JP2000509286A

JP2000509286A - ジャガイモの脱分枝酵素をコードする核酸分子

Info

Publication number: JP2000509286A
Application number: JP9539534A
Authority: JP
Inventors: ミカエルエメルマン; イエンスコスマン
Original assignee: プランテックバイオテクノロジスクゲーエムベーハー
Priority date: 1996-05-06
Filing date: 1997-05-06
Publication date: 2000-07-25
Also published as: EP0900277A1; US6255563B1; HUP9902317A3; AU2891797A; WO1997042328A1; HUP9902317A2; US6670525B2; AU724164B2; CA2253234A1; US20030167527A1; DE19618125A1

Abstract

(57)【要約】ジャガイモの脱分枝酵素をコードする核酸分子と共に、ジャガイモ由来の脱分枝酵素の発現により、またはそのような内因性脱分枝酵素の活性の阻害により修飾特性を有するアミロペクチンが合成されるトランスジェニック植物細胞および植物体について開示する。

Description

【発明の詳細な説明】ジャガイモの脱分枝酵素をコードする核酸分子本発明は、脱分枝酵素の酵素活性を有するジャガイモ由来の蛋白質をコードする核酸分子に関する。本発明はさらに、ジャガイモ由来の別の脱分枝酵素活性の発現により、または内因性脱分枝酵素活性の阻害により分枝の程度が変化したアミロペクチンが合成されるトランスジェニック植物および植物細胞に関する。本発明はまた、該トランスジェニック植物細胞および植物から得られるデンプンに関する。デンプンは、多数の植物における貯蔵物質として、および再生可能で工業利用可能な原材料としても重要な役割を果たし、重要性が増している。デンプンの工業的利用に関しては、その構造、形状、および／またはその他の物理化学的パラメータに関して、加工産業の需要に応えることが必要である。可能な限り多くの領域で利用できるようにするためには、多様な物質を得ることがさらに必要である。多糖類であるデンプンは、化学的に均一な基本成分、すなわちグルコースから構成される。しかし、デンプンは重合化の程度および分枝の程度が互いに異なる様々なタイプの分子の非常に複雑な混合物を構成する。α-1,4グリコシド分枝グルコース分子から成る基本的に非分枝ポリマーであるアミロースデンプンと、分枝がさらなるα-1,6グリコシド結合の結果である分枝ポリマーであるアミロペクチンデンプンとは区別される。トウモロコシまたはジャガイモのようなデンプンの製造に典型的に用いられる植物では、合成されたデンプンはアミロースデンプン約25％とアミロペクチンデンプン約75％とからなる。例えば、トウモロコシの場合、アミロペクチン以外のさらなる分枝多糖類、すなわち分枝の程度が高く、異なる溶解度を示すことによってアミロペクチンとは異なる、いわゆる植物グリコーゲンが生じる（例えば、リーら（Lee）、Arch Biochem.Biophys.143（1971）、365〜374；パン＆ネルソン（Pan and Nelson）、Plant Physiol.74（1984）、324〜328参照）。本出願の範囲において、アミロペクチンという用語は植物グリコーゲンを含むように用いられている。産業分野において利用するための基本成分デンプンの均一性という点に関して、デンプン産生植物は、例えば、成分アミロペクチンのみを含む、または成分アミロースのみを含むことが必要である。その他の多くの利用では、植物は、分枝の程度が異なるアミロペクチンタイプを合成することが必要である。そのような植物は例えば、育種または変異誘発の方法によって得てもよい。トウモロコシなど様々な植物種に関して、変異誘発法によって、アミロペクチンのみを形成する変種が作出されることは知られている。ジャガイモの場合も同様に、化学的変異誘発によって半数体株から一つの遺伝子型が作出された。該遺伝子型はアミロースを形成しない（ホーベンカンプ-ハーメリンク（Hovenkamp-Herme link）、Theor.Appl.Genet.75（1987）、217〜221）。デンプン貯蔵性植物のデンプン代謝を特異的に阻害するために、慣習的な交雑法および変異誘発法に加えて、今日では組換えDNA技術がますます用いられている。このために予め必要な要件は、デンプン代謝に関与する酵素をコードするDN A配列が提供されていることである。例えば、ジャガイモの場合、顆粒結合性デンプン合成酵素または分枝酵素（Q酵素）をコードするDNA配列が今日までに判明しており、それらは植物を遺伝的に修飾するために用いられている。 DNA組換え技術によって、植物におけるデンプン、特に植物において合成されたデンプンの分枝の程度の目標とする修飾をさらに行うために、デンプン代謝、特にデンプン分子の分枝に関与する酵素をコードするDNA配列を特定することがさらに必要である。デンプン分子に分枝を導入するQ酵素以外にも、分枝を溶解することが可能な酵素が植物において生じている。これらの酵素は脱分枝酵素と呼ばれる。サトウダイコンの場合、リら（（Li）、Plant Physiol.98（1992）、1277〜12 84）は、５つのエンドおよび２つのエキソアミラーゼとは別に、一つの脱分枝酵素の発生を証明できたに過ぎなかった。大きさが約100kDで至適pH値が5.5であるこの酵素は、葉緑体の中に存在する。脱分枝酵素はまた、ホウレンソウに関しても記述されている。サトウダイコンと共に、ホウレンソウからの脱分枝酵素は、基質としてプルランを用いた場合の反応と比較して、基質としてアミロペクチンを用いた場合の反応では活性が５倍低い（ルドウィグら（Ludwig）、Plant Phys iol.74（1984）、856〜861；リら（Li）、Plant Physiol.98（1992）、1277〜12 84）。脱分枝酵素をコードするcDNAの単離が、ホウレンソウに関して報告されている（Rentzら、Plant Physiol．108(1995)，1342）。トウモロコシの脱分枝酵素の存在は、先行技術において記載されている。対応する変異体はsu（糖（sugary））と命名された。sugary遺伝子座の遺伝子が、最近クローニングされた（Jamesら、PlantCell 7(1995)，417〜429を参照のこと）。農業的に重要なデンプン貯蔵性ジャガイモ培養植物の場合では、脱分枝酵素活性は、ホブソンら（（Hobson）、J.Chem.Soc.，（1951）、1451）によって調べられた。Q酵素とは対照的に、どの酵素も、多糖類の鎖の伸長に至るいかなる活性も示さず、α-1,6-グリコシド結合を単に加水分解するのみであることが証明された。ジャガイモの脱分枝酵素の精製法と共に、精製蛋白質の部分ペプチド配列がすでに提示されている（国際公開公報第95/04826号）。現在までの所、ジャガイモの他種の脱分枝酵素の存在に関する報告は見られない。しかし、ジャガイモで産生されるすべての種類の脱分枝酵素を同定し、アミロペクチンデンプンの分枝の程度を修飾するためにいかなる脱分枝酵素の活性をももはや示さないトランスジェニックジャガイモ植物を製造するために、対応する遺伝子またはcDNA配列を単離すべきである。したがって、本発明の基礎となる技術的問題は、ジャガイモにおいておそらく生じるさらなる脱分枝酵素を同定し、これらの酵素をコードする対応する核酸分子を単離することである。この問題は、請求の範囲に定義される態様を提供することによって解決される。したがって、本発明は、ジャガイモの脱分枝酵素の生物活性を有するタンパク質をコードする核酸分子に関する。該核酸分子は、好ましくは、配列番号:2に記載のアミノ酸配列を示す、ジャガイモ由来脱分枝酵素の生物活性を有するタンパク質をコードする。特に好ましい態様において、該核酸分子は、配列番号：１に記載のヌクレオチド配列、特に、そのコード領域を含む。本発明はまた、ジャガイモ由来脱分枝酵素の生物学的活性を有するタンパク質をコードし、かつ上記核酸分子の一つまたはその相補鎖とハイブリダイズする核酸分子に関する。さらに、本発明は、遺伝子コードの縮重によりその配列が上記核酸分子の配列とは異なる、およびジャガイモの脱分枝酵素の生物活性を示す蛋白質をコードする核酸分子に関する。「ジャガイモ由来」という用語は、本発明の核酸分子にコードされる、例えばゲノムもしくはRNA分子またはそれに由来する分子にコードされている脱分枝酵素がジャガイモ（Solanum tuberosum）種に特有である、すなわちそれが該植物において天然に生じることを意味する。由来する分子は、例えばRNA分子の逆転写、増幅、変異、欠失、置換、挿入などにより産生されるものであってよい。すなわちこの用語にはまた、ジャガイモにおいて天然に生じる配列の対立遺伝子および誘導体にコードされる酵素が含まれる。これらは例えば、組換えDNA技術によりインビトロで作製できる。本発明の範囲内において、「ハイブリダイゼーション」という用語は、例えばサムブルックら（（Sambrook）、「分子クローニング、実験マニュアル」（Mole cular Cloning，A Laboratory Manual）第二版（1989）、Cold Spring Harbor L aboratory Press，Cold Spring Harbor，NY）が記述したように、通常のハイブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントな条件下で行われるハイブリダイゼーションを意味する。本発明の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子は、基本的に、いかなる所望のタイプのジャガイモ植物に由来するものでもよい。本発明の分子にハイブリダイズする核酸分子は、例えば、ゲノムまたはcDNAライブラリから単離してもよい。そのような核酸分子の同定および単離は、本発明の分子もしくはこれらの分子の一部を用いることによって、または場合により、例えば、定法に従ったハイブリダイゼーションによってこれらの分子の逆相補鎖を用いることによって（例えば、サムブルックら（Sambrook）、（1989）「分子クローニング、実験マニュアル」（Molecular Cloning，A Laboratory Manual）第二版、Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY参照）、またはPCRによる増幅によって行うことができる。ハイブリダイゼーションのプローブとして、例えば、配列番号：１に示すヌクレオチド配列またはその一部を正確に、または基本的に含む核酸分子を用いてもよい。ハイブリダイゼーションプローブとして用いる断片はまた、従来の合成法によって産生され、その配列が本発明の核酸分子の配列と基本的に同一である合成断片であってもよい。本発明の核酸配列とハイブリダイズする遺伝子の同定および単離後、配列を決定し、この配列によってコードされる蛋白質の特性を分析しなければならない。また、本発明の核酸分子とハイブリダイズする分子には、ジャガイモの脱分枝酵素の酵素活性を有するタンパク質をコードする上記DNA分子の断片、誘導体、および対立遺伝子変種、または生物学的、すなわちその酵素的活性断片が含まれる。これに関連して、断片とは、脱分枝酵素の酵素活性を有するポリペプチドをコードするために十分な長さの核酸分子の一部として定義される。これに関連して、誘導体という用語は、これらの分子の配列が一つ以上の位置で上記核酸分子の配列とは異なり、およびそれらがこれらの配列と程度の高い相同性を示すことを意味する。この点において、相同性とは、少なくとも70％の配列同一性、特に少なくとも80％の同一性、好ましくは90％以上の同一性、さらにより好ましくは 95％以上の配列同一性を意味する。上記核酸分子と比較した場合に生じる逸脱は、欠失、付加、置換、挿入または組換えによって生じたものでもよい。その上、相同性は、各々の核酸分子またはそれらがコードする蛋白質が、機能的および／または構造的に同等であることを意味する。上記分子と相同で、これらの分子の誘導体を表す核酸分子は、一般的に同じ生物機能を示す修飾を構成するこれらの分子の変種である。これらの変種は天然に生じる変種、例えば、その他のジャガイモもしくはその変種に由来する配列であってもよく、または天然に生じた変異もしくは特異的変異誘発によって導入された変異である変異体であってもよい。その上、変種は合成で製造された配列であってもよい。対立遺伝子変種は合成で製造された変種またはDNA組換え技術によって生じた変種と共に、天然に生じるものであってもよい。本発明の核酸分子の様々な変種によってコードされる蛋白質は、ある特定の共通の特徴を示す。酵素活性、分子量、免疫応答性、コンフォメーション等は、ゲル電気泳動での移動度、クロマトグラフィー特性、沈降計数、溶解度、分光特性、安定性、のような物理的特性；至適pH、至適温度等と共に、これらの特徴に属しうる。脱分枝酵素の酵素活性は例えば、国際公開公報第95/04826号に記述のように、染色試験によって示してもよい。この試験では、デンプン修飾活性を有する蛋白質が、例えばジャガイモ塊茎からの蛋白質抽出物を、非変性アミロペクチン含有ポリアクリルアミドゲル（PAAG）で分離し、その後ゲルを適当な緩衝液とインキュベートした後、ヨード染色することによって示される。ヨード処理非分枝アミロースは青色に染色され、アミロペクチンは赤紫色を呈する。ヨード処置すると赤紫色になるアミロペクチン含有ポリアクリルアミドゲルでは、紫色に染まるアミロペクチンの分枝が脱分枝酵素によって溶解されるため、ゲルの色は脱分枝活性が存在するところでは青色に変化する傾向がある。または、脱分枝酵素活性は、DNSS試験によって示してもよい（ルドウィグら（ Ludwig）、Plant Physiol.74（1984）、856〜861参照）。本発明の核酸分子は、いかなる所望の核酸分子であってもよく、特にcDNA、ゲノムDNA、mRNA等のDNAまたはRNA分子であってもよい。それらは、天然の分子であってもよく、組換え型DNAまたは化学的合成技術によって製造してもよい。本発明の核酸分子は、脱分枝酵素の酵素活性を有するジャガイモ由来のこれまでに未知の蛋白質をコードしている。これまでのところ、唯一の脱分枝酵素がジャガイモについて報告されている。先行技術において、さらなる脱分枝酵素をコードする遺伝子がジャガイモに存在することは示されていない。驚くべきことに今日では、現在までに知られているジャガイモ由来脱分枝酵素以外に、脱分枝活性を有する少なくとも一つの別の酵素の存在が見出された。したがって、本発明の分子は、ジャガイモの新規なタイプの脱分枝酵素をコードする。これらの分子により、今や、ジャガイモおよび他のデンプン貯蔵植物のデンプン代謝を特異的に妨害し、したがって化学または物理特性が修飾されたデンプンの合成が可能となる。これは、本発明の核酸分子をいかなる所望の植物、好ましくはデンプン貯蔵植物において過剰発現させることによって、または本発明の核酸配列を例えば、アンチセンス、もしくはリボザイム効果によって利用することにより、ジャガイモ植物における脱分枝酵素活性を低下させることによって、行ってもよい。さらに、本発明は、本発明の核酸分子と特異的にハイブリダイズする少なくとも15塩基対、好ましくは50塩基対以上、最も好ましくは200塩基対以上の長さの核酸分子に関する。これに関連して、特異的にハイブリダイズするとは、これらの分子がジャガイモの新規脱分枝酵素をコードする核酸分子にハイブリダイズするが、その他の蛋白質をコードする核酸分子にはハイブリダイズしないことを意味する。この点において、ハイブリダイズは、好ましくはストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション（上記参照）を意味する。本発明は特に、本発明の核酸分子の転写物とハイブリダイズし、それによって転写を阻害する核酸分子に関する。本発明の核酸分子と特異的にハイブリダイズするそのような核酸分子は、例えばmRNA構築物またはリボザイムの一部であってもよく、PCRによる増幅のプライマーとして用いてもよい。さらに、本発明は、本発明の上記核酸分子を含むベクター、特にプラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、および遺伝子操作に一般的なその他のベクターに関する。好ましい態様において、ベクターに含まれる核酸分子は、原核細胞および真核生物細胞における転写および翻訳を確実にする制御エレメントに結合している。さらなる態様において、本発明は、宿主細胞、特に上記核酸分子またはベクターによって形質転換されている原核細胞または真核細胞、ならびにそのような宿主細胞に由来し上記の核酸分子またはベクターを含む細胞に関する。宿主細胞は、細菌または真菌細胞、ならびに植物細胞または動物細胞であってもよい。本発明はまた、本発明の核酸分子によってコードされるジャガイモからの脱分枝酵素の生物活性を有する蛋白質、またはその生物活性断片に関する。さらに、本発明は、本発明の宿主細胞が適当な条件下で培養され、蛋白質が培養物、例えば、培養細胞および／または培養培地から単離される、トウモロコシの脱分枝酵素の生物活性を有する植物蛋白質またはその生物活性断片の製造法に関する。好ましい態様において、本発明の宿主細胞は、導入した本発明の核酸分子の存在および発現により、非形質転換細胞と比較して新しいまたは増加した脱分枝酵素活性を示すトランスジェニック植物細胞である。本発明の核酸分子を提供することにより、野生型細胞と比較して、新規なまたは増加した脱分枝酵素活性を示すように、組換え型DNA法によって植物細胞を修飾することが可能となる。そのようなトランスジェニック植物細胞は、導入された核酸分子が、形質転換細胞と異種である、すなわち異なるゲノム背景を有する細胞に由来するか、または形質転換植物種と同種である場合には、非形質転換細胞では天然に生じないようなゲノムの位置に導入された核酸分子が存在するという点において、非形質転換細胞とは異なる。導入された核酸分子は、天然のプロモーターの制御下にあっても、または外来遺伝子の制御エレメントに結合していてもよい。上記トランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物もまた、本発明の主題である。本発明の核酸分子で形質転換され、そのような分子の導入によりジャガイモの脱分枝酵素が合成される植物は、原則として、いかなる所望の種の植物であってもよい。好ましくは単子葉または双子葉の有用植物であり、特に穀類、マメ類、ジャガイモ、またはキャッサバのようなデンプン貯蔵植物である。穀類は特にポールス（Poales）目、特にイネ科(Poaceae)に属する単子葉植物である。その例は、カラスムギ属(Avena)（オート麦(oats)）、パンコムギ(Trit icum)（小麦(wheat)）、ライ麦(Secale)（ライ麦(rye)）、大麦(Hordeum)（大麦 (barley)）、イネ(0ryza)（コメ(rice)）、キビ(Panicum)、チカラシバ(Pennise tum)、セタリア(Setaria)、モロコシ(Sorghum)（アワ(millet)）、トウモロコシ (Zea)（トウモロコシ(maize)）等に属する植物である。デンプン貯蔵マメ類は、例えば、何らかのタイプのエンドウ豆属（例えば、エンドウ）、ソラマメ（例えば、ソラマメ）、ヒヨコ豆（例えば、ヒヨコ豆）、レンズ豆（例えば、レンズ・キュリナリス（Lens culinaris））、インゲン豆（例えば、インゲン豆およびファセオラス・コクシネウス（Phaseolus coccineus））等である。本発明はまた、トランスジェニック植物細胞または植物から得られるデンプンに関する。本発明のトランスジェニック植物細胞および植物における新規のまたはさらなるジャガイモ由来脱分枝酵素活性の発現は、該細胞および植物において合成されるアミロペクチンの分子の程度に影響を及ぼす。したがって、これらの植物において合成されるデンプンは、野生型植物由来のデンプンと比較して、改変された物理的および／または科学的特性を呈する。さらに、本発明は、この繁殖材料が上記トランスジェニック植物細胞を含む、種子、果実、挿し木、塊茎、根茎等のような本発明のトランスジェニック植物の繁殖材料に関する。ジャガイモ植物の場合、繁殖材料は、好ましくは塊茎である。さらに、本発明は、該新規の脱分枝酵素をコードする内因性核酸分子の転写または翻訳の阻害により、本発明の脱分枝酵素活性が低下している、ジャガイモのトランスジェニック植物細胞に関する。これは、好ましくは、対応する植物細胞における本発明の核酸分子またはその一部のアンチセンス方向への発現、およびアンチセンス効果により記述の脱分枝酵素活性が低下するという事実によって達成される。植物細胞において脱分枝酵素活性を低下させるさらなる可能性は、本発明のDNA分子の転写物を特異的に開裂する適当なリボザイムを発現することである。本発明のDNA分子によるそのようなリボザイムの製造は、当業者には既知である。リボザイム効果と併せてアンチセンス効果を発揮する分子を発現することも可能である。または、植物細胞における脱分枝酵素活性は、共抑制効果によって低下させてもよい。方法は当業者には既知で、例えば、ヨーゲンセン（（Jo rgensen）、Trends Biotechnol.8（1990）、340〜344）、ニーベルら（（Niebel ）、Curr.Top.Microbiol.Immunol.197（1995）、91〜103）、フラベルら（（Fla vell）、Curr.Top.Microbiol.Immunol.197（1995）、43〜46）、パラキ＆ボーシェレ（（Palaqui and Vaucheret）、Plant Mol.Biol.29（1995）、149〜159）、ボーシェレら（（Vaucheret）、Mol.Gen.Genet.248（1995）、311〜317）、デボーンら（（de Borne）、Mol.Gen.Genet.243（1994）、613〜621）およびその他の出典に記述されている。細胞において特定の酵素の活性を減少させるためにリボザイムを発現させることも、当業者には公知であり、例えばEP-BI 0 321 201号に記載されている。植物細胞におけるリボザイムの発現は、例えばフェイターら（Feyter）により記載されている（Mol．Gen．Genet．250(1996)，329〜338）。例えば、遺伝子標識もしくはトランスポゾン変異誘発による、または該新規脱分枝酵素を特異的に認識する抗体を発現させることによる、該酵素をコードするゲノム配列の変異誘発といった、植物細胞において上記の新規脱分枝酵素の活性を減少させるためのそのほかの可能性は、当業者に公知である。ゲノム配列の変異誘発は、該遺伝子のコード領域（イントロンおよびエキソン）に適用してもよく、または調節領域、特に転写開始に必要な領域にも適用できる。本発明はさらに、脱分枝酵素活性が低下した上記トランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニックジャガイモ植物に関する。トランスジェニック細胞または植物から得られる修飾デンプンもまた、本発明の主題である。非形質転換細胞と比較すると、トランスジェニック細胞および植物のアミロペクチンデンプンは、脱分枝酵素活性の低下により分枝の程度が修飾されている。本発明はまた、上記トランスジェニック植物細胞を含む、上記トランスジェニック植物の繁殖材料、特に種子および塊茎に関する。新規またはさらなる脱分枝酵素活性の発現により、野生型植物において合成されるアミロペクチンデンプンと比較して、分枝の程度が修飾されたアミロペクチンデンプンを形成するトランスジェニック植物細胞は、例えば、以下の段階を含む方法によって製造することができる：（a）以下のDNA配列を含む発現カセットの製造：（i）植物細胞における転写を確実にするプロモーター；（ii）脱分枝酵素の酵素活性を有する蛋白質またはその生物学的活性断片をコードし、センス方向においてプロモーターの3'末端と結合している、本発明の少なくとも一つの核酸配列；および（iii）選択的に、コード領域の3'末端に結合している転写終結のための終結シグナルおよび展開しつつある転写物へのポリAテールの付加。（b）工程（a）において製造された発現カセットによる植物細胞の形質転換。記述の脱分枝酵素活性の低下により、野生型植物において合成されるアミロペクチンデンプンと比較して、分枝の程度が改変されたアミロペクチンデンプンを形成するトランスジェニック植物細胞は、例えば、以下の段階を含む方法によって製造してもよい：（a）以下のDNA配列を含む発現カセットの製造（i）植物細胞において転写を確実にするプロモーター；（ii）脱分枝酵素の酵素活性を有する蛋白質またはその生物学的活性部分をコードし、アンチセンス方向においてプロモーターの3'末端と結合している、本発明の少なくとも一つの核酸配列；および（iii）選択的に、コード領域の3'末端に結合している転写終結のための終結シグナルおよび展開しつつある転写物へのポリAテールの付加。（b）工程（a）において製造された発現カセットによる植物細胞の形質転換。基本的に、形質転換に選択した植物において機能的なあらゆるプロモーターを、（i）で述べたプロモーターとして用いてもよい。プロモーターは、用いる植物種に関して同種であっても異種であってもよい。例えば、全ての植物組織において構成的な発現を確実にするカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター（オーデルら（Odell）、Nature 313（1985）、810〜812）および国際公開公報第9401571号に記述のプロモーター構築物を利用してもよい。もう一つの例は、トウモロコシ由来のポリユビキチン遺伝子のプロモーターである（クリステンセンら（Christensen）、Plant.Mol.Biol.18（1992）675〜689）。しかし、細胞外要因によって決定された時点でのみ活性化されるプロモーター（国際公開公報第9307279号のように）もまた利用してもよい。この点において、単純誘導を可能にする熱ショック蛋白質のプロモーターは、特に重要であるかも知れない。さらに、植物の特定の組織において下流の配列を発現させるプロモーターを利用してもよい（例えば、ストックハウスら（Stockhaus）、EMBO J.8（1989）、2245 〜2251参照）。好ましくは、形質転換すべき植物のデンプン貯蔵部分において活性を示すプロモーターを用いる。トウモロコシの場合、これらの部分はトウモロコシ粒、ジャガイモの場合は塊茎である。ジャガイモにおいて本発明の核酸分子を過剰発現させるために、例えば塊茎特異的B33-プロモーター（ロシャーソサら（Rocha-Sosa）、EMBO J.8（1989）、23〜29）を用いてもよい。ソラマメおよびその他の植物における種子特異的発現を確実にするソラマメ由来のUSPプロモーターのように、種子特異的プロモーターが既に様々な植物種について記述されている（フィードラーら（Fiedler）、Plant Mol.Biol.22（1993 ） 467）。例えば、トウモロコシの場合、ゼイン遺伝子のプロモーターは、トウモロコシ粒の内胚乳の内部での特異的な発現を確実にする（ペダーセンら（Peders en）、Cell 29（1982）、1015〜1026；クアトロッキオら（Quattrocchio）、Pla nt Mol.Biol.15（1990）、81〜93）。処理段階（a）（ii）で述べた、ジャガイモの脱分枝酵素の酵素活性を有する蛋白質をコードする核酸配列がプロモーターにセンス方向で結合している場合、この核酸配列は、形質転換すべき植物種、すなわち記述の発現カセットによって形質転換されうるジャガイモ植物ならびにその他のいかなる所望の植物（好ましくは上記のデンプン貯蔵植物）に関して、天然もしくは同種起源であってもよく、外来もしくは異種起源であってもよい。合成された蛋白質は原則として、植物細胞内のいかなる所望の区画に位置していてもよい。植物の脱分枝酵素は一般に、プラスチド内に存在し、したがって、これらの小器官へ移動するためのシグナル配列を有する。別の区画に局在させるためには、このシグナル配列をコードするDNA配列が欠失していなければならず、コード領域は、各区画における位置を確実にするDNA配列に結合していなければならない。そのような配列は既知である（例えば、ブラウンら（Braun）、EMB O J．11（1992）、3219〜3227；ウォルターら（Wolter）、Pro.Natl.Acad.Sci.U SA 85（1988）、846〜850；ゾネワルドら（Sonnewald）、Plant J.1（1991）、9 5〜106参照）。処理段階（a）（ii）で述べた、脱分枝酵素の酵素活性を有する蛋白質をコードするジャガイモの核酸配列がプロモーターにアンチセンス方向に結合している場合、形質転換すべき植物種に関して同種起源の核酸配列が好ましい。しかし、同様に、内因性に存在する脱分枝酵素遺伝子と高度の相同性を示す核酸配列もまた用いてもよく、特に80％以上の相同性を示し、好ましくは90％〜100％の相同性、最も好ましくは95％以上の相同性を示す。最小の長さが15塩基対である配列を用いてもよい。より短い配列を用いても、阻害効果はなくならない。100〜500塩基対のより長い配列を用いることが好ましい；有効なアンチセンス阻害のためには、長さが500塩基対以上の配列を用いる。通常、5000塩基対より短い配列を利用し、好ましくは2500塩基対より短い配列を利用する。植物細胞における転写の終結シグナルは記述されており、必要に応じて変更してもよい。例えば、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tu mefaciens）由来のオクトピン・シンターゼ遺伝子の終結配列を利用することができる。処理段階（a）によって構築された発現カセットのトランスファーは、プラスミドを用いて、特に、植物ゲノムへの発現カセットの安定的な組み込みを確実にするプラスミドによって行うことが好ましい。ジャガイモの新規脱分枝酵素を過剰発現するための上記方法は、原則として、全ての植物種について用いることができる。これに関連して、単子葉植物および双子葉植物、ならびに特に上記デンプン貯蔵植物が重要である。脱分枝酵素活性を低下させる上記方法は、好ましくは双子葉植物、特にジャガイモについて用いる。上記方法によって構築された発現カセットの導入により、形質転換植物細胞内にRNAが形成される。ジャガイモの脱分枝酵素をコードする核酸分子が発現カセット内でセンス方向にプロモーターと結合している場合、植物細胞においてジャガイモ由来の別のまたは新規の脱分枝酵素の合成のためのマトリクスとして役立つ可能性があるmRNAが合成される。その結果として、これらの細胞は、ジャガイモの脱分枝酵素の活性を示す、または場合によっては増加した活性を示し、これにより細胞に形成されたアミロペクチンの分枝の程度が修飾される。それによって、天然のデンプンと比較して、均一性の増加と共により明確な秩序構造を特徴とするデンプンが利用できるようになる。特にこれは、薄膜形成特性に好ましい影響を及ぼしうる。しかし、ジャガイモの脱分枝酵素をコードする核酸配列がアンチセンス方向にプロモーターと結合している場合、トランスジェニック植物細胞内に、内因性脱分枝酵素遺伝子の発現を阻害するアンチセンスRNAが合成される。その結果、これらの細胞はジャガイモの新規脱分枝酵素の活性が低下し、これにより修飾デンプンが合成される。アンチセンス技術により、ジャガイモにおける内因性脱分枝酵素遺伝子の発現が０％〜100％の範囲内で異なる程度に阻害される植物を製造することが可能である。これにより、特に、分枝の程度が最も多様に変化したアミロペクチンデンプンを合成するジャガイモ植物の製造が可能となる。これは、そのような変種を提供するために多くの時間と費用を必要とする従来の育種および変異誘発法に対して利点となる。高度に分枝したアミロペクチンは、特に大きな表面を有し、したがって、コポリマーとして特に適している。高度の分枝によりさらに、アミロペクチンの水への溶解度が改善される。この特性は、特定の技術応用にとって非常に利点となる。ジャガイモは、脱分枝酵素をコードする本発明の核酸分子を用いることによって、修飾アミロペクチンの産生に特に適している。しかし、本発明の応用は、この植物種に限らない。いかなる所望のその他の植物種も過剰発現のために用いてもよい。トランスジェニック植物において合成された修飾デンプンは、従来の方法によって植物または植物細胞から単離してもよく、精製後食品および工業製晶の製造に用いてもよい。本発明に係るデンプンは、既知の方法によって当業者によって修飾することができ、食品または非食品産業での異なる用途のために、修飾または非修飾形状で用いることができる。基本的に、デンプンの用途は大きく２つの分野に分けることができる。一つの分野はデンプンの加水分解産物およびいわゆる天然のデンプンからなる。加水分解産物は本質的に、グルコースと酵素的または化学的プロセスによって得られるグルカン成分とを含む。それらは、発酵および化学修飾のようなさらなるプロセスに用いることができる。これに関連して、加水分解プロセスは単純かつ安価に行うことができることは重要であるかも知れない。現在、加水分解はアミログルコシダーゼを用いて実質的に酵素的に行われている。デンプン構造の変化、例えば、粒子表面の増加、用いる酵素の近づき易さを制限するより少ない分枝または立体構造による消化性の改善により、加水分解に用いる酵素量をより少なくすることによってコストを削減する可能性があることは考えられる。ポリマー構造のために用いられるいわゆる天然のデンプンの用途は、２つのさらなる領域に分けることができる。１．食品での利用デンプンは、本質的に水溶性添加剤を結合させる目的に有用で、および／または粘度の増加またはゲル形成の増加を引き起こす、様々な食品に対する古典的な添加剤である。重要な特徴的特性は、流動および吸収作用、膨張およびペースト化温度、粘度および濃化能力、デンプンの溶解度、透明性およびペースト構造、熱、離断、および酸抵抗性、老化傾向、薄膜形成能、凍結／融解に対する抵抗性、消化可能性と共に、例えば、無機または有機イオンとの複合体形成能である。２．非食品での利用その他の主な応用分野は、様々な製造プロセスにおける補助剤として、または技術的製品における添加剤としてのデンプンの利用である。補助剤としてのデンプン利用の主な応用分野は、まず、製紙および厚紙産業である。この領域において、デンプンは主に、保持（固体を支える）のため、充填剤および微粒子の分粒のため、物質の固化剤として、および脱水のために用いられる。さらに、剛性、硬度、音、把握力、光沢、なめらかさ、断裂強度と共に、表面に関するデンプンの有利な特性が利用される。 2.1 製紙および厚紙産業製紙プロセスにおいて、４つの応用分野、すなわち表面、コーティング、かさ、および噴霧に分類することができる。表面処理に関してデンプンに要求されることは、本質的に、高度の輝き、対応する粘度、高い粘度安定性、良好な薄膜形成と共に、埃の低形成性である。固体内容物のコーティングに用いる場合は、対応する粘度、高度の結合能と共に、高度の色素親和性は重要な役割を果たす。塊に対する添加剤としては、速やかで、均一な、ロスのない拡散、高度の力学的安定性、および紙パルプの完全な保持が重要である。デンプンを噴霧に用いる場合、対応する固体内容物、高粘度と共に、高結合能がまた、重要である。 2.2 接着剤産業主な応用分野は例えば、接着剤産業で、応用分野は４つの領域に分けられる：純粋なデンプン糊としての利用、特殊化学物質と共に調製されたデンプン糊での利用、合成樹脂およびポリマー拡散の添加剤としてのデンプンの利用と共に、合成接着剤の増量剤としてのデンプンの利用。全てのデンプン基剤接着剤の90％が段ボール紙、紙サックおよび紙袋、紙およびアルミニウムの複合材料、箱および封筒、切手等のための湿潤糊、の製造に用いられている。 2.3 織物および織物ケア製品補助剤および添加剤としてのもう一つの考えられる用途は、織物および織物ケア製品の製造である。繊維産業では、以下の４つの応用分野に分けることができる：分粒剤、すなわち織る際の裂断抵抗性の増加と共に、織る際に生じる張力から生地を護るためにギザギザにする作用をなめらかに強化するための補助剤として、主に品質を悪化させるような前処置、例えば、漂白、染色等の後の織物の改善剤として、色素拡散の予防のための色素ペーストの製造における濃化剤として、および縫い糸の整経剤のための添加剤としてのデンプンの利用。 2.4 建築産業さらに、デンプンは建築材料における添加剤として用いてもよい。一つの例は、石膏ボードの製造で、薄いしっくいと混合したデンプンを水でペースト状にし、石膏ボードの表面で拡散させ、このように、ボードに厚紙を結合させる。その他の応用領域は、デンプンを石膏および鉱物繊維と混合することである。混合済みのコンクリートでは、デンプンは分粒プロセスの減速に用いてもよい。 2.5 土壌の安定化さらに、デンプンは、人工的な地盤のずれにおいて、水に対する土壌粒子の一時的な保護に用いられる土壌安定化のための手段の製造に有利である。現状の知識によれば、デンプンとポリマー乳剤からなる混合製品は、これまでに用いられた製品と同じ侵食および堆積減少効果を有すると考えることができる；しかしそれらはかなり安価である。 2.6 植物栄養剤および肥料での使用もう一つの応用領域は、これらの調製物の特殊な特性を修飾するための植物栄養剤におけるデンプンの利用である。例えばデンプンは、植物栄養剤および肥料の湿潤性の改善、活性成分の一定量放出、液体、揮発性および／または芳香性活性成分を、微結晶の安定な変形可能な物質への変換、配合できない組成物の混合、および分解の減少による効果持続期間の延長に用いられる。 2.7 薬物、医薬品および化粧品産業デンプンはまた、薬物、医薬品および化粧品産業において用いてもよい。製薬産業では、デンプンは、錠剤の結合剤として、またはカプセルにおける結合剤の希釈のために用いてもよい。さらに、デンプンは、膨張すると液体を吸収し、短時間の後にかなりの量を吸収して活性成分を放出するため、錠剤の崩壊剤として適している。品質的理由から、医薬品の流動性および散布剤はさらなる応用分野である。化粧品の分野では、デンプンは例えば、香水およびサリチル酸のような粉末添加剤の担体として用いてもよい。デンプンの比較的広い応用範囲は歯磨きペーストである。 2.8 木炭および練炭の添加剤としてのデンプン木炭および練炭の添加剤としてのデンプンの利用もまた考えられる。デンプンを加えることによって、木炭は定量的に塊になり、および／または高品質の練炭になることができ、このように、練炭の未成熟な崩壊を防ぐことができる。バーベキュー木炭は４〜６％の付加デンプンを含有し、発熱炭は0.1〜0.5％を含有する。さらに、デンプンを木炭および練炭に加えると毒性物質の放出をかなり減少させることができるので、デンプンは結合剤として適している。 2.9 鉱石および石炭スラリーの加工さらに、デンプンは鉱石および石炭スラリーの加工における凝集剤として用いてもよい。 2.10 ケーシング（casing）材料に対する添加剤もう一つの適応分野は、鋳造における材料の加工のための添加剤としての利用である。様々な鋳造過程に対して、結合剤と混合した砂からコアを作る必要がある。今日では、最も一般的に用いられる結合剤は、ほとんどが膨張デンプンである修飾デンプンと混合したベントナイトである。デンプンを加える目的は、結合強度の改善と共に、流動抵抗性の増加である。その上、膨張デンプンは、冷水での拡散性、再水和可能性、砂との良好な混合性、および水との高い結合力のような、製造プロセスにとって欠くことのできない条件をより満たす可能性がある。 2.11 ゴム産業ゴム産業において、デンプンは、技術的および光学的品質の改善に用いてもよい。この理由は、表面の光沢、把握力、および外観の改善である。この目的のため、低温加硫の前に、デンプンをゴム物質の粘着性ゴム引き表面に拡散させる。デンプンはまたゴムの印刷可能性を改善するために用いてもよい。 2.12 皮革代用品の製造修飾デンプンのもう一つの応用分野は、皮革代用品の製造である。 2.13 合成ポリマーにおけるデンプンプラスチック市場では、以下の応用分野が出現しつつある：デンプンに由来する製品を加工プロセスに組み込む（デンプンは単なる充填剤で、合成ポリマーとデンプンとの間に直接結合はない）、またはデンプンに由来する製品をポリマーの製造に組み込む（デンプンとポリマーは安定な結合を形成する）。デンプンの純粋な充填剤としての利用は、タルクのようなその他の物質と競合できない。特殊なデンプン特性が有効になり、最終製品の特性プロフィールがこのように明確に変化すれば、この状況は異なる。一つの例は、ポリエチレンのような熱可塑材料の加工におけるデンプン製品の利用である。それによって、デンプンおよび合成ポリマーを共発現によって、１：１の比で混合して「マスターバッチ」を形成し、顆粒状ポリエチレンを用いて一般的な技法によって、そこから様々な製品を製造する。ポリエチレン薄膜にデンプンの組み入れると、中空体における物質透過性の増加、水蒸気透過性の改善、静電気作用の改善、アンチブロック作用と共に、水性染料の印刷性の改善が得られる可能性がある。もう一つの可能性は、ポリウレタンフォームにおけるデンプンの利用である。加工技術の最適化と共にデンプン誘導体の適合により、合成ポリマーとデンプンの水酸基との間の反応を特異的に調節することが可能である。その結果、デンプンの利用により以下の特性プロフィールを有するポリウレタン薄膜が得られる：熱膨張係数の低下、収縮作用の減少、圧／張力作用の改善、水受容性の変化を伴わない水蒸気透過性の改善、引火性およびクラッキング密度の減少、可燃性部分の落下がない、ハロゲンがないおよびエージングの減少。現在なおも存在する短所は、圧および衝撃強度の低下である。薄膜の製品開発は単なる選択肢ではない。同様に、ポット、皿、およびボウルのような強化プラスチック製品は、50％以上のデンプン含量により製造することができる。さらに、デンプン／ポリマー混合物はそれらがはるかに容易に生体内分解性であるという長所を提供する。さらに、水に対する強い結合能により、デンプングラフトポリマーは、最も重要となっている。これらは、ラジカル連鎖メカニズムの原理に従って、デンプンの骨格と合成モノマーの格子状の面を合わせた製品である。今日利用できるデンプングラフトポリマーは、デンプン１g当たり1000gまでの水を高粘度で結合および保持する能力の改善を特徴とする。これらの超吸収剤は、農業分野、例えば種子ペレットと共に、主として衛生分野、例えば、おむつやシーツなどの製品に用いられている。 DNA組換え技術によって修飾された新規デンプンの使用にとって最も重要なことは、一方で、構造、水分含量、蛋白質含量、脂質含量、繊維含量、灰／リン酸含量、アミロース／アミロペクチン比、相対モル質量の分布、分枝の程度、顆粒サイズおよび形状と共に結晶で、他方では以下の特徴を示す特性である：流動および吸収作用、ペースト化温度、粘度、濃化能力、溶解度、ペースト構造、透過性、熱、離断および酸抵抗性、老化傾向、ゲル形成能、凍結／融解抵抗性、複合体形成能、ヨード結合、薄膜形成、粘着強度、酵素安定性、消化性および反応性。 DNA組換え技術によって修飾された新規デンプンの使用にとって最も重要なことは、一方で、構造、水分含量、蛋白質含量、脂質含量、繊維含量、灰／リン酸含量、アミロース／アミロペクチン比、相対モル質量の分布、分枝の程度、顆粒サイズおよび形状と共に結晶で、他方では以下の特徴を示す特性である：流動および吸収作用、ペースト化温度、粘度、濃化能力、溶解度、ペースト構造、透過性、熱、離断および酸抵抗性、老化傾向、ゲル形成能、凍結／融解抵抗性、複合体形成能、ヨード結合、薄膜形成、粘着強度、酵素安定性、消化性および反応性。トランスジェニック植物を遺伝子操作することによる修飾デンプンの製造は、化学または物理的方法によるさらなる修飾が不要となるような方法で、植物から得られるデンプンの特性を修飾してもよい。一方、DNA組換え技術によって修飾したデンプンにさらなる化学修飾を行ってもよく、その結果いくつかの上記応用分野の品質がさらに改善するだろう。これらの化学的修飾は主に、当業者に既知である。これらは特に、以下による修飾で、 − 熱処理 − 酸処理 − 酸化および − エステル化リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、キサントゲン酸塩、酢酸塩およびクエン酸塩デンプンが形成される。その他の有機酸もまたエステル化に用いてもよい： − デンプンエーテルの形成デンプンアルキルエーテル、O-アリルエーテル、ヒドロキシルアルキルエーテル、O-カルボキシルメチルエーテル、N-含有デンプンエーテル、P-含有デンプンエーテル、およびS-含有デンプンエーテル − 分枝デンプンの形成 − デンプングラフトポリマーの形成さらに、本発明は、野生型植物と比較して分子の程度が改変されているアミロースペクチンデンプンを合成する植物の製造を目的とする、本発明の核酸分子の使用に関する。本発明のさらなる主題は、植物または他の生物から脱分枝酵素の酵素活性を有するタンパク質または該タンパク質断片をコードする相同分子の同定および単離を目的とする、本発明の核酸分子もしくはその一部の使用、または場合によっては、その逆相補鎖の使用である。「相同」という用語については、上記の定義を参照されたい。原則として、本発明の核酸分子はまた、本発明の分枝酵素の活性が増加または低下している、および同時にデンプン生合成に関係するその他の酵素活性が修飾されている植物を製造するために用いてもよい。この点において、全ての種類の組み合わせおよび順列が考えられる。例えば、本発明の蛋白質をコードする核酸分子、または対応するアンチセンス構築物は、内因性の脱分枝酵素、GBSS-I、SS S-I、II-またはGBSS II-蛋白質の合成が、アンチセンス効果または変異によって既に阻害されている、または分枝酵素の合成が阻害されている（例えば、国際公開公報第92/14827号に記述のように、またはトウモロコシのae変異体（シャノン＆ガーウッド（Shannon and Garwood）、1984、ウィスラー、ベミラー、およびパシャル（Whistler，BeMiller，and Paschall）「デンプン：化学と技術」（St arch：Chemistry and Technology）、Academic Press，London、第２版（1984） 25〜86）に関連して）、植物細胞に導入してもよい。形質転換植物においていくつかの分枝酵素の合成を阻害する場合、各々の脱分枝酵素をコードするいくつかの領域をアンチセンス方向に同時に含み、適当なプロモーターによって調節されるDNA分子を形質転換に用いることができる。そのような構築物において、各配列はまたはそれ自身のプロモーターによって調節してもよく、そうでなければ、一般的なプロモーターからの融合体として配列を転写してもよい。この場合、各蛋白質の合成はほぼ同じ程度に阻害されるはずなので、最後の代替法が一般に好ましいと考えられる。さらに、脱分枝酵素をコードする配列以外の、デンプン合成または修飾に関係するその他の蛋白質をコードするその他のDNA配列が存在するような分子を構築することが可能である。これらは、適当なプロモーターにアンチセンス方向で結合される。ここでも、配列を連続して結合してもよく、および一般的なプロモーターから転写してもよく、または各々を自身のプロモーターによって転写してもよい。該構築物に用いられるコード領域の長さについては、アンチセンス構築物に関して上記にすでに記載したのと同一の長さが適用される。そのようなDNA分子では、一つのプロモーターから転写されるアンチセンス断片の数に上限はない。しかし、得られた転写物は通常、20kbを超えず、５kbより短いことが好ましい。そのようなDNA分子において、その他のコード領域と共に、適したプロモーターの下流にアンチセンス方向で位置するコード領域は、以下の蛋白質をコードするDNA配列から導出してもよい：顆粒結合デンプンシンターゼ（GBSS IおよびII ）、その他の可溶性デンプンシンターゼ（例えばSSS IおよびII）、分枝酵素、その他の脱分枝酵素、不均化酵素およびデンプンフォスフォリラーゼ。この列挙は単なる例に過ぎない。そのような組み合わせの枠組みの中でのその他のDNA配列の利用もまた考えられる。そのような構築物によって、これらの構築物で形質転換した植物細胞内で、いくつかの酵素を同時に阻害することが可能である。さらに、デンプンシンターゼの一つ以上の遺伝子を欠損する古典的な変異体に、構築物を導入してもよい。これらの欠損は、以下の蛋白質に関連してもよい：顆粒結合（GBSS IおよびII）および可溶性デンプンシンターゼ（例えば、SSS I およびII）、分枝酵素（BE IおよびII）、脱分枝酵素、不均化酵素およびデンプンフォスフォリラーゼ。ここでも、この列挙は単なる例に過ぎない。高等植物への外来遺伝子の導入の準備をするため、大腸菌の複製シグナルおよび形質転換した細菌細胞の選択のためのマーカー遺伝子を含む、多数のクローニングベクターが自由に利用できる。そのようなベクターの例は、pBR322、pUCシリーズ、M13mpシリーズ、pACYC184等である。望ましい配列を適した制限部位でベクターに組み込んでもよい。得られたプラスミドを大腸菌細胞の形質転換に用いる。形質転換した大腸菌細胞を適した培地で培養し、その後回収して溶解する。プラスミドを回収する。得られたプラスミドDNAの特徴の解析法として、一般に制限分析、ゲル電気泳動、およびその他の生化学分子生物学的方法を利用する。各操作後、プラスミドDNAを開裂し、得られたDNA断片をその他のDNA配列に結合させてもよい。各プラスミドDNAは同じまたは別のプラスミドにクローニングしてもよい。植物宿主細胞にDNAを導入するためには、幅広い技法が自由に利用できる。これらの技法は、形質転換媒介体としてアグロバクテリウム・ツメファシエンス（ Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾジエネス（Agrob acteirum rhizogenes）を用いることによるT-DNAによる植物細胞の形質転換、プロトプラストの融合、DNAの注入および電気穿孔、バイオリスティック（biolist ic）法によるDNAの導入と共にさらなる可能性からなる。 DNAの植物細胞への注入および電気穿孔の場合、用いるプラスミドに特別な要件はない。pUC誘導体のような単純なプラスミドを用いてもよい。しかし、植物全体を、形質転換された細胞からそのようにして再生させる場合、好ましくは選択可能なマーカー遺伝子が存在する。所望の遺伝子を植物細胞に導入する方法によっては、さらなるDNA配列が必要となるかも知れない。例えば、植物細胞の形質転換にTi-またはRi-プラスミドを用いる場合、Ti-およびRi-プラスミドT-DNAの少なくとも右境界、しかしより好ましくは左右境界を、隣接領域として導入すべき外来遺伝子と結合しなければならない。アグロバクテリアを形質転換に用いる場合、組み込むべきDNAは特殊なプラスミド、すなわち中間ベクターまたはバイナリベクターのいずれかにクローニングしなければならない。T-DNA内での配列と相同な配列により、中間ベクターを相同的組換えによりアグロバクテリウムのTi-またはRi-プラスミドに組み込んでもよい。これはまた、T-DNAのトランスファーに必要なvir-領域を含む。中間ベクターはアグロバクテリア内で複製できない。ヘルパープラスミドによって、中間ベクターはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacien s）にトランスファーしてもよい（接合）。バイナリベクターはアグロバクテリアと共に、大腸菌で複製してもよい。それらは、左右のT-DNA境界領域によって枠組みされるリンカーまたはポリリンカーと共に、選択可能なマーカー遺伝子を含む。それらは、アグロバクテリアの中に直接形質転換してもよい（ホルスターズら（Holsters）、Mol.Gen.Genet.163（1978）、181〜187）。宿主細胞として作用するアグロバクテリアは、vir-領域を有するプラスミドを含まなければならない。vir-領域は、T-DNAの植物細胞へのトランスファーに必要である。さらなるT-DNAが存在してもよい。そのように形質転換したアグロバクテリウムは植物細胞の形質転換に用いられる。植物細胞の形質転換にT-DNAを用いることは、欧州特許第120 516号；ホーケマ（Hoekema）「バイナリ植物ベクターシステム」（The Binary Plant Vector Sys tem）Offsetdrukkerij Kanters B.V．Alblasserdam（1985）第Ｖ章；フラレーら（Fraley）、Crit.Rev.Plant.Sci.,4、1〜46およびアンら（An）、EMBO J.4（19 85）、277〜287において詳しく調べられ、十分に記述されている。 DNAを植物細胞にトランスファーするためには、植物外植体をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）またはアグロバクテリウム・リゾジェネス（Agrobacteirum rhizogenes）と共に培養することが適している。感染した植物材料（例えば、葉片、茎の一部、根、またプロトプラスト、または懸濁培養植物細胞）から、形質転換細胞の選択のために抗生物質またはバイオザイド（biozide）を含んでもよい適した培地において、植物全体をその後再生してもよい。そのようにして得られた植物を次に、導入DNAの有無に関して調べてもよい。バイオリスティック法を用いた、またはプロトプラストの形質転換による、外来DNAを導入するためのその他の可能性は当業者に既知である（例えば、ウィルミッツァー（Willmitzer，L.）、1993、「トランスジェニック植物」（ Transgenic plants）「バイオテクノロジー、多数巻の広範囲に及ぶ論文」（Bio technology，A Multi-Volume Comprehensive Treatise）レーム、リード、ピューラー、 659 VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge参照）。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）によるTi-プラスミドベクター系による双子葉植物の形質転換は十分に確立されているが、より最近の研究は、アグロバクテリウムに基づくベクターを用いた形質転換には単子葉植物も適しているかも知れないことを示している（チャンら（Chan ）、Plant Mol.Biol.22（1993）、491〜506；ヒエイら（Hiei）、Plant J.6（19 94）、271〜282；デンら（Deng）、Science in China 33（1990）、28〜34；ウィルミンクら（Wilmink）、Plant Cell Reports 11（1992）、76〜80；メイら（ May）、Bio/Technology 13（1995）、486〜492；コナー＆ドミッセ（Conner and Domisse）、Int.J.Plant Sci.153（1992）、550〜555;リッチーら（Ritchie）、Transgenic Res.2（1993）、252〜265）。単子葉植物の形質転換に関する別の系は、バイオリスティック（biolistic）アプローチ（ワン＆レモー（Wan and Lemaux）、Plant Physiol.104（1994）、3 7〜48；ベジルら（Vasil）、Bio/Technology 11（1993）、1553〜1558；リタラら（Ritala）、Plant Mol.Biol.24（1994）、317〜325；スペンサーら（Spencer ）、Theor.Appl.Gent.79（1990）、625〜631）、プロトプラスト形質転換、部分透過細胞の電気穿孔、グラスファイバーによるDNAの導入、を用いた形質転換である。トウモロコシの形質転換を特に扱った関係論文に様々な引用がある（例えば、国際公開公報第95/06128号、欧州特許第0 513 849号；欧州特許第0 465 875号；フロムら（Fromm）、Biotechnology 8（1990）、833〜844；ゴードン-カムら（G ordon-Kamm）、P1ant Cell ２(1990)、603〜618；コジールら（Koziel）、Biote chnology 11（1993）、194〜200）。欧州特許第292 435号では、粘液のない、もろい顆粒状のトウモロコシカルスを開始材料として、それによって受精能力のある植物を得てもよい方法を記述している。この文において、受精能力のある植物を再生するためには、植物に再生することが可能な分裂したプロトプラストの培養物を、そこから作出することができる、カルス懸濁培養から開始することが必要であることがシリトら（Shillito、Bio/Technology 7（1989）、581）によってさらに観察されている。７〜８ヶ月のインビトロ培養期間の後、シリトら（Sh illito）は、生存子孫を有する植物を得ているが、それらは形態および繁殖に異常を示した。 589）は、カテト（Cateto）トウモロコシ近交系カタログ番号100-1のトウモロコシプロトプラストから受精可能な植物を再生および得る方法について記述した。著者らは、プロトプラストの受精可能植物への再生は、遺伝子型、ドナー細胞の生理状態、および培養条件のような多くの様々な要因に依存すると仮定している。オオムギ（ワン＆レモー、上記引用文献；リタラら、上記引用文献）およびコムギ（ネーラら（Nehra）、Plant J.5（1994）、285〜297）のような、その他の穀類の形質転換の成功についても、これまでに記述されている。導入されたDNAが植物細胞のゲノムに一度取り込まれると、それは通常、その場に安定に留まり、最初の形質転換細胞の子孫にも残る。通常、バイオザイドまたはカナマイシン、G 418、ブレオマイシン、ヒグロマイシン、またはフォスフィノトリシン等のような抗生物質に対する耐性を形質転換植物細胞に付与する選択可能マーカーを含む。したがって、個々に選択されたマーカーがあれば、導入されたDNAを欠如する細胞に対して形質転換細胞の選択が可能となるはずである。形質転換細胞は、植物内で通常に増殖する（マコーミックら（McCormick）、P lant Cell Reports 5（1986）、81〜84）。得られた植物は通常のように栽培することが可能で、同じ形質転換した遺伝子遺伝または別の遺伝子遺伝を有する植物と交配することができる。得られたハイブリッド個体は、対応する表現型特性を有している。植物細胞から種子を得てもよい。表現型特徴を安定に保つか否か、およびそれがトランスファーされるか否かを保証するためには、２世代以上を増殖させるべきである。さらに、対応する表現型または他の特性が残っていることを保証するために、種子を採取すべきである。実施例により本発明を例示する。本実施例では、以下の方法を用いた。１．クローニング法大腸菌でのクローニングに関しては、ベクターpBluescript II SK（ストラタジーン）を用いた。２．細菌株 BluescriptベクターおよびpUSP構築物に関しては、大腸菌株DH5α（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ、ガイサースバーグ、USA）を利用した。大腸菌株XL1-Blueはインビボ切除に用いた。３．DNA断片の放射活性マーキング DNA断片の放射活性マーキングは、製造元の指示に従って、ベーリンガー（ドイツ）のDNA-ランダムプライマー標識キットによって実施した。実施例１ジャガイモ（Solanum tuberosum）の新規脱分枝酵素をコードする cDNAのクローニングジャガイモの新規脱分枝酵素をコードするcDNA分子を単離するため、塊茎のポリA⁺RNAから始めて、cDNAライブラリをベクターラムダZAP II（ストラタジーン）内で構築し、ファージヘッドにパックした。XL1 Blue株の大腸菌細胞をその後 cDNA断片（１×10⁶ pfu）を含むファージで感染させ、約30,000個／75cm²の密度でペトリ皿の培地に播種した。８時間のインキュベーションの後、ニトロセルロース膜を溶解した細菌に載せ、１分後に除去した。フィルターをまず0.5M NaOH ；1.5M NaClで２分インキュベートし、次に0.5Mトリス/塩酸pH7.0で２分間、および最後に２×SSCで２分間インキュベートした。UVクロスリンクによってDNAを乾燥および固定させた後、放射活性標識プローブを加える前に、フィルターをハイブリダイゼーション緩衝液で48℃で３時間インキュベートした。プローブとして、脱分枝酵素をコードするトウモロコシのcDNAを利用した（Ja mesら、Plant Cell 7(1995)，417〜429，ヌクレオチド1150〜2128参照）。ハイブリダイゼーションは、２×SSC、10×デーンハルド（Dehnhardt）溶液； 50mM Na₂HPO₄、pH7.2；0.2％SDS；５mM EDTAおよび250μｇ/ml変性ニシン精子DN Aで、48℃で実施した。ハイブリダイズしたファージクローンを選び出し、定法によってさらに精製した。インビボ切り出しにより、陽性ファージクローンから大腸菌クローンを得た。大腸菌クローンは、それぞれにcDNAインサートを有する二本鎖pBluescriptプラスミドを含んだ。インサートのサイズおよび制限パターンを調べた後、プラスミドDNAを適したクローン、Iso5から単離し、そのように単離したプラスミドは2 295bpのインサートを含んだ。実施例２プラスミドIso5のcDNAインサートの配列分析実施例１に記述のように単離したプラスミドIso5の場合、cDNAインサートのヌクレオチド配列は、ジデソキシ（didesoxy）ヌクレオチド法（サンガーら（Sang er）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74（1977）、5463〜5467）によって標準的なルーチンにおいて決定した。インサートの長さは2295bpである。このインサートの 2133bpのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を、配列番号：１に示す。相同性比較により、コードした蛋白質がジャガイモの新規脱分枝酵素であることが示された。配列番号：１に示すヌクレオチド配列は、これまで未知のトウモロコシの脱分枝酵素をコードする部分的cDNAを表す。この配列により、定法によって、適した cDNAまたはゲノムライブラリから完全なcDNA配列またはゲノム配列を単離することが可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 9/44 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．（a）配列番号：２に示すアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする核酸分子；（b）配列番号：１に示すヌクレオチド配列を含む核酸分子；（c）（a）または（b）の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子；および（d）そのヌクレオチド配列が、遺伝子コードの縮重により（a）、（b）または（c）の核酸分子のヌクレオチド配列から逸脱している核酸分子、からなる群より選択される、ジャガイモ（Solanum tuberosum）の脱分枝酵素の生物活性を有する蛋白質をコードする核酸分子。２．cDNA分子である請求項１記載の核酸分子。３．請求項１または２記載の核酸分子に特異的にハイブリダイズする、少なくとも15bpの核酸分子。４．請求項１または２記載の核酸分子の転写物と特異的にハイブリダイズし、それによってその翻訳が阻害される、請求項３記載の核酸分子。５．請求項１または２記載の核酸分子を含むベクター。６．核酸分子が、原核または真核生物細胞における転写および翻訳を可能にする制御エレメントとセンス方向で結合している、請求項５記載のベクター。７．請求項１もしくは２記載の核酸分子、または請求項５もしくは６記載のベクターによって遺伝的に改変された宿主細胞。８．請求項７記載の宿主細胞を適当な条件下で培養し、合成された蛋白質を培養物から回収する、ジャガイモ（Solanum tuberosum）の脱分枝酵素の生物活性を有する蛋白質の製造法。９．請求項１または２記載の核酸分子によってコードされる、ジャガイモ（So lanum tuberosum）由来脱分枝酵素の生物活性を有する蛋白質。 10．請求項１または２記載の核酸分子がゲノム中に安定的に組み込まれており、かつ発現される、トランスジェニック植物細胞である請求項７記載の宿主細胞。 11．請求項10記載のトランスジェニック植物細胞を含むトランスジェニック植物。 12．デンプン貯蔵植物である請求項11記載のトランスジェニック植物。 13．穀物植物である請求項12記載のトランスジェニック植物。 14．ジャガイモ植物である請求項12記載のトランスジェニック植物。 15．非形質転換細胞と比較して請求項９記載の蛋白質の活性が減少しており、かつ組換え分子がそのゲノム中に安定的に組み込まれているトランスジェニック植物細胞であって、該分子が以下の(a)および(b)を含む、植物細胞：（a）植物細胞において活性なプロモーター、ならびに（b）下記の(i)〜(iii)からなる群より選択される核酸配列： (i)転写の際に請求項１または２記載の核酸分子に対するアンチセンスRNAが合成されるような様式で(a)に記載のプロモーターに結合されている核酸配列、 (ii)請求項１または２記載の核酸分子の転写物を特異的に開裂するリボザイムをコードする核酸配列、および (iii)転写の際に請求項９記載の蛋白質のセンスRNAが合成され、その発現により植物細胞における共抑制効果へと至るような様式で(a)に記載のプロモーターに結合されている核酸配列。 16．請求項15記載の植物細胞を含むトランスジェニック植物。 17．ジャガイモ植物である請求項16記載のトランスジェニック植物。 18．請求項10または請求項15記載の植物細胞を含む、請求項11〜14、または請求項16もしくは17のいずれか一項に記載の植物の繁殖材料。