al (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. Finner (1992).
Les boîtes de cals ainsi bombardés sont ensuite scellées à l'aide- de ®Scellofrais, puis cultivées à l'obscurité à 27°C. Le premier repiquage a lieu 24 heures après, puis tous les quinze jours pendant trois mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. Les agents sélectifs utilisables consistent généralement en composés actifs de certains herbicides (®Basta, ®Roundup) ou certains antibiotiques (Hygromycine, kanamycine, ...).
On obtient après trois mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent de sélection, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal pour boîte bombardée. Ces cals sont identifiés, individualisés, amplifiés puis cultivés de façon à régénérer des plantules. Afin d'éviter toute interférence avec des cellules non transformées, toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture contenant l'agent sélectif.
Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées. C. Utilisation d'Agrobacterium tumefaciens pour la transformation génétique du maïs.
La technique utilisée est décrite par Ishida et al., 1996.
EXEMPLE 6 :
Mise en évidence du rôle de l'enzyme D dans la dégradation de malto-oiigosaccharides par la phosphorylase
Dans la bactérie, il est suggéré que l'amylomaltase, une α-1 ,4 glucanotranferase similaire à l'enzyme D, augmente la production de glucose-
1 -phosphate par la maltodextrine phosphorylase, en générant des glucanes assez longs (DP5) pour être utilisables par la phosphorylase (Boos et al.,
1998). Une mesure de la production de glucose-1 -phosphate à partir de maltotriose, maltotétraose, maltopentaose et maltoheptaose (2.5mM) en présence de 100μg d'extraits de souche sauvage (137C) et mutante sta11-1
(JV45J) de Chlamydomonas, a mis en évidence une stimulation d'un facteur 5 au moins, en présence d'enzyme D, de la dégradation du maltotétraose et du maltotriose par la phosphorylase. Sachant que la production de glucose-1- phosphate à partir de glucane de longueur DP5 est retrouvée à la fois chez les bactéries et les plantes, l'enzyme D pourrait également faciliter l'action de la phosphorylase chez les plantes.
EXEMPLE 7 : Clonage des séquences codant pour l'enzyme D
Une analyse préliminaire de dosage de gènes dans des souches diploïdes et triploïdes, sauvage et mutante respectivement, a permis d'établir une corrélation entre le nombre d'allèles sauvages STA11 et la quantité d'enzyme correspondante. L'isolement de séquences génomiques codant pour l'enzyme D de Chlamydomonas a suivi le protocole suivant : un alignement de séquences réalisé entre Solanum tuberosum, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis et Clostridium butyricum, a permis de choisir des oligonucléotides correspondants aux régions conservées (régions 1 et 2), pour servir d'amorces à des réactions de PCR. Pour faciliter le clonage d'un éventuel fragment de PCR, une extension de 16 nucléotides contenant les séquences de restrictions de 3 enzymes différentes a été ajouté en 5' [EcoRI, Sacll, Notf].
Figure imgf000032_0001
Toutes les réactions de PCR ont été réalisées avec l'ADN polymerase taq de chez GibcoBRL Life Technologies, couplée à un anticorps et qui ne devient active qu'après un passage de 3 minutes à 94°C. Les conditions optimales pour l'amplification spécifique de la région d'intérêt sont les suivantes: une concentration en MgCI2 de 3 mM et la séquence de programmation qui suit :
- 3 minutes à 94°C
- 45 secondes à 94°C - 30 secondes à 62°C
- 1 minute 30 secondes à 72°C
- répétition 35 fois des étapes 2 à 4 - 10 minutes à 72°C
- conservation à 4°C Une bande d'environ 1 ,6 Kb a ainsi pu être amplifiée à partir d'ADN génomique.
Ce produit de PCR est extrait d'un gel TAE 0,8% selon le protocole "DNA Purification Kit" de PROLABO, et placé dans le site multiple de clonage du piasmide pBlueskipt II SK au site Notl. Une transformation de la souche d'Escherichia coli XL1-Blue rendue compétente permet alors l'amplification du clone. Un séquençage rapide des 1 ,6 Kb (entre les primers T3 et T7) suivant la méthode de Sanger a alors été réalisé (SEQ ID N°1 ). Selon un protocole adapté, le clonage chez le mutant sta11-1 de la région correspondant au gène de l'enzyme D peut être réalisé, pour déterminer la nature de la mutation conduisant à l'absence de la protéine dans la cellule mutante. La mise en évidence de modifications allèle spécifique du profil de restriction de la souche mutée et l'étude de la coségrégation du polymorphisme de restriction et de la mutation chez les ségrégants d'un croisement entre une souche sauvage et une souche STA11 peuvent permettent de corréler définitivement le gène STA11 à l'enzyme D.
EXEMPLE 8 :
Expression conditionnelle de la mutation
Une analyse comparative des souches sauvage et mutante sta11-1 en condition carencée en azote ou normale montre que l'expression du phénotype mutant sta11-1 est partiellement conditionnelle. Ceci indique que l'expressivité de la mutation sur le phénotype peut varier en fonction des conditions physiologiques pour un même organisme. Il est possible que ces variations d'expressivité du phénotype se retrouvent d'une espèce végétale à une autre. Il est possible de trouver des conditions dans lesquelles la baisse de la quantité d'amidon ne se produit pas alors que des modifications phénotypiques sont observées (présence d'oligosaccharides, modification de la structure de l'amylopectine).
Le tableau ci-après présente les résultats obtenus sur les phértotypes des souches sauvage et mutante lors de la synthèse de l'amidon de transition ou de stockage respectivement à partir de culture non carencée en azote (+N) et de culture carencée en azote (-N). Phénotype des souches sauvage et mutante lors de la synthèse de l'amidon de transition ou de stockage :
Les valeurs listées sont la moyenne de trois mesures séparées dans une seule expérience.
Souche Génotype Ap λmax3 Amidon MOSL Am %u
+N -N +N -N +N -N +N -N
CO23 + 566 560 1.2 13 0.011 0.018 1 .14
CO65 + 570 542 0.4 24.7 0.007 0.001 15
CO35 + 564 554 0.91 22.8 0.012 0.017 25
CO29 stαll-1 576 570 1.7 0.45 0.45 38
CO137 stαll-1 572 564 0.83 0.3 0.17 10 25
CO214 stαll-1 575 562 0.31 0.78 0.2 0.2 12 24
a : Ap λmax, longueur d'onde de l'absorbance maximale d'un complexe polysaccharide iodé d' amylopectine purifiée par filtration sur gel. b : quantité de polysaccharide insoluble, exprimée en μg.10"6 cellules, purifié par sédimentation (mesure par dosage standard de Pamyloglucosidase). c : MOS : quantité de malto-oligosaccharides solubles, exprimée μg.10"6 cellules. 0.5 μg.10"6 cellules correspond à une concentration plastidiale de 10 mM si tout le MOS devait être considéré comme étant du maltotriose d : Le pourcentage d'amylose dans l'amidon purifié a été calculé par filtration sur gel des polysaccharides dispersés. BIBLIOGRAPHIE
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de modification de la distribution de la longueur des chaînes d'un amidon ou des chaînes d'un glycogène, dans lequel on augmente ou on diminue l'activité d'une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase dans les cellules d'une plante de telle sorte que ladite plante produise un amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la distribution de la longueur de ses chaînes externes ou produise un glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement par la distribution de la longueur de ses chaînes externes.
2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on diminue le taux d'expression d'enzyme α-1 ,4 glucanotransferase endogène de façon à conduire à la production d'amidon comprenant une amylopectine présentant un enrichissement des chaînes comportant moins de 6 résidus de glucose.
3. Procédé selon la revendication 2 comprenant les étapes consistant à : a) construire un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique antisens du gène codant pour ladite enzyme α-1 ,4 glucanotransferase ; b) transformer une cellule de plante avec ledit vecteur d'expression ; c) régénérer la plante à partir de la cellule transformée à l'étape b, ladite plante transgénique ainsi obtenue produisant un amidon comprenant une amylopectine présentant un enrichissement des chaînes comportant moins de 6 résidus de glucose.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite enzyme α-1 ,4 glucanotransferase est une enzyme D.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite enzyme α-1 ,4 glucanotransferase est une protéine comprenant une séquence d'acides aminés codée par la séquence nucléotidique choisie parmi la séquence SEQ ID n° 1 , ou une séquence homologue de celle-ci.
6. Plante ou partie de plante, telle que notamment pomme de terre, blé, maïs ou riz, produisant de l'amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la distribution de la longueur de ses chaînes externes ou produisant du glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement par la distribution de la longueur de ses chaînes externes, ladite plante ou partie de plante étant obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.
7. Procédé d'obtention d'amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la distribution de la longueur de ses chaînes externes, dans lequel :
- on extrait l'amidon modifié à partir des plantes ou parties de plantes selon la revendication 6 ; - ou on met en contact un amidon, préalablement extrait de plantes ou parties de plantes puis solubilisé, avec une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase, en présence de polysaccharides ou d'oligosaccharides éventuellement modifiés.
8. Amidon modifié obtenu selon le procédé de la revendication 7.
9. Utilisation d'amidon modifié selon la revendication 8 pour la préparation de produits dérivés, notamment de produits alimentaires.
10. Produits contenant un amidon modifié selon la revendication 9.
1 1. Procédé d'obtention de glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement par la distribution des longueurs de ses chaînes externes, dans lequel : on extrait le glycogène modifié à partir des plantes ou parties de plantes obtenues selon le procédé de l'invention, tel que décrit précédemment. ou on met en contact un glycogène avec une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase, en présence de polysaccharides ou d'oligosaccharides éventuellement modifiés.
12. Enzyme D de Chlamydomonas reinhardtii purifiée par le procédé comprenant les étapes consistant à :
- centrifuger la souche Chlamydomonas reinhardtii;
- précipiter la fraction acellulaire au sulfate de protamine ; - passer le surnageant obtenu à l'étape précédente sur une chromatographie d'échange d'anions ;
- soumettre la fraction non retenue à l'étape précédente à une précipitation différentielle au sulfate d'ammonium ;
- soumettre le surnageant obtenu à l'étape précédente à une chromatographie de tamisage moléculaire ;
- concentrer par une chromatographie d'échange de cations le culot obtenu à l'étape précédente.
13. Acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi la séquence SEQ ID n° 1 , et un fragment de cette séquence codant pour une protéine présentant une activité enzymatique d'α-1 ,4 glucanotransferase.
14. Acide nucléique comprenant une séquence complémentaire de la séquence telle que définie à la revendication 13.
15. Vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 13 ou 14.
16. Protéine présentant une activité enzymatique d'α-1 ,4 glucanotransferase, comprenant une séquence d'acides aminés codée par une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 13.
17. Utilisation d'un acide nucléique comprenant une séquence codant pour une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase ou une séquence antisens de ladite séquence codant pour une enzyme α-1 ,4 glucanotransferase, pour modifier la distribution de la longueur des chaînes externes de l'amidon ou du glycogène.
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