BRPI0921543B1 - métodos para produzir uma composição de óleo, e para fabricar um produto químico, e, composição de óleo. - Google Patents

métodos para produzir uma composição de óleo, e para fabricar um produto químico, e, composição de óleo. Download PDF

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BRPI0921543B1
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BRPI0921543-3A
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Scott Franklin
Aravind Somanchi
Karen Espina
George Rudenko
Penelope Chua
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Terravia Holdings, Inc.
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Abstract

METODO PARA PRODUZIR UMA COMPOSIQAO DE OLEO DE TRIGLICERIDEOS, COMPOSIQAO DE OLEO DE TRIGLICERIDEO, OLEO MISTURADO, METODO PARA FABRICAR UM COMPOSTO QUIMICO,E,ACIDO NUCLEICO RECOMBINANTE. Metodos e composipoes para a produpao de oleo, combustfveis, oleoquimicos e outros compostos em Prototheca sao fornecidos, incluindo microrganismos contendo oleo e metodos de cultivo de baixo custo desses microrganismos. C6lulas de Prototheca contendo genes exdgenos codificando, por exemplo, uma lipase, um transportador de sacarose, uma invertase sacarose, uma frutoquinase, uma enzima de degradapao de polissacandeo, uma acil-ACP tioesterase graxa, uma redutasse acil-CoA graxa/aldefdo, uma redutase acil-CoA graxa, uma redutase de aldefdo graxo, uma decarbonilase de aldefdo graxo e/ou uma proteina transportadora de acila sao uteis na fabricapao de combustfveis de transpose, tai como diesel renovavel, biodiesel e combustivel de jato renovcivel.

Description

[001] O presente pedido reivindica o beneffcio de acordo com 35 U.S.C. 119(e) do pedido de patente provisional US numero 61/118.590, depositado em 28 de novembro de 2008, pedido de patente provisional US numero 61/118.994, depositado em 1 de dezembro de 2008, pedido de patente provisional US numero 61/174.357, depositado em 30 de abril de 2009, e pedido de patente provisional US numero 61/219.525, depositado em 23 de junho de 2009, Cada desses pedidos e incorporado aqui a titulo de referenda na Integra para todas as finalidades.
REFERENCIA A UMA LISTAGEM DE SEQUENCIAS
[002] Este pedido inclui uma listagem de sequencia como mostrado nas paginas 1 a 72, apensas ao presente.
CAMPO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção refere-se a produgao de oleos, combustlveis e oleoqulmicos feitos de microorganismos. Em particular, a revelagao refere-se a microalgas contendo oleo, metodos de cultivar as mesmas para a produgao de compostos uteis, incluindo lipldeos, esteres de acido graxo, acidos graxos, aldeldos, alcoois, e alcanos, e metodos e reagentes para geneticamente alterar os mesmos para melhorar a eficiencia de produgao e alterar o tipo e composigao dos oleos produzidos pelos mesmos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[004] Combustlvel fossil e um termo geral para depositos geologicos combustlveis enterrados de materiais organicos, formados de plantas e animais em decomposigao que foram convertidos em oleo bruto, carvao, gas natural, ou oleos pesados por exposigao a calor e pressao na crosta da terra durante centenas de milhoes de anos. Combustlveis fosseis e um recurso nao renovavel, finito.
[005] A crescente demanda por energia pela economia global tambem colocou pressao crescente sobre o custo de hidrocarbonetos. Alem da energia, muitas industrias, incluindo fabricantes quimicos e de plastico, dependem intensamente na disponibilidade de hidrocarbonetos como um insumo para seus processos de fabricagao. Altemativas eficazes em termos de custo para fontes atuais de fomecimento poderiam ajudar a diminuir a pressao ascendente sobre energia e esses custos de materia-prima.
[006] A publicagao PCT numero 2008/151149 descreve metodos e materiais para cultivar microalgas para a produgao de oleo e particularmente exemplifica a produgao de combustivel diesel de oleo produzido pelas microalgas Chlorella protothecoides. Permanece necessidade de metodos aperfeigoados para produzir oleo em microalgas, particularmente para metodos que produzem oleos com comprimento de cadeia mais curto e grau mais elevado de saturagao e sem pigmentos, com maior rendimento e eficiencia. A presente invenção atende essa necessidade.
SUMARIO DA INVENÇÃO
[007] A invenção prove celulas do genera Prototheca compreendendo um gene exogeno, e em algumas modalidades, a celula e uma cepa da especie Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora ou Prototheca zopfii e em outra modalidade a celula tern uma sequencia rRNA 23S com pelo menos 70, 75, 80, 85 ou 95% de identidade de nucleotideo para uma ou mais das SEQ ID NOS: 11-19, Em algumas celulas o gene exogeno e sequencia de codificagao e esta em ligagao operavel com um promotor, e em algumas modalidades o promotor e de um gene endogeno a uma especie do genera Prototheca. Em modalidades adicionais a sequencia de codificagao codifica uma proteina selecionada do grupo que consiste em uma invertase de sacarose, um tioesterase ACP-acila graxa, uma reductasae de aldeido/CoA-acila graxa, uma reductase de CoA-acila graxa, uma reductase de aldefdo graxo, uma decarbonilase de aldefdo graxo, uma proteina portadora de acila e uma protema que transmite resistencia a um antibiotico. Algumas modalidades de uma tioesterase ACP-acila graxa que tern atividade de hidrolise no sentido de um ou mais substrates ACP-acila graxa de comprimento de cadeia C8, CIO, C12 ou C14, incluindo tioesterases ACPacila com pelo menos 50, 60, 70, 80ou 90% de identidade de aminoacidos com uma ou mais sequencias selecionadas do grupo que consiste em SEQ ID NOS: 59, 61, 63 e 138-140, Em modalidades adicionais a sequencia de codificagao compreende uma sequencia de direcionamento para plastfdio de microalgas, e em algumas modalidades as microalgas sao uma especie do genero Prototheca ou Chlorella bem como outros generos da famflia Chlorellac&ae,. Em algumas modalidades a sequencia de direcionamento para plastfdio tern pelo menos 20, 25, 35, 45 ou 55% de identidade de sequencia de aminoacidos para uma ou mais das SEQ ID NOS: 127-133 e e capaz de direcionar uma protema codificada por um gene exogeno nao localizado no genoma de plastfdio para o plastfdio. Em outras modalidades o promotor e regulado ascendentemente em resposta a redugao ou eliminagao de nitrogenio no meio de cultura da celula, como pelo menos uma regulagao ascendente de 3 vezes como determinado por abundancia de transcrito em uma celula do genero Prototheca quando o ambiente extracelular muda de conter pelo menos 10 mM ou 5 mM de nitrogenio para nao conter nitrogenio. Em modalidades adicionais o promotor compreende um segmento de 50 ou mais nucleotideos de um de SEQ ID Nos: 91-102, Em outras modalidades a celula tern uma sequencia rRNA 23S com pelo menos 70, 75, 80, 85 ou 95% de identidade de nucleotideo para uma ou mais das SEQ ID NOS: 11-19, Em outras modalidades o gene exogeno e integrado em um cromossomo da celula.
[008] Em modalidades adicionais de celulas da invenção, a celula e do genero Prototheca e compreende um gene tioesterase ACP-acila graxa exogena e um perfil de lipideo de pelo menos 4% C8-C14 de lipideos totais da celula, uma quantidade de C8 que e pelo menos 0,3% de lipfdeos totais da celula, uma quantidade de CIO que e pelo menos 2% de lipfdeos totais da celula, uma quantidade de C12 que e pelo menos 2% de lipfdeos totais da celula, uma quantidade de C14 que e pelo menos 4% de lipfdeos totais da celula, e uma quantidade de C8-C14 que e 10-30%, 20-30% ou pelo menos 10, 20 ou 30% dos lipfdeos totais da celula. Em algumas modalidades a celula compreende ainda um gene de invertase sacarose exogena. Em algumas modalidades a celula e uma cepa da especie Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora ou Prototheca zopfii, e em outra modalidade a celula tern uma sequencia rRNA 23S com pelo menos 70, 75, 80, 85 ou 95% de identidade nucleotideo para uma ou mais das SEQ ID NOS: 11-19, Em outras modalidades o gene tioesterase ACP-acila graxa exogena e integrada em um cromossomo da celula. Outras modalidades da invenção compreendem metodos de fazer composigoes de triglicerfdeo de um perfil de lipideo de pelo menos 4% C8-C14 peso/peso ou percentagem de area da composigao de triglicerfdeo, uma quantidade de C8 que e pelo menos 0,3% peso/peso ou percentagem de area, uma quantidade de CIO que e pelo menos 2% peso/peso ou percentagem de area, uma quantidade de C12 que e pelo menos 2% peso/peso ou percentagem de area, uma quantidade de C14 que e pelo menos 4% peso/peso ou percentagem de area, e uma quantidade de C8C14 que e 10-30%, 20-30% ou pelo menos 10, 20, ou 30% peso/peso ou percentagem de area. A invenção tambem compreende metodos de fazer composigoes de triglicerfdeo compreendendo cultivar as celulas acima, em que as celulas tambem compreendem um gene exogeno codificando uma invertase de sacarose e sacarose e fomecida como uma fonte de carbono. Em algumas modalidades a invertase de sacarose tern pelo menos 50, 60, 70, 80, ou 90% de identidade de aminoacidos para uma ou mais das SEQ ID NOS: 3, 20-29 e 90.
[009] As modalidades da invenção incluem composigoes de oleo de triglicendeo bem como celulas contendo composipoes de oleo de triglicerfdeo compreendendo um perfil de lipfdeo de pelo menos 4% C8-C14 e um ou mais dos seguintes atributos: 0,1 a 0,4 micrograma/ml de carotenoides totais, menos de 0,4 microgramas/ml de carotenoides totais, menos de 0,001 micrograma/ml de licopeno; menos de 0,02 micrograma/ml de beta caroteno, menos de 0,02 miligrama de clorofila por quilograma de oleo; 0,40 a 0,60 miligrama de gama tocoferol por 100 gramas de oleo; 0,2 a 0,5 miligrama de tocotrienois totais por grama de oleo, menos de 0,4 miligrama de tocotrienois totais por grama de oleo, 4 a 8 mg por 100 gramas de oleo de campesterol, e 40 a 60 mg por 100 gramas de oleo de estigmasterol. Em algumas modalidades da invenção as composipoes de oleo de triglicendeo tern um perfil de lipfdeo de pelo menos 4% C8-C14 peso/peso ou percentagem de area da composipao de triglicendeo, uma quantidade de C8 que e pelo menos 0,3% peso/peso ou percentagem de area, uma quantidade de CIO que e pelo menos 2% peso/peso ou percentagem de area, uma quantidade de C12 que e pelo menos 2% peso/peso ou percentagem de area, uma quantidade de C14 que e pelo menos 4% peso/peso ou percentagem de area, e uma quantidade de C8C14 que e de 10 a 30%, 20 a 30% ou pelo menos 10, 20 ou 30% peso/peso ou percentagem de area. Em outras modalidades a composipao de oleo de triglicendeo e misturada com pelo menos outra composipao selecionada do grupo que consiste em soja, semente de colza, canola, palma, semente de palma, coco, milho, refugo de vegetal, sebo chines, azeitona, girassol, semente de algodao, gordura de galinha, sebo de boi, sebo de porco, microalgas, macroalgas, Cuphea, linho, amendoim, graxa branca de escolha, banha, Camelina sativa, castanha de caju semente de mostarda, aveias, tremopo, kenaf, calendula, canhamo, cafe, linhapa (linho), avela, euforbia, semente de abobora, pecan, jojoba, jatrpfa, macadamia, castanhas do para, abacate, petroleo, ou uma frapao destilada de quaisquer dos oleos anteriores.
[0010] Os metodos da invenpao tambem incluem processar os oleos acima mencionados por executar uma ou mais reagoes quimicas da lista que consistem e transesterificagao, hidrogenagao, hidrocraqueamento, desoxigenagao, isomerizagao, interesterificagao, hidroxilagao, hidrolise para fomecer acidos graxos livres, e saponificagao. A invenção tambem inclui combustfveis de hidrocarboneto feitos de hidrogenagao e isomerizagao dos oleos acima mencionados e esteres de alquila de acido graxo feitos de transesterificagao dos oleos acima mencionados. Em algumas modalidades o combustivel de hidrocarboneto e feito de triglicerfdeo isolado de celulas do genero Prototheca em que a faixa de destilagao T10 a T90 ASTM D86 e pelo menos 25°C. Em outras modalidades o combustivel de ester de alquila de acido graxo e feito de triglicerfdeo isolado de celulas do genero Prototheca, em que a composigao tern um tempo de embeber frio Al ASTM D6751 menor do que 120 segundos.
[0011] A invenção tambem inclui composigoes compreendendo (a) polissacarideo compreendendo um ou mais monossacarideos da lista que consiste em 20 a 30 moles em porcentagem de galactose, 55 a 65 moles em porcentagem de glicose; e 5 a 15 moles em porcentagem de manose; (b) proteina; e (c) DNA compreendendo uma sequencia rRNA 23S com pelo menos 70,75, 80, 85, ou 95% de identidade de nucleotfdeos para uma ou mais das SEQ ID NOS: 11-19; e (d) um gene exogeno. Em algumas modalidades o gene exogeno e selecionado de uma invertase de sacarose e uma tioesterase ACP-acila graxa, e em modalidades adicionais a composigao compreende ainda lipideo com um perfil de lipideo de pelo menos 4% C8-C14. Em outras modalidades a composigao e formulada para consumo como uma ragao de animal.
[0012] A invenção inclui acidos nucleicos recombinantes codificando promotores que sao regulados ascendentes em resposta a redugao ou eliminagao de nitrogenio no meio de cultura de uma celula do genero Prototheca, como pelo menos uma regulagao ascendente de 3 vezes como determinado por abundancia de transcrito quando o ambiente extracelular muda de conter pelo menos 10 mM ou 5 mM de nitrogenio para nao conter nitrogenio. Em algumas modalidades o acido nucleico recombinante compreende um segmento de 50 ou mais nucleotideos de uma das SEQ ID NOS: 91-102, A invenção tambem inclui vetores de acido nucleico compreendendo um cassete de expressao que compreende (a) um promotor que e ativo em uma celula do genero Prototheccr, e (b) uma sequencia de codificagao em ligagao operavel com o promotor em que a sequencia de codificagao contem o mais ou o segundo mais preferido codon da tabela 1 para pelo menos 20, 30, 40, 50, 60 ou 80% dos codons da sequencia de codificagao. Em alguns vetores a sequencia de codificagao compreende uma sequencia de direcionamento para plastfdio em quadro com uma tioesterase ACP-acila graxa, incluindo tioesterase que tern atividade de hidrolise em diregao a um ou mais substratos ACP-acila graxa de comprimento de cadeia C8, CIO, C12 ou C14, Alguns vetores incluem sequencias de direcionamento para plastfdio que codificam peptfdeos que sao capazes de direcionar uma protema ao plastfdio de uma celula do genero Prototheca, incluindo aqueles de microalgas e aqueles em que a sequencia de direcionamento para plastfdio tern pelo menos 20, 25, 35, 45, ou 55% de identidade de sequencia de aminoacidos para uma ou mais das SEQ ID NOS. 127 133 e e capaz de direcionar uma protema para o plastfdio de uma celula do genero Prototheca. Vetores adicionais da invenção compreendem sequencias de acido nucleico endogenas ao genoma nuclear de uma celula do genero Prototheca, em que a sequencia tern pelo menos 200 nucleotideos de comprimento, e alguns vetores compreendem primeira e segunda sequencias de acidos nucleicos endogenas ao genoma nuclear de uma celula do genero Prototheca, em que as primeira e segunda sequencias (a) tern individualmente pelo menos 200 nucleotideos de comprimento; (b) flanqueiam o cassete de expressao; e (c) sao localizados no mesmo cromossomo de Prototheca nao separados em mais do que 5, 10, 15,
[0013] A invenção tambem inclui um acido nucleico recombinante com pelo menos 80, 90, 95 ou 98% de identidade de nucleotfdeos para uma ou ambas das SEQ ID NOS: 134-135 e um acido nucleico recombinante que codificam uma proteina com pelo menos 80, 90, 95 ou 98% de identidade de aminoacidos para uma ou ambas de SEQ ID NOS: 136-137.
[0014] A invenção tambem compreende metodos de produzir composigoes de triglicerfdeo, compreendendo (a) cultivar uma populagao de celulas do genero Prototheca na presenga de uma fonte de carbono fixa, em que: (i) as celulas contem um gene exogeno; (ii) as celulas acumulam pelo menos 10, 20, 30, 40, 60 ou 70% de seu peso de celula seco como lipideo; e (iii) a fonte de carbono fixo e selecionada do grupo que consiste em sorgo e material celulosico despolimerizado; e (b) isolar componentes de lipideo dos microorganismos cultivados. Em algumas modalidades a fonte de carbono fixo e material celulosico despolimerizado selecionado do grupo que consiste em forragem de milho, Miscanthus, sorgo de forragem, polpa de beterraba e bagago de cana de agucar, opcionalmente que foi submetido a lavagem com agua antes da etapa de cultivo. Em alguns metodos a fonte de carbono fixo e material celulosico despolimerizado e o nivel de glicose do material celulose despolimerizado e concentrado em um nfvel de pelo menos 300 g/litro, pelo menos 400g/litro, pelo menos 500 g/litro, ou pelo menos 600 g/litro antes da etapa de cultivo e e alimentado a cultura com o passar do tempo a medida que as celulas crescem e acumulam lipideo. Em alguns metodos o gene exogeno codifica uma tioesterase ACP-acila graxa que tern atividade de hidrolise em diregao a um ou mais substratos ACP-acila graxa de comprimento de cadeia C8, CIO, C12 ou C14, e em alguns metodos o triglicerfdeo tern um perfil de lipideo de pelo menos 4% C8-C14 e um ou mais dos seguintes atributos: 0,1 a 0,4 micrograma/ml de carotenoides totais; menos de 0,02 miligrama de clorofila por quilograma de oleo; 0,40 a 0,60 miligrama de gama tocoferol por 100 gramas de oleo; 0,2 a 0,5 miligrama de tocotrienois totais por grama de oleo, 4 a 8 mg por 100 gramas de oleo de campesterol, e 40 a 60 mg por 100 gramas de oleo de estigmasterol.
[0015] Metodos adicionais da invenção incluem produzir uma composigao de triglicendeo, compreendendo: (a) cultivar uma populagao de microorganismos na presenga de material celulose despolimerizado, em que: (i) o material celulosico despolimerizado e submetido a lavagem com agua antes da etapa de cultivo; (ii) as celulas acumulam pelo menos 10, 20, 30, 40, 60 ou 70% de seu peso de celula seco como lipfdeo; e (iii) o material celulosico despolimerizado e concentrado a pelo menos 300, 400, 500 ou 600 g/litro de glicose antes da etapa de cultivo; (iv) os microorganismos sao cultivados em uma reagao de batelada alimentada na qual material celulosico despolimerizado de pelo menos 300, 400, 500 ou 600 g/litro de glicose e alimentado aos microorganismos; e (b) isolar componentes de lipfdeo dos microorganismos cultivados. Em algumas modalidades a fonte de carbono fixo e material celulosico despolimerizado selecionado do grupo que consiste em forragem de milho, Miscanthus, sorgo de forragem, polpa de beterraba e bagago de cana de agucar. Em modalidades adicionais os microorganismos sao uma especie do genero Prototheca e contem um gene exogeno, incluindo uma tioesterase ACP-acila graxa que tern atividade de hidrolise em diregao a um ou mais substrates ACP-acila graxa de comprimento de cadeia C8, CIO, C12 ou C14. Um metodo adicional da invenção compreende fabricar oleo de triglicendeo compreendendo cultivar uma celula que tern uma sequencia rRNA 23 S com pelo menos 90% ou 96% de identidade de nucleotideo para SEQ ID NO: 30 na presenga de sacarose como uma fonte de carbono.
[0016] A invenção tambem inclui metodos de fabricar um produto qufmico compreendendo executar uma ou mais reagoes qufmicas da lista que consiste em transesterificagao, hidrogenagao, hidrocraqueamento, desoxigenagao, isomerizagao, interesterificagao, hidroxilagao, hidrolise e saponificagao em um oleo de triglicerfdeo, em que o oleo tern um perfil de lipideo de pelo menos 4% C8-C14 e um ou mais dos seguintes atributos: 0,1 a 0,4 microgramas/ml de carotenoides totais; menos de 0,02 miligramas de clorofila por quilograma de oleo; 0,10 a 0,60 miligramas de gama tocoferol por 100 gramas de oleo; 0,1 a 0,5 miligramas de tocotrienois totais por grama de oleo, 1 a 8 mg por 100 gramas de oleo de campesterol, e 10 a 60 mg por 100 gramas de oleo de estigmasterol. Alguns metodos sao realizados por fabricar o oleo por cultivar uma celula do genero Prototheca que compreende um gene trioesterase ACP-acila graxa exogena que codifica um tioesterase ACP-acila graxa tendo atividade de hidrolise no sentido de um ou mais substratos ACP-acila graxa de comprimento de cadeia C8, CIO, C12 ou C14. Em alguns metodos a reagao de hidrolise e selecionada do grupo que consiste em saponificagao, hidrolise de acido, hidrolise alcalina, hidrolise enzimatica, hidrolise catalftica, e hidrolise de agua comprimida quente, incluindo uma reagao de hidrolise catalftica em que o oleo e dividido em glicerol e acidos graxos. Em metodos adicionais os acidos graxos sao submetidos a uma reagao de aminagao para produzir compostos de nitrogenio graxo ou uma reagao de ozonolise para produzir acidos monoe dibasicos. Em algumas modalidades o oleo e submetido a um metodo de divisao de triglicerfdeo selecionado do grupo que consiste em divisao enzimatica e divisao por pressao. Em alguns metodos uma reagao de condensagao segue a reagao de hidrolise outros metodos incluem executar uma reagao de hidroprocessamento no oleo, opcionalmente em que o produto da reagao de hidroprocessamento e submetido a uma reagao de desoxigenagao ou uma reagao de condensagao antes de ou simultaneamente com a reagao de hidroprocessamento. Alguns metodos incluem adicionalmente uma reagao de remogao de gas. Metodos adicionais incluem processar os oleos acima mencionados por executar uma reagao de desoxigenagao selecionada do grupo que consiste em: uma reagao de hidrogenolise, hidrogenagao, uma reagao de hidrogenolise-hidrogenagao consecutiva, uma reagao de hidrogenagao-hidrogenolise consecutiva, e uma reagao de hidrogenolise-hidrogenagao combinada. Em alguns metodos uma reagao de condensagao segue a reagao de desoxigenagao. Outros metodos incluem executar uma reagao de esterificagao nos oleos acima mencionados, opcionalmente uma reagao de interesterificagao ou uma reagao de transesterificagao. Outros metodos incluem executar uma reagao de hidroxilagao nos oleos acima mencionados, opcionalmente em que uma reagao de condensagao segue a reagao de hidroxilagao.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0017] As Figures 1 e 2 ilustram as curvas de crescimento de especie Prototheca e cepa Chlorella luteoviridis SAG 2214 crescida em sorgo como a fonte de carbono.
[0018] A Figura 3 mostra crescimento de curso de tempo de SAG 2214 em glicose e sacarose.
[0019] A Figura 4 mostra mapas dos cassetes utilizando transformagoes em Prototheca, como descrito no exemplo 3.
[0020] A Figura 5 mostra os resultados de analise Southern blot em tres transformantes de cepa UTEX 1435, como descrito no exemplo 3.
[0021] A Figura 6 mostra um diagrama esquematico do construto de transgene de (invertase de sacarose de levedura (ylnv)) sue 2 otimizado em codon e nao otimizada em codon. Os sftios de clonagem de restrigao relevantes sao indicados e as setas indicam a diregao de transcrigao.
[0022] A Figura 7a mostra os resultados de Prototheca moriformis crescido em agucares derivados de celulose (forragem de milho, polpa de beterraba, cana de sorgo, Miscanthus e controle de glicose). O crescimento e expresso em medigoes de densidade optica (leituras A750).
[0023] A Figura 7b mostra os resultados de experimentos de crescimento utilizando Prototheca moriformis utilizando mveis diferentes de agucar celulosico derivado de forragem de milho como comparado com controle de xilose/glicose.
[0024] A Figura 7c mostra o impacto que xilose tem sobre a produgao de lipideo em culturas de Prototheca.
[0025] A Figura 7d mostra o impacto de concentragao de sal (Na2SO4) e antiespuma no crescimento (em peso de celula seca (DCW)) de Prototheca.
[0026] A Figura 8 mostra o impacto de tratamento hidrotermico de varios materiais celulosicos (bagago de cana de agucar, cana de sorgo, Miscanthus e polpa de beterraba) e o fluxo de agucar resultante no crescimento de Prototheca.
[0027] A Figura 9 mostra niveis decrescentes de hidroxi metil furfurais (HMF) e furfurais em biomassa celulosica (bagago de cana de agucar, cana de sorgo, Miscanthus e polpa de beterraba) apos ciclos repetidos de tratamento hidrotermico.
[0028] A Figura 10 mostra um diagrama esquematico de um processo de sacarificagao de materiais celulosicos para gerar fluxos de agucar apropriados para uso em produgao de oleo heterotrofico em um fermentador.
[0029] A Figura 11 mostra niveis decrescentes de HMF e furfurais em bagago de cana de agucar explodido apos ciclos repetidos de tratamento hidrotermico.
[0030] A Figura 12 mostra um diagrama esquematico de construtos de tioesterase utilizados em transformagoes de Prototheca. Os promotores de beta-tubulina heterologos (NeoR de acionamento) e desidrogenase de glutamato sao derivados de Chlamydomonas reinhardtii e Chlorella sorokiniana, respectivamente. 3’UTR reductase de nitrato foi derivado de Chlorella vulgaris. Os sftios de clonagem de restrigao relevantes sao indicados e setas indicam a diregao de transcrigao.
[0031] A Figura 13 mostra um cromatograma de diesel renovavel produzido de oleo de triglicerfdeo Prototheca.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[0032] A presente invenção se origina da descoberta de que Prototheca e certos microorganismos relacionados tern propriedades inesperadamente vantajosas para a produgao de oleos, combustlveis e outras composigoes de lipfdeo ou hidrocarboneto economicamente e em grandes quantidades, bem como da descoberta de metodos e reagentes para geneticamente alterar esses microorganismos para melhorar essas propriedades. Os oleos produzidos por esses microorganismos podem ser utilizados no combustlvel de transporte, industrias petroqulmica, e/ou alimentlcia e cosmetica, entre outras aplicagoes. A transesterificagao de lipfdeos fomece esteres de acido graxo de cadeia longa uteis como biodiesel. Outros processos enzimaticos e qulmicos podem ser moldados para fomecer acidos graxos, aldeldos, alcoois, alcanos e alcenos. Em algumas aplicagoes, diesel renovavel, combustlvel de jato, ou outros compostos de hidrocarboneto sao produzidos. A presente invenção tambem prove metodos de cultiva microalgas para produtividade aumentada e rendimento aumentado de lipfdeos, e/ou para produgao mais eficaz em termos de custo das composigoes descritas aqui.
[0033] Essa descrigao detalhada da invenção e dividida em segoes para conveniencia do leitor. A segao I prove definigoes em termos usados aqui. A segao 2 prove uma descrigao de condigoes de cultura uteis nos metodos da invenção. A segao 3 prove uma descrigao de metodos e materiais de engenharia genetica. A segao 4 prove uma descrigao de engenharia genetica de Prototheca para permitir utilizagao de sacarose. A segao 5 prove uma descrigao de engenharia genetica de Prototheca para modificar biosslntese de lipfdeo. A segao 6 descreve metodos para fazer combustlveis e produtos qufmicos. A segao 7 revela exemplos e modalidades da invenção. A descrigao detalhada invenção e seguida por exemplos que ilustram os varios aspectos e modalidades da invenção.
I. DEFINIQOES
[0034] A menos que defmido de outro modo, todos os termos tecnicos e cientfficos utilizados aqui tern o significado comumente entendido por uma pessoa versada na tecnica a qual essa invenção pertence. As seguintes referencias fomecem a uma pessoa versada com uma definigao geral de muitos dos termos utilizados nessa invenção: Singleton e outros., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5a Ed., R. Rieger e outros. (eds.), Springer Verlag (1991); e Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como utilizado aqui, os seguintes termos tern os significados atribuidos aos mesmos a menos que especificado de outro modo.
[0035] “Ativo em microalgas” se refere a um acido nucleico que e funcional em microalgas. Por exemplo, um promotor que foi utilizado para acionar um gene de resistencia a antibiotico para transmitir resistencia a antibiotic© a uma microalga transgenica e ativo em microalgas.
[0036] “Proteina portadora de acila” ou “ACP” e uma proteina que liga uma cadeia de acila em crescimento durante smtese de acido graxo como um ester tiol no tiol distal da fragao 4’-fosfopantetema e compreende um componente do complexo de sintase de acido graxo.
[0037] “Molecula de CoA-acila” ou “acila-CoA” e uma molecula compreendendo uma fragao de acila fixada covalentemente a coenzima A atraves de uma ligagao de ester tiol no tiol distal da fragao 4’-fosfopantetema de coenzima A.
[0038] “Percentagem de area” se refere a area de picos observados utilizando metodos de detecgao GC/FID FAME nos quais todo acido graxo na amostra e convertido em um ester metflico de acido graxo (FAME) antes da detecgao. Por exemplo, um pico separado e observado para um acido graxo de 14 atomos de carbono sem insaturagao (C14:0) em comparagao com qualquer outro acido graxo como C14:l. A area de pico para cada classe de FAME e diretamente proportional a sua percentagem de composigao na mistura e e calculada com base na soma de todos os picos presentes na amostra (isto e, [area sob pico especifico/ area total de todos os picos medidos] x 100). Ao se referir a perils de lipideo de oleos e celulas da invenção, “pelo menos 4% C8C14” significa que pelo menos 4% do total de acidos graxos na celula ou na composigao de glicerolipldeo extralda tern um comprimento de cadeia que inclui 8, 10, 12 ou 14 atomos de carbono.
[0039] “Axenico” e uma cultura de um organismo isento de contaminagao por outros organismos vivos.
[0040] “Biodiesel” e um ester de alquila de acido graxo biologicamente produzido apropriado para uso como um combustlvel em um motor diesel.
[0041] “Biomassa” e um material produzido por crescimento e/ou propagagao de celulas. Biomassa pode conter celulas e/ou conteudo intracelular bem como material extracelular, inclui, porem nao e limitado a, compostos secretados por uma celula.
[0042] “Biorreator” e um involucre ou involucre parcial no qual celulas sao cultivadas, opcionalmente em suspensao.
[0043] “Catalisador” e um agente, como uma molecula ou complexo macromolecular, capaz de facilitar ou promover uma reagao qulmica de um reagente a um produto sem se tomar uma parte do produto. Um catalisador aumenta a taxa de uma reagao, apos o que, o catalisador pode atuar em outre reagente para formar o produto. Um catalisador diminui genericamente a energia de ativagao geral exigida para a reagao de tai modo que prossegue mais rapidamente ou em uma temperatura inferior. Desse modo, um equillbrio de reagao pode ser obtido mais rapidamente. Os exemplos de catalisadores incluem enzimas, que sao catalisadores biologicos; calor, que e um catalisador nao biologico; e metais utilizados em processos de refinagao de oleo fossil.
[0044] “Material celulosico” e o produto de digestao de celulose, incluindo glicose e xilose, e compostos adicionais opcionalmente como dissacandeos, oligossacandeos, lignina, furfurais e outros compostos. Exemplos nao limitadores de fontes de material celulosico incluem bagagos de cana de agucar, polpa de beterraba, forragem de milho, aparas de madeira, po de serra e switchgrass.
[0045] “Co-cultura”, e variantes da mesma como “co-cultivar” e “cofermentar”, se referem a presenga de dois ou mais tipos de celulas no mesmo biorreator. Os dois ou mais tipos de celulas podem ambos ser microorganismos, como microalgas, ou podem ser uma celula de microalgas cultivada com um tipo de celula diferente. As condigoes de cultura podem ser aquelas que favorecem crescimento e/ou propagagao dos dois ou mais tipos de celulas ou aqueles que facilitam crescimento e/ou proliferagao de um, ou um subconjunto, de duas ou mais celulas enquanto mantem crescimento celular para o restante.
[0046] “Cofator” e qualquer molecula diferente do substrato, exigida para uma enzima realizar sua atividade enzimatica.
[0047] “DNA complementar” ou “nDNA” e uma copia de DNA de mRNA, normalmente obtida por transcrigao inversa de RNA mensageiro (mRNA) ou amplificagao (por exemplo, atraves de reagao de cadeia de polimerase (“PCR”)).
[0048] “Cultivado” e variantes do mesmo como “cultivado” e “fermentado”, se referem a promogao intentional de crescimento (aumentos em tamanho de celula, teores celulares e/ou atividade celular) e/ou propagagao (aumentos em numeros de celula atraves de mitose) de uma ou mais celulas pelo uso de condigoes selecionadas e/ou controladas. A combinagao tanto de crescimento como de propagagao pode ser denominada proliferagao. Os exemplos de condigoes selecionadas e/ou controladas incluem o uso de um meio definido (com caractensticas conhecidas com pH, resistencia ionica, e fonte de carbono), temperatura especificada, tensao de oxigenio, nfveis de dioxido de carbono, e crescimento em um biorreator. Cultivar nao se refere ao crescimento ou propagagao de microorganismos em natureza ou de outro modo sem intervengao humana; por exemplo, crescimento natural de um organismo que se toma finalmente fossilizado para produzir oleo bruto geologico nao e cultivo.
[0049] “Citolise” e a lise de celulas em um ambiente hipotonico. A citolise e causada por osmose excessiva, ou movimento de agua, em diregao ao interior de uma celula (hiperidratagao). A celula nao pode resistir a pressao osmotica da agua no interior, e assim explode.
[0050] “Farelo deslipidado” e “biomassa microbiana deslipidada” e biomassa microbiana apos o oleo (incluindo lipfdeos) ter sido extrafdo ou isolado da mesma, atraves do uso de extragao mecanica (isto e, exercida por uma prensa expelidora) ou por solvente ou ambos. Farelo deslipidado tern uma quantidade reduzida de oleo/lipfdeos em comparagao com antes da extragao ou isolamento de oleo/lipfdeos da biomassa microbiana porem contem algum oleo residual/lipfdeo.
[0051] “Vetor de expressao” ou “construto de expressao” ou “plasmideo” ou “construto de DNA recombinante” se refere a um acido nucleico que foi gerado atraves de intervengao humana, incluindo por meio recombinante ou smtese quimica direta, com uma serie de elementos de acido nucleico especificados que permitem transcrigao e/ou tradugao de um acido nucleico especifico em uma celula hospedeira. O vetor de expressao pode ser parte de um plasmideo, vfrus ou fragmento de acido nucleico. Tipicamente, o vetor de expressao inclui um acido nucleico a ser transcrito operativamente ligado a um promotor.
[0052] “Gene exogeno” e um acido nucleico que codifica para a expressao de um RNA e/ou protema que foi introduzida (“transformada”) em uma celula. Uma celula transformada pode ser mencionada como uma celula recombinante, na qual gene(s) exogeno(s) adicionais podem ser introduzidos. O gene exogeno pode ser de uma especie diferente (e assim heterologo) ou da mesma especie (e assim homologo) em relagao a celula sendo transformada. Desse modo, um gene exogeno pode incluir um gene homologo que ocupa um local diferente no genoma da celula ou esta sob controle diferente, em relagao a copia endogena do gene. Um gene exogeno pode estar presente em mais de uma copia na celula. Um gene exogeno pode ser mantido em uma celula como uma insergao no genoma ou como uma molecula epissomal.
[0053] “Fomecido de forma exogena” se refere a uma molecula fomecida ao meio de cultura de uma cultura de celula.
[0054] “Prensagem em expelidor” e um metodo mecanico para extrair oleo de materias primas como sojas e semente de colza. Uma prensa expelidora e uma maquina do tipo parafuso, que pressiona material atraves de uma cavidade semelhante a barril em gaiola. Materias primas entram em um lado da prensa e massa usada sai do outro lado enquanto o oleo vaza para fora entre as barras na gaiola e e coletado. A maquina utiliza fricgao e pressao contmua dos acionamentos de parafuso para mover e comprimir a materiaprima. O oleo vaza atraves de pequenas aberturas que nao permitem passagem de solidos. A medida que a materia-prima e prensada, a fricgao faz com que a mesma tipicamente aquega.
[0055] “Tioesterase ACP-acila graxa” e uma enzima que catalisa a clivagem de um acido graxo de uma proteina portadora de acila (ACP) durante sfntese de lipideo.
[0056] “Reductase de aldeido/CoA-acila graxa” e uma enzima que catalisa a redugao de uma molecula CoA-acila para um alcool primario.
[0057] “Reductase CoA-acila graxa” e uma enzima que catalisa a redugao de uma molecula de CoA-acila para um aldefdo.
[0058] “Descarbonilase de aldefdo graxo” e uma enzima que catalisa a conversao de um aldefdo graxo em um alcano.
[0059] “Reductase de aldefdo graxo” e uma enzima que catalisa a redugao de um aldeido a um alcool primario.
[0060] “Fonte de carbono fixa” e uma molecula(s) que contem carbono, tipicamente uma molecula organica, que esta presente em temperatura e pressao ambiente em forma solida ou Hquida em um meio de cultura que pode ser utilizado por um microorganismo cultivado na mesma.
[0061] “Homogeneizado” e biomassa que foi fisicamente rompida.
[0062] “Hidrocarboneto” e (a) uma molecula contendo somente atomos de carbono e hidrogenio em que os atomos de carbono sao covalentemente ligados para formar uma espinha dorsal cfclica ou parcialmente cfclica, linear, ramificada, a qual os atomos de hidrogenio sao ligados. A estrutura molecular de compostos de hidrocarboneto varia da mais simples, na forma de metano (CH4), que e um constituinte de gas natural, ate a muito pesada e muito complexa, como algumas moleculas como asfaltenos encontrados em oleo bruto, petroleo e betumes. Hidrocarbonetos podem estar em forma gasosa, Hquida ou solida, ou qualquer combinagao dessas formas, e podem ter uma ou mais ligagoes duplas ou triplas entre atomos de carbono adjacentes na espinha dorsal. Por conseguinte, o termo inclui alcanos cfclicos ou parcialmente cfclicos, lineares, ramificados, alcenos, lipfdeos e parafinas. Os exemplos incluem propano, butano, pentano, hexano, octano e esqualeno.
[0063] “Razao de hidrogenio:carbono” e a razao de atomos de hidrogenio para atomos de carbono em uma molecula em uma base de atomo para atomo. A razao pode ser utilizada para se referir ao numero de atomos de carbono e hidrogenio em uma molecula de hidrocarboneto. Por exemplo, o hidrocarboneto com a razao mais elevada e metano CH4 (4:1).
[0064] “Fragao hidrofobica” e a porgao, ou fragao de um material que e mais soluvel em uma fase hidrofobica em comparagao com uma fase aquosa. Uma fragao hidrofobica e substancialmente insoluvel em agua e normalmente nao polar.
[0065] “Rendimento aumentado de lipfdeo” se refere a um aumento na produtividade de uma cultura microbiana, por exemplo, por aumentar o peso seco de celulas por litro de cultura, aumentar a percentagem de celulas que constituem lipideo, ou aumentar a quantidade geral de lipideo por litro de volume de cultura por tempo unitario.
[0066] “Promotor induzfvel” e um promotor que media transcrigao de um gene operativamente ligado em resposta a um estfmulo especifico.
[0067] “Em ligagao operavel” e uma ligagao funcional entre duas sequencias de acido nucleico, como sequencia de controle (tipicamente um promotor) e a sequencia ligada (tipicamente uma sequencia que codifica uma proteina, tambem chamada uma sequencia de codificagao). Um promotor esta em ligagao operavel com um gene exogeno se puder mediar transcrigao do gene.
[0068] “In situ” significa “no lugar” ou “em sua posigao original”.
[0069] “Concentragao de limitagao de um nutriente” e uma concentragao de um composto em uma cultura que limita a propagagao de um organismo cultivado. Uma “concentragao nao limitadora de um nutriente” e uma concentragao que suporta propagagao maxima durante um dado periodo de cultura. Desse modo, o numero de celulas produzidas durante um dado periodo de cultura e mais baixo na presenga de uma concentragao de limitagao de um nutriente do que quando o nutriente e nao limitador. Diz-se que um nutriente esta “em excesso” em uma cultura, quando o nutriente esta presente em uma concentragao maior do que aquela que suporta propagagao maxima.
[0070] “Lipase” e uma enzima soluvel em agua que catalisa a hidrolise de ligagoes de ester em substratos de lipideo insoluveis em agua. Lipases catalisam a hidrolise de lipfdeos em glicerois e acidos graxos.
[0071] “Enzima de modificagao de lipideo” se refere a uma enzima que altera a estrutura covalente de um lipideo. Os exemplos de enzimas de modificagao de lipideo incluem uma lipase, uma tioesterase ACP-acila graxa, uma reductase de aldeido/CoA-acila graxa, uma reductase de CoA-acila graxa, uma reductase de aldefdo graxo, e uma decarbonilase de aldeido graxo.
[0072] “Enzima de via de lipfdeo” e qualquer enzima que desempenha um papel em metabolismo de lipfdeo, isto e, sfntese, modificagao ou degradagao de lipfdeo, e quaisquer proteinas que modificam quimicamente lipfdeos, bem como proteinas portadoras.
[0073] “Lipfdeos” sao uma classe de moleculas que sao soluveis em solventes nao polares (como eter e cloroformio) e sao relativamente ou totalmente insoluveis em agua. Moleculas de lipfdeo tern essas propriedades, porque consistem amplamente em caudas de hidrocarboneto longas que sao de natureza hidrofobica. Os exemplos de lipfdeos incluem acidos graxos (saturados e insaturados); glicendeos ou glicerolipideos (como monoglicerfdeos, digliceiideos, triglicendeos ou gorduras neutras, e fosfoglicerfdeos ou glicerofosfolipfdeos); nonglicendeos (esfingolipidios, lipfdeos de esterol incluindo colesterol e hormonios de esteroide, lipfdeos de prenol incluindo terpenoides, alcoois graxos, ceras e policetfdes); e derivados de lipfdeo complexos (lipfdeos ligados por agticar, ou glicolipfdeos, e lipfdeos ligados por protema). “Gorduras” sao um subgrupo de lipfdeos chamado “triacilglicerideos.”
[0074] “Lisado” e uma solugao contendo o conteudo de celulas lisadas.
[0075] “Lise” e a ruptura da membrana de plasma e opcionalmente a parede de celula de um organismo biologico suficiente para liberar pelo menos um pouco do conteudo intracelular, frequentemente por mecanismos mecanico, viral ou osmotico que comprometem sua integridade.
[0076] “Lisar” e romper a membrana celular e opcionalmente a parede da celula de um organismo biologico ou celula suficiente para liberar pelo menos um pouco do conteudo intracelular.
[0077] “Microalgas” e um organismo microbiano eucariotico que contem um cloroplasto ou plastfdio, e opcionalmente que e capaz de executar fotossmtese, ou um organismo microbiano procariotico capaz de executar fotossmtese. Microalgas incluem fotoautotrofos obrigados, que nao podem metabolizar uma fonte de carbono fixa como energia, bem como heterotrofos, que podem viver exclusivamente de uma fonte de carbono fixa. Microalgas incluem organismos unicelulares que separam de celulas irmas logo apos a divisao das celulas, como Chlamydomonas, bem como microbios como, por exemplo, Volvox, que e um microbio fotossintetico multicelular simples de dois tipos de celulas distintas. Microalgas incluem celulas como Chlorella, Dunaliella e Prototheca. Microalgas tambem incluem outros organismos fotossinteticos microbianos que apresentam adesao de celula-celula, como Agmenellum, Anabaena e Pyrobotrus. Microalgas tambem incluem microorganismos heterotroficos obrigados que perderam a capacidade de executar fotossmtese, como certas especies de algas dinoflagellate e especies do genero Prototheca.
[0078] “Microorganismo” e “microbio” sao organismos unicelulares microscopicos.
[0079] “Naturalmente coexpresso” com referenda a duas protemas ou genes significa que as protemas ou seus genes sao coexpressos naturalmente em um tecido ou organismo do qual sao derivados, por exemplo, porque os genes que codificam as duas protemas estao sob o controle de uma sequencia reguladora comum ou porque sao expresses em resposta ao mesmo estfmulo.
[0080] “Choque osmotico” e a ruptura de celulas em uma solugao apos uma redugao subita em pressao osmotica. Choque osmotico e as vezes induzido para liberar componentes celulares de tais celulas em uma solugao.
[0081] “Enzima de degradar polissacarfdeos” e qualquer enzima capaz de catalisar a hidrolise, ou sacarificagao, de qualquer polissacandeo. Por exemplo, celulases catalisam a hidrolise de celulose.
[0082] “Polissacarfdeos” ou “glicanos” sao carboidratos compostos de monossacarfdeos unidos por ligagoes glicosidicas. Celulose e um polissacarfdeo que compoem certas paredes de celula de planta. Celulose pode ser despolimerizada por enzimas para fomecer monossacandeos como xilose e glicose, bem como dissacarfdeos e oligossacarideos maiores.
[0083] “Promotor” e uma sequencia de controle de acido nucleico que orienta a transcrigao de um acido nucleico. Como utilizado aqui, um promotor inclui sequencias de acido nucleicas necessarias proximas ao sftio de partida de transcrigao, como, no caso de um promotor do tipo polimerase II, um elemento TATA. Um promotor tambem inclui opcionalmente elementos intensificadores ou repressores distais, que podem ser localizados tantos quanto varios ilhares de pares base do sftio de partida de transcrigao.
[0084] “Recombinante” e uma celula, acido nucleico, proteina ou vetor, que foi modificado devido a introdugao de um acido nucleico exogeno ou a alteragao de um acido nucleico native. Desse modo, por exemplo, celulas recombinantes expressam genes que nao sao encontrados na forma nativa (nao recombinante) da celula ou expressam genes nativos diferentemente daqueles genes sao expresses por uma celula nao recombinante. Um “acido nucleico recombinante” e um acido nucleico originalmente formado in vitro, em geral, pela manipulagao de acido nucleico, por exemplo, utilizando polimerases e endonucleases, ou de outro modo esta em uma forma nao encontrada normalmente na natureza. Acidos nucleicos recombinantes podem ser produzidos, por exemplo, para colocar dois ou mais acidos nucleicos em ligagao operavel. Desse modo, um acido nucleico isolado ou um vetor de expressao formado in vitro por ligar moleculas de DNA que nao sao normalmente unidas em natureza, sao ambos considerados recombinantes para fins da presente invenção. Apos um acido nucleico recombinante ser feito e introduzido em uma celula hospedeiro ou organismo, pode replicar utilizando maquinaria celular in vivo da celula hospedeira; entretanto, tais acidos nucleicos, apos serem produzidos de forma recombinante, embora subseqiientemente replicados intracelularmente, sao ainda considerados recombinantes para fins da presente invenção. Similarmente uma “protema recombinante” e uma protema feita utilizando tecnicas recombinantes, isto e, atraves da expressao de um acido nucleico recombinante.
[0085] “Diesel renovavel” e uma mistura de alcanos (como Cl0:0, C12:0, C14:0, C16:0 e C18:0) produzida atraves de hidrogenagao e desoxigenagao de lipfdeos.
[0086] “Sacarificagao” e um processo de converter biomassa, normalmente biomassa celulosica ou lignocelulosica em agiicares monomericos, como glicose e xilose. Material celulosico “sacarificado” ou “despolimerizado” ou biomassa se refere a material celulosico ou biomassa que foi convertido em agucares monomericos atraves de sacarificagao.
[0087] “Sonicagao” e um processo de romper materiais biologicos, como uma celula, por uso de energia de onda sonora.
[0088] “Especie de furfural” e 2-furancarboxaldeido ou um derivado que retem as mesmas caracterfsticas estruturais basicas.
[0089] “Forragem” sao os talos e folhas secas de uma cultura que permanece apos um grao ter sido colhido.
[0090] “Gene de utilizagao de sacarose” e um gene que quando expresso, auxilia a capacidade de uma celula utilizar sacarose como uma fonte de energia. Proteinas codificadas por um gene de utilizagao de sacarose sao mencionadas aqui como “enzimas de utilizagao de sacarose” e incluem transportadores de sacarose, invertases de sacarose, e hexocinases como glucocinases e frutocinases.
II. CULTIVO
[0091] A presente invenção refere-se genericamente ao cultivo de cepas de Prototheca, particularmente cepas de Prototheca recombinantes, para a produgao de lipfdeo. Para conveniencia do leitor, essa segao e subdividida em subsegoes. A subsegao 1 descreve especie e cepas de Prototheca e como identificar novas especies e cepas de Prototheca e microalgas relacionadas por comparagao genomica de DNA. A subsegao 2 descreve biorreatores uteis para cultivo. A subsegao 3 descreve meios para cultivo. A subsegao 4 descreve produgao de oleo de acordo com metodos de cultivo ilustrativos da invenção.
1. Especie e cepas de Prototheca
[0092] Prototheca e um microorganismo notavel para uso na produgao de lipideo, porque pode produzir niveis elevados de lipideo, particularmente lipideo apropriado para produgao de combustivel. O lipideo produzido por Prototheca tern cadeias de hidrocarboneto de comprimento de cadeia mais curto e um grau de saturagao mais elevado do que aquele produzido por outras microalgas. Alem disso, o lipideo de Prototheca 6 genericamente livre de pigmentos (niveis baixo a nao detectavel de clorofila e certos carotenoides) e em qualquer caso contem muito menos pigmento do que lipideo de outras microalgas. Alem disso, celulas de Prototheca recombinantes fomecidas pela invenção podem ser utilizadas para produzir lipideo em rendimento e eficiencia maiores, e com custo reduzido, em relagao a produgao de lipideo de outros microorganismos. Cepas de Prototheca ilustrativas para uso nos metodos da invenção incluem, alem disso, essa microalga cresce heterotroficamente e pode ser geneticamente construida como Prototheca wickerhamii, Prototheca stagnora (incluindo UTEX 327), Prototheca portoricensis, Prototheca moriformis (incluindo cepas UTEX 1441, 1435), e Prototheca zopfii. Especies do genero Prototheca sao heterotrofos obrigados.
[0093] A especie de Prototheca para uso na invenção pode ser identificada por amplificagao de certas regioes alvo do genoma. Por exemplo, a identificagao de uma especie ou cepa de Prototheca especifica pode ser obtida atraves de amplificagao e seqtienciamento de DNA nuclear e/ou cloroplasto utilizando iniciadores e metodologia utilizando qualquer regiao do genoma, por exemplo, utilizando os metodos descritos em Wu e outros, Bot. Bull. Acad. Sin. (2001) 42:115-121, Identification of Chlorella spp. isolates using ribosomal DNA sequences. Metodos bem estabelecidos de analise filogenetica, como amplificagao e seqiienciamentos de espagador transcrito intemo ribosomal (ITS1 e ITS2 rDNA), 23S rRNA, 18s rRNA e outras regioes geonomicas conservadas podem ser utilizados por aqueles versados na tecnica para identificar especie nao somente de Prototheca, porem outros organismos que produzem lipfdeo e hidrocarboneto com perfis de lipfdeo similares e capacidade de produgao. Para exemplos de metodos de identificagao e classificagao de algas, vide, tambem, por exemplo, Genetics, 2005 Agosto; 170(4):1601-10 eRNA, 2005 Abril;ll(4):361-4.
[0094] Desse modo, a comparagao de DNA genomico pode ser utilizada para identificar especie apropriada de microalgas a serem utilizadas na presente invenção. Regioes de DNA genomico conservado como, porem nao limitado a, DNA codificando para 23 S rRNA, podem ser amplificadas de especies de microalgas e comparadas com sequencias de consenso para selecionar para especies de microalgas que sao relacionadas de forma taxonomica com as microalgas preferidas utilizadas na presente invenção. Os exemplos de tai comparagao de sequencia de DNA para especies no genero de Prototheca sao mostrados abaixo. A comparagao de DNA genomico pode ser tambem util para identificar especies de microalgas que foram identificadas erroneamente em uma colegao de cepas. Freqtientemente uma colegao de cepas identificara especies de microalgas com base em caracterfsticas morfologicas e fenotipicas. O uso dessas caracterfsticas pode levar a categorizagao erronea da especie ou genero de uma microalga. O uso de comparagao de DNA genomico pode ser um metodo melhor de categorizar especie de microalgas com base em sua relagao filogenetica.
[0095] Microalgas para uso na presente invenção tern tipicamente sequencias de DNA genomico codificando para 23 S rRNA que tern pelo menos 99%, pelo menos 95%, pelo menos 90%, ou pelomenos85% de identidade de nucleotideo para pelo menos uma das sequencias listadas na SEQ ID NOS: 11-19.
[0096] Para comparagao de sequencia para determinar a percentagem de identidade de aminoacido ou nucleotideo, tipicamente uma sequencia atua como uma sequencia de referenda, com a qual sequencias de teste sao comparadas. Ao utilizar um algoritmo de comparagao de sequencias, sequencias de referenda e teste sao entradas em um computador, coordenadas de subseqiiencia sao designadas, se necessario, e parametros de programa de algoritmo de sequencia sao designados. O algoritmo de comparagao de sequencia calcula entao a percentagem de identidade de sequencia para a(s) sequencia(s) de teste em relagao a sequencia de referenda, com base nos parametros de programa designados.
[0097] O alinhamento otimo de sequencias para comparagao pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), pelo metodo de busca para similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat’I. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988), por implementagoes computadorizadas desses algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ou por inspegao visual (vide geneticamente, Ausubel e outros., supra).
[0098] Outro algoritmo de exemplo que e apropriado para determinar a percentagem de identidade de sequencia e similaridade de sequencia e o algoritmo BLAST, que e descrito em Altschul e outros., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990). Software para executar analises BLAST esta disponfvel ao publico atraves de e National Center for Biotechnology Information (no enderego da rede www.ncbi.nlm.nih.gov). Esse algoritmo envolve identificar primeiramente pares de sequencia de marcagao elevada (HSPs) por identificar palavras curtas de comprimento W na sequencia de consulta, que casam ou atendem alguma marcagao de limite de valor positive T quando alinhado com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequencia de banco de dados. T e mencionado como o limite de marcagao de palavra na vizinhanga (Altschul e outros, supra). Esses hits de palavra da vizinhanga, iniciais, atuam como sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos contendo as mesmas. Os hits de palavra sao entao estendidos nas duas diregoes ao longo de cada sequencia ate onde a marcagao de alinhamento cumulative pode ser aumentada. Marcagoes cumulativas sao calculadas utilizando, para sequencias de nucleotideo, os parametros M (marcagao de recompensa para um par de residuos casados; sempre > 0) e N (marcagao de penalidade para residues descasados; sempre < 0). Para sequencias de aminoacidos, uma matriz de marcagao e utilizada para calcular a marcagao cumulativa. A extensao dos hits de palavras em cada diregao e parada quando: a marcagao de alinhamento cumulativo cai pela quantidade X de seu valor maximo obtido; a marcagao cumulativa vai para zero ou abaixo devido ao acumulo de um ou mais alinhamentos de residue de marcagao negativa; ou o termino de qualquer sequencia e atingido. Para identificar se um acido nucleico ou polipeptfdio esta compreendido no escopo da invenção, os parametros default dos programas BLAST sao apropriados. O programa BLASTN (para sequencias de nucleotideo) utiliza como defaults um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M=5, N= -4, e uma comparagao das duas fitas. Para sequencias de aminoacidos, o programa BLASTP utiliza como defaults um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e a matriz de marcagao BLOSUM62, O programa TBLATN (utilizando sequencia de protema para sequencia de nucleotideo) utiliza como defaults um comprimento de palavra (W) de 3, uma expectativa (E) de 10, e uma matriz de marcagao BLSOUM 62, (vide Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89:10915 (1989)).
[0099] Alem de calcular a percentagem de identidade de sequencia, o algoritmo BLAST tambem executa uma analise estatfstica da similaridade entre duas sequencias (vide, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat’I. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993)). Uma medida de similaridade fomecida pelo algoritmo BLAST e a menor probabilidade de soma (P(N)), que fomece uma indicagao da probabilidade pela qual um casamento entre duas sequencias de aminoacidos ou nucleotfdeos ocorreria por acaso. Por exemplo, um acido nucleico e considerado similar a uma sequencia de referenda se a menor probabilidade de soma em uma comparagao com acido nucleico de teste para o acido nucleico de referenda for menor do que aproximadamente 0,1, mais preferivelmente menor do que aproximadamente 0,01, e mais preferivelmente menor do que aproximadamente 0,001,
[00100] Outras consideragoes que afetam a selegao de microorganismos para uso na invenção incluem, alem da produgao de lipfdeos ou hidrocarbonetos apropriados para a produgao de oleos, combustfveis e oleoqufmicos: (1) teor elevado de lipideo como percentagem de peso de celula; (2) facilidade de crescimento; (3) facilidade de engenharia genetica; e (4) facilidade de processamento de biomassa. Em modalidades especfficas, o microorganismo construido geneticamente ou do tipo selvagem fomece celulas que sao pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65% ou pelo menos 70% ou mais de lipideo. Organismos preferidos crescem heterotroficamente (em agucares na ausencia de luz).
2. Biorreator
[00101] Microorganismos sao cultivados tanto para fins de conduzir manipulagoes geneticas e para produgao de hidrocarbonetos (por exemplo, lipfdeos, acidos graxos, aldeidos, alcoois e alcanos). O tipo anterior de cultura e conduzido em uma escala pequena e inicialmente, pelo menos sob condigoes nas quais o microorganismo de partida pode crescer. A cultura para fins de produgao de hidrocarboneto e normalmente conduzida em uma escala grande (por exemplo, 10,000 L, 40,000 L, 100,000 L ou biorreatores maiores) em um biorreator. Prototheca sao tipicamente cultivadas nos metodos da invenção em meios liquidos em um biorreator. Tipicamente, o biorreator nao permite entrada de luz.
[00102] O biorreator ou fermentador e utilizado para cultivar celulas de microalgas atraves das varias fases de seu ciclo fisiologico. Biorreatores oferecem muitas vantagens para uso em metodos de crescimento e propagagao heterotroficos. Para produzir biomassa para uso em alimentos, microalgas sao preferivelmente fermentadas em grandes quantidades em liquido, como em culturas de suspensao como exemplo. Biorreatores como fermentadores de ago podem acomodar volumes de cultura muito grandes (40.000 litres e biorreatores de capacidade maior sao utilizados em varias modalidades da invenção). Biorreatores tambem permitem tipicamente o controle de condigoes de cultura como temperatura, pH, tensao de oxigenio, e mveis de dioxido de carbono. Por exemplo, biorreatores sao tipicamente configuraveis, por exemplo, utilizando oriffcios fixados a tubagem, para permitir que componentes gasosos, como oxigenio ou nitrogenio, sejam borbulhados atraves de uma cultura de liquido. Outros parametros de cultura, como o pH do meio de cultura, a identidade e concentragao de elementos residuais, e outros constituintes de meios tambem possam ser mais facilmente manipulados utilizando um biorreator.
[00103] Biorreatores podem ser configurados para fluir meio de cultura atraves do biorreator durante todo o periodo de tempo durante o qual as microalgas reproduzem e aumentam em numero. Em algumas modalidades, por exemplo, os meios podem ser infundidos no biorreator apos inoculagao, porem antes das celulas atingirem uma densidade desejada. Em outros casos, um biorreator e cheio de meio de cultura no infcio de uma cultura, e nenhuma quantidade adicional de meio de cultura e infundida apos a cultura ser inoculada. Em outras palavras, a biomassa de microalgas e cultivada em um meio aquoso por um periodo de tempo durante o qual as microalgas reproduzem e aumentam em numero; entretanto, quantidades de meio de cultura aquosa nao sao fluidas atraves do biorreator durante todo o periodo de tempo. Desse modo em algumas modalidades, meio de cultura aquoso nao e flufdo atraves do biorreator apos inoculagao.
[00104] Biorreatores equipados com dispositivos como pas de rotagao e impulsores, mecanismos de oscilagao, barras de agitagao, meio para infusao de gas pressurizado podem ser utilizados para submeter as culturas de microalgas a mistura. A mistura pode ser contmua ou intermitente. Por exemplo, em algumas modalidades, um regime de fluxo turbulento de entrada de gas e entrada de meio nao e mantido para reprodugao de microalgas ate que um aumento desejado em numero das microalgas tenha sido obtido.
[00105] Orificios de biorreator podem ser utilizados para introduzir, ou extrair gases, solidos, semissolidos e liquidos, na camara de biorreator contendo as microalgas. Embora muitos biorreatores tenham mais de um orificio (por exemplo, um para entrada de meio, e outro para amostragem), nao e necessario que somente uma substancia entre ou saia de um orificio. Por exemplo, um orificio pode ser utilizado para fluir meio de cultura para dentro do biorreator e posteriormente utilizado para amostragem, entrada de gas, saida de gas, ou outras finalidades. Preferivelmente, um orificio de amostragem pode ser utilizado repetidamente sem alteragao comprometendo a natureza axenica da cultura. Um orificio de amostragem pode ser configurado com uma valvula ou outro dispositivo que permita que o fluxo de amostra seja parado e iniciado ou fomega um meio de amostragem continua. Biorreatores tern tipicamente pelo menos um orificio que permite inoculagao de uma cultura, e tai orificio tambem pode ser utilizado para outras finalidades como meios ou entrada de gas.
[00106] Orificios de biorreatores permitem que o teor de gas da cultura de microalgas seja manipulado. Para ilustrar, parte do volume de um biorreator pode ser gas em vez de liquido, e as entradas de gas do biorreator para permitir bombeamento de gases para dentro do biorreator. Gases que podem ser beneficamente bombeados para dentro de um biorreator incluem ar, misturas de ar/CCh, gases nobres, como argonio e outros gases. Biorreatores sao tipicamente equipados para permitir que o usuario controle a taxa de entrada de um gas no biorreator. Como observado acima, o fluxo de gas crescente para dentro de um biorreator pode ser utilizado para aumentar a mistura da cultura.
[00107] O fluxo de gas aumentado afeta a turbidez da cultura tambem. A turbulencia pode ser obtida por colocar um orificio de entrada de gas abaixo do nivel do meio de cultura aquoso de modo que o gas que entra no biorreator borbulhe ate a superflcie da cultura. Um ou mais oriflcios de saida de gas permitem escapamento de gas, desse modo evitando acumulo de pressao no biorreator. Preferivelmente um orificio de saida de gas levada a uma valvula “de uma via” que evita que microorganismos contaminantes entrem no biorreator.
3. Meios
[00108] Meio de cultura de microalgas contem tipicamente componentes como fonte de nitrogenio fixo, uma fonte de carbono fixo, elementos residuais, opcionalmente um tampao para maniitengao de pH, e fosfato (tipicamente fomecido como um sal de fosfato). Outros componentes podem incluir sais como cloreto de sodio, particularmente para microalgas de agua do mar. Fontes de nitrogenio incluem fontes de nitrogenio organico e inorganico, incluindo, por exemplo, sem limitagao, nitrogenio molecular, nitrato, sais de nitrato, arnonia (pura ou em forma de sal, como (NH^SCh e NH4OH), protema, farelo de soja, solugao de infusao de milho, e extrato de levedo. Os exemplos de elementos residuais incluem zinco, boro, cobalto, cobre, manganes e molibdenio, por exemplo, nas respectivas formas de ZnCl2, H3BO3, COCI26H2O, CUC12-2H2O, MnCl2-4H2O e (NH4)6Mo7O24’4H2O.
[00109] Microorganismos uteis de acordo com os metodos da presente invenção sao encontrados em varios locais e ambientes em todo o mundo. Como conseqiiencia de seu isolamento de outras especies e sua divergencia evolucionaria resultante, o meio de crescimento especifico para crescimento otimo e geragao de constituintes de lipideo e/ou hidrocarboneto podem ser dificeis de prever. Em alguns casos, certas cepas de microorganismos podem ser incapazes de crescer em um meio de crescimento especifico devido a presenga de algum componente inibidor ou a ausencia de alguma exigencia nutricional essential exigida pela cepa de microorganismo especifico.
[00110] Meios de crescimento solidos e liquidos sao geneticamente dispomveis de uma ampla variedade de fontes, e instrugoes para a preparagao de meios especfficos que sao apropriados para uma ampla variedade de cepas de microorganismos podem ser encontrados, por exemplo, online em http://www.utex.org/, a site mantido pela University of Texas em Austin, 1 University Station A6700, Austin, Texas, 78712-0183, para sua colegao de cultura de algas (UTEX). Por exemplo, varios meios de agua salgada e agua doce incluem aqueles descritos na Pub. PCT numero 2008/151149, incorporado aqui a titulo de referencia.
[00111] Em um exemplo especifico, Meio de proteose e apropriado para culturas axenicas, e um volume de IL do meio (pH ~6,8) pode ser preparado por adigao de 1g de peptona de proteose a 1 litro de Meio Bristol. O meio Bristol compreende 2,94 mM NaNCh, 0,17 mM CaCl2-2H2O, 0,3 mM MgSO4-7H2O, 0,43 mM, 1,29 mM KH2PO4, e 1,43 mM NaCl em uma solugao aquosa. Para 1,5% de meio de Agar, 15 g de Agar podem ser adicionados a 1 L da solugao. A solugao e coberta e submetida a autoclave, e entao armazenada em uma temperatura refrigerada antes do uso. Outro exemplo e o meio de isolamento de Prototheca (PIM), que compreende lOg/L de ftalato de hidrogenio de potassio (KHP), 0,9g/L de hidroxido de sodio, 0,1 g/L de sulfato de magnesio, 0,2g/L de fosfato de hidrogenio de potassio, 0,3g/L de cloreto de amonio, lOg/L glicose 0,001g/L de cloridreto de tiamina, 20g/L agar, 0,25g/L 5-fluorocitosina, em um pH na faixa de 5,0 a 5,2 (vide Pore, 1973, App. Microbiology, 26: 648-649). Outros meios apropriados para uso com os metodos da invenção podem ser prontamente identificados por consultar o URL identificado acima, ou por consultar outras organizagoes que mantem culturas de microorganismos, como SAG, CCAP, ou CCALA. SAG se refere a Culture Collection of Algae na University of Gottingen (Gottingen, Alemanha), CCAP se refere a colegao de culturas de algas e protozoarios controlada pela Scottish Association for Marine Science (Escocia, Reino Unido), e CCALA se refere a colegao de cultura de laboratorio de algas no Institute of Botany (Tfebon, Republica Checa). Adicionalmente, a patente US numero 5,900,370 descreve formulagoes de meios e condigoes apropriadas para fermentagao heterotrofica de especie de Prototheca.
[00112] Para produgao de oleo, a selegao de uma fonte de carbono fixo e importante, visto que o custo da fonte de carbono fixo deve ser suficientemente baixo para tomar a produgao de oleo economica. Desse modo, embora fontes de carbono apropriadas incluam, por exemplo, acetato, floridoside, frutose, galactose, acido glucuronico, glicose, glicerol, lactose, manose, N-acetil glicosamina, ramnose, sacarose e/ou xilose, a selegao de insumos contendo aqueles compostos e um aspecto importante dos metodos da invenção. Insumos apropriados uteis de acordo com os metodos da invenção incluem, por exemplo, licor preto, amido de milho, material celulosico despolimerizado, soro de leite, melado, batata, sorgo, sacarose, beterraba, cana de agucar, arroz e trigo. Fontes de carbono tambem podem ser fomecidas como uma mistura, como uma mistura de sacarose de polpa de beterraba despolimerizada. Uma ou mais fonte(s) de carbono podem ser fomecidas em uma concentragao de pelo menos aproximadamente 50 |1M, pelo menos aproximadamente 100 |1M, pelo menos aproximadamente 500 |11M, pelo menos aproximadamente 5 mM, pelo menos aproximadamente 50 mM e pelo menos aproximadamente 500 mM, de uma ou mais fonte(s) de carbono fixo exogenamente fomecida(s). fontes de carbono de interesse especifico para fins da presente invenção incluem celulose (em uma forma despolimerizado), glicerol, sacarose e sorgo, cada um dos quais e discutido em mais detalhes abaixo.
[00113] De acordo com a presente invenção, microorganismos podem ser cultivados inutilizando biomassa celulosica despolimerizada como insumo. Biomassa celulosica (por exemplo, forragem, como forragem de milho) e barata e prontamente dispomvel; entretanto, as tentativas para utilizar esse material como insumo para levedura falharam. Em particular, verificou-se que tais insumos sao inibidores ao crescimento de levedura, e a levedura nao pode utilizar os agucares de 5 carbonos produzidos de materiais celulosicos (por exemplo, xilose de hemicelulose). Por contraste, microalgas podem crescer em material celulosico processado. Materiais celulosicos incluem genericamente aproximadamente 40 a 60% de celulose, aproximadamente 20 a 40% de hemicelulose; e 10 a 30% de lignina.
[00114] Materiais celulosicos apropriados incluem residues de culturas de energia de madeira e herbaceas, bem com culturas agncolas, isto e, as partes de plantas, principalmente talos e folhas, nao removidos dos campos com o alimento primario ou produto de fibra. Os exemplos incluem refugos agncolas como bagago de cana de agucar, cascas de arroz, fibra de milho (incluindo talos, folhas, cascas e espigas), palha de trigo, palha de arroz, polpa de beterraba, polpa citrica, cascas citricas; refugos de silviculture como partes finas de madeira dura e madeira macia, e residues de madeira dura e madeira macia de operagoes de madeira; refugos de madeira como refugos de serraria (aparas de madeira, po de serra) e refugo de descarogador; refugos urbanos como fragoes de papel de refugo solido municipal, refugo de madeira urbano e refugo verde urbano como aparas de grama municipal; e refugo de construgao de madeira. Celulosicos adicionais incluem culturas celulosicas dedicadas como switchgrass, madeira de alamo hibrida, e miscanthus, cana de fibra e sorgo de fibra. Agucares de cinco carbonos que sao produzidos de tais materials incluem xilose.
[00115] Materials celulosicos sao tratados para aumentar a eficiencia com a qual o microbio pode utilizar o(s) agucar(es) contido(s) nos materials. A invenção prove metodos novos para o tratamento de materiais celulosicos apos explosao acida de modo que os materiais sejam apropriados para uso em uma cultura heterotrofica de microbios (por exemplo, microalgas e levedura oleaginosa). Como discutido acima, biomassa lignocelulosica e compreendida de varias fragoes, incluindo celulose, um polimero cristalino de glicose ligado 1,4 beta (um agucar de seis carbonos, hemicelulose, um polimero mais frouxamente associado predominantemente compreendido de xilose (um agucar de cinco carbonos) e ate um ponto menor manose, galactose, arabinose, lignina, um polimero aromatico complexo compreendido de alcool de sinapila e seus derivados, e pectinas, que sao cadeias lineares de um acido poligalacturonico ligado 1,4 alfa. Devido a estrutura polimerica de celulose e hemicelulose, os agucares (por exemplo, xilose e glicose monomerica) nos mesmos nao estao em uma forma que possa ser eficientemente utilizada (metabolizada) por muitos microbios. Para tais microbios, o processamento adicional da biomassa celulosica para gerar os agucares monomericos que compoem os polfmeros podem ser muito uteis para assegurar que os materiais celulosicos sejam eficientemente utilizados como insumo (fonte de carbono).
[00116] Celulose ou biomassa celulosica e submetida a um processo, denominado “explosao”, no qual a biomassa e tratada com acido sulfurico (ou outro) diluido em temperatura e pressao elevadas. Esse processo condiciona a biomassa de tai modo que possa ser eficientemente submetida a hidrolise enzimatica das fragoes celulosica e hemicelulosica em monomeros de xilose e glicose. Os agucares monomericos resultantes sao denominados agucares celulosicos. Agucares celulosicos podem ser subseqiientemente utilizados por microorganismos para produzir uma variedade de metabolitos (por exemplo, lipideo). A etapa de explosao de acido resulta em uma hidrolise partial da fragao de hemicelulose em monossacandeos constituintes. Esses agucares podem ser totalmente liberados da biomassa com tratamento adicional. Em algumas modalidades, o tratamento adicional e um tratamento hidrotermico que inclui lavagem do material explodido com agua quente, que remove contaminantes como sais. Essa etapa nao e necessaria para fermentagoes de etanol celulosico devido as concentragoes mais dilufdas de agucar utilizadas em tais processos. Em outras modalidades, o tratamento adicional e tratamento acido adicional. Ainda em outras modalidades, o tratamento adicional e hidrolise enzimatica do material explodido. Esses tratamentos tambem podem ser utilizados em qualquer combinagao. O tipo de tratamento pode afetar o tipo de agucares liberados (por exemplo, agucares de cinco carbonos versus agucares de seis carbonos) e o estagio no qual sao liberados no processo. Como conseqiiencia fluxos diferentes de agucar, quer sejam predominantemente de cinco carbonos ou de seis carbonos, podem ser criados. Esses fluxos de cinco carbonos ou seis carbonos enriquecidos podem ser desse modo dirigidos a microorganismos especificos com capacidades de utilizagao de carbono diferentes.
[00117] Os metodos da presente invenção envolvem tipicamente a fermentagao em densidades de celula mais elevadas do que o que e obtido em fermentagao de etanol. Devido as densidades mais elevadas das culturas para produgao de oleo celulosico heterotrofico, a fonte de carbono fixa (por exemplo, o(s) fluxo(s) de agucar derivado celulosico) esta preferivelmente em uma forma concentrada. O nivel de glicose do material celulosico despolimerizado e preferivelmente pelo menos 300 g/litro, pelo menos 400g/litro, pelo menos 500 g/litro ou pelo menos 600 g/litro antes da etapa de cultivo, que e opcionalmente um cultivo de batelada alimentada no qual o material e alimentado para as celulas com o passar do tempo a medida que as celulas crescem e acumulam lipfdeo. Fluxos de agucar celulosico nao sao utilizados em ou proximo a essa faixa de concentragao na produgao de etanol celulosico. Desse modo, para gerar e manter as densidades de celulas muito elevadas durante a produgao de oleo lignocelulosico, o (s) insumo(s) de carbono deve(m) ser distribuido(s) nas culturas heterotroficas em uma forma altamente concentrada. Entretanto, qualquer componente no fluxo de alimentagao que nao seja um substrato para, e nao seja metabolizado pelo microorganismo oleaginoso acumulara no biorreator, o que pode levar a problemas se o competente for toxico ou inibidor para a produgao do produto final desejado. Embora lignina e subprodutos derivados de lignina, subprodutos derivados de carboidrato como furfurais e hidroximetil furfurais e sais derivados da geragao dos materiais celulosicos (tanto no processo de explosao como no processo de neutralizagao subseqiiente) e mesmo agucares de hexose/pnose nao metabolizados podem apresentar problemas em fermentagoes etanolicas, esses efeitos sao amplificados significativamente em um processo no qual sua concentragao no insumo initial e elevada. Para obter concentragoes de agucar na faixa de 300 g/L (ou mais elevada para agucares de seis carbonos que podem ser utilizadas em produgao em grande escala de oleo lignocelulosico descrito na presente invenção, a concentragao desses materiais toxicos pode ser 20 vezes mais elevada do que as concentragoes tipicamente presentes em fermentagoes etanolicas de biomassa celulosica.
[00118] O tratamento de processo de explosao do material celulosico utiliza quantidades significativas de acido sulfurico, calor e pressao, desse modo liberando subprodutos de carboidratos, a saber furfurais e hidroxi metil furfurais. Furfurais e hidroxi metil furfurais sao produzidos durante hidrolise de hemicelulose atraves da desidratagao de xilose em furfural e agua. Em algumas modalidades da presente invenção, esses subprodutos (por exemplo, furfurais e hidroxi metil furfurais) sao removidos do material lignocelulosico sacarificado antes da introdugao no biorreator. Em certas modalidades da presente invenção, o process© para remogao dos subprodutos de carboidratos e tratamento hidrotermico dos materiais celulosicos explodidos. Alem disso, a presente invenção prove metodos nos quais as cepas capazes de tolerar compostos como furfurais ou hidroximetil furfurais sao utilizadas para produgao de oleo lignocelulosico. Em outra modalidade, a presente invenção tambem prove metodos e microorganismos que nao sao somente capazes de tolerar furfurais no meio de fermentagao, como sao na realidade capazes de metabolizar esses subprodutos durante a produgao de oleo lignocelulosico.
[00119] O processo de explosao tambem gera niveis significativos de sais. Por exemplo, condigoes tfpicas para explosao podem resultar em condutividades em excesso de 5 mS/cm quando a biomassa celulosica explodida e ressuspensa em uma razao de 10:1 agua:solidos (peso seco). Em certas modalidades da presente invenção, a biomassa explodida dilufda e submetida a sacarificagao enzimatica, e o sobrenadante resultante e concentrado ate 25 vezes para uso no biorreator. O nivel de sal (como medido por condutividade) no(s) fluxo(s) de agucar concentrado pode ser inaceitavelmente elevado (ate 1,5 M Na+ equivalentes). Sais adicionais sao gerados apos neutralizagao dos materiais explodidos para o processo de sacarificagao enzimatica subseqiiente tambem. A presente invenção prove metodos para remover esses sais de modo que o(s) fluxo(s) de agucar celulosico concentrado(s) resultante(s) pode(m) ser utilizados em processos heterotroficos para produzir oleo lignocelulosico. Em algumas modalidades, o metodo de remover esses sais e deionizagao com resinas, como, porem nao limitados a DOWEX Marathon MR3, Em certas modalidades, a etapa de deionizagao com resina ocorre antes da concentragao de agucar ou ajuste de pH e tratamento hidrotermico de biomassa antes da sacarificagao, ou qualquer combinagao do anterior; em outras modalidades, a etapa e conduzida apos um ou mais desses processos. Em outras modalidades, o proprio processo de explosao e alterado de modo a evitar a geragao de sais em nfveis inaceitavelmente elevados. Por exemplo, uma altemativa apropriada para explosao de acido sulfurico (ou outro acido) da biomassa celulosica e polpagem mecanica para tomar a biomassa celulosica respectiva a hidrolise enzimatica (sacarificagao). Ainda em outras modalidades, cepas nativas de microorganismos resistentes a nfveis elevados de sais ou cepas geneticamente construidas com resistencia a nfveis elevados de sais sao utilizados.
[00120] Uma modalidade preferida para o processo de preparagao de biomassa celulosica explodida para uso em produgao de oleo lignocelulosico heterotrofico utilizando microbios oleaginosos e diagramada na figura 10, Etapa I compreende ajuste do pH da biomassa celulosica explodida ressuspensa ate a faixa de 5,0 a 5,3 seguido por lavagem da biomassa celulosica tres vezes. Essa etapa de lavagem pode ser realizada por uma variedade de meios incluindo o uso de resinas de permuta de fon e dessalinizagao, osmose inversa, tratamento hidrotermico (como descrito acima), ou apenas ressuspensao repetida e centrifugagao em agua deionizada. Essa etapa de lavagem resulta em um fluxo celulosico cuja condutividade esta entre 100 a 300 uS/cm e a remogao de quantidades significativas de furfurais e hidroxi metil furfurais. Decantagoes dessa etapa de lavagem podem ser economizados para concentrar agucares de cinco carbonos liberados da fragao de hemicelulose. A etapa II compreende sacarificagao enzimatica da biomassa celulosica lavada. Em uma modalidade preferida, Accellerase (Genencor) e utilizado. A etapa III compreende a recuperagao de agucares atraves de centrifugagao ou decantagao e enxagiie da biomassa sacarificada. A biomassa resultante (solidos) e um componente rico em lignina, denso em energia que pode ser utilizado como combustlvel ou enviado para refugo. O fluxo de agucar recuperado no processo de centrifugagao/decantagao e enxague e coletado. A etapa IV compreende microfiltragao para remover solidos contaminantes com a recuperagao do permeado. A etapa V compreende uma etapa de concentragao que pode ser realizada utilizando um evaporador a vacuo. Essa etapa pode incluir opcionalmente a adigao de agentes antiespuma como P’2000 (Sigma/Fluka) que e as vezes necessario devido ao teor de proteina do insumo de agucar resultante.
[00121] Em outra modalidade do metodo da invenção, a fonte de carbono e glicerol, incluindo subproduto de glicerol acidulado e nao acidulado de transesterificagao de biodiesel. Em uma modalidade, a fonte de carbono inclui glicerol e pelo menos outra fonte de carbono. Em alguns casos, todo glicerol e pelo menos outra fonte de carbono fixo sao fomecidos para o microorganismo no imcio da fermentagao. Em alguns casos, o glicerol e pelo menos outra fonte de carbono fixo sao fomecidos ao microorganismo simultaneamente em uma razao predeterminada. Em alguns casos, o glicerol e pelo menos outra fonte de carbono fixo sao alimentadas para os microbios em uma taxa predeterminada durante o curso de fermentagao.
[00122] Algumas microalgas sao submetidas a divisao de celulas mais rapidamente na presenga de glicerol do que na presenga de glicose (vide a publicagao PCT numero 2008/151149). Nesses casos, processos de crescimento em dois estagios nos quais sao primeiramente alimentadas com glicerol para rapidamente aumentar a densidade das celulas, e sao, entao, alimentadas com glicose para acumular lipfdeos podem melhorar a eficiencia com a qual os lipfdeos sao produzidos. O uso do subproduto de glicerol do processo de transesterificagao prove vantagens economicas significativas quando colocado de volta no processo de produgao. Outros metodos de alimentagao sao fomecidos tambem, como misturas de glicerol e glicose. A alimentagao de tais misturas tambem capture os mesmos beneficios economicos. Alem disso, a invenção prove metodos de alimentar agucares alternatives para microalgas como sacarose em varias combinagoes com glicerol.
[00123] Em outra modalidade dos metodos da invenção, a fonte de carbono e sacarose, incluindo um insumo complexo contendo sacarose, como suco de cana grosso de processamento de cana de agucar. Em uma modalidade, o meio de cultura inclui ainda pelo menos uma enzima de utilizagao de sacarose. Em alguns casos, o meio de cultura inclui uma invertase de sacarose. Em uma modalidade, a enzima de invertase de sacarose e uma enzima de invertase de sacarose secretavel codificada por um gene de invertase de sacarose exogena expresso pela populagao de microorganismos. Desse modo, em alguns casos, como descrito em mais detalhes na Segao IV, abaixo, as microalgas foram geneticamente construfdas para expressar uma enzima de utilizagao de sacarose, como um transportador de sacarose, uma invertase de sacarose, uma hexocinase, uma glucocinase, ou uma frutocinase.
[00124] Insumos complexes contendo sacarose incluem melado de refugo do processamento de cana de agucar; o uso desse produto de refugo de baixo valor, do processamento de cana de agucar, pode fomecer economia de custo significativa na produgao de hidrocarbonetos e outros oleos. Outro insumo complexo que contem sacarose que e util nos metodos da invenção e sorgo, incluindo xarope de sorgo e sorgo puro. Xarope de sorgo e produzido do suco de cana de sorgo doce. Seu perfil de agucar consiste principalmente em glicose (dextrano), frutose e sacarose.
4. Producao de oleo
[00125] Para a produgao de oleo de acordo com os metodos da invenção, e preferfvel cultivar celulas no escuro, como e o caso, por exemplo, ao utilizar fermentadores extremamente grandes (40,000 litres e superior) que nao permitem que a luz atinja a cultura. Especies de Prototheca sao crescidas e propagadas para a produgao de oleo em um meio contendo uma fonte de carbono fixo e na ausencia de luz; tai crescimento e conhecido como crescimento heterotrofico.
[00126] Como exemplo, um inoculo de celulas de microalgas que produzem lipideo e introduzido no meio; ha um periodo de retardo (fase de retardo) antes das celulas comegarem a se propagar. Apos o penodo de retardo, a taxa de propagagao aumenta constantemente e entra fase de log, ou exponential. A fase exponential e, por sua vez, seguida por diminuigao de propagagao devido a diminuigoes em nutrientes como nitrogenio, aumentos em substancias toxicas, e mecanismos de sentir quorum. Apos essa diminuigao, a propagagao para, e as celulas entram em uma fase estacionaria ou estado de crescimento constante, dependendo do ambiente especifico fomecido as celulas. Para obter biomassa rica em lipfdeo, a cultura e tipicamente colhida bem apos o termino da fase exponential, que pode ser terminada cedo por permitir que nitrogenio ou outro nutriente chave (diferente de carbono) se tome esgotado, forgando as celulas a converterem as fontes de carbono, presentes em excesso, em lipideo. Parametros de condigao de cultura podem ser manipulados para otimizar produgao total de oleo, a combinagao de especies de lipfdeos produzida, e/ou produgao de um oleo especifico.
[00127] Como discutido acima, um biorreator ou fermentador e utilizado para permitir que celulas sejam submetidas a varias fases de seu ciclo de crescimento. Como exemplo, um inoculo de celulas que produzem lipideo pode ser introduzido em um meio seguido por um penodo de retardo (fase de retardo) antes das celulas comegarem o crescimento. Apos o penodo de retardo, a taxa de crescimento aumenta constantemente e entra na fase log ou exponential. A fase exponential e por sua vez seguida por diminuigao de crescimento devido a diminuigoes em nutrientes e/ou aumentos em substancias toxicas. Apos essa diminuigao, o crescimento para, e as celulas entram em uma fase estacionaria ou estado constante, dependendo do ambiente especifico fomecido as celulas. A produgao de lipideo por celulas reveladas aqui pode ocorrer durante a fase log ou posteriormente, incluindo a fase estacionaria em que nutrientes sao fomecidos, ou ainda dispomveis, para permitir a continuagao de produgao de lipfdeos na ausencia de divisao de celulas.
[00128] Preferivelmente, microorganismos crescidos utilizando condigoes descritas aqui e conhecidos na tecnica compreendem pelo menos aproximadamente 20% em peso de lipideo, preferivelmente pelo menos aproximadamente 40% em peso, mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 50% em peso, e mais preferivelmente pelo menos aproximadamente 60% em peso. Condigoes de processo podem ser ajustadas para aumentar o rendimento de lipfdeos apropriados para um uso especifico e/ou reduzir custo de produgao. Por exemplo, em certas modalidades, uma microalga e cultivada na presenga de uma concentragao de limite de um ou mais nutrientes, como, por exemplo, nitrogenio, fosforo, ou enxofre, enquanto fomece um excesso de energia de carbono fixa como glicose. A limitagao de nitrogenio tende a aumentar o rendimento microbiano de lipideo em relagao ao rendimento microbiano de lipideo em uma cultura na qual nitrogenio e fomecido em excesso. Em modalidades especlficas, o aumento em rendimento de lipideo e pelo menos aproximadamente: 10%, 50%, 100%, 200% ou 500%. O microbio pode ser cultivado na presenga de uma quantidade limitagao de um nutriente para uma porgao do periodo total de cultura ou para o periodo inteiro. Em modalidades especlficas, a concentragao de nutriente e ciclada entre uma concentragao de limitagao e uma concentragao nao de limitagao pelo menos duas vezes durante o periodo tai de cultura. O teor de lipideo de celulas pode ser aumentado por continuar a cultura por periodos aumentados de tempo enquanto fomece um excesso de carbono, porem limitando ou sem nitrogenio.
[00129] Em outra modalidade, o rendimento de lipideo e aumentado por cultivar um microbio que produz lipideo (por exemplo, microalgas) na presenga de um ou mais cofator(es) para uma enzima de via de lipideo (por exemplo, uma enzima sintetica de acido graxo). Genericamente, a concentragao do(s) cofator(es) e suficiente para aumentar rendimento de lipideo microbiano (por exemplo, acido graxo) em relagao ao rendimento de lipideo microbiano na ausencia do(s) cofator(es). Em uma modalidade especifica, o(s) cofator(es) sao fomecidos a cultura por incluir na cultura um microbio (por exemplo, microalgas) contendo um gene exogeno que codifica o(s) cofator(es). Alternativamente, cofator(es) podem ser fomecidos a uma cultura por incluir um microbio (por exemplo, microalgas) contendo um gene exogeno que codifica uma protema que participa na smtese do cofator. Em certas modalidades, cofatores apropriados incluem qualquer vitamina exigida por uma enzima de via de lipideo, como, por exemplo: biotina, pantotenato. Genes que codificam cofatores apropriados para uso na invenção ou que participam na smtese de tais cofatores sao bem conhecidos e podem ser introduzidos em microbios (por exemplo, microalgas) utilizando construtos e tecnicas como aquelas descritas acima.
[00130] Os exemplos especfficos de biorreatores, condigoes de cultura, e metodos de crescimento e propagagao heterotroficos descritos aqui podem ser combinados em qualquer modo apropriado para melhorar a eficiencia de crescimento microbiano e produgao de lipideo e/ou protema.
[00131] Biomassa de microalgas com elevada percentagem de acumulo de lipfdeo/oleo por peso seco foi gerada utilizando metodos de cultura diferentes, que sao conhecidos na tecnica (vide a publicagao PCT numero 2008/151149). Biomassa de microalgas gerada pelos metodos de cultura descritos aqui e uteis de acordo com a presente invenção compreende pelo menos 10% de oleo de microalga em peso seco. Em algumas modalidades, a biomassa de microalga compreende pelo menos 25% , pelo menos 50%, pelo menos 55%, ou pelo menos 60% de oleo de microalga em peso seco. Em algumas modalidades, a biomassa de microalga contem de 10 a 90% de oleo de microalga, de 25 a 75% de oleo de microalga, de 40 a 75% de oleo de microalga, ou de 50 a 70% de oleo de microalga por peso seco.
[00132] O oleo de microalga da biomassa descrito acima, ou extrafdo da biomassa para uso nos metodos e composigoes da presente invenção pode compreender glicerolipideos com uma ou mais cadeias laterals de ester de acido graxo distintas. Glicerolipideos compreendem uma molecula de glicerol esterificada a uma, duas ou tres moleculas de acido graxo, que podem ser de comprimentos variaveis e ter graus de saturagao variaveis. As caractensticas de comprimento e saturagao das moleculas de acido graxo (e os oleos de microalgas) podem ser manipuladas para modificar as propriedades ou proporgoes das moleculas de acido graxo nos oleos de microalgas da presente invenção atraves de condigoes de cultura ou atraves de engenharia de via de lipideo, como descrito em mais detalhe na segao IV, abaixo. Desse modo, misturas especlficas de oleo de algas podem ser preparadas em uma especie unica de algas por misturar juntas a biomassa ou oleo de alga de duas ou mais especies de microalgas, ou por misturar oleo de alga da invenção com oleos de outras fontes, como soja, semente de colza, canola, palma, semente de palma, coco, milho, refugo de vegetal, sebo chines, azeitona, girassol, semente de algodao, gordura de galinha, sebo de boi, sebo de porco, microalgas, macroalgas, Cuphea, linho, amendoim, graxa branca de escolha, banha, Camelina sativa, semente de mostarda, castanha de caju, aveias, tremogo, kenaf, calendula, canhamo, cafe, linhaga (linho), avela, euforbia, semente de abobora, pecan, jojoba, jatrpfa, macadamia, castanhas do para, abacate, petroleo, ou uma fragao destilada de quaisquer dos oleos anteriores.
[00133] A composigao de oleo, isto e, as propriedades e proporgoes dos constituintes de acido graxo dos glicerolipideos, tambem pode ser manipulada por combinar biomassa ou oleo de pelo menos duas especies distintas de microalgas. Em algumas modalidades, pelo menos duas das especies distintas de microalgas tern perfis de glicerolipideos diferentes. As especies distintas de microalgas podem ser cultivadas juntas ou separadamente como descrito acima, preferivelmente sob condigoes heterotroficas, para gerar os respectivos oleos. Especies diferentes de microalgas podem conter percentagens diferentes de constituintes de acido graxo distintos nos glicerolipideos de celula.
[00134] Genericamente, cepas de Prototheca tem muito pouco ou nenhum acido graxo com o comprimento de cadeia C8-C14, Por exemplo, Prototheca moriformis (UTEX 1435), Prototheca krugani (UTEX 329), Prototheca stagnora (UTEX 1442) e Prototheca zopfii (UTEX 1438) nao contem (ou contem quantidades nao detectaveis) de acidos graxos C8, entre 0 a 0,01% de acidos graxos CIO, entre 0,03 a 2,1% de acidos graxos C12 e entre 1,0 a 1,7% de acidos graxos C14.
[00135] Em alguns casos, as cepas de Prototheca contendo um transgene que codifica uma tioesterase ACP-acila graxa que tem atividade para substrato ACP-acila graxa de comprimentos de cadeia C8-C10 tem pelo menos 0,3%, pelo menos 0,8%, pelo menos 1,5% ou mais de acidos graxos de comprimento de cadeia C8 e pelo menos 0,3%, pelo menos 1,0%, pelo menos 3,0%, pelo menos 5% ou mais de acidos graxos de comprimento de cadeia CIO, Em outros casos, as cepas Prototheca contendo um transgene que codifica um tioesterase ACP-acila graxa que tem atividade em diregao ao substrato ACP-acila graxa de comprimento de cadeia C12 tem pelo menos 3,0%, pelo menos 5%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 13% ou mais de acidos graxos do comprimento de cadeia C12 e pelo menos 1,5%, pelo menos 2% ou pelo menos 3% ou mais de acidos graxos do comprimento de cadeia C14, Em outros casos, as cepas de Prototheca contendo um transgene que codifica uma tioesterasae ACP-acila graxa que tem atividade para substrato ACP-acila graxa de comprimento de cadeia C14 tem pelo menos 4,0%, pelo menos 7%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25% ou mais acidos graxos do comprimento de cadeia C14, e pelo menos 0,4%, pelo menos 1%, pelo menos 1,5% ou mais de acidos graxos do comprimento de cadeia Cl 2.
[00136] Em exemplos nao limitadores, as cepas de Prototheca contendo um transgene que codifica uma tioesterase ACP-acila graxa que tem atividade para o substrato ACP-acila graxa de comprimento de cadeia C8 e CIO tern entre 0,3 a 1,58% de acidos graxos de comprimento de cadeia C8 e entre 0,35 a 6,76% de acidos graxos do comprimento de cadeia CIO. Em outros exemplos nao limitadores, as cepas de Prototheca contendo um transgene que codifica uma tioesterase ACP-acila graxa que tern atividade para o substrato ACP-acila graxa de comprimento de cadeia C12 tern entre 3,9 a 14,11% de acidos graxos do comprimento de cadeia C12 e entre 1,95 a 3,05% de acidos graxos do comprimento de cadeia C14. Em outros exemplos nao limitadores, cepas de Prototheca contendo um transgene que codifica uma tioesterase ACP-acila graxa que tern atividade para o substrato ACPacila graxa de comprimento de cadeia C14 tern entre 4,40 a 17,35% de acidos graxos do comprimento de cadeia C14 e entre 0,4 a 1,83% de area de acidos graxos do comprimento de cadeia Cl2. Em alguns casos, as cepas de Prototheca contendo um transgene que codifica uma tioesterase ACP-acila graxa que tern atividade para o substrato ACP-acila graxa de comprimentos de cadeia entre C8 e C14 tern entre 3,5 a 20% acidos graxos de cadeia media (C8-C14). Em alguns casos, manter as cepas de Prototheca transgenicas sob pressao seletiva elevada e constante para reter genes exogenos e vantajoso devido ao aumento no acido graxo desejado de um comprimento de cadeia especifico. Em um exemplo nao limitador, o exemplo 5 demonstra um aumento de duas vezes em acidos graxos de comprimento de cadeia C14 (maior do que 30% de acidos graxos de comprimento de cadeia C8-C14) quando a cultura de Prototheca moriformis contendo um gene exogeno de tioesterase preferido C14 e retido. Niveis elevados de retengao de gene exogeno tambem podem ser obtidos por inserir genes exogenos nos cromossomos nucleares das celulas utilizando vetores de recombinagao homologos e metodos revelados aqui. Celulas recombinantes contendo genes exogenos integrados em cromossomos nucleares sao um objeto da invenção.
[00137] Oleo de microalga tambem inclui outros constituintes produzidos pelas microalgas, ou incorporados no oleo de microalgas a partir do meio de cultura. Esses outros constituintes podem estar presentes em quantidade variavel dependendo das condigoes de cultura utilizadas para cultivar as microalgas, a especie de microalgas, o metodo de extragao utilizado para recuperar oleo de microalgas a partir da biomassa e outros fatores que podem afetar a composigao de oleo de microalga. Exemplos nao limitadores de tais constituintes incluem carotenoides, presentes de 0,1 a 0,4 microgramas/ml, clorofila presente de 0 a 0,02 miligrama/quilograma de oleo, gama tocoferol presente de 0,4 a 0,6 miligrama/100 gramas de oleo, e tocotrienois totais presentes de 0,2 a 0,5 miligramas/gramas de oleo.
[00138] Os outros constituintes podem incluir, sem limitagao, fosfolipfdios, tocoferois, tocotrienois, carotenoides (por exemplo, alfacaroteno, beta-caroteno, licopeno, etc.), xantofilas (por exemplo, lutema, zeaxantina, alfa-criptoxanitna e beta-criptoxantina) e varios compostos organicos ou inorganicos.
[00139] Em alguns casos, o oleo extrafdo da especie Prototheca compreende nao mais do que 0,02 mg/kg de clorofila. Em alguns casos, o oleo extrafdo da especie Prototheca compreende nao mais do que 0,4 mg/ml carotenoides totais. Em alguns casos o oleo de Prototheca compreende entre 0,40 a 0,60 miligrama de gama tocoferol por 100 gramas de oleo. Em outros casos, o oleo de Prototheca compreende entre 0,2 a 0,5 miligrama de tocotrienois totais por grama de oleo.
IIII. METODOS E MATERIAIS DE ENGENHARIA GENETICA
[00140] A presente invenção prove metodos e materiais para modificar geneticamente celulas de Prototheca e celulas hospedeiras recombinantes uteis nos metodos da presente invenção, incluindo, porem, nao limitados a celulas hospedeiras Prototheca moriformis, Prototheca zopfii, Prototheca krugani e Prototheca stagnora recombinantes. A descrigao desses metodos e materiais e dividida em subsegoes para conveniencia do leitor. Na subsegao 1, metodos de transformagao sao descritos. Na subsegao 2, metodos de engenharia genetica utilizando recombinagao homologa sao descritos. Na subsegao 3, vetores de expressao e componentes sao descritos.
1. Metodos de Engenharia Transformagao
[00141] Celulas podem ser transformadas por qualquer tecnica apropriada incluindo, por exemplo, biolfstica, eletroporagao (vide Maruyama e outros. (2004), Biotechnology Techniques 8:821 a 826), transformagao de conta de vidro e transformagao de whisker de carbeto de silfcio. Outro metodo que pode ser utilizado envolve a formagao de protoplastos e uso de CaCh e polietileno glicol (PEG) para introduzir DNA recombinante em celulas de microalgas (vide Kim e outros. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73, que relata o uso desse metodo para a transformagao de Chorella ellipsoidea). A cotransformagao de microalgas pode ser utilizada para introduzir duas moleculas de vetor distintas em uma celula simultaneamente (vide, por exemplo, Protist 2004 Dez;155(4):381-93).
[00142] Metodos biohsticos (vide, por exemplo, Sanford, Trends In Biotech. (1988) 6:299 302, patente US numero 4,945,050; eletroporagao (Fromm e outros., Proc. Nat’l. Acad. Sci. (USA) (1985) 82:5824 5828); uso de um feixe laser, microinjegao ou qualquer outro metodo capaz de introduzir DNA em uma microalga tambem podem ser utilizados para transformagao de uma celula de Prototheca.
[00143] 2. Metodos de Engenharia Recombinagao Homologa
[00144] Recombinagao homologa e a capacidade de sequencias de DNA complementares alinharem e permutarem regioes de homologia. DNA transgenico (“doador”) contendo sequencias homologas as sequencias genomicas alvo (“gabarito”) e introduzido no organismo e entao submetido a recombinagao no genoma no sftio das sequencias homologas genomicas correspondentes. As etapas mecanfsticas desse processo, na maioria dos casos, incluem: (1) emparelhamento de segmentos de DNA homologos; (2) introdugao de quebras de fita dupla na molecula de DNA doador; (3) invasao da molecula de DNA gabarito pelas extremidades de DNA doador livre seguido por smtese de DNA; e (4) resolugao de eventos de reparo de quebra de fita dupla que resulta em produtos de recombinagao final.
[00145] A capacidade de realizar recombinagao homologa em um organismo hospedeiro tem muitas implicagoes praticas para o que pode ser realizado no nfvel genetico molecular e e util na geragao de um microbio oleaginoso que pode produzir oleos moldados. Por sua natureza, recombinagao homologa e um evento preciso de “mirar” um gene, conseqiientemente a maioria das linhas transgenicas geradas com a mesma sequencia alvo serao essencialmente identicas em termos de fenotipo, necessitando da selegao de bem menos eventos de transformagao. A recombinagao homologa tambem objetiva eventos de insergao de gene no cromossomo hospedeiro, resultando em excelente estabilidade genetica, mesmo na ausencia de selegao genetica. Como locais cromossomicos diferentes impactarao provavelmente a expressao de gene, mesmo de promotores heterologos/UTRs, a recombinagao homologa pode ser um metodo de consultar locais em um ambiente de genoma nao familiar e avaliar o impacto desses ambientes sobre a expressao de gene.
[00146] Aplicagoes de engenharia genetica particularmente uteis utilizando recombinagao homologa sao elementos reguladores hospedeiros especfficos como promotores/UTRs para acionar expressao de gene heterologo em um modo altamente especifico. Por exemplo, a ablagao precisa do gene desaturase ACP de estearofla endogeno com um cassete de gene (tioesterase) FATB especifico C12:0 heterologo e marcador seletivo apropriado, poderia ser esperada diminuir dramaticamente nfveis endogenos de acidos graxos Cl8:1 concomitante com nfveis aumentados dos acidos graxos C12:0, O exemplo 13 descreve o construto para recombinagao homologa que e apropriado para a ablagao de um gene desaturase ACP estearofla de Prototheca moriformis endogeno.
[00147] Como a recombinagao homologa e um evento de “mirar” gene de modo precise, pode ser utilizado para modificar precisamente quaisquer nucleotfdeo(s) em um gene ou regiao de interesse, desde que regioes de flanquear suficientes tenham sido identificadas. Portanto, a recombinagao homologa pode ser utilizada como meio para modificar sequencias reguladoras que impactam expressao de gene de RNA e/ou protemas. Tambem pode ser utilizado para modificar regioes de codificar proteina em um esforgo para modificar atividades de enzima como especificidade de substrato, afinidades e Km, e desse modo afetando a alteragao desejada em metabolismo da celula hospedeira. Recombinagao homologa prove um meio potente para manipular o genoma hospedeiro resultando em ’’gene targeting”, conversao de gene, delegao de gene, duplicagao de gene, inversao de gene e permutar elementos reguladores de expressao de gene como promotores, intensificadores e 3’UTRs.
[00148] Recombinagao homologa pode ser obtida utilizando construtos de contendo pedagos de sequencias endogenas para “mirar” o gene ou regiao de interesse no genoma de celula hospedeira endogeno. Tais sequencias para “mirar” podem ser localizadas 5’ do gene ou regiao de interesse, 3’ do gene/regiao de interesse ou mesmo flanquear o gene/regiao de interesse. Tais construtos para “mirar” podem ser transformados na celula hospedeira como um DNA de plasmfdeo super-enrolado com espinha dorsal de vetor adicional, um produto PCR sem espinha dorsal de vetor, ou como uma molecula linearizada. Em alguns casos, pode ser vantajoso primeiramente expor as sequencias homologas no DNA transgenico (DNA doador) com uma enzima de restrigao. Essa etapa pode aumentar a eficiencia de recombinagao e diminuir a ocorrencia de eventos indesejaveis. Outros metodos de aumentar a eficiencia de recombinagao incluem o uso de PCR para gerar DNA transgenico de transformagao que contem extremidades lineares homologas as sequencias gendmicas alvo.
3. Vetores e componentes de vetor
[00149] Vetores para transformagao de microorganismos de acordo com a presente invenção podem ser preparados por tecnicas conhecidas familiares para aqueles versados na tecnica em vista da revelagao da presente invenção. Um vetor contem tipicamente um ou mais genes, nos quais cada gene codifica a expressao de um produto desejado (o produtor de gene) e e operativamente ligado a uma ou mais sequencias de controle que regulam a expressao de gene ou direcionam o produto de gene a um local especifico na celula recombinante. Para auxiliar o leitor, essa subsegao e dividida em subsegoes. A subsegao A descreve sequencias de controle tipicamente contidas em vetores bem como sequencias de controle novas fomecidas pela presente invenção. A subsegao B descreve genes contidos tipicamente em vetores bem como metodos de otimizagao de codon novos e genes preparados utilizando os mesmos fomecidos pela invenção.
A. Sequencias de controle
[00150] Sequencias de controle sao acidos nucleicos que regulam a expressao de uma sequencia de codificagao ou orientam um produto de gene a um local especifico em ou fora de uma celula. Sequencias de controle que regulam expressao incluem, por exemplo, promotores que regulam a transcrigao de uma sequencia de codificagao e terminadores que terminam transcrigao de uma sequencia de codificagao. Outra sequencia de controle e uma sequencia nao traduzida 3’ localizada na extremidade de uma sequencia de codificagao que codifica um sinal de poliadenilagao. Sequencias de controle que orientam produtos de gene para locais especificos incluem aquelas que codificam peptfdeos de sinais, que orientam a protema a qual sao fixados a um local especifico em ou fora da celula.
[00151] Desse modo, um desenho de vetor exemplar para expressao de um gene exogeno em uma microalga contem uma sequencia de codificagao para um produto de gene desejado (por exemplo, um marcador selecionavel, uma enzima de modificagao de via de lipideo, ou uma enzima de utilizagao de sacarose) em ligagao operavel com um promotor ativo em microalgas. Alternativamente, se o vetor nao contiver um promotor em ligagao operavel com a sequencia de codificagao de interesse, a sequencia de codificagao pode ser transformada nas celulas de tai modo que se tome operativamente ligada a um promotor endogeno no ponto de integragao de vetor. O metodo de transformagao sem promotor provou funcionar em microalgas (vide, por exemplo, Plant Journal 14:4 (1998), pag. 441 a 447).
[00152] Muitos promotores sao ativos em microalgas, incluindo promotores que sao endogenos para as algas sendo transformadas, bem como promotores que nao sao endogenos para as algas sendo transformadas (isto e, promotores de outras algas, promotores de plantas mais elevadas, e promotores de vfrus de planta ou virus de algas). Promotores exogenos e/ou endogenos ilustrativos que sao ativos em microalgas (bem com genes de resistencia a antibiotico funcionais em microalgas) sao descritos na pub. PCT no. 2008/151149 e referencias citadas na mesma.
[00153] O promotor utilizado para expressar um gene exogeno pode ser o promotor ligado naturalmente aquele gene ou pode ser um gene heterologo. Alguns promotores sao ativos em mais de uma especie de microalgas. Outros promotores sao especificos de especie. Promotores ilustrativos incluem promotores como P-tubulina de Chlamydomonas reinhardtii, utilizado nos Exemplos abaixo e promotores virais, como vfrus mosaico de couve-flor (CMV) e vfrus clorela, que mostraram ser ativos em multiplas especies de microalgas (vide, por exemplo, Plant Cell Rep. 2005 Mar;23(10-ll):727-35; J Microbiol. 2005 agosto; 43(4):361-5; Mar Biotechnol (NY). 2002 Jan;4(l):63-73). Outro promoter que e adequado para uso para expressao de gene exogenos em Prototheca e o promotor de desidrogenase glutamato Chlorella soroka-iiana/S' UTR (SEQ ID NO: 69). Opcionalmente, pelo menos 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 nucleotideos ou mais dessas sequencias contendo um promotor sao utilizados. Promotores ilustrativos uteis para expressao de genes exogenos em Prototheca sao listados na listagem de sequencias desse pedido, como promotor do gene HUPI Chlorella (SEQ ID NO: 1) e o promotor reductase nitrato Chlorella ellipsoidea (SEQ ID NO: 2). Promotores de virus Chlorella tambem podem ser utilizados para expressar genes em Prototheca, como SEQ ID NOS: 1-7 da patente US 6,395,965. Promotores adicionais ativos em Prototheca podem ser encontrados, por exemplo, em Biochem Biophys Res Commun. 1994 Out 14;204(l): 187-94; Plant Mol Biol. 1994 Out;26(l):85-93; Virology. 2004 Agosto 15;326(1): 150-9; e Virology. 2004 Jan 5;318(l):214-23.
[00154] Um promoter pode ser genericamente caracterizado como constitutive ou induzfvel. Promotores constitutivos sao genericamente ativos ou funcionam para acionar expressao durante todo o tempo (ou em certos tempos no ciclo de vida de celula) no mesmo nivel. Promotores induzfveis, inversamente, sao ativos (ou tornados inativos) ou sao significativamente regulados ascendentemente ou descendentemente somente em resposta a um estfmulo. Os dois tipos de promotores encontram aplicagao nos metodos da invenção. Promotores induzfveis uteis na invenção incluem aqueles que mediam transcrigao de um gene operativamente ligado em resposta a um estfmulo, como uma molecula pequena exogenamente fomecida (por exemplo, glicose como em SEQ ID NO: 1), temperatura (calor ou frio), falta de nitrogenio em meio de cultura, etc. Promotores apropriados podem ativar a transcrigao de um gene essencialmente silencioso ou regular ascendentemente, preferivelmente substancialmente, transcrigao de um gene operativamente ligado que e transcrito em um nfvel baixo.
[00155] A inclusao de sequencia de controle de regiao de terminagao e optional, e se empregada, entao a escolha deve ser principalmente uma de conveniencia, como a regiao de terminagao e relativamente intercambiavel. A regiao de terminagao pode ser nativa a regiao de iniciagao de transcrigao (o promotor), pode ser nativa a sequencia de DNA de interesse, ou pode ser obtemvel de outra fonte. Vide, por exemplo, Chen e Orozco, Nucleic Acids Res. (1988) 16:8411.
[00156] A presente invenção tambem prove sequencias de controle e genes recombinantes e vetores contendo as mesmas que fomecem a expressao compartimentalizada de um gene de interesse. Organelas para direcionamento sao cloroplastos, plastfdios, mitocondrias, e retfculo endoplasmico. Alem disso, a presente invenção prove sequencias de controle e genes recombinantes e vetores contendo os mesmos que fomecem a secregao de uma proteina fora da celula.
[00157] Proteinas expressas no genoma nuclear de Prototheca podem ser direcionados para o plastfdio utilizando sinais de direcionamento para plastfdio. Sequencias de direcionamento para plastfdio endogenas a Chlorella sao conhecidas, como genes no genoma nuclear Chorella que codificam proteinas que sao direcionadas ao plastfdio; vide por exemplo, numeros de acesso GenBank AY646197 e AF499684, e em uma modalidade, tais sequencias de controle sao utilizadas nos vetores da presente invenção para direcionar expressao de uma proteina para um plastfdio de Prototheca.
[00158] Os Exemplos abaixo descrevem o uso de sequencias de direcionamento para plastfdio de alga para direcionar proteinas heterologas para o compartimento correto na celula hospedeira. Bibliotecas de cDNA foram feitas utilizando celulas Prototheca moriformis e Chlorella protothecodies e sao descritas nos exemplos 12 e exemplo 11 abaixo. Sequencias foram BLASTed e analisadas para homologia com proteinas conhecidas que negociam para o plastfdio/cloroplasto. Os cDNAs que codificam essas proteinas foram clonados e sequencias de direcionamento para plastfdio foram isolados desses cDNAs. As sequencias e aminoacidos das sequencias de direcionamento para plastfdio de algas identificadas das bibliotecas de cDNA e as sequencias de aminoacidos de tioesterease ACPacila graxa de planta que sao utilizadas nos Exemplos de expressao heterologa, abaixo, sao listadas nas SEQ ID Nos: 127-133.
[00159] Em outra modalidade da presente invenção, a expressao de um polipeptfdio em Prototheca e direcionada ao retfculo endoplasmico. A inclusao de uma retengao apropriada ou sinal de separagao em um vetor de expressao assegura que protemas sao retidas no retfculo endoplasmico (ER) e nao vao a jusante no Golgi. Por exemplo, o vetor IMPACTVECTOR1,3, de Wageningen UR-Plant Research International, inclui o sinal de separagao ou retengao KDEL bem conhecido. Com esse vetor, retengao de ER tern uma vantagem pratica em que foi relatado como aperfeigoando niveis de expressao 5 ou mais vezes. O principal motivo para isso parece ser que o ER contem concentragoes mais baixas e/ou diferentes proteases responsaveis por degradagao pos-tradugao de protemas expressas do que estao presentes no citoplasma. Sinais de retengao ER funcionais em microalgas verdes sao conhecidos. Por exemplo, vide Proc Natl Acad Sci USA 26 de abril de 2005; 102 (17): 6224-30.
[00160] Em outra modalidade da presente invenção, um polipeptfdio e direcionado para secregao para fora da celula no meio de cultura. Vide Hawkins e outros, Current Microbiology Vo. 38(1999), pag. 335-341 para exemplos de sinais de secregao ativos em Chlorella que podem ser utilizados, de acordo com os metodos da invenção, em Prototheca.
B. Genes e otimizagao de codon
[00161] Tipicamente, um gene inclui um promotor, sequencia de codificagao, e sequencias de controle de terminagao. Quando montado por tecnologia de DNA recombinante, um gene pode ser denominado um cassete de expressao e pode ser flanqueado por sitios de restrigao para insergao conveniente em um vetor que e utilizado para introduzir o gene recombinante em uma celula hospedeira. O cassete de expressao pode ser flanqueado por sequencias de DNA a partir do genoma ou outro acido nucleico alvo para facilitar integragao estavel do cassete de expressao no genoma por recombinagao homologa. Alternativamente, o vetor e seu cassete de expressao podem permanecer nao integrados, em cujo caso, o vetor inclui tipicamente uma origem de replicagao, que e capaz de fomecer replicagao do DNA de vetor heterologo.
[00162] Um gene comum presente em um vetor e um gene que codifica uma protema, cuja expressao permite que a celula recombinante contendo a protema seja diferenciada das celulas que nao expressam a protema. Tai gene, e seu produto de gene correspondente, e chamado marcador selecionavel. Qualquer de uma ampla variedade de marcadores selecionaveis pode ser empregado em um construto de transgene util para transformar Prototheca. Os exemplos de marcadores selecionaveis apropriados incluem o gene de resistencia G418, o gene de reductase de nitrato (vide Dawson e outros. (1997), Current Microbiology 35:356-362), o gene de fosfotransfersae de (HPT; vide Kim e outros. (2002), Mar. Biotechnol. 4:63-73), to gene de fosfotransferase de neomicina, e o gene ble, que confere Resistencia a fleomicina (Huang e outros. (2007), Appl. Microbiol. Biotechnol. 72:197205). Os metodos de determinar sensibilidade de microalgas a antibioticos sao bem conhecidos. Por exemplo, Mol Gen Genet. 16 de outubro 1996;252(5):572-9.
[00163] Para fins da presente invenção, o vetor de expressao utilizado para preparar uma celula hospedeira recombinante da invenção incluira pelo menos dois, e freqiientemente tres genes, se um dos genes for um marcador selecionavel. Por exemplo, um Prototheca geneticamente construido da invenção pode ser feito por transformagao com vetores da invenção que compreendem, alem de um marcador selecionavel, um ou mais genes exogenos, como por exemplo, gene de invertase sacarose ou gene de tioesterase-ACP acila. Um ou ambos os genes podem ser expresses utilizando um promotor induzivel, que permite que o timing relative de expressao desses genes seja controlado para aumentar o rendimento de lipideo e conversao em esteres de acido graxo. A expressao dos dois ou mais genes exogenos pode estar sob controle do mesmo promotor induzivel ou sob controle de promotores induziveis diferentes (ou constitutivos). Na situagao mencionada por ultimo, a expressao de um primeiro gene exogeno pode ser induzida por um primeiro periodo de tempo (durante o qual expressao de um segundo gene exogeno pode ser induzido ou nao) e expressao de um segundo gene exogeno pode ser induzida por um segundo periodo de tempo (durante o qual expressao de um primeiro gene exogeno pode ser induzido ou nao).
[00164] Em outras modalidades, dois ou mais genes exogenos (alem de qualquer marcador selecionavel) sao: uma tioesterase ACP-acila graxa e uma reductase de aldefdo/CoA-acila graxa, cuja agao combinada fomece um produto de alcool. sao fomecidas adicionalmente outras combinagoes de genes exogenos, incluindo sem limitagao, uma tioesterase ACP-arila graxa e uma reductase CoA-acila graxa para gerar aldeidos. Em uma modalidade, o vetor prove a combinagao de um tioestearase ACP-acila graxa, uma reductase CoA-acila graxa, e um decarbonilase de aldefdo graxo para gerar alcanos. Em cada dessas modalidades, um ou mais dos genes exogenos pode ser expresso utilizando um promotor induzivel.
[00165] Outros vetores ilustrativos da invenção que expressam dois ou mais genes exogenos incluem aqueles que codificam tanto um transportador de sacarose e uma enzima de invertase de sacarose como aqueles que codificam tanto um marcador selecionavel e uma invertase de sacarose secretada. O Prototheca recombinante transformado com qualquer tipo de vetor produz lipfdeos em custo de fabricagao mais baixo devido a capacidade construida de utilizar cana de agucar (e agucares derivados de cana de agucar) como uma fonte de carbono. A insergao dos dois genes exogenos descritos acima pode ser combinada com a ruptura de biossmtese de polissacarfdeo atraves de mutagenese dirigida e/ou aleatoria, que orienta fluxo de carbono sempre maior para produgao de lipideo. Individualmente e em combinagao, conversao trofica, engenharia para alterar produgao de lipfdeos e tratamento com enzimas exogenas alteram a composigao de lipideo produzida por um microorganismo. A alteragao pode ser uma mudanga na quantidade lipfdeos produzidos, a quantidade de uma ou mais especies de hidrocarboneto produzidas em relagao a outros lipfdeos, e/ou os tipos de especie de lipideo produzidas no microorganismo. Por exemplo, microalgas podem ser construidas para produzir uma quantidade e/ou percentagem mais elevada de TAGs.
[00166] Para expressao otima de uma proteina recombinante, e vantajoso empregar sequencias de codificagao que produzem mRNA com codons preferencialmente utilizados pela celula hospedeira para serem transformados. Desse modo, a expressao adequada de transgenes pode exigir que o uso de codon do transgene case com a polarizagao especifica de codon do organismo no qual o transgene esta sendo expresso. Os mecanismos precisos subordinados a esse efeito sao muitos, porem incluem o equilfbrio adequado de pools de RNA aminoacilados disponfveis com protemas sendo sintetizadas na celula, acoplados a tradugao mais eficiente do RNA mensageiro transgenico (mRNA) quando essa necessidade e atendida. Quando uso de codon no transgene nao e otimizado, pools de tRNA disponfveis nao sao suficientes para permitir tradugao eficiente do mRNA heterologo resultando em perda ribossomal e terminagao e possivel instabilidade do mRNA transgenico.
[00167] A presente invenção prove acidos nucleicos otimizados pro codon uteis para a expressao bem sucedida de protemas recombinantes em Prototheca. O uso de codon em especies de Prototheca foi analisado por estudar sequencias de cDNA isoladas de Prototheca moriformis. Essa analise representa a interrogagao sobre 24,000 codons e resultou na tabela 1 abaixo. Tabela 1. Uso preferido de codon em cepas de Prototheca.
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[00168] Em outras modalidades, o gene no vetor recombinante foi otimizado por codon com referenda a uma cepa de microalgas diferente de uma cepa de Prototheca. Por exemplo, metodos de recodificar genes para expressao e microalgas sao descritos na patente US numero 7.135.290. Informagoes adicionais para otimizagao de codon sao dispomveis, por exemplo, no banco de dados de uso de codon de GenBank.
[00169] Embora os metodos e materiais da invenção permitam a introdugao de qualquer gene exogeno em Prototheca, genes referentes a utilizagao de sacarose e modificagao de via de lipideo sao de interesse especifico, como discutido nas seguintes segoes.
IV. UTILIZAGAO DE SACAROSE
[00170] Na modalidade, a celula de Prototheca recombinante da invenção contem ainda um ou mais genes de utilizagao de sacarose exogeno. Em varias modalidades, um ou mais genes codificam uma ou mais proteinas selecionadas do grupo que consiste em uma frutocinase, uma glucocinase, uma hexocinase, uma invertase de sacarose, um transportador de sacarose. Por exemplo, a expressao de um transportador de sacarose e uma invertase de sacarose permite que Prototheca transporte sacarose para a celula a partir do meio de cultura e hidrolise sacarose para fomecer glicose e frutose. Opcionalmente, uma frutocinase pode ser expressa tambem em casos onde atividade de hexocinase endogena e insuficiente para fosforilagao maxima de frutose. Os exemplos de transportadores de sacarose apropriados sao numeros de acessao Genbank CAD91334, CAB92307 e CAA53390, Os exemplos de frutocinases apropriados sao numeros de acessao Genbank P26984, P26420 e CAA43322.
[00171] Em uma modalidade, a presente invenção prove uma celula hospedeira de Prototheca que secreta uma invertase de sacarose. A secregao de uma invertase de sacarose evita a necessidade de expressao de um transportador que pode transportar sacarose para a celula. Isso e porque uma invertase secretada catalisa a conversao de uma molecula de sacarose em uma molecula de glicose e uma molecula de frutos, as quais podem ser ambas transportadas e utilizadas por microbios fomecidos pela invenção. Por exemplo, a expressao de uma invertase de sacarose (como SEQ ID NO: 3) com um sinal de secregao (como aquele de SEQ ID NO: 4 (de levedura), SEQ ID NO: 5 (de plantas superiores), SEQ ID NO: 6 (sinal de secregao de consenso eucariotico) e SEQ ID NO: 7 (combinagao de sequencia de sinal de plantas superiores e consenso eucariotico) gera atividade de invertase fora da celula. A expressao de tai proteina, como permitido pela metodologia de engenharia genetica revelada aqui, permite que celulas ja capazes de utilizar glicose extracelular como uma fonte de energia utilizem sacarose como uma fonte de energia extracelular.
[00172] As especies de Prototheca que expressam uma invertase em meio contendo sacarose sao uma especie de microalga preferida para a produgao de oleo. O exemplo 3 ilustra como os metodos e reagentes da invenção podem ser utilizados para expressar uma invertase de levedura recombinante e secretam a mesma de uma celula de Prototheca recombinante. A expressao e direcionamento extracelular dessa proteina totalmente ativa permitem que as celulas hospedeiras resultantes cresgam em sacarose, ao passo que suas copias nao transformadas nao podem. Desse modo, a presente invenção prove celulas recombinantes de Prototheca com um gene de invertase otimizado por codon incluindo, porem nao limitado, ao gene de invertase de levedura, integrado em seu genoma de tai modo que o gene de invertase e expresso como avaliado por atividade de invertase e hidrolise de sacarose. A presente invenção tambem prove genes de invertase uteis como marcadores selecionaveis em celulas recombinantes de Prototheca, visto que tais celulas sao capazes de crescer em sacarose, enquanto suas copias nao transformadas nao podem; e metodos para selecionar celulas hospedeiras recombinantes utilizando uma invertase como um marcador selecionavel potente para genetica molecular de algas.
[00173] A expressao bem sucedida de uma invertase de sacarose em Prototheca tambem ilustra outro aspecto da presente invenção em que demonstra que proteinas heterologas (recombinantes) podem ser expressas na celula de algas e transita com sucesso fora da celula e para dentro do meio de cultura em uma forma funcional e totalmente ativa. Desse modo, a presente invenção prove metodos e reagentes para expressar um conjunto ample e diverso de proteinas heterologas em microalgas e secretar as mesmas fora da celula hospedeira. Tais proteinas incluem, porem exemplo, enzimas industriais como, por exemplo, lipases, proteases, celulases, pectinases, amilases, esterases, oxidoreductases, transferases, lactases, isomerases, e invertases, bem como proteinas terapeuticas como, por exemplo, fatores de crescimento, citosinas, anticorpos de comprimento total compreendendo duas cadeias leves e duas pesadas, Fabs, scFvs (fragmento variavel de cadeia unica), anticorpos do tipo camellid, fragmentos de anticorpo, fusoesfragmento de anticorpo, fusoes de receptor-anticorpo, insulina, interferons, e fatores de crescimento semelhantes a insulina.
[00174] A expressao bem sucedida de uma invertase de sacarose em Prototheca tambem ilustra outro aspecto da presente invenção em que prove metodos e reagentes para o uso de peptfdeos de transito de fungo em algas para dirigir a secregao de proteinas em Prototheca', e metodos e reagentes para determinar se um peptfdeo pode funcionar, e a capacidade do mesmo funcionar, como um peptfdeo de transito em celulas de Prototheca. Os metodos e reagentes da invenção podem ser utilizados como uma ferramenta e plataforma para identificar outros peptfdeos de transito que podem negociar com sucesso proteinas fora de uma celula, e que a invertase de levedura tem grande utilidade nesses metodos. Como demonstrado nesse exemplo, a remogao do peptfdeo de transito de invertase de levedura endogena e sua substituigao por outros peptfdeos de transito, endogeno para a alga hospedeira ou de outras fontes (eucariotico, procariotico e viral) pode identificar se qualquer peptfdeo de interesse pode funcionar como um peptfdeo de transito em guiar saida de proteina da celula.
[00175] Os exemplos de invertases de sacarose apropriadas incluem aquelas identificadas por numeros de acessao Genbank CAB95010, NP_012104 e CAA06839. Exemplos nao limitadores de invertases apropriadas sao listados abaixo na Tabela 2. Sequencias de aminoacidos para cada invertase listada sao incluidas na Listagem de sequencia abaixo. Em alguns casos, o gene de utilizagao de sacarose exogeno apropriado para uso nos metodos e vetores da invenção codifica uma invertase de sacarose que tern pelo menos 40, 50, 60, 75, ou 90% ou identidade de aminoacido mais elevada com uma invertase de sacarose selecionada da Tabela 2. Tabela 2. Invertases de sacarose.
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[00176] A secregao de uma invertase para o meio de cultura por Prototheca permite que as celulas cresgam tambem em melado de refugo de processamento de cana de agucar como o fazem em glicose do tipo reagente puro; o uso desse produto de refugo de baixo valor de processamento de cana de agucar pode fomecer economia significativa de custo na produgao de lipfdeos e outros oleos. Desse modo, a presente invenção prove uma cultura microbiana contendo uma populagao de microorganismos de Prototheca, e um meio de cultura compreendendo (i) sacarose e (ii) uma enzima de invertase de sacarose. Em varias modalidades a sacarose na cultura vem de sorgo, beterraba, cana de agucar, melado, ou material celulosico despolimerizado (que pode conter opcionalmente lignina). Em outro aspecto, os metodos e reagentes da invenção aumentam significativamente o numero e tipo de insumos que podem ser utilizados por Prototheca recombinante. Embora os microbios exemplificados aqui sejarn alterados de tai modo que possam utilizar sacarose, os metodos e reagentes da invenção podem ser aplicados de modo que os insumos como celulosicos sejam utilizados por um microbio hospedeiro construido da invenção com a capacidade de secretar celulases, pectinases, isomerases, ou similares, de tai modo que os produtos de ruptura das reagoes enzimaticas nao sejam mais simplesmente tolerados porem em vez disso utilizados como uma fonte de carbono pelo hospedeiro.
V. ENGENHARIA DE VIA DE LIPIDEO
[00177] Alem de alterar a capacidade de Prototheca utilizar insumos como insumos contendo sacarose, a presente invenção tambem prove Prototheca recombinante que foi modificada para alterar as propriedades e/ou proporgoes de lipfdeos produzidos. A via pode ser adicionalmente, ou alternativamente, modificada para alterar as propriedades e/ou proporgoes de varias moleculas de lipideo produzidas atraves de processamento enzimatico de lipfdeos e intermediarios na via de acido graxo. Em varias modalidades, as celulas de Prototheca recombinantes da invenção tern, em relagao a suas copias nao transformadas, rendimento de lipideo otimizado por volume de unidade e/ou por tempo unitario, comprimento de cadeia de carbono (por exemplo, para produgao diesel renovavel ou para aplicagoes qufmicas industrials que exigem insumo de lipfdeo), numero reduzido de ligagbes duplas ou triplas, opcionalmente para zero, e aumento da razao de hidrogenio : carbono de uma especie especffica de lipfdeo ou de uma populagao de lipfdeo distinto.
[00178] Em modalidades especificas, uma ou mais enzimas chaves que controlam pontos de ramificagao em metabolismo para smtese de acido graxo foram reguladas ascendentemente ou reguladas descendentemente para melhorar a produgao de lipfdeo. A regulagao ascendente pode ser obtida, por exemplo, por transformar celulas com construtos de expressao nos quais um gene que codifica a enzima de interesse e expresso, por exemplo, utilizando um promotor forte e/ou elementos intensificadores que aumentam a transcrigao. Tais construtos podem incluir um marcador selecionavel de tai modo que os transformantes possam ser submetidos a selegao, que pode resultar em amplificagao do construto e um aumento no nivel de expressao da enzima codificada. Os exemplos de enzimas apropriadas para regulagao ascendente de acordo com os metodos da invenção incluem desidrogenase piruvato, que desempenha um papel na conversao de piruvato em acetila-CoA (exemplos alguns de microalgas, incluem numeros de acessao Genbank NP.415392; AAA53047; Q1XDM1; e CAF05587). A regulagao ascendente de desidrogenase piruvato pode aumentar a produgao de acetil-CoA, e desse modo aumentar a smtese de acido graxo. Acetil-CoA carboxilase catalisa a etapa initial em smtese de acido graxo. Por conseguinte, essa enzima pode ser regulada ascendentemente para aumentar a produgao de acidos graxos (exemplos, alguns de microalgas, incluem numeros de acessao Genbank BAA94752; AAA75528; AAA81471; YP_537052; YP.536879; NP_045833; e BAA57908). A produgao de acido graxo pode ser tambem aumentada por regulagao ascendente de protema portadora acila (ACP), que transporta as cadeias de acila em crescimento durante smtese de acido graxo (exemplos, alguns de microalgas, incluem numeros de acessao Genbank A0T0F8; P51280; NP_849041; YP_874433). Acil transferase de glicerol-3-fosfato catalisa a etapa de limitar taxa de smtese de acido graxo. A regulagao ascendente dessa enzima pode aumentar a produgao de acido graxo (exemplos, alguns de microalgas, incluem numeros de acessao Genbank AAA74319; AAA33122; AAA37647; P44857; e ABO94442).
[00179] A regulagao ascendente e/ou descendente de genes pode ser aplicada a reguladores globais que controlam a expressao dos genes das vias biossinteticas de acido graxo. Por conseguinte, um ou mais reguladores globais de smtese de acido graxo podem ser reguladores ascendentemente ou descendentemente, como apropriado, para inibir ou aumentar, respectivamente, a expressao de uma pluralidade de genes sinteticos de acido graxo e finalmente aumentar a produgao de lipideo. Os exemplos incluem protemas de ligagao de elemento regulador de esterol (SREBPs), como SREBP-la e SREBP-lc (por exemplo, vide numeros de acessao Genbank NP.035610 e Q9WTN3).
[00180] A presente invenção tambem prove celulas de Prototheca recombinantes que foram modificadas para conter um ou mais genes exogenos que codificam enzimas de modificagao de lipideo como, por exemplo, tioesterasaes ACP-acila graxa (vide a Tabela 3), reductases de aldeido/CoA-acila graxa (vide a Tabela 4), reductases CoA-acila graxa (vide a Tabela 5), decarbonilase de aldefdo graxo (vide a Tabela 6), reductases de aldefdo graxo, e sintases de esqualeno (vide numero de Acessao Genbank AF205791). Em algumas modalidades, genes que codificam uma tioesterase ACP-acila graxa e uma proteina portadora de acila naturalmente coexpressa sao transformados em uma celula de Prototheca, opcionalmente com um ou mais genes que codificam outras enzimas de modificagao de lipfdeos. Em outras modalidades, o ACP e o tioesterase ACP-acila graxa podem ter uma afinidade entre si que transmite uma vantagem quando as duas sao utilizadas juntas nos microbios e metodos da presente invenção, independente de se sao ou nao naturalmente coexpressas em um tecido ou organism© especifico. Desse modo, a presente invenção considera tanto pares naturalmente coexpressos dessas enzimas como aqueles que partilham uma afinidade para interagir entre si para facilitar clivagem de uma cadeia de carbono especifico de comprimento da ACP.
[00181] Ainda em outras modalidades, um gene exogeno que codifica uma desaturase e transformado na celula de Prototheca em combinagao com um ou mais genes codificando outras enzimas de modificagao de lipfdeo para fomecer modificagoes com relagao a saturagao de lipfdeo. Desaturase ACPestearofla (vide, por exemplo, numeros de acessao GenBank AAF15308; ABM45911; e AAY86086), por exemplo, catalisa a conversao de estearoflaACP em oleofla-ACP. A regulagao ascendente desse gene pode aumentar a proporgao de acidos graxos monoinsaturados produzidos por uma celula; ao passo que a regulagao descendente pode reduzir a proporgao de monoinsaturados. Similarmente, a expressao de uma ou mais desaturases de glicerolipfdeo pode ser controlada para alterar a razao de acidos graxos insaturados para saturados como ©-6 desaturase de acido graxo, w-3 desaturase de acido graxo, ou ra-6-oleato desaturase. Em algumas modalidades, a desaturase pode ser selecionada com referenda a um comprimento de cadeia de carbono desejado, de tai modo que a desaturase seja capaz de fazer modificagoes especificas de local em um substrato de comprimento de carbono especificado, ou substratos tendo um comprimento de carbono em uma faixa especificada.
[00182] Desse modo, em modalidades especificas, microbios da presente invenção sao geneticamente construfdos para expressar um ou mais genes exogenos selecionados de uma tioesterase ACP-acila, uma reductase de aldefdo/CoA-acila, uma reductase CoA-acila graxa, uma reductase de aldefdo graxo, um decarbonilase de aldefdo graxo, ou uma proteina portadora de acila naturalmente co-expressa. Metodos de expressao apropriados sao descritos acima com relagao a expressao de um gene de lipase, incluindo, entre outros metodos, expressao induzivel e expressao compartimentalizada. Uma tioesterase ACPacila graxa cliva um acido graxo de uma protema portadora de acila (ACP) durante smtese de lipideo. Atraves de processamento enzimatico adicional, o acido graxo clivado e entao combinado com uma coenzima para fomecer uma molecula CoA-acila. Essa acila-CoA e o substrato para a atividade enzimatica de uma reductase de CoA-acila graxa para fomecer um aldefdo, bem como para uma reductase de aldefdo/CoAacila graxa para fomecer um alcool. O aldefdo produzido pela agao da reductase de CoA-acila graxa identificada acima e o substrato para atividade enzimatica adicional por uma reductase de aldefdo graxo para fomecer um alcool, ou uma decarbonilase de aldefdo graxo para fomecer um alcano ou alceno.
[00183] Em algumas modalidades, acidos graxos, glicerolipfdeos, ou os alcoois primarios correspondentes, aldefdos, alcanos ou alcenos, gerados pelos metodos descritos aqui, contem 8, 10, 12 ou 14 atomos de carbono. Acidos graxos preferidos para a produgao de diesel, biodiesel, diesel renovavel, ou combustlvel de jato, ou os alcoois primarios correspondentes, aldefdos, alcanos e alcenos, para aplicagoes industriais contem 8 a 14 atomos de carbono. Em certas modalidades, os acidos graxos acima, bem como as outras moleculas de hidrocarboneto correspondentes, sao saturadas (sem ligagoes duplas ou triplas de carbono-carbono); mono insaturadas (ligagao dupla unica); poli insaturadas (duas ou mais ligagoes duplas); sao lineares (nao cfclicas) ou ramificadas. Para produgao de combustlvel, saturagao maior e preferida.
[00184] As enzimas descritas diretamente acima tem uma especificidade preferential para hidrolise de um substrato contendo um numero especifico de atomos de carbono. Por exemplo, uma tioesterase ACPacila graxa pode ter uma preferencia para clivar um acido graxo tendo 12 atomos de carbono a partir do ACP. Em algumas modalidades, o ACP e a tioesterase especifica de comprimento podem ter uma afinidade entre si que as toma particularmente uteis como uma combinagao (por exemplo, os genes de tioesterase e ACP exogeno podem ser co-expressos naturalmente em um tecido ou organismo especifico a partir do qual sao derivados). Portanto, em varias modalidades, a celula de Prototheca recombinante da invenção pode conter um gene exogeno que codifica uma proteina com especificidade para catalisar uma atividade enzimatica (por exemplo, clivagem de um acido graxo de um ACP, redugao de uma acila-CoA para um aldefdo ou um alcool, ou conversao de um aldefdo em um alcano) com relagao ao numero de atomos de carbono contidos no substrato. A especificidade enzimatica pode, em varias modalidades, ser para um substrato tendo de 8 a 34 atomos de carbono, preferivelmente de 8 a 18 atomos de carbono, e mais preferivelmente de 8 a 14 atomos de carbono. Uma especificidade preferida e para um substrato tendo menos, isto e, 12, em vez de mais, isto e, 18, atomos de carbono.
[00185] Em exemplos nao limitadores, porem, ilustrativos, a presente invenção prove vetores e celulas hospedeiras de Prototheca que expressam uma tioesterase exogena e por conseguinte produzem lipideo enriquecido, em relagao ao perfil de lipideo de celulas de Prototheca nao transformadas, no comprimento de cadeia para o qual a trioesterase e especifica. As tioesterases ilustradas sao (i) Cinnamomum camphorum FatBl (No. De acessao GenBank. Q39473, a sequencia de aminoacido esta em SEQ ID NO: 59, sequencia de aminoacido sem sequencia de direcionamento para plastfdio (PTS) esta em SEQ ID NO: 139, e sequencia de cDNA otimizada por codon baseada na tabela 1 esta na SEQ ID NO: 60), que tern preferencia para substrato ACP-acila graxa com um comprimento de cadeia de carbono de 14; (ii) Cuphea hookeriana FatB2 ( No de acessao GenBank. AAC49269, sequencia de aminoacido esta na SEQ ID NO: 61, sequencia de aminoacido sem PTS esta na SEQ ID NO: 138, e sequencia de cDNA otimizada por codon baseada na tabela 1 esta na SEQ ID NO: 62), que tern preferencia para um substrato ACP-acila graxa com um comprimento de cadeia de carbono de 8-10; e (iii) Umbellularia Fat Bl (No. De acessao GenBank Q41635, sequencia de aminoacido esta inclufda na SEQ ID NO: 63, sequencia de aminoacido sem PTS esta na SEQ ID NO: 139, e sequencia de cDNA otimizada por codon com base na Tabela 1 e incluida na SEQ ID NO: 64), que tern uma preferencia para um substrato ACP-acila graxa com um comprimento de cadeia de carbono de 12,
[00186] Outras tioesterase ACP-acila graxa apropriadas para uso com os microbios e metodos da invenção incluem, sem limitagao, aquelas listadas na Tabela 3. Tabela 3. Tioestearase ACP-acila graxa e numeros de acessao GenBank
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[00187] Os Exemplos abaixo descrevem o direcionamento bem sucedido e expressao de tioesterase ACP-acila graxa heterologos de Cuphea hookeriana, Umbellularia califomica, Cinnamomum camphora nas especies Prototheca. Adicionalmente, alteragoes em perfis de acido graxo foram confirmados na expressao de celulas hospedeiras desses tioesterases ACPacila graxa heterologos. Esses resultados foram bem inesperados dada a ausencia de identidade de sequencia entre tioesterases de plantas superiores e algas em geral, e entre tioesterase ACP-acila graxa Prototheca moriformis e as tioesterases ACP-acila graxa heterologas acima listadas. Duas tioestereases ACP-acila Prototheca moriformis foram isoladas e seqiienciadas. As sequencias dos dois cDNAs mostraram um alto grau de identidade entre si, diferindo em somente 12 posigoes no nfvel de nucleotideo e cinco posigoes no nivel de aminoacido, quatro desses no peptfdeo de transito de plastfdio. A analise adicional de sequencia genomica de Prototheca moriformis confirmou que esses dois cDNAs foram realmente codificados em contigs separados, e embora altamente homologos, sao codificados por dois genes distintos. O cDNA e sequencia de aminoacidos dos dois tioesterase ACP-acila graxa Prototheca moriformis, tioesterease-1 ACP-acila graxa P. moriformis e tioesterease-2 ACP-acila graxa P. moriformis sao listados como SEQ IDN OS: 134-137.
[00188] Quando as sequencias de aminoacidos desses dois cDNAs foram BLASTed contra o banco de dados NCBI, as duas sequencias mais homologas foram tioestereases ACP-acila graxa de Chlamydomonas reinhardtii e Arabidopsis thaliana. Surpreendentemente, o mvel de identidade de aminoacido entre as tioesterases ACP-acila graxa Prototheca moriformis e tioesterases de planta superior foi relativamente baixo, somente em 49 e 37% de identidade. Alem disso, ha tambem uma diferenga sutil nas sequencias que circundam a porgao terminal amino do triade catalitico (NXHX36C) entre esses tioesterases ACP-acila graxa. Trinta e nove de quarenta tioesterases ACP-acila graxa de planta superior pesquisadas mostraram a sequencia LDMNQH que circunda os residues N e H na extremidade amino do tnade, enquanto todas as sequencias de algas identificadas tiveram a sequencia MDMNGH. Dada a identidade de sequencia de aminoacidos baixa e as diferengas que circundam o tnade catalitico dos tioesterases, os resultados bem sucedidos de expressao de tioesterases ACP-acila graxa exogenos obtidos e descritos nos exemplos foram inesperados, particularmente dado o fato de que a atividade das tioesterases ACP-acila graxa exogena era dependente em uma interagao de protema-protema funcional com a proteina portadora de acila Prototheca endogena.
[00189] Reductases de aldefdo/CoA-acila graxa apropriados para uso com os microbios e metodos da invenção incluem, sem limitagao, aquelas listadas na Tabela 4. Tabela 4: Reductases de aldefdo/CoA—acila graxa listadas por numeros de acessao GenBank.
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[00190] Reductases CoA-acila graxa apropriadas para uso com os microbios e metodos da invenção incluem, sem limitagao, aqueles listados na Tabela 5. Tabela 5. Reductases Co A-Acila graxa listadas por numeros de acessao GenBank.
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[00191] Decarbonilases de aldefdo graxo apropriados para uso com os microbios e metodos da invenção incluem, sem limitagao, aqueles listados na tabela 6. Tabela 6. Descarboxilases de aldefdo graxo listados por numeros de acessao GenBank.
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[00192] Combinagoes de tioestereases ACP-acila graxa coexpressas naturalmente e proteinas portadoras de acila sao apropriadas para uso com os microbios e metodos da invenção.
[00193] Exemplos adicionais de enzimas de modificagao de lipfdeo ou hidrocarboneto incluem sequencias de aminoacidos contidas em, referenciadas em, ou codificadas por sequencias de acido nucleico contidas ou referenciadas em, quaisquer das seguintes patentes US: 6.610.527; 6.451.576; 6.429.014; 6.342.380; 6.265.639; 6.194.185; 6.114.160; 6.083.731; 6.043.072; 5.994.114; 5.891.697; 5.871.988; 6.265.639, e adicionalmente descritos em numeros de acessao GenBank: AAO18435; ZP_00513891; Q38710; AAK60613; AAK60610; AAK60611; NP_113747; CAB75874; AAK60612; AAF20201; BAA11024; AF205791; e CAA03710.
[00194] Outras enzimas apropriadas para uso com os microbios e os metodos da invenção incluem aqueles que tern pelo menos 70% de identidade de aminoacido com uma das proteinas listadas nas Tabelas 3 a 6, e que apresentam a atividade enzimatica desejada correspondente (por exemplo, clivagem de um acido graxo de uma proteina portadora de acila, redugao de uma acila-CoA em um aldefdo ou um alcool, ou conversao de um aldefdo em um alcano). Em modalidades adicionais, a atividade enzimatica esta presente em uma sequencia que tern pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade com uma das sequencias descritas acima, todas as quais sao pela presente incorporadas a tftulo de referenda como se totalmente expostas.
[00195] Selecionando a combinagao desejada de genes exogenos a serem expresses, pode-se moldar o produto gerado pelo microbio, que pode ser entao extrafdo da biomassa aquosa. Por exemplo, o microbio pode conter: (i) um gene exogeno que codifica uma tioesterase ACP-acila graxa; e opcionalmente, (ii) uma protema portadora de acila naturalmente co-expressa ou uma protema portadora de acila de outro modo tendo afmidade para a tioesterase ACP-acila graxa (ou inversamente); e opcionalmente (iii) um gene exogeno que codifica uma reductase de aldeido/CoA-acila graxa ou uma reductase de CoA-acila graxa; e opcionalmente, (iv) um gene exogeno que codifica uma reductase de aldefdo graxo ou uma decarbonilase de aldefdo graxo. O microbio, sob condigoes de cultura descritas aqui, sintetiza um acido graxo ligado a um ACP e a tioesterase ACP-acila graxa catalisa a clivagem do acido graxo a partir do ACP para fomecer, atraves de processamento enzimatico adicional, uma molecula de CoA-acila graxa. Quando presente, a reductase de aldeido/CoA-acila graxa catalisa a redugao de acila-CoA em um alcool. Similarmente, a reductase de CoA-acila graxa, quando presente, catalisa a redugao de acila-CoA em um aldefdo. Naquelas modalidades nas quais um gene exogeno codificando uma reductase de CoA-acila graxa esta presente e expresso para fomecer um produto de aldefdo, uma reductase de aldefdo graxo, codificada pelo terceiro gene exogeno, catalisa a redugao do aldefdo em um alcool. Similarmente, uma decarbonilase de aldefdo graxo catalisa a conversao do aldefdo em um alcano ou um alceno, quando presente.
[00196] Genes que codificam tais enzimas podem ser obtidos de celulas ja conhecidas como apresentando produgao significativa de lipfdeos como Chlorella protothecoides. Genes ja conhecidos como tendo um papel em produgao de lipfdeos, por exemplo, um gene codificando uma enzima que satura ligagoes duplas, podem ser transformados individualmente em celulas receptoras. Entretanto, para por em pratica a invenção nao e necessario fazer assungoes a priori com relagao a quais genes sao exigidos. Os metodos para identificar genes que podem alterar (melhorar) a produgao de lipfdeos em microalgas sao descritos na publicagao PCT numero 2008/151149.
[00197] Desse modo, a presente invenção prove uma celula de Prototheca que foi geneticamente construida para expressar uma enzima de via de lipideo em um mvel alterado em comparagao com uma celula do tipo selvagem da mesma especie. Em alguns casos, a celula produz mais lipideo em comparagao com a celula do tipo selvagem quando as duas celulas sao cultivadas sob as mesmas condigoes. Em alguns casos, a celula foi geneticamente construida e/ou selecionada para expressar uma enzima de via de lipideo em um mvel mais elevado do que a celula do tipo selvagem. Em alguns casos, a enzima de via de lipideo e selecionada do grupo que consiste em piruvato desidrogenase, acetil-CoA carboxilase, proteina portadora de acila, e aciltransferase de fosfato glicerol-3. Em alguns casos, a celula foi geneticamente construida e/ou selecionada para expressar uma enzima de via de lipideo em um nivel mais baixo do que a celula do tipo selvagem. Pelo menos em uma modalidade na qual a celula expressa a enzima de via de lipideo em um mvel mais baixo, a enzima de via de lipideo compreende sintase de citrato.
[00198] Em algumas modalidades, a celula foi geneticamente construida e/ou selecionada para expressar um regulador global de smtese de acido graxo em um mvel alterado em comparagao com a celula do tipo selvagem, pelo que os niveis de expressao de uma pluralidade de genes sinteticos de acido graxo sao alterados em comparagao com a celula do tipo selvagem. Em alguns casos, a enzima de via de lipideo compreende uma enzima que modifica um acido graxo. Em alguns casos, a enzima de via de lipideo e selecionada de uma desaturase ACP-estearofla e uma desaturase de glicerolipfdeo.
[00199] Em outras modalidades, a presente invenção e dirigida a um microbio que produz oleo contendo um ou mais genes exogenos, em que os genes exogenos codificam protema(s) selecionada(s) do grupo que consiste em uma tioesterase ACP-acila graxa, uma reductase CoA-acila graxa, uma reductase de aldefdo graxo, uma reductase de aldefdo/CoA-acila graxa, uma decarbonilase de aldefdo graxo, e uma proteina portadora de acila. Em uma modalidade, o gene exogeno esta em ligagao operavel com um promotor, que e induzivel ou reprimfvel em resposta a um estfmulo. Em alguns casos, o estimulo e selecionado do grupo que consiste em uma molecula pequena exogenamente fomecida, calor, frio e nitrogenio limitado ou sem nitrogenio no meio de cultura. Em alguns casos, o gene exogeno e expresso em um compartimento de celulas. Em algumas modalidades, o compartimento celular e selecionado do grupo que consiste em um cloroplasto, um plastfdio e um mitocondrio. Em algumas modalidades o microbio e Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora ou Prototheca zopfii.
[00200] Em uma modalidade, o gene exogeno codifica uma tioesterase ACP-acila de acido graxo. Em alguns casos, a tioesterease codificada pelo gene exogeno catalisa a clivagem de um acido graxo de 8 a 18 carbonos de uma proteina portadora de acila (ACP). Em alguns casos, a tioesterase codificada pelo gene exogeno catalisa a clivagem de um acido graxo de 10 a 14 carbonos de um ACP. Em uma modalidade, a tioesterase codificada pelo gene exogeno catalisa a clivagem de um acido graxo de 12 carbonos de um ACP.
[00201] Em uma modalidade, o gene exogeno codifica uma reductase de aldefdo/CoA-acila graxa. Em alguns casos, a reductase codificada pelo gene exogeno catalisa a redugao de um CoA-acila graxa de 8 a 18 carbonos com um alcool primario correspondente. Em alguns casos, a reductase codificada pelo gene exogeno catalisa a redugao de um CoA-acila graxa de 10 a 14 carbonos com um alcool primario correspondente. Em uma modalidade, a reductase codificada pelo gene exogeno catalisa a redugao de um CoA-acila graxa de 12 carbonos com dodecanol.
[00202] A presente invenção tambem prove uma celula Prototheca recombinante contendo dois genes exogenos, em que um primeiro gene exogeno codifica uma tioesterase ACP-acila graxa e um segundo gene exogeno codifica uma protema selecionada do grupo que consiste em uma reductase CoA-acila graxa, uma reductase de aldeido/CoA-acila graxa, e uma protema portadora de acila. Em alguns casos, os dois genes exogenos estao individualmente em ligagao operavel com um promotor, que e induzivel em resposta a um estfmulo. Em alguns casos, cada promotor e induzivel em resposta a um estfmulo identico, como nitrogenio limitado ou sem nitrogenio no meio de cultura. A limitagao ou falta total de nitrogenio no meio de cultura estimula produgao de oleo em alguns microorganismos como especie de Prototheca, e pode ser utilizada como um gatilho para induzir produgao de oleo em nfveis elevados. Quando utilizado em combinagao com os metodos de engenharia genetica revelados aqui, o lipfdeo como uma percentagem de peso de celula seca pode ser empurrado a nfveis elevados como pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70% e pelo menos 75%; os metodos revelados aqui fomecem celulas com esses nfveis de lipfdeo, em que o lipfdeo e pelo menos 4% C8-C14, pelo menos 0,3% C8, pelo menos 2% CIO, pelo menos 2% C12, e pelo menos 2% C14. Em algumas modalidades, as celulas estao acima de 25% de lipfdeos por peso de celula seca e contem lipfdeo que e pelo menos 10% C8-C14, pelo menos 20% C8-C14, pelo menos 30% C8-C14, 10-30% C8-C14, e 20-30% C8-C14,
[00203] Os oleos novos revelados aqui sao distintos de outros oleos de ocorrencia natural que sao elevados em acidos graxos de cadeia mic, como oleo de palma, oleo de semente de palma, e oleo de coco. Por exemplo, nfveis de contaminantes como carotenoides sao bem mais elevados em oleo de palma e oleo de semente de palma do que nos oleos da invenção. Oleos de palma e semente de palma em particular contem alfa e beta carotenos e licopeno em quantidades muito mais elevadas do que nos oleos da invenção. Alem disso, mais de 20 carotenoides diferentes sao encontrados em oleo de palma e semente de palma, ao passo que os exemplos demonstram que os oleos da invenção contem muito poucas especies de carotenoide s e niveis muito baixos. Alem disso, os niveis de compostos de vitamina E como tocotrienois sao bem mais elevados em oleo de palma, semente de palma, e coco do que nos oleos da invenção.
[00204] Em uma modalidade, a tioesterase codificada pelo primeiro gene exogeno catalisa a clivagem de um acido graxo de 8 a 18 carbonos de um ACP. Em algumas modalidades, o segundo gene exogeno codifica uma reductase de aldefdo/CoA-acila graxa que catalisa a redugao de uma CoAacila graxa de 8 a 18 carbonos com um alcool primario correspondente. Em alguns casos, a tioesterase codificada pelo primeiro gene exogeno catalisa a clivagem de um acido graxo de 10 a 14 carbonos de um ACP, e a reductase codificada pelo segundo gene exogeno catalisa a redugao de uma CoA-acila graxa de 10 a 14 carbonos com o alcool primario correspondente, em que a tioesterase e a reductase atuam no mesmo comprimento de cadeia de carbono. Em uma modalidade, a tioesterase codificada pelo primeiro gene exogeno catalisa a clivagem de um acido graxo de 12 carbonos de um ACP, e a reductase codificada pelo segundo gene exogeno catalisa a redugao de um CoA-acila graxa de 12 carbonos em dodecanol. Em algumas modalidades, o segundo gene exogeno codifica uma reductase de CoA-acila graxa que catalisa a redugao de um CoA-acila graxa de 8 a 18 carbonos em um aldefdo correspondente. Em algumas modalidades, o segundo gene exogeno codifica uma proteina portadora de acila que e naturalmente coexpressa com a tioesterase ACP-acila graxa.
[00205] Em algumas modalidades, o segundo gene exogeno codifica uma reductase CoA-acila graxa, e o microbio contem ainda um terceiro gene exogeno que codifica uma decarbonilase de aldefdo graxo. Em alguns casos, a tioesterase codificada pelo primeiro gene exogeno catalisa a clivagem de um acido graxo de 8 a 18 carbonos de um ACP, a reductase codificada pelo segundo gene exogeno catalisa a reductase de um CoA-acila graxa de 8 a 18 carbonos a um aldefdo graxo correspondente, e a decarbonilase codificada pelo terceiro gene exogeno catalisa a conversao de um aldefdo graxo de 8 a 18 carbonos com um alcano correspondente, em que a tioesterase, a reductase e a decarbonilase atuam no mesmo comprimento de cadeia de carbono.
[00206] Em algumas modalidades, o segundo gene exogeno codifica uma proteina portadora de acila, e o microbio contem ainda um terceiro gene exogeno que codifica uma proteina selecionada do grupo que consiste em uma reductase CoA-acila graxa e uma reductase de aldefdo/CoA-acila graxa. Em alguns casos, o terceiro gene exogeno codifica uma reductase de CoAacila graxa, e o microbio contem ainda um quarto gene exogeno codificando uma decarbonilase de aldefdo graxo.
[00207] A presente invenção tambem prove metodos para produzir um alcool que compreende cultivar uma populagao de celulas de Prototheca recombinantes em um meio de cultura, em que as celulas contem (i) um primeiro gene exogeno que codifica uma tioesterase ACP-acila graxa, e (ii) um segundo gene exogeno que codifica uma reductase de aldefdo/CoA-acila graxa, e as celulas sintetizam um acido graxo ligado a uma proteina portadora de acila (ACP), a tioesterase ACP-acila graxa catalisa a clivagem do acido graxo da ACP para fomecer, atraves de processamento adicional, uma CoAacila graxa, e a reductase de aldefdo/CoA acila graxa catalisa a redugao da CoA-acila graxa em um alcool.
[00208] A presente invenção tambem prove metodos de produzir uma molecula de lipfdeo em uma celula de Prototheca. Em uma modalidade, o metodo compreende cultivar uma populagao de celulas de Prototheca em um meio de cultura, em que as celulas contem (i) um primeiro gene exogeno que codifica uma tioesterase ACP-acila graxa, e (ii) um segundo gene exogeno que codifica uma reductase CoA-acila graxa, e em que os microbios sintetizam um acido graxo ligado a uma protema portadora de acila (ACP), a tioesterase ACP-acila graxa catalisa a clivagem do acido graxo da ACP para fomecer, atraves de processamento adicional, uma CoA-acila graxa, e a reductase de CoA-acila graxa catalisa a redugao de CoA-acila em um aldefdo.
[00209] A presente invenção tambem prove metodos de produzir uma molecula de acido graxo tendo um comprimento de cadeia de carbono especificado em uma celula de Prototheca. Em uma modalidade, o metodo compreende cultivar uma populagao de celulas de Prototheca que produzem lipfdeo em um meio de cultura, em que os microbios contem um gene exogeno que codifica uma tioesterase ACP-acila graxa tendo uma atividade especffica ou preferential para certo comprimento de cadeia de carbono, como 8, 10, 12 ou 14 atomos de carbono, e em que os microbios sintetizam um acido graxo ligado a uma protema portadora de acila (ACP) e a tioesterase catalisa a clivagem do acido graxo da ACP quando o acido graxo foi sintetizado com o comprimento de cadeia de carbono especifico.
[00210] Nas varias modalidades descritas acima, a celula de Prototheca pode conter pelo menos um gene exogeno que codifica uma enzima de via de lipfdeo. Em alguns casos, a enzima de via de lipfdeo e selecionada do grupo que consiste em uma desaturase ACP-estearofla, uma desaturase de glicerolipideo, um piruvato desidrogenase, uma carboxilase CoA-acetila, uma protema portadora de acila, e um aciltransferase de fosfato glicerol-3. Em outros casos, a celula de Prototheca contem uma enzima de modificagao de lipfdeo selecionada do grupo que consiste em uma tioesterase ACP-acila graxa, uma reductase de aldeido/CoA-acila graxa, uma reductase de CoA-acila graxa, uma reductase de aldefdo graxo, uma decarbonilase de aldefdo graxo, e/ou uma protema portadora de acila.
VI. PRODUGAO DE PRODUTOS QUIMICOS E COMBUSTIVEIS
[00211] Para a produgao de combustivel de acordo com os metodos da invenção, lipfdeos produzidos por celulas da invenção sao colhidos, ou de outro modo coletados, por qualquer meio conveniente. Lipfdeos podem ser isolados por extragao de celulas inteiras. As celulas sao primeiramente rompidas, e entao lipfdeos associados a parede de celula/membrana de celula e intracelular bem como hidrocarbonetos extracelulares podem ser separados da massa de celulas, como por uso de centrifugagao como descrito acima. Lipfdeos intracelulares produzidos em microorganismos sao, em algumas modalidades, extrafdos apos lisar as celulas dos microorganismos. Apos extragao, os lipfdeos sao adicionalmente refinados para produzir oleos, combustfveis ou oleoqufmicos.
[00212] Apos termino de cultivo, os microorganismos podem ser separados do caldo de fermentagao. Opcionalmente, a separagao e efetuada por centrifugagao para gerar uma pasta concentrada. A centrifugagao nao remove quantidades significativas de agua intracelular a partir dos microorganismos e nao e uma etapa de secagem. A biomassa pode ser entao opcionalmente lavada com uma solugao de lavagem (por exemplo, agua DI) para se livrar do caldo de fermentagao e residues. Opcionalmente, a biomassa microbiana lavada pode ser tambem seca (seca em fomo, liofilizada, etc.) antes da ruptura das celulas. Alternativamente, as celulas podem ser lisadas sem separagao de algum ou todo caldo de fermentagao quando a fermentagao e conclufda. Por exemplo, as celulas podem estar em uma razao menor do que 1:1 v:v celulas para liquido extracelular quando as celulas sao lisadas.
[00213] Microorganismos contendo um lipideo podem ser lisados para produzir um lisado. Como detalhado aqui, a etapa de lisar um microorganismo (tambem mencionado como lise de celula) pode ser obtida por qualquer meio conveniente, incluindo lise induzido por calor, adigao de uma base, adigao de um acido, uso de enzimas como proteases e enzimas de degradagao de polissacandeo como amilases, uso de ultrassom, lise mecanica, uso de choque osmotico, infecgao com um virus litico, e/ou expressao de um ou mais genes Ifticos. A lise e realizada para liberar moleculas intracelulares que foram produzidos pelo microorganismo. Cada desses metodos para lisar um microorganismo pode ser utilizado como um metodo unico ou em combinagao simultaneamente ou seqiiencialmente. A extensao de ruptura de celulas pode ser observada por analise microscopica. O uso de um ou mais dos metodos descritos aqui, tipicamente mais de 70% de quebra de celulas e observado. Preferivelmente, a quebra de celulas e maior do que 80%, mais preferivelmente maior do que 90% e mais preferivelmente aproximadamente 100%.
[00214] Em modalidades especificas, o microorganismo e lisado apos crescimento, por exemplo, para aumentar a exposigao de lipideo e/ou hidrocarboneto celular para extragao ou processamento adicional. O timing de expressao de lipase (por exemplo, atraves de um promotor induzivel) ou lise de celula pode ser ajustado para otimizar o rendimento de lipfdeos e/ou hidrocarbonetos. Sao descritas abaixo diversas tecnicas de lise. Essas tecnicas podem ser utilizadas individualmente ou em combinagao.
[00215] Em uma modalidade da presente invenção, a etapa de lisar um microorganismo compreende aquecimento de uma suspensao celular contendo o microorganismo. Nessa modalidade, o caldo de fermentagao contendo os microorganismos (ou uma suspensao de microorganismos isolados do caldo de fermentagao) e aquecido ate que os microorganismos, isto e, as paredes da celula e membranas de microorganismos degradam ou rompem. Tipicamente, as temperaturas aplicadas sao pelo menos 50°C. Temperaturas mais elevadas, como pelo menos 30°C, pelo menos 60°C pelo menos 70°C, pelo menos 80°C, pelo menos 90°C, pelo menos 100°C, pelo menos 110°C, pelo menos 120°C, pelo menos 130°C ou mais elevadas sao utilizadas para lise mais eficiente de celulas. Lise de celulas por tratamento termico pode ser realizado por ferver o microorganismo. Alternativamente, o tratamento termico (sem ebuligao) pode ser realizado em uma autoclave. O lisado tratado com calor pode ser resfriado para tratamento adicional. A ruptura de celulas pode ser tambem realizada por tratamento a vapor, isto e, atraves de adigao de vapor pressurizado. O tratamento a vapor de microalgas para ruptura de celulas e descrito, por exemplo, na patente US numero 6,750,048, em algumas modalidades, o tratamento a vapor pode ser obtido por pulverizar vapor no fermentador e manter o caldo em uma temperatura desejada por menos do que aproximadamente 90 minutos, preferivelmente menos do que aproximadamente 60 minutos, e mais preferivelmente menos do que aproximadamente 30 minutos.
[00216] Em outra modalidade da presente invenção, a etapa de lisar um microorganismo compreende adicionar uma base a uma suspensao celular contendo o microorganismo. A base deve ser forte o bastante para hidrolisar pelo menos uma porgao dos compostos proteinaceos dos microorganismos utilizados. Bases que sao uteis para solubilizar proteinas sao conhecidas na tecnica de qufmica. Bases exemplares que sao uteis nos metodos da presente invenção incluem, porem nao sao limitadas a hidroxidos, carbonatos e bicarbonatos de litio, sodio, potassio, calcio e misturas dos mesmos. Uma base preferida e KOH. O tratamento de base de microalgas para ruptura de celulas e descrito, por exemplo, na patente US numero 6,750,048.
[00217] Em outra modalidade da presente invenção, a etapa de lisar um microorganismo compreende adicionar um acido a uma suspensao celular contendo o microorganismo. Lise de acido pode ser efetuada utilizando um acido em uma concentragao de 10 a500 mN ou preferivelmente 40 a 160 nM. Lise de acido e preferivelmente realizada acima da temperatura ambiente (por exemplo, em 40 a 160°C, e preferivelmente uma temperatura de 50 a 130°C. Para temperatures moderadas (por exemplo, temperatura ambiente a 100°C e particularmente temperatura ambiente a 65°C, tratamento acido pode ser combinado de forma util com sonicagao ou outros metodos de ruptura de celulas.
[00218] Em outra modalidade da presente invenção, a etapa de lisar um microorganismo compreende lisar o microorganismo utilizando uma enzima. Enzimas preferidas para lisar um microorganismo sao proteases e enzimas de degradar polissacandeo como hemicelulase (por exemplo, hemicelulase de Aspergillus niger; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #H2125), pectinase (por exemplo, pectinase de Rhizopus sp.; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #P2401), Mannaway 4,0 L (Novozymes), celulase (por exemplo, celulose de Trichoderma viride; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #C9422), e driselase (por exemplo, driselase de Basidiomycetes sp.; Sigma Aldrich, St. Louis, MO; #D9515.
[00219] Em outras modalidades da presente invenção, lise e realizada utilizando uma enzima como, por exemplo, uma celulase como uma enzima de degradar polissacandeo, opcionalmente de Chlorella ou um virus de Chlorella ou uma protease, como protease Streptomyces griseus, quimotripsina, proteinase K, proteases listadas em Degradation of Polylactide by Commercial Proteases, Oda Yet al., Journal of Polymers and the Environment, Volume 8, Numero 1, Janeiro de 2000 , pag. 29-32(4), Alcalase 2,4 FG (Novozymes), e Flavourzyme 100 L (Novozymes). Qualquer combinagao de uma protease e uma enzima de degradar polissacarfdeos pode ser tambem utilizada, incluindo qualquer combinagao das proteases e enzimas de degradar polissacandeo precedentes.
[00220] Em outra modalidade, lise pode ser realizada utilizando uma prensa expelidora. Nesse processo, biomassa e forgada atraves de um dispositivo do tipo parafuso em pressao elevada, lisando as celulas e fazendo com que o lipideo intracelular seja liberado e separado da proteina e fibra (e outros componentes) na celula.
[00221] Em outra modalidade da presente invenção, a etapa de lisar um microorganismo e realizada utilizando ultrassom, isto e, sonicagao. Desse modo, as celulas podem ser tambem lisadas com som de alta freqiiencia. O som pode ser produzido eletronicamente e transportado atraves de uma ponta metalica para uma suspensao celular apropriadamente concentrada. Essa sonicagao (ou ultrassonicagao) rompe a integridade celular com base na criagao de cavidades em suspensao de celulas.
[00222] Em outra modalidade da presente invenção, a etapa de lisar um microorganismo e realizada por lise mecanica. Celulas podem ser lisadas mecanicamente e opcionalmente homogeneizadas para facilitar coleta de hidrocarboneto (por exemplo, lipideo). Por exemplo, um meio de ruptura de pressao pode ser utilizado para bombear uma pasta contendo celulas atraves de uma valvula de orificio restrito. Pressao elevada (ate 1500 bar) e aplicada, seguido por uma expansao instantanea atraves de um bocal de saida. Ruptura de celulas e realizada por tres mecanismos diferentes: incidencia sobre a valvula, cisalhamento de liquido elevado no orificio, e quebra subita de pressao apos descarga, causando explosao da celula. O metodo libera moleculas intracelulares. Alternativamente, um moinho de bolas pode ser utilizado. Em um moinho de bolas, celulas sao agitadas em suspensao com partfculas abrasivas pequenas, como contas. As celulas quebram devido a forgas de cisalhamento, trituragao entre contas, e colisoes com contas. As contas rompem as celulas para liberar o conteudo celular. As celulas tambem podem ser rompidas por forgas de cisalhamento, como com o uso de mistura (como com uma elevada velocidade ou misturador Waring como exemplos), a prensa francesa, ou mesmo centrifugagao em caso de paredes de celulas fracas, para romper as celulas.
[00223] Em outra modalidade da presente invenção, a etapa de lisar um microorganismo e realizada por aplicar um choque osmotico.
[00224] Em outra modalidade, da presente invenção, a etapa de lisar um microorganismo compreende infecgao do microorganismo com um virus litico. Uma ampla variedade de vfrus e conhecida para lisar microorganismos apropriados para uso na presente invenção, e a selegao e uso de um vfrus litico especifico para um microorganismo especifico esta compreendido no nfvel de conhecimentos na tecnica. Por exemplo, vfrus paramecium bursaria clorela (PBCV-1) e o prototipo de um grupo (famflia Phycodnaviridae, genero Chlorovirus) de vfrus de DNA de fita dupla, formagao de placa, icosoedro, grandes que replicam em e lisam, certas algas verdes semelhantes a clorela, eucarioticas, unicelulares. Por conseguinte, quaisquer microalgas suscetfveis podem ser lisadas por infectar a cultura com um vfrus de clorela apropriado. Os metodos de infectar especies de Chlorela com um vfrus de clorela sao conhecidos. Vide, por exemplo, Adv. Virus Res. 2006;66:293-336; Virology, 25 de abril de 1999;257(1): 15-23; Virology,5 de Janeiro de 2004;318(l):214-23; Nucleic Acids Symp. Ser. 2000;(44): 161-2; J. Virol. 2006 Mar;80(5):2437-44; e Annu. Rev. Microbiol. 1999;53:447-94,
[00225] Em outra modalidade da presente invenção, a etapa de lisar um microorganismo compreende autolise. Nessa modalidade, um microorganismo de acordo com a invenção e geneticamente construfdo para produzir uma proteina Utica que lisara o microorganismo. Esse gene litico pode ser expresso utilizando um promotor induzivel de modo que as celulas possam primeiramente ser cultivadas a uma densidade desejavel em um fermentador, seguido por indugao do promotor para expressar o gene litico para lisar as celulas. Em uma modalidade, o gene litico codifica uma enzima de degradar polissacandeo. Em certas outras modalidades, o gene litico e um gene de um vfrus litico. Desse modo, por exemplo, um gene litico de um vfrus Chlorela pode ser expresso em uma celula de algas; vide Virology 260, 308315 (1999); FEMS Microbiology Letters 180 (1999) 45-53; Virology 263, 376-387 (1999); e Virology 230, 361-368 (1997). A expressao de genes Ifticos e feita preferivelmente utilizando um promoter induzivel, como um promoter ativo em microalgas que e induzido por um estfmulo como a presenca de uma pequena molecula, luz, calor e outros estfmulos.
[00226] Varios metodos sao disponfveis para separar lipfdeos de lisados celulares produzidos pelos metodos acima. Por exemplo, lipfdeos e derivados de lipfdeos como aldefdos graxos, alcoois graxos, e hidrocarbonetos como alcanos podem ser extraidos com um solvente hidrofobico como hexano (vide Frfenz e outros 1989, Enzyme Microb. Technol., 11:717). Lipfdeos e derivados de lipfdeos tambem podem ser extraidos utilizando liquefagao (vide, por exemplo, Sawayama e outros. 1999, Biomass and Bioenergy 17:3339 e Inoue e outros. 1993, Biomass Bioenergy 6(4):269-274); liquefagao de oleo (vide, por exemplo, Minowa e outros. 1995, Fuel 74(12): 1735-1738); e extragao de CO2 supercrftica (vide por exemplo, Mendes e outros. 2003, Inorganica Chimica Acta 356:328-334). Miao e Wu descrevem um protocolo da recuperagao de lipideo de microalgas de uma cultura de Chlorella prototheocoides na qual as celulas foram colhidas por centrifugagao, lavadas com agua destilada e secas por liofilizagao. O po de celulas resultantes foi pulverizado em um pilao e entao extraido com n -hexano. Miao e Wu, Biosource Technology (2006) 97:841 a 846.
[00227] Desse modo, lipfdeos, derivados de lipideo e hidrocarbonetos gerados pelos microorganismos da presente invenção podem ser recuperados por extragao com um solvente organico. Em alguns casos, o solvente organico preferido e hexano. Tipicamente, o solvente organico e adicionado diretamente ao lisado sem separagao anterior dos componentes de lisado. Em uma modalidade, o lisado gerado por um ou mais dos metodos descritos acima e contatado com um solvente organico por um periodo de tempo suficiente para permitir que os componentes de lipideo e/ou hidrocarboneto formem uma solugao com o solvente organico. Em alguns casos, a solugao pode ser entao adicionalmente refinada para recuperar componentes de lipideo ou hidrocarboneto desejados, especfficos. Metodos de extragao de hexano sao bem conhecidos na tecnica.
[00228] Lipfdeos e derivados de lipfdeos como aldefdos graxos, alcoois graxos e hidrocarbonetos como alcanos produzidos pelas celulas como descrito aqui podem ser modificados pelo uso de uma ou mais enzimas, incluindo uma lipase, como descrito acima. Quando os hidrocarbonetos estao no ambiente extracelular das celulas, uma ou mais enzimas podem ser adicionadas aquele ambiente sob condigoes nas quais a enzima modifica o hidrocarboneto ou completa sua smtese de um precursor de hidrocarboneto. Alternativamente, os hidrocarbonetos podem ser parcial ou totalmente isolados do material celular antes da adigao de um ou mais catalisadores como enzimas. Tais catalisadores sao adicionados de forma exogena, e sua atividade ocorre fora da celula ou in vitro.
[00229] Desse modo, lipfdeos e hidrocarbonetos produzidos por celulas in vivo, ou modificados enzimaticamente in vitro, como descrito aqui podem ser opcionalmente processados adicionalmente por meio conventional. O processamento pode incluir “craqueamento” para reduzir o tamanho, e desse modo aumentar a razao de hidrogenio:carbono, de moleculas de hidrocarboneto. Metodos de craqueamento termico e catalftico sao rotineiramente utilizados em processamento de oleo de triglicendeo e hidrocarboneto. Metodos catalfticos envolvem o uso de um catalisador, como um catalisador de acido solido. O catalisador pode ser sflica-alumina ou uma zeolito, que resultam na quebra heterolitica ou assimetrica de uma ligagao de carbono-carbono para resultar em um carbocation e um anion de hidreto. Esses intermediaries reativos sao entao submetidos a rearranjo ou transferencia de hidreto com outro hidrocarboneto. As reagoes podem desse modo regenerar os intermediaries para resultar em um mecanismo de cadeia de auto-propagagao. Hidrocarbonetos tambem podem ser processados para reduzir, opcionalmente a zero, o numero de ligagoes duplas ou triplas de carbono-carbono nos mesmos. Hidrocarbonetos tambem podem ser processados para remover ou eliminar um anel ou estrutura ciclica nos mesmos. Hidrocarbonetos tambem podem ser processados para aumentar a razao de hidrogenio:carbono. Isso pode incluir a adigao de hidrogenio (“hidrogenagao”) e/ou o “craqueamento” de hidrocarbonetos em hidrocarbonetos menores.
[00230] Metodos termicos envolvem o uso de temperatura e pressao elevada para reduzir tamanho de hidrocarboneto. Uma temperatura elevada de aproximadamente 800°C e pressao de aproximadamente 700 kPa podem ser utilizadas. Essas conduces geram “leve”, um termo que e as vezes utilizado para se referir a moleculas de hidrocarboneto ricas em hidrogenio (como distinguido de fluxo foton) enquanto tambem gera, por condensagao moleculas de hidrocarboneto mais pesadas que sao relativamente esgotadas de hidrogenio. A metodologia prove quebra homolftica ou simetrica e produz alcenos, que pode ser opcionalmente enzimaticamente saturada como descrito acima.
[00231] Metodos catalftico e termico sao padroes em plantas para processamento de hidrocarboneto e refinagao de oleo. Desse modo hidrocarbonetos produzidos por celulas como descrito aqui podem ser coletados e processados ou refinados atraves de meio convencional. Vide Hillen e outros (Biotechnology and Bioengineering., vol. XXIV: 193-205 (1982)) para um relatorio sobre hidrocraqueamento de hidrocarbonetos produzidos de microalgas. Em modalidades altemativas, a fragao e tratada com outro catalisador, como um composto organico, calor e/ou um composto inorganico. Para processamento de lipfdeos em biodiesel, um processo de transesterificagao e utilizado como descrigao na segao IV da presente invenção.
[00232] Hidrocarbonetos produzidos atraves de metodos da presente invenção sao uteis em uma variedade de aplicagoes industriais. Por exemplo, a produgao de sulfonato de alquil benzeno linear (LAS), um tensoativo anionico utilizado em quase todos os tipos de detergentes e preparados de limpeza, utiliza hidrocarbonetos compreendendo genericamente uma cadeia de 10-14 atomos de carbono. Vide, por exemplo, as patentes US numeros: 6.946.430; 5.506.201; 6.692.730; 6.268.517; 6.020.509; 6.140.302; 5.080.848; e 5.567.359. Tensoativos, como LAS, podem ser utilizados na fabricagao de composigoes para cuidados pessoais e detergentes, como aqueles descritos nas patentes US numeros: 5.942.479; 6.086.903; 5.833.999; 6.468.955; e 6.407.044.
[00233] O interesse crescente e dirigido ao uso de componentes de hidrocarboneto de origem biologica em combustfveis, como biodiesel, diesel renovavel, e combustivel de jato, uma vez que materiais de partida biologicos renovaveis que podem substituir materiais de partida derivados de combustfveis fosseis sao disponfveis e o uso dos mesmos e desejavel. Ha necessidade urgente por metodos para produzir componentes de hidrocarboneto de materiais biologicos. A presente invenção atende essa necessidade por fomecer metodos para a produgao de biodiesel, diesel renovavel, e combustivel de jato utilizando os lipfdeos gerados pelos metodos descritos aqui como um material biologico para produzir biodiesel, diesel renovavel e combustivel de jato.
[00234] Combustfveis diesel tradicionais sao destilados de petroleo ricos em hidrocarbonetos parafmicos tern faixas de ebuligao tao amplas quanto 370° a 780°F, que sao apropriadas pra combustao em um motor de ignigao de compressao, como veiculo de motor diesel. O American Society of Testing and Materials (ASTM) estabelece o tipo de diesel de acordo com a faixa de ebuligao, juntamente com faixas permissfveis de outras propriedades do combustivel, como numero de cetano, ponto de nevoa, ponto de inflamagao, viscosidade, ponto de anilina, teor de enxofre, teor de agua, teor de cinzas, corrosao de tira de cobre e residuo de carbono. Tecnicamente, qualquer material destilado de hidrocarboneto derivado de biomassa ou de outro modo que atenda a especificagao ASTM apropriada pode ser definido como combustlvel diesel (ASTM D975), combustlvel de jato (ASTM DI655) ou como biodiesel se for um ester metflico de acido graxo (ASTM D6751).
[00235] Apos extragao, componentes de lipideo e/ou hidrocarboneto recuperados da biomassa microbiana descrita aqui podem ser submetidos a tratamento qulmico para fabricar um combustlvel para uso em veiculos diesel e motores de jato.
[00236] Biodiesel e um liquido que varia em cor entre dourado e marrom escuro dependendo do insumo de produgao. E praticamente imisclvel com agua, tem elevado ponto de ebuligao e baixa pressao de vapor. Biodiesel se refere a um combustlvel processador equivalente a diesel para uso em veiculos de motor diesel. Biodiesel e biodegradavel e nao toxico. Um beneflcio adicional de biodiesel em relagao a combustlvel diesel convencional e desgaste mais baixo do motor. Tipicamente, biodiesel compreende esteres de alquila C14-C18. Varios processos convertem biomassa ou um lipideo produzido e isolado como descrito aqui em combustlveis diesel. Um metodo preferido para produzir biodiesel e por transesterificagao de um lipideo como descrito aqui. Um ester de alquila preferido para uso como biodiesel e um ester de metila ou ester de etila.
[00237] Biodiesel produzido por um metodo descrito aqui pode ser utilizado individualmente ou misturado com combustlvel diesel convencional em qualquer concentragao na maioria dos veiculos de motor diesel modemos. Quando misturado com combustlvel diesel convencional (diesel de petroleo), biodiesel pode estar presente de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 99,9%. Grande parte do mundo usa um sistema conhecido como o fator “B” para declarar a quantidade de biodiesel em qualquer mistura de combustlvel. Por exemplo, combustlvel contendo 20% de biodiesel e rotulado B20, Biodiesel puro e mencionado como B100.
[00238] Biodiesel tambem pode ser utilizado como um combustlvel de aquecimento em boilers domesticos e comerciais. Boilers de oleo existentes podem conter partes de borracha e podem exigir conversao para operar em biodiesel. O processo de conversao e normalmente relativamente simples, envolvendo a troca de partes de borracha por partes sinteticas devido a biodiesel sendo um solvente forte. Devido a seu poder de solvente forte, a queima de biodiesel aumentara a eficiencia de boilers. Biodiesel pode ser utilizado como aditivo em formulapoes de diesel para aumentar a lubrificapao de combustfvel Diesel de enxofre ultra-baixo (ULSD) puro, que e vantajoso porque nao tern virtualmente teor de enxofre. Biodiesel e um solvente melhor do que petrodiesel e pode ser utilizado para romper depositos de resfduos nas linhas de combustfvel de vefculos que rodavam previamente em petrodiesel.
[00239] Biodiesel pode ser produzido por transesterificapao de triglicerideos contidos em biomassa rica em oleo. Desse modo, em outro aspecto da presente invenpao um metodo para produzir biodiesel e fomecido. Em uma modalidade preferida, o metodo para produzir biodiesel compreende as etapas de (a) cultivar um microorganismo contendo lipfdeo utilizando metodos revelados aqui (b) lisar um microorganismo contendo lipfdeo para produzir um lisado, (c) isolar lipfdeo do microorganismo lisado, e (d) transesterificar a composipao de lipfdeo, pelo que biodiesel e produzido. Os metodos para crescimento de um microorganismo, lisar um microorganismo para produzir um lisado, tratar o lisado em um meio compreendendo um solvente organico para formar uma mistura heterogenea e separar o lisado tratado em uma composipao de lipfdeo foram descritos acima e podem ser tambem utilizados no metodo de produzir biodiesel.
[00240] O perfil de lipfdeo do biodiesel e normalmente altamente similar ao perfil de lipfdeo do oleo de insumo. Outros oleos fomecidos pelos metodos e composipoes da invenpao podem ser submetidos a transesterificapao para fomecer biodiesel com perfis de lipfdeo incluindo (a) pelo menos 4% de C8-C14; (b) pelo menos 0,3% de C8; (c) pelo menos 2% de CIO; (d) pelo menos 2% de C12; e (e) pelo menos 30% de C8-C14.
[00241] Composigoes de lipideo podem ser submetidas a transesterificagao para fornecer esteres de acido graxo de cadeia longa uteis como biodiesel. Reagbes de transesterificagao preferidas sao delineadas abaixo e incluem transesterificagao de base catalisada e transesterificagao utilizando lipases recombinantes. Em um processo de transesterificagao de base catalisada, os triacilglicerideos sao reagidos com um alcool, como metanol ou etanol, na presenga de um catalisador alcalino, tipicamente hidroxido de potassio. Essa reagao forma esteres de metila ou etila e glicerina (glicerol) como um subproduto.
[00242] Oleos de planta e animal sao tipicamente feitos de triglicerideos que sao esteres de acidos graxos livres com o alcool triidrico, glicerol. Em transesterificagao, o glicerol em um triacilglicerideo (TAG) e substituido com um alcool de cadeia curta como metanol ou etanol. Um esquema de reagao tipica e como a seguir:
Figure img0009
[00243] Nessa reagao, o alcool e desprotonado com uma base para tomar o mesmo um nucleofilo mais forte. Comumente, etanol ou metanol e utilizado em vasto excesso (ate 50 vezes). Normalmente, essa reagao prosseguira excessivamente lentamente ou nao prosseguira de forma alguma. Carlo, bem como um acido ou base pode ser utilizado para ajudar a reagao a prosseguir mais rapidamente. O acido ou base nao e consumido pela reagao de transesterificagao, desse modo nao sao reagentes, porem catalisadores. Quase todo biodiesel foi produzido utilizado a tecnica de base catalisada visto que requer somente baixas temperaturas e pressbes e produz mais de 98% de rendimento de conversao (com a condigao de que o oleo de partida seja baixo em umidade e acidos graxos livres).
[00244] A transesterificagao foi tambem realizada como discutido acima, utilizando uma enzima como lipase em vez de uma base. Transesterificagao catalisada por liase pode ser realizada, por exemplo, em uma temperatura entre a temperatura ambiente e 80°C, e uma razao molar do TAG para o alcool inferior maior do que 1:1, preferivelmente aproximadamente 3:1, Lipases apropriadas para uso em transesterificagao incluem, porem nao sao limitadas aquelas listas na Tabela 7. Outros exemplos de lipases uteis para transesterificagao sao encontradas, por exemplo, nas patentes US numeros 4,798,793; 4,940,845 5,156,963; 5,342,768; 5,776,741e W089/01032. Tais lipases incluem, porem nao sao limitadas a, lipases produzidas por microorganismos de Rhizopus, Aspergillus, Candida, Mucor, Pseudomonas, Rhizomucor, Candida., e Humicola e lipase de pancreas. Tabela 7. Lipases apropriadas para uso em transesterificagao.
Figure img0010
[00245] Um desafio para utilizar uma lipase para a produgao de esteres de acido graxo apropriados para biodiesel e que o prego de lipase e muito mais elevado do que o prego de hidroxido de sodio (NaOH) utilizado pelo processo de base forte. Esse desafio foi tratado utilizando uma lipase imobilizada, que pode ser reciclada. Entretanto, a atividade da lipase imobilizada deve ser mantida apos ser reciclada por um numero imnimo de ciclos para permitir que um processo baseado em lipase compita com o processo de base forte em termos do custo de produgao. Lipases imobilizadas estao sujeitas a envenenamento pelos alcoois inferiores tipicamente utilizados em transesterificagao. A patente US numero 6.398.707 (expedida em 4 de junho de 2002 para Wu e outros) descreve metodos para aumentar a atividade de lipases imobilizadas e regenerar lipases imobilizadas tendo atividade reduzida. Alguns metodos apropriados incluem imergir uma lipase imobilizada em um alcool tendo um numero de atomo de carbono nao menor do que 3 por um periodo de tempo, preferivelmente de 0,5 a 48 horas, e mais preferivelmente de 0,5 a 1,5 horas. Alguns metodos apropriados tambem incluem lavar uma lipase imobilizada desativada com um alcool tendo um numero de atomo de carbono nao menor do que 3 e entao imergir a lipase imobilizada desativada em um oleo vegetal por 0,5 a 48 horas.
[00246] Em modalidades especificas, uma lipase recombinante e expressa nos mesmos microorganismos que produzem o lipfdeo no qual a lipase atua. Lipases recombinantes apropriadas incluem aquelas listadas acima na Tabela 7 e/ou tendo numeros de Acessao Genbank listados acima na tabela 7, ou um polipeptfdio que tern pelo menos 70% de identidade de aminoacidos com uma das listas listadas acima na tabela 7 e que apresenta atividade de lipase. Em modalidades adicionais, a atividade enzimatica esta presente em uma sequencia que tern pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 95%, ou pelo menos aproximadamente 99% de identidade com uma das sequencias descritas acima, todas as quais sao incorporadas pelo presente a tftulo de referenda como se exposta totalmente. DNA codificando a liase e marcador selecionavel e preferivelmente cDNA otimizado por codon. Os metodos de recodificar genes para expressao em microalgas sapo descritos na patente US 7.135.290.
[00247] O padrao intemacional comum para biodiesel e EN 14214, ASTM D6751 e o padrao de biodiesel mais comum referenciado nos Estados Unidos e Canada. A Alemanha usa DIN EN 14214 e o Reino Unido requer conformidade com BS EN 14214. Testes industrials basicos para determinar se os produtos se conformam a esses padroes incluem tipicamente cromatografia de gas, HPLC e outros. Biodiesel que atende aos padroes de qualidade e muito toxico, com uma classificagao de toxicidade (LD50) maior do que 50 mL/kg.
[00248] Embora biodiesel que atenda aos padroes ASTM tenha de ser nao toxico, pode haver contaminantes que tendem a cristalizar e/ou precipitar e sair da solugao como sedimento. A formagao de sedimentos e particularmente um problema quando biodiesel e utilizado em temperaturas mais baixas. O sedimento ou precipitados podem causar problemas como diminuir fhixo de combustfvel, obstruir linhas de combustfvel, obstruir filtros, etc. Processos sao bem conhecidos na tecnica que lidam especificamente com a remogao desses contaminantes e sedimentos em biodiesel para produzir um produto de qualidade superior. Os exemplos para tais processos incluem, porem nao sao limitados, a pre-tratamento do oleo para remover contaminantes como fosfolipidios e acidos graxos livres (por exemplo, retirada de goma, refinagao caustica e filtragao de adsorvente de silica) e filtragao fria. Filtragao fria e um processo que foi desenvolvido especificamente para remover quaisquer materiais em particulas e sedimentos que estao presentes no biodiesel apos produgao. Esse processo resfria o biodiesel e filtra quaisquer sedimentos ou precipitados que poderiam se formar quando o combustfvel e utilizado em uma temperatura mais baixa. Tai processo e bem conhecido na arte e e descrito na publicagao do pedido de patente US numero 2007-0175091, Metodos apropriados podem incluir resfriamento do biodiesel a uma temperatura menor do que aproximadamente 38°C de modo que as impurezas e contaminantes precipitem para fora como materiais em particulas no liquido biodiesel. Terra diatomacea ou outro material de filtragao pode ser entao adicionado ao biodiesel resfriado para formar uma pasta, que pode ser entao filtrada atraves de uma folha de pressao ou outro tipo de filtro para remover os materiais em particulas. O biodiesel filtrado pode ser entao passado atraves de um filtro de polimento para remover quaisquer sedimentos restantes e terra diatomacea, de modo a produzir o produto biodiesel final.
[00249] O Exemplo 14 descreveu a produgao de biodiesel utilizando oleo de triglicendeo de Prototheca moriformis. O metodo Capacidade de filtragao de embeber frio pelo ASTM D6751 Al do biodiesel produzido no exemplo 14 foi 120 segundos para um volume de 300 ml. Esse teste envolve filtragao de 300 ml de B100, resfriado a 40°F por 16 horas, deixado aquecer ate a temp, ambiente, e filtrado a vacuo utilizando filtro de fibra de vidro de 0,7 micron com suporte de ago inoxidavel. Oleos da invenção podem ser transesterificados para gerar biodiesel com um tempo de embeber frio menor do que 120 segundos, menor do que 100 segundos e menor do que 90 segundos.
[00250] Processos subseqiientes tambem podem ser utilizados se o biodiesel for utilizado em temperatures particularmente frias. Tais processos incluem adaptagao para o invemo e fracionamento. Os dois processos sao projetados para melhorar o desempenho em invemo e fluxo frio do combustlvel por diminuir o ponto de nevoa (a temperatura na qual o biodiesel comega a cristalizar). Ha varias abordagens para adaptagao do biodiesel par o invemo. Uma abordagem e misturar o biodiesel com diesel de petroleo. Outra abordagem e utilizar aditivos que podem diminuir o ponto de nevoa de biodiesel. Outra abordagem e remover esteres de metila saturada indiscriminadamente por misturar aditivos e deixar a cristalizagao de saturados e entao filtrar os cristais. O fracionamento separa seletivamente esteres de metila em componentes ou fragoes individuals, permitindo a remogao ou inclusao de esteres de metila especfficos. Os metodos de fracionamento incluem fracionamento de ureia, fracionamento de solventes e destilagao termica.
[00251] Outro combustlvel valioso fomecido pelos metodos da presente invenção e diesel renovavel, que compreende alcanos, como Cl0:0, C12:0, C14:0, C16:0 e C18:0 e desse modo sao distinguiveis de biodiesel. Diesel renovavel de alta qualidade se conforma com o padrao ASTM D975, Os lipfdeos produzidos pelos metodos da presente invenção podem servir como insumo para produzir diesel renovavel. Desse modo, em outro aspecto da presente invenção, um metodo para produzir diesel renovavel e fomecido. Diesel renovavel pode ser produzido por pelo menos tres processos: processamento hidrotermico (hidrotratamento); hidroprocessamento e liquefagao indireta. Esses processos fomecem destilados nao de ester. Durante esses processos, triacilglicendeos produzidos e isolados como descrito aqui, sao convertidos em alcanos.
[00252] Em uma modalidade, o metodo para produzir diesel renovavel compreende (a) cultivar um microrganismo contendo lipfdeo utilizando metodos revelados aqui (b) lisar o microorganismo para produzir um lisado, (c) isolar lipfdeo do microorganismo lisado, e (d) desoxigenar e hidrotratar o lipfdeo para produzir um alcano, pelo que diesel renovavel e produzido. Lipfdeos apropriados para fabricar diesel renovavel podem ser obtidos atraves de extragao de biomassa microbiana utilizando um solvente organico como hexano, ou atraves de outros metodos como aqueles descritos na patente US 5.928.696. Alguns metodos apropriados podem incluir pressao mecanica e centrifugagao.
[00253] Em alguns metodos, o lipfdeo microbiano e primeiramente craqueado em combinagao com hidrotratamento para reduzir comprimento de cadeia de carbono e saturar ligagoes duplas, respectivamente. O material e entao isomerizado, tambem em combinagao com hidrotratamento. A fragao de nafta pode ser entao removida atraves de destilagao, seguido por destilagao adicional para vaporizar e destilar componentes desejados no combustfvel diesel para atender um padrao ASTM D975 enquanto deixa componentes que sao mais pesados do que desejado para atender o padrao D975. Os metodos de hidrotratamento, hidrocraqueamento, desoxigenagao e isomerizagao de modificar quimicamente oleos, incluindo oleos de triglicerfdeo, sao bem conhecidos na tecnica. Vide, por exemplo, os pedidos de patente europeia EP1741768 (Al); EP1741767 (Al); EP1682466 (Al); EP1640437 (Al); EP1681337 (Al); EP1795576 (Al); e patentes US 7.238.277; 6.630.066; 6.596.155; 6.977.322; 7.041.866; 6.217.746; 5.885.440; 6.881.873.
[00254] Em uma modalidade do metodo para produzir diesel renovavel, o tratamento do lipideo para produzir um alcano e executado por hidrotratamento da composigao de lipideo. No processamento hidrotermico, tipicamente, biomassa e reagida em agua em uma temperatura e pressao elevadas para formar oleos e solidos residuais. Temperaturas de conversao sao tipicamente 300° a 660°F, com pressao suficiente para manter a agua principalmente como um Ifquido, 100 a 170 atmosfera padrao (atm). Tempos de reagao sao da ordem de 15 a 30 minutos. Apos termino da reagao, os organicos sao separados da agua. Desse modo um destilado apropriado para diesel e produzido.
[00255] Em alguns metodos de fazer diesel renovavel, a primeira etapa de tratar um triglicerfdeo e hidroprocessamento para saturar ligagoes duplas, seguido por desoxigenagao em temperatura elevada na presenga de hidrogenio e um catalisador. Em alguns metodos, hidrogenagao e desoxigenagao ocorrem na mesma reagao. Em outros metodos desoxigenagao ocorre antes da hidrogenagao. Isomerizagao e entao opcionalmente realizada, tambem na presenga de hidrogenio e um catalisador. Componentes de nafta sao preferivelmente removidos atraves de destilagao. Por exemplo, vide as patentes US 5.475.160 (hidrogenagao de triglicerideos); 5.091.116 (desoxigenagao, hidrogenagao e remogao de gas); 6.391.815 (hidrogenagao); e 5.888.947 (isomerizagao).
[00256] Um metodo apropriado para a hidrogenagao de triglicerideos inclui a preparagao de uma solugao aquosa de sais de cobre, zinco, magnesio e lantanio e outra solugao de metal alcalino ou preferivelmente carbonato de amonio. As duas solugoes podem ser aquecidas a uma temperatura de aproximadamente 20°C ate aproximadamente 85°C e dosadas juntas em um recipiente de precipitagao em taxas de tai modo que o pH no recipiente de precipitagao seja mantido entre 5,5 e 7,5 para formar um catalisador. Agua adicional pode ser utilizada inicialmente no recipiente de precipitagao ou adicionada simultaneamente com a solugao de sal e solugao de precipitagao. O precipitado resultante pode ser entao completamente lavado, seco, calcinado a aproximadamente 300°C e ativado em hidrogenio em temperaturas que variam de aproximadamente 100°C a aproximadamente 400°C. Um ou mais triglicendeos podem ser entao contatados e reagidos com hidrogenio na presenga do catalisador descrito acima em um reator. O reator pode ser um reator de leito de acumulagao, reator solido-gas de leito fixo, reator de coluna de bolha acondicionada, reator de tanque continuamente agitado, um reator de fase de pasta, ou qualquer outro tipo de reator apropriado conhecido na tecnica. O processo pode ser realizado em batelada ou em modo contmuo. Temperaturas de reagao estao tipicamente na faixa de aproximadamente 170°C a aproximadamente 250°C enquanto as pressoes de reagao estao tipicamente na faixa de aproximadamente 300 psig a aproximadamente 2000 psig. Alem disso, a razao molar de hidrogenio para triglicendeo no processo da presente invenção esta tipicamente na faixa de aproximadamente 20:1 a aproximadamente 700:1. O processo e tipicamente realizado em uma velocidade espacial horaria ponderal (WHSV) na faixa de aproximadamente 0,1 h1 a aproximadamente 5 h1, Uma pessoa versada na tecnica reconhecera que o penodo de tempo exigido para reagao variara de acordo com a temperatura utilizada, a razao molar de hidrogenio para triglicendeo, e a pressao parcial de hidrogenio. Os produtos produzidos pelos processos de hidrogenagao incluem alcoois graxos, glicerol, residues de parafinas e triglicendeos nao reagidos. Esses produtos sao tipicamente separados por meio convencional como, por exemplo, destilagao, extragao, filtragao, cristalizagao e similares.
[00257] Refinadores de petroleo utilizam hidroprocessamento para remover impurezas por tratar alimentagoes com hidrogenio. Temperaturas de conversao de hidroprocessamento sao tipicamente 300° a 700°F. Pressoes sao tipicamente 40 a 100 atm. Os tempos de reagao sao tipicamente da ordem de 10 a 60 minutos. Catalisadores solidos sao empregados para aumentar certas taxas de reagao, melhorar a seletividade para certos produtos, e otimizar consumo de hidrogenio.
[00258] Metodos apropriados para a desoxigenagao de um oleo incluem aquecer um oleo a uma temperatura na faixa de aproximadamente 350°F a aproximadamente 550°F e continuamente contatar o oleo aquecido com nitrogenio sob pelo menos pressao que varia de aproximadamente atmosferica ate acima por pelo menos aproximadamente 5 minutos.
[00259] Metodos apropriados para isomerizagao incluem o uso de isomerizagao alcalina e outra isomerizagao de oleo conhecida na tecnica.
[00260] Hidrotratamento e hidroprocessamento levam finalmente a uma redugao no peso molecular da alimentagao de triglicerfdeo. A molecula de triglicerfdeo e reduzida a quatro moleculas de hidrocarboneto sob condigoes de hidroprocessamento: uma molecula de propano e tres moleculas de hidrocarboneto mais pesadas, tipicamente na faixa de C8 a C18.
[00261] Desse modo, em uma modalidade, o produto de uma ou mais reagao(oes) quimica(s) realizada(s) em composigoes de lipideo da invenção e uma mistura de alcano que compreende diesel renovavel ASTM D975. A produgao de hidrocarbonetos por microorganismos e examinada por Metzger e outros. Appl Microbiol Biotechnol (2005) 66: 486—496 e A Look Back at the U.S. Department of Energy’s Aquatic Species Program: Biodiesel from Algae, NREL/TP-580-24190, John Sheehan, Terri Dunahay, John Benemann e Paul Roessler (1998). descritas em termos de T10-T90 (temperatura a 10% e 90% respectivamente, volume destilado). Diesel renovavel foi produzido de oleo de triglicendeo Prototheca morifonnis e e descrito no exemplo 14. O T10-T90 do material produzido no exemplo 14 foi de 57,9°C. os metodos de hidrotratamento, isomerizagao e outra modificagao covalente de oleos revelados aqui, bem como metodos de destilagao e fracionamento (como filtragao fria) revelados aqui, podem ser empregados para gerar composigoes de diesel renovavel com outras faixas T10-T90, como 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 e 65°C utilizando oleos de triglicendeo produzidos de acordo com os metodos revelados aqui. [00263] O T10 do material produzido no Exemplo 14 foi de 242,1°C. Os metodos de hidrotratamento, isomerizagao e outra modificagao covalente de oleos revelados aqui, bem como metodos de destilagao e fracionamento (como filtragao fria) revelados aqui, podem ser empregados para gerar composigoes de diesel renovavel com outros valores T10, como T10 entre 180 e 295, entre 190 e 270, entre 210 e 250, entre 225 e 245, e pelo menos 290.
[00262] As propriedades de destilação de um combustível diesel são descritas em termos de T10-T90 (temperatura a 10% e 90% respectivamente, volume destilado). Diesel renovável foi produzido de óleo de triglicerídeo Prototheca moriformis e é descrito no exemplo 14. O T10-T90 do material produzido no exemplo 14 foi de 57,9°C. os métodos de hidrotratamento, isomerização e outra modificação covalente de óleos revelados aqui, bem como métodos de destilação e fracionamento (como filtração fria) revelados aqui, podem ser empregados para gerar composições de diesel renovável com outras faixas T10-T90, como 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 e 65°C utilizando óleos de triglicerídeo produzidos de acordo com os métodos revelados aqui.
[00263] O T10 do material produzido no Exemplo 14 foi de 242,1°C. Os métodos de hidrotratamento, isomerização e outra modificação covalente de óleos revelados aqui, bem como métodos de destilação e fracionamento (como filtração fria) revelados aqui, podem ser empregados para gerar composições de diesel renovável com outros valores T10, como T10 entre 180 e 295, entre 190 e 270, entre 210 e 250, entre 225 e 245, e pelo menos 290.
[00264] O T90 do material produzido no Exemplo 14 foi de 300°C. os metodos de hidrotratamento, isomerizagao e outra modificagao covalente de oleos revelados aqui, bem como metodos de destilagao e fracionamento (como filtragao fria) revelados aqui podem ser empregados para gerar composigoes de diesel renovavel com outros valores T90, como T90 entre 280 e 380, entre 290 e 360, entre 300 e 350, entre 310 e 340 e pelo menos 290.
[00265] O FBP do material produzido no Exemplo 14 foi de 300°C. Os metodos de hidrotratamento, isomerizagao e outra modificagao covalente de oleos revelados aqui, bem como metodos de destilagao e fracionamento (como filtragao fria) revelados aqui, podem ser empregados para gerar composigoes de diesel renovavel com outros valores FBP, como FBP entre 290 e 400, entre 300 e 385, entre 310 e 370, entre 315 e 360, e pelo menos 300.
[00266] Outros oleos fomecidos pelos metodos e composigoes da invenção podem ser submetidos a combinagoes de hidrotratamento, isomerizagao, e outra modificagao covalente incluindo oleos com perfis de lipfdeo incluindo (a) pelo menos 4% C8-C14; (b) pelo menos 0,3% C8; (c) pelo menos 2% CIO; (d) pelo menos 2% C12; e (3) pelo menos 30% C8-C14.
[00267] Um diesel de enxofre ultrabaixo tradicional pode ser produzido de qualquer forma de biomassa por um processo de duas etapas. Primeiramente, a biomassa e convertida em um gas de smtese, uma mistura gasosa rica em hidrogenio e monoxido de carbono. A seguir, o gas de smtese e cataliticamente convertido em liquidos. Tipicamente, a produgao de liquidos e realizada utilizando smtese Fischer-Tropsch (FT). Essa tecnologia se aplica a carvao, gas natural e oleos pesados. Desse modo, ainda em outra modalidade preferida do metodo para produzir diesel renovavel, o tratamento da composigao de lipfdeo para produzir um alcano e realizado por liquefagao indireta da composigao de lipfdeo.
[00268] A presente invenção tambem prove metodos para produzir combustlvel de jato. Combustlvel de jato e de cor clara para palha. O combustlvel mais comum e um combustlvel a base de oleo de parafinas/sem chumbo classificado como Aeroplane A-l, que e produzido para um conjunto intemacionalmente padronizado de especificagoes. Combustlvel de jato e uma mistura de um grande numero de hidrocarbonetos diferentes, possivelmente tantos quantos um mil ou mais. A faixa de seus tamanhos (pesos moleculares ou numeros de carbono) e limitada pelas exigencias para o produto, por exemplo, ponto de congelamento ou ponto maximo de chama sem fumaga. Combustlvel de Aeroplane do tipo querosene (incluindo Jato A e Jato A-l) tem uma distribuigao de numero de carbono entre aproximadamente 8 e 16 numeros de carbono. Combustlvel Aeroplane do tipo nafta ou corte amplo (incluindo Jato B) tem tipicamente uma distribuigao de numero de carbono entre aproximadamente 5 e 15 carbonos.
[00269] Ambos Aeroplanes (Jato A e Jato B) podem conter diversos aditivos. Aditivos uteis incluem, porem nao sao limitados a antioxidantes, agentes antiestaticos, inibidores de corrosao, e agentes inibidores de formagao de gelo de sistema de combustfvel (FSII). Antioxidantes evitam goma e normalmente sao baseados em fenois alquilados, por exemplo, AO-30, AO-31 ou AO-37. Agentes antiestaticos dissipam eletricidade estatica e evitam centelhamento. Stadis 450 com acido dinonil naftil sulfonico (DINNSA) como o ingrediente ativo, e um exemplo. Inibidores de corrosao, por exemplo, DCI-4A e utilizado para combustfveis militares e civis e DCI-6A e utilizado para combustfveis militares. Agentes FSII incluem, por exemplo, Di-EGME.
[00270] Em uma modalidade da invenção, um combustfvel de jato e produzido por misturar combustfveis de alga com combustfvel de jato existente. Os lipfdeos produzidos pelos metodos da presente invenção podem servir como insumo para produzir combustfvel de jato. Desse modo, em outro aspecto da presente invenção, um metodo para produzir combustfvel de jato e fomecido. Com o presente dois metodos para produzir combustfvel de jato dos lipfdeos produzidos pelos metodos da presente invenção sao fomecidos: craqueamento catalitico de fluido (FCC); e hidrodesoxigenagao (HDO).
[00271] Craqueamento catalitico de fluido (FCC) e um metodo que e utilizado para produzir olefinas, especialmente propileno de fragoes brutas pesadas. Os lipfdeos produzidos pelo metodo da presente invenção podem ser convertidos em olefinas. O processo envolve fluir os lipfdeos produzidos atraves de uma zona FCC e coletar um fluxo de produto compreendido de olefinas, que e util como combustfvel de jato. O s lipfdeos produzidos sao contatados com um catalisador de craqueamento em condigoes de craqueamento para fomecer um fluxo de produto que compreende olefinas e hidrocarbonetos uteis como combustfvel de jato. jato compreende (a) cultivar um microorganismo contendo lipideo utilizando metodos revelados aqui, (b) lisar o microorganismo contendo lipideo para produzir um lisado, (c) isolar lipideo do lisado, e (d) tratar a composigao de lipideo, pelo que combustivel de jato e produzido. Em uma modalidade do metodo para produzir um combustivel de jato, a composigao de lipideo pode ser fluida atraves de uma zona de craqueamento catalitico de fluido, que, em uma modalidade, pode compreender contatar a composigao de lipideo com um catalisador de craqueamento em condigoes de craqueamento para fomecer um fluxo de produto compreendendo olefinas C2-C5.
[00272] Em uma modalidade, o método para produzir combustível de jato compreende (a) cultivar um microorganismo contendo lipídeo utilizando métodos revelados aqui, (b) lisar o microorganismo contendo lipídeo para produzir um lisado, (c) isolar lipídeo do lisado, e (d) tratar a composição de lipídeo, pelo que combustível de jato é produzido. Em uma modalidade do método para produzir um combustível de jato, a composição de lipídeo pode ser fluída através de uma zona de craqueamento catalítico de fluido, que, em uma modalidade, pode compreender contatar a composição de lipídeo com um catalisador de craqueamento em condições de craqueamento para fornecer um fluxo de produto compreendendo olefinas C2-C5.
[00273] Em certas modalidades desse metodo, pode ser desejavel remover quaisquer contaminantes que podem estar presentes na composigao de lipideo. Desse modo, antes de fluir a composigao de lipideo atraves de uma zona de craqueamento catalitico de fluido, a composigao de lipideo e pretratada. O pre-tratamento pode envoiver contatar a composigao de lipideo com uma resina de permuta de ions. A resina de permuta de ions e uma resina de permuta de ion acido, como AmberlystTM-15 e pode ser utilizada como um leito em um reator atraves do qual a composigao de lipideo e fluida, fluxo ascendente ou fluxo descendente. Outros pre-tratamentos podem incluir lavagens com acido branco por contatar a composigao de lipideo com um acido, como acido sulfurico, acetico, mtrico ou clondrico. O contato e feito com uma solugao de acido diluida normalmente em temperatura ambiente e pressao atmosferica.
[00274] A composigao de lipideo, opcionalmente pre-tratada, e fluida ate uma zona FCC onde os componentes hidrocarbonaceos sao craqueados em olefinas. O craqueamento catalitico e realizado por contatar a composigao de lipideo em uma zona de reagao com um catalisador composto de material em partfculas finamente dividido. A reagao e craqueamento catalitico, ao contrario de hidrocraqueamento, e e realizada na ausencia de hidrogenio adicionado ou o consumo de hidrogenio. A medida que a reagao de craqueamento prossegue, quantidades substanciais de coque sao depositadas no catalisador. O catalisador e regenerado em temperaturas elevadas por queimar coque do catalisador em uma zona de regeneragao. Catalisador contendo coque, mencionado aqui como catalisador coqueificado, e continuamente transportado da zona de reagao para a zona de regeneragao para ser regenerado e substituido por catalisador regenerado essencialmente isento de coque a partir da zona de regeneragao. A fluidificagao das particulas de catalisador por varies fluxos gasosos permite o transporte de catalisador entre a zona de reagao e a zona de regeneragao. Os metodos para craquear hidrocarbonetos, como aqueles da composigao de lipfdeo descrita aqui, em um fluxo fluidificado de catalisador, transportando catalisador entre zonas de reagao e regeneragao, e queimando coque no regenerador sao bem conhecidos por aqueles versados na tecnica de processos FCC. Aplicagoes de FCC exemplares e catalisadores uteis para craqueamento da composigao de lipfdeo para produzir olefinas C2-C5 sao descritas nas patentes US numeros 6.538.169, 7.288.685, que sao incorporadas na Integra a tftulo de referenda.
[00275] Catalisadores de FCC apropriados compreendem genericamente pelo menos dois componentes que podem ou nao estar na mesma matriz. Em algumas modalidades, os dois componentes podem ser circulados por todo recipiente de reagao. O primeiro competente inclui genericamente quaisquer dos catalisadores bem conhecidos que sao utilizados na tecnica de craqueamento catalitico fluidificado, como um catalisador do tipo argila amorfa ativa e/ou uma peneira molecular cristalina, de atividade elevada. Catalisadores de peneira molecular podem ser preferidos em relagao a catalisadores amorfos devido a sua seletividade muito aperfeigoada para produtos desejados. Em algumas modalidades preferidas, zeolitos podem ser utilizados como a peneira molecular nos processos FCC. Preferivelmente, o primeiro componente de catalisador compreende um zeolito de poro grande, como um zeolito do tipo Y, um material de alumina ativa, um material aglutinante, compreendendo silica ou alumina e uma carga inerte como caulim.
[00276] Em uma modalidade, craqueamento da composigao de lipfdeo da presente invenção, ocorre na segao de tubo ascendente, ou alternativamente, na segao de elevagao, da zona FCC. A composigao de lipfdeo e introduzida no tubo ascendente por um bocal resultando na vaporizagao rapida da composigao de lipfdeos. Antes de contatar o catalisador, a composigao de lipfdeos tera comumente uma temperatura de aproximadamente 149°C a aproximadamente 316°C (300°F a 600°F). O catalisador e flufdo de um recipiente de mistura para o tubo ascendente onde contata a composigao de lipfdeo por um tempo de aproximadamente 2 segundos ou menos.
[00277] O catalisador misturado e vapores de composigao de lipfdeo reagido sao entao despregados do topo do tubo ascendente atraves de uma saida e separados em um fluxo de vapor de produto craqueado incluindo olefinas e uma colegao de particulas de catalisador cobertas com quantidades substanciais de coque e genericamente mencionadas como “catalisador coqueificado.” Em um esforgo para minimizar o tempo de contato da composigao de lipfdeo e catalisador que pode promover conversao adicional de produtos desejados em outros produtos indesejaveis, qualquer arranjo de separadores como um arranjo de brago de oscilagao pode ser utilizado para remover catalisador coqueificado do fluxo de produto rapidamente. O separador, por exemplo, separador de brago de oscilagao, e localizado em uma porgao superior de uma camara com uma zona de extragao situada na porgao inferior da camara. O catalisador separado pelo arranjo de brago de oscilagao cai para dentro da zona de extragao. O fluxo de vapor de produto craqueado compreendendo hidrocarbonetos craqueados, incluindo olefinas leves e algum catalisador, sai da camara atraves de um conduto que esta em comunicagao com ciclones. Os ciclones removem particulas de catalisador restantes a partir do fluxo de vapor de produto para reduzir concentrates de partfculas a niveis muito baixos. O fluxo de vapor de produto entao sai do topo do recipiente de separagao. O catalisador separado pelos ciclones e retomado ao recipiente de separagao e entao para a zona de extragao. A zona de extragao remove hidrocarbonetos adsorvidos a partir da superficie do catalisador por contato contracorrente com vapor.
[00278] A pressao baixa partial de hidrocarboneto opera para favorecer a produgao de olefinas leves. Por conseguinte, a pressao de tubo ascendente e ajustada em aproximadamente 172 a 241 kPa (25 a 35 psia) com uma pressao partial de hidrocarboneto de aproximadamente 35 a 172 kPa (5 a 25 psia), com uma pressao partial de hidrocarboneto preferida de aproximadamente 69 a 138 kPa (10 a 20 psia). Essa pressao partial relativamente baixa de hidrocarboneto e obtida utilizando vapor como diluente ate o ponto em que o diluente e 10 a 55% em peso de composigao de lipideo e preferivelmente aproximadamente 15% em peso de composigao de lipideo. Outros diluentes como gas seco podem ser utilizados para obter pressoes parciais de hidrocarboneto equivalentes.
[00279] A temperatura do fluxo craqueado na saida do tubo ascendente sera aproximadamente 510°C a 621 °C (950°F a 1150°F). Entretanto, as temperaturas de saida de tubo ascendente acima de 566°C (1050°F) fazem mais gas seco e mais olefinas. Ao passo que as temperaturas de saida do tubo ascendente abaixo de 566°C (1050°F) fazem menos etileno e propileno. Por conseguinte, prefere-se operar o processo FCC em uma temperatura preferida de aproximadamente 566°C a aproximadamente 630°C, pressao preferida de aproximadamente 138 kPa a aproximadamente 240 kPa (20 a 35 psia). Outra condigao para o processo e a razao de composigao de catalisador para lipideo que pode variar de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 e preferivelmente de aproximadamente 10 a aproximadamente 15. [0285] Em uma modalidade do metodo para produzir um combustivel de jato, a composigao de lipfdeo e introduzida na segao de elevagao de um reator FCC. A temperatura na segao de elevagao sera muito quente e varia de aproximadamente 700°C (1292°F) a aproximadamente 760°C (MOOT) com uma razao de composigao de catalisador para lipfdeo de aproximadamente 100 a aproximadamente 150. Preve-se que a introdugao da composigao de lipfdeo na segao de elevagao produzira quantidades consideraveis de propileno e etileno.
[00280] Em outra modalidade do metodo para produzir um combustlvel de jato utilizando a composigao de lipfdeo ou os lipfdeos produzidos como descrito aqui, a estrutura da composigao de lipfdeo ou os lipfdeos e quebrada por um processo mencionado como hidrodesoxigenagao (HDO). HDO significa remogao de oxigenio por intermedio de hidrogenio, isto e, oxigenio e removido enquanto quebra a estrutura do material. Ligagoes duplas olefmicas sao hidrogenadas e quaisquer compostos de enxofre e nitrogenio sao remo vidos. A remogao de enxofre e chamada hidrodessulfurizagao (HDS). O pre-tratamento e pureza das materias primas (composigao de lipfdeo ou os lipfdeos) contribuem para a vida em servigo do catalisador.
[00281] Genericamente na etapa de HDO/HDS, hidrogenio e misturado com o insumo (composigao de lipfdeo ou os lipfdeos) e entao a mistura e passada atraves de um leito catalisador como um fluxo co-corrente, como um estoque de alimentagao de fase unica ou duas fases. Apos a etapa HDO/MDS, a fragao de produto e separada e passada para um reator de isomerizagao separado. Um reator de isomerizagao para material de partida biologico e descrito na literature (Fl 100 248) como um reator cocorrente.
[00282] O processo para produzir um combustlvel por hidrogenar uma alimentagao de hidrocarboneto, por exemplo, a composigao de lipfdeo ou os lipfdeos da presente invenção, tambem pode ser realizado por passar a composigao de lipfdeo ou os lipfdeos como um fluxo de co-corrente com gas hidrogenio atraves de uma primeira zona de hidrogenagao, e posteriormente o efluente de hidrocarboneto e adicionalmente hidrogenado em uma segunda zona de hidrogenagao por passar gas hidrogenio para a segunda zona de hidrogenagao como um fluxo contracorrente em relagao ao efluente de hidrocarboneto. Aplicagoes de HDO exemplares e catalisadores uteis para craquear a composigao de lipfdeo para produzir olefinas C2-C5 sao descritos na patente US numero 7.232.935, que e incorporada na Integra a tftulo de referenda.
[00283] Tipicamente, na etapa de hidrodesoxigenagao, a estrutura do componente biologico, como a composigao de lipideo ou lipfdeos da presente invenção, e decomposta, compostos de oxigenio, nitrogenio, fosforo e enxofre, e hidrocarbonetos leves como gas sao removidos, e as ligagoes oleffnicas sao hidrogenadas. Na segunda etapa do processo, isto e, na etapa denominada isomerizagao, isomerizagao e realizada para ramificar a cadeia de hidrocarboneto e melhorar o desempenho da parafina em baixas temperaturas.
[00284] Na primeira etapa, isto e, etapa HDO, do processo de craqueamento, gas hidrogenio e a composigao de lipfdeo ou lipfdeos da presente invenção que devem ser hidrogenados sao passados para um sistema de leito catalisador HDO como fluxos co-corrente ou contracorrente, o sistema de leito catalisador compreendendo um ou mais leito(s) catalisador(es), preferivelmente 1-3 leitos catalisadores. A etapa HDO e tipicamente operada em um modo cocorrente. No caso de um sistema de leito catalisador HDO compreendendo dois ou mais leitos de catalisador, um ou mais dos leitos pode ser operado utilizando o princfpio de fluxo contracorrente. Na etapa HDO, a pressao varia entre 20 e 150 bar, preferivelmente entre 50 e 100 bar, e a temperatura varia entre 200 e 500°C, preferivelmente na faixa de 300-400°C. Na etapa HDO, catalisadores de hidrogenagao conhecidos contendo metais do Grupo VII e/ou VIB do Sistema periodico podem ser utilizados. Preferivelmente, os catalisadores de hidrogenagao sao catalisadores Pd, Pt, Ni, NiMo ou CoMo suportados, o suporte sendo alumina e/ou silica. Tipicamente, catalisadores N1MO/AI2O3 e COMO/AI2O3 sao utilizados.
[00285] Antes da etapa HDO, a composigao de lipideo ou lipfdeos da presente invenção podem ser tratados opcionalmente por prehidrogenagao sob condigoes mais brandas desse modo evitando reagoes colaterais das ligagoes duplas. Tai pre-hidrogenagao e realizada na presenga de um catalisador de prehidrogenagao em temperaturas de 50 a 400°C e em pressoes de hidrogenio de 1 200 bar, preferivelmente em uma temperatura entre 150 e 250°C e em uma pressao de hidrogenio entre 10 e 100 bar. O catalisador pode conter metais do Grupo VIII e/ou VIB do Sistema Periodico. Preferivelmente, o catalisador de pre-hidrogenagao e um catalisador Pd, Pt, Ni, NiMo ou C0M0 suportado, o suporte sendo alumina e/ou silica.
[00286] Um fluxo gasoso da etapa HDO contendo hidrogenio e resfriado e entao compostos de monoxido de carbono, dioxido de carbono, nitrogenio, fosforo e enxofre, hidrocarbonetos leves gasosos e outras impurezas sao removidos do mesmo. Apos compressao, o hidrogenio purificado ou hidrogenio reciclado e retomado ao primeiro leito de catalisador e/ou entre os leitos de catalisador para compensar pelo fluxo de gas resfriado. Agua e removida do Ifquido condensado. O Ifquido e passado para o primeiro leito de catalisador ou entre os leitos de catalisador.
[00287] Apos a etapa HDO, o produto e submetido a uma etapa de isomerizagao. E substantial para o processo que as impurezas sejam removidas tao completamente quanto possfvel antes que os hidrocarbonetos sejam contatados com o catalisador de isomerizagao. A etapa de isomerizagao compreende uma etapa de extragao optional, em que o produto de reagao da etapa HDO pode ser purificado por extragao com vapor de agua ou um gas apropriado como hidrocarboneto leve, nitrogenio ou hidrogenio. A etapa de extragao optional e realizada em modo contracorrente em uma unidade a montante do catalisador de isomerizagao, em que o gas e liquido sao contatados entre si ou antes do reator de isomerizagao efetivo em uma unidade de extragao separada utilizando princfpio de contracorrente.
[00288] Apos a etapa de extragao o gas hidrogenio e a composigao de lipfdeo hidrogenado ou lipfdeos da presente invenção, e opcionalmente uma mistura de n-parafina, sao passados para uma unidade de isomerizagao reativa compreendendo um ou varios leito(s) de catalisador. Os leitos de catalisador da etapa de isomerizagao podem operar em modo cocorrente ou contracorrente.
[00289] E importante para o processo que o princfpio de fluxo contracorrente seja aplicado na etapa de isomerizagao. Na etapa d isomerizagao isso e feito por realizar a etapa de extragao opcional ou a etapa de reagao de isomerizagao ou ambos no modo contracorrente. Na etapa de isomerizagao, a pressao varia na faixa de 20 150 bar, preferivelmente na faixa de 20 100 bar, a temperatura estando entre 200 e 500°C, preferivelmente entre 300 e 400°C. na etapa de isomerizagao, catalisadores de isomerizagao conhecidos na tecnica podem ser utilizados. Catalisadores de isomerizagao apropriados contem peneira molecular e/ou um metal do Grupo VII ZSM-22 ou ZSM-23 ou ferrierita e Pt, Pd ou Ni e AI2O3 ou SiCh.Catalisadores de isomerizagao tfpicos sao, por exemplo, Pt/SAPO-11/AI2O3, Pt/ZSM22/AI2O3, Pt/ZSM-23/A12O3 e Pt/SAPO-1 l/SiCh. A etapa de isomerizagao e a etapa HDO podem ser realizadas no mesmo recipiente de pressao ou em recipiente de pressao separados. A prehidrogenagao opcional pode ser realizada em um recipiente de pressao separado ou no mesmo recipiente de pressao que as etapas de isomerizagao e HDO.
[00290] Desse modo, em uma modalidade, o produto de uma ou mais reagoes qufmicas e uma mistura de alcano que compreende combustlvel de jato ASTM D1655. Em algumas modalidades, a composigao que se conforma a especificagao de combustlvel de jato ASTM 1655 tem um teor de enxofre que e menor do que 10 ppm. Em outras modalidades, a composigao que se conforma a especificagao de combustfvel de jato ASTM 1655 tern um valor T10 da curva de destilagao menor do que 205°C. Em outra modalidade, a composigao que se conforma a especificagao de combustfvel de jato ASTM 1655 tern um ponto de ebuligao final (FBP) menor do que 300°C. Em outra modalidade, a composigao que se conforma a especificagao de combustfvel de jato ASTM 1655 tern um ponto de inflamagao de pelo menos 38°C. Em outra modalidade, a composigao que se conforma a especificagao de combustfvel de jato ASTM 1655 tern uma densidade entre 775K/M3 e 840K/M3. Ainda em outra modalidade, a composigao que se conforma a especificagao de combustfvel de jato ASTM 1655 tern um ponto de congelamento que esta abaixo de -47°C. Em outra modalidade, a composigao que se conforma a especificagao de combustfvel de jato ASTM 1655 tern um Calor de combustao liquido que e pelo menos 42,8 MJ/K. Em outra modalidade, a composigao que se conforma a especificagao de combustfvel de jato ASTM 1655 tern um teor de hidrogenio que e pelo menos 13,4% em massa. Em outra modalidade, a composigao que se conforma a especificagao de combustfvel de jato ASTM 1655 tern uma estabilidade termica, como testado por JFTOT gravimetrico quantitative a 260°C, que e abaixo de 3 mm de Hg. Em outra modalidade, a composigao que se conforma a especificagao de combustfvel de jato ASTM 1655 tern uma bomba existente que esta abaixo de 7 mg/dl.
[00291] Desse modo, a presente invenção revela uma variedade de metodos nos quais a modificagao qufmica de lipfdeo de microalgas e realizada para fomecer produtos uteis em uma variedade de aplicagoes industrials e outras. Os exemplos de processos para modificar oleo produzido pelos metodos revelados aqui incluem, porem nao sao limitados a, hidrolise do oleo, hidroprocessamento do oleo, e esterificagao do oleo. A modificagao do oleo de microalgas produz oleoqufmicos basicos que podem ser adicionalmente modificados em oleoqufmicos derivados selecionados para uma fungao desejada. Em um modo similar aquele descrito acima com referenda a processos de produgao de combustivel, essas modificagoes quimicas tambem podem ser realizadas em oleos gerados das culturas microbianas descritas aqui. Os exemplos de oleoquimicos basicos incluem, porem nao sao limitados a saboes, acidos graxos, esteres metflicos de acido graxo, e glicerol. Os exemplos de oleoquimicos derivados incluem, porem nao sao limitados a nitrilas graxas, esteres, acidos de dfmero, quats, tensoativos, alcanolamidas graxas, sulfatos de alcool graxo, resinas, emulsificantes, alcoois graxos, olefinas e alcanos mais elevados.
[00292] Hidrolise dos constituintes de acido graxo a partir dos glicerolipideos produzidos pelos metodos da invenção fomece acidos graxos livres que podem ser derivados para produzir outros produtos qufmicos uteis. Hidrolise ocorre na presenga de agua e um catalisador que pode ser um acido ou uma base. Os acidos graxos livres liberados podem ser derivados para fomecer uma variedade de produtos, como relatado nos que se seguem:
[00293] Patentes US Nos. 5.304.664 (Highly sulfated acido graxos); 7.262.158 (Cleansing compositions); 7.115.173 (Fabric softener compositions); 6.342.208 (Emulsions for treating skin); 7.264.886 (Water repellant compositions); 6.924.333 (Paint additives); 6.596.768 (Lipidemiched ruminant feedstock); e 6.380.410 (Surfactants for detergentes and cleaners).
[00294] Com relagao a hidrolise, em uma modalidade da invenção, um oleo de triglicerfdeo e opcionalmente hidrolisado primeiramente em um meio Ifquido como agua ou hidroxido de sodio de modo a obter glicerol e saboes. Ha varios metodos de hidrolise de triglicerfdeo apropriados, incluindo, porem nao limitados a, saponificagao, hidrolise de acido, hidrolise alcalina, hidrolise enzimatica (mencionado aqui como divisao) e hidrolise utilizando agua comprimida quente. Uma pessoa versada na tecnica reconhecera que um oleo de triglicerfdeo nao necessita ser hidrolisado para produzir um oleoqufmico; em vez disso, o oleo pode ser convertido diretamente no oleoqufmico desejado por outro processo conhecido. Por exemplo, o oleo de triglicendeo pode ser diretamente convertido em acido graxo de ester metila atraves de esterificagao.
[00295] Em algumas modalidades, hidrolise catalftica do oleo produzido por metodos revelados aqui ocorre por dividir o oleo em glicerol e acidos graxos. Como discutido acima, os acidos graxos podem ser entao adicionalmente processados atraves de varias outras modificagoes para obter oleoqufmicos derivados. Por exemplo, em uma modalidade os acidos graxos podem ser submetidos a uma reagao de aminagao para produzir compostos de nitrogenio graxo. Em outra modalidade, os acidos graxos podem ser submetidos a ozonolise para produzir acidos mono e dibasicos.
[00296] Em outras modalidades hidrolise pode ocorrer atraves da divisao de oleos produzidos aqui para criar oleoqufmicos. Em algumas modalidades preferidas da invenção, um oleo de triglicendeo pode ser dividido antes que outros processos sejam realizados. Uma pessoa versada na tecnica reconhecera que ha muitos metodos de divisao de triglicendeo apropriados, incluindo, porem nao limitados a, divisao enzimatica e divisao por pressao.
[00297] Genericamente, metodos de divisao de oleo utilizam enzimas, lipases, como biocatalisadores atuando em uma mistura de agua/oleo. A divisao enzimatica entao divide o oleo ou gordura, respectivamente, em glicerol e acidos graxos livres. O glicerol pode entao migrar para a fase de agua ao passo que a fase organica enriquece com acidos graxos livres.
[00298] As reagoes de divisao enzimatica ocorrem genericamente no limite de fase entre fase organica e aquosa, onde a enzima esta presente somente no limite de fase. Triglicendeos que encontram o limite de fase entao contribui para ou participam na reagao de divisao. A medida que a reagao prossegue, a densidade de ocupagao ou concentragao de acidos graxos ainda quimicamente ligados como glicendeos, em comparagao com acidos graxos livres, diminui no limite de fase de modo que a reagao seja diminufda. Em certas modalidades, a divisao enzimatica pode ocorrer em temperatura ambiente. Uma pessoa com conhecimentos comuns na tecnica saberia as condigoes apropriadas para dividir oleo nos acidos graxos desejados.
[00299] Como exemplo, a velocidade de reagao pode ser acelerada por aumentar a superficie de limite de interface. Apos termino da reagao, acidos graxos livres sao entao separados da fase organica liberada da enzima, e o residue que ainda contem acidos graxos quimicamente ligados como glicendeos e realimentado ou reciclado e misturado com oleo novo ou gordura para ser submetido a divisao. Desse modo, glicendeos reciclados sao entao submetidos a um processo de divisao enzimatica adicional. Em algumas modalidades, os acidos graxos livres sao extraidos de um oleo ou gordura parcialmente dividida de tai modo. Desse modo, se os acidos graxos quimicamente ligados (triglicerideos) sao retomados ou realimentados para o processo de divisao, o consume de enzima pode ser drasticamente reduzido.
[00300] O grau de divisao e determinado como a razao do valor acido medido dividido pelo valor acido teoricamente possivel que pode ser computado para um dado oleo ou gordura. Preferivelmente, o valor acido e medido por intermedio de titulagao de acordo com metodos comuns padroes. Alternativamente, a densidade da fase de glicerol aquosa pode ser tomada como uma medida para o grau de divisao.
[00301] Em uma modalidade, o processo de divisao como descrito aqui tambem e adequado para dividir o mono-, die triglicerfdeo que estao contidos no denominado material de sabao dos processos de refinagao alcalina dos oleos produzidos. Desse modo, o material de sabao pode ser quantitativamente convertido sem saponificagao previa dos oleos neutros nos acidos graxos. Para essa finalidade, os acidos graxos sendo quimicamente ligados nos saboes sao liberados, preferivelmente antes da divisao, atraves de uma adigao de acido. Em certas modalidades, uma solugao tampao e utilizada alem de agua e enzima para o processo de divisao.
[00302] Em uma modalidade, oleos produzidos de acordo com os metodos da invenção tambem podem ser submetidos a saponificagao como um metodo de hidrolise. Oleos de animal e planta sao tipicamente feitos de triacilglicerois (TAGs) que sao esteres de acidos graxos com o alcool trudrico, glicerol. Em uma reagao de hidrolise alcalina, o glicerol em um TAG e removido, deixando tres anions carboxflicos que podem associar com os cations de metal alcalino como sodio ou potassio para produzir sais de acido graxo. Nesse esquema, os constituintes de acido carboxflico sao clivados da fragao de glicerol e substituidos com grupos de hidroxila. A quantidade de base (por exemplo, KOH) que e utilizada na reagao e determinada pelo grau desejado de saponificagao. Se o objetivo for, por exemplo, produzir um produto de sabao que compreenda um pouco dos oleos originalmente presentes na composigao de TAG, uma quantidade de base insuficiente para converter todos os TAGS em sais de acido graxo e introduzida na mistura de reagao. Normalmente, essa reagao e executada em uma solugao aquosa e prossegue lentamente, porem pode ser acelerada pela adigao de calor. A precipitagao dos sais de acido graxo pode ser facilitada pela adigao de sais, como haletos de metal alcalino soluveis em agua (por exemplo, NaCl ou KC1), a mistura de reagao. Preferivelmente, a base e um hidroxido de metal alcalino, como NaOH ou KOH. Alternativamente, outras bases como alcanol aminas, incluindo por exemplo trietanol amina e amino metil propanol, podem ser utilizadas no esquema de reagao. Em alguns casos, essas altemativas podem ser preferidas para produzir um produto de sabao transparente.
[00303] Em alguns metodos, a primeira etapa de modificagao qufmica pode ser hidroprocessamento para saturar ligagoes duplas, seguido por desoxigenagao em temperatura elevada na presenga de hidrogenio e um catalisador. Em outros metodos, hidrogenagao e desoxigenagao podem ocorrer na mesma reagao. Ainda em outros metodos desoxigenagao ocorre antes de hidrogenagao. A Isomerizagao pode ser entao opcionalmente executada, tambem na presenga de hidrogenio e um catalisador. Finalmente, gases e componentes de nafta podem ser removidos se desejado. Por exemplo, vide as patentes 5.475.160 (hydrogenation of triglycerides); 5.091.116 (deoxygenation, hydrogenation and gas removal); 6.391.815 (hydrogenation); e 5.888.947 (isomerization).
[00304] Em algumas modalidades da invenção, os oleos de triglicendeo sao parcial ou totalmente desoxigenados. As reagoes de desoxigenagao formam produtos desejados, incluindo, porem nao limitados a, acidos graxos, alcoois graxos, poliois, cetonas e aldefdos. Em geral, sem ser limitado por nenhuma teoria especffica, as reagoes de desoxigenagao envolvem uma combinagao de varias vias de reagao diferentes, incluindo sem limitagao: hidrogenolise, hidrogenagao, hidrogenagao-hidrogenolise consecutiva, hidrogenolise-hidrogenagao consecutiva, e reagoes combinadas de hidrogenagao-hidrogenolise, resultando pelo menos na remogao parcial de oxigenio a partir do acido graxo ou ester de acido graxo para produzir produtos de reagao, como alcoois graxos, que podem ser facilmente convertidos nos produtos qufmicos desejados por processamento adicional. Por exemplo, em uma modalidade, um alcool graxo pode ser convertido em olefinas atraves de reagao de FCC ou em alcanos mais elevados atraves de uma reagao de condensagao.
[00305] Tai modificagao qufmica e hidrogenagao, que e a adigao de hidrogenio a ligagoes duplas nos constituintes de acido graxo de glicerolipfdeos ou de acidos graxos livres. O processo de hidrogenagao permite a transformagao de oleos liquidos em gorduras solidas ou semisolidas, que podem ser mais apropriadas para aplicagoes especfficas.
[00306] Hidrogenagao de oleo produzido pelos metodos descritos aqui pode ser realizada em combinagao com um ou mais dos metodos e/ou materiais fomecidos aqui, como relatado nos que se seguem: patentes US Nos. 7.288.278 (Food additives or medicaments); 5.346.724 (Lubrication products); 5.475.160 (Fatty alcohols); 5.091.116 (Edible oils); 6.808.737 (Structural fats for margarine and spreads); 5.298.637 (Reduced-calorie fat substitutes); 6.391.815 (Hydrogenation catalyst and sulfur adsorbent); 5.233.099 e 5.233.100 (Fatty alcohols); 4.584.139 (Hydrogenation catalysts); 6.057.375 (Foam suppressing agents); e 7.118.773 (Edible emulsion spreads).
[00307] Uma pessoa versada na tecnica reconhecera que varios processos podem ser utilizados para hidrogenar carboidratos. Um metodo apropriado inclui contatar o carboidrato com hidrogenio ou hidrogenio misturado com um gas apropriado e um catalisador sob condigoes suficientes em um reator de hidrogenagao para formar um produto hidrogenado. O catalisador de hidrogenagao pode incluir genericamente Cu, Re, Ni, Fe, Co, Ru, Pd, Rh, Pt, Os, Ir, e ligas ou qualquer combinagao dos mesmos, individualmente ou com promotores como W, Mo, Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, B, P, Bi, e ligas ou qualquer combinagao dos mesmos. Outros materiais de catalisador de hidrogenagao eficazes incluem mquel suportado ou rutenio modificado com renio. Em uma modalidade, o catalisador de hidrogenagao tambem inclui qualquer um dos suportes, dependendo da funcionalidade desejada do catalisador. Os catalisadores de hidrogenagao podem ser preparados por metodos conhecidos por aqueles com conhecimentos comuns na tecnica.
[00308] Em algumas modalidades o catalisador de hidrogenagao inclui um catalisador de metal do Grupo VIII suportado e um material de esponja de metal (por exemplo, um catalisador de mquel de esponja). Niquel Raney prove um exemplo de um catalisador de mquel de esponja ativado apropriado para uso nessa invenção. Em outra modalidade, a reagao de hidrogenagao na invenção e realizada inutilizando um catalisador que compreende um catalisador de mquel-renio ou um catalisador de niquel modificado por tungstenio. Um exemplo de um catalisador apropriado para a reagao de hidrogenagao da invenção e um catalisador de renio-niquel suportado por carbono.
[00309] Em uma modalidade, um catalisador de nlquel Raney apropriado pode ser preparado por tratar uma liga de quantidades aproximadamente iguais em peso de mquel e aluminio com uma solugao alcalina aquosa, por exemplo, contendo aproximadamente 25% em peso de hidroxido de sodio. O aluminio e seletivamente dissolvido pela solugao alcalina aquosa que resulta em um material no formato de esponja compreendendo na maior parte mquel com quantidades menores de alumino. A liga initial inclui metais promotores (isto e, molibdenio ou cromo) na quantidade tai que aproximadamente 1 a 2 por cento em peso permanecem no catalisador de mquel de esponja formado. Em outra modalidade, o catalisador de hidrogenagao e preparado utilizando uma solugao de nitrosil nitrato de rutenio (III), cloreto de rutenio (III) em agua para impregnar um material de suporte apropriado. A solugao e entao seca para formar um solido tendo um teor de agua menor do que aproximadamente 1% em peso. O solido pode ser entao reduzido em pressao atmosferica em um fluxo de hidrogenio a 300°C (nao calcinado) ou 400°C (calcinado) em um fomo de bola giratoria por 4 horas. Apos resfriamento e tomar o catalisador inerte com nitrogenio, 5% em volume de oxigenio em nitrogenio sao passados sobre o catalisador por 2 horas.
[00310] Em certas modalidades, o catalisador descrito inclui um suporte de catalisador. O suporte de catalisador estabiliza e suporta o catalisador. O tipo de suporte de catalisador utilizado depende do catalisador escolhido e das condigoes de reagao. Suportes apropriados para a invenção incluem, porem nao sao limitados a, carbono, silica, sflica-alumina, zirconia, titania, ceria, vanadia, nitreto, nitreto de boro, heteropoliacidos, hidroxiapatita, oxido de zinco, cromia, zeolites, nanotubos de carbono, fluereno de carbono e quaisquer combinagoes dos mesmos.
[00311] Os catalisadores utilizados na presente invenção podem ser preparados utilizando metodos convencionais conhecidos por aqueles versados na tecnica. Metodos apropriados podem incluir, porem nao sao limitados a, umedecimento incipiente, impregnagao evaporativa, deposito de vapor qufmico, revestimento por lavagem, tecnicas de sublimagao catodica de magneton, e similares.
[00312] As condigoes para realizar a reagao de hidrogenagao variarao com base no tipo de material de partida e produtos desejados. Uma pessoa com conhecimentos comuns na tecnica, com o beneffcio dessa revelagao, reconhecera as condigoes de reagao apropriadas. Em geral, a reagao de hidrogenagao e realizada em temperaturas de 80°C a 250°C e preferivelmente em 90°C a 200°C, e mais preferivelmente em 100°C a 150°C. Em algumas modalidades, a reagao de hidrogenagao e realizada em pressoes de 500 KPa a 14000KPa.
[00313] O hidrogenio utilizado na reagao de hidrogenolise da presente invenção pode incluir hidrogenio extemo, hidrogenio reciclado, hidrogenio gerado in situ, e qualquer combinagao dos mesmos. Como utilizado aqui, o termo “hidrogenio extemo” se refere a hidrogenio que nao se origina da propria reagao de biomassa, porem em vez disso e adicionado ao sistema a partir de outra fonte.
[00314] Em algumas modalidades da invenção, e desejavel converter o carboidrato de partida em uma molecula menor que sera mais facilmente convertida em hidrocarbonetos mais elevados desejados. Um metodo apropriado para essa conversao e atraves de uma reagao de hidrogenolise. Varios processos sao conhecidos para executar hidrogenolise de carboidratos. Um metodo apropriado inclui contatar um carboidrato com hidrogenio ou hidrogenio misturado com um gas apropriado e um catalisador de hidrogenolise em um reator de hidrogenolise sob condigoes suficientes para formar um produto de reagao que compreende moleculas menores ou poliois. Como utilizado aqui, o termo “poliois ou moleculas menores” inclui qualquer molecula que tenha um peso molecular menor, que pode incluir um numero menor de atomos de carbono ou atomos de oxigeno do que o carboidrato de partida. Em uma modalidade, os produtos de reagao incluem moleculas menores que incluem poliois e alcoois. Uma pessoa com conhecimentos comuns na tecnica seria capaz de escolher o metodo apropriado pelo qual realizar a reagao de hidrogenolise.
[00315] Em algumas modalidades, um agucar com 5 e/ou 6 carbonos ou alcool de agucar pode ser convertido em propileno glicol, etileno glicol, e glicerol utilizando um catalisador de hidrogenolise. O catalisador de hidrogenolise pode incluir Cr, Mo, W, Re, Mn, Cu, Cd, Fe, Co, Ni, Pt, Pd, Rh, Ru, Ir, Os, e ligas ou qualquer combinagao dos mesmos, individualmente ou com promotores como Au, Ag, Cr, Zn, Mn, Sn, Bi, B, O, e ligas ou qualquer combinagao dos mesmos. O catalisador de hidrogenolise pode incluir tambem um catalisador de piropolfmero carbonaceo contendo metais de transigao (por exemplo, cromo, molibdenio, tungstenio, renio, manganes, cobre, cadmio) ou metais do grupo VIII (por exemplo, ferro, cobalto, mquel, platina, paladio, rodio, rutenio, indio e osmio). Em certas modalidades, o catalisador de hidrogenolise pode incluir qualquer dos metais acima combinados com um oxido de metal alcalino terroso ou aderido a um suporte cataliticamente ativo. Em certas modalidades, o catalisador descrito na reagao de hidrogenolise pode incluir um suporte de catalisador como descrito acima para a reagao de hidrogenagao.
[00316] As condigoes para realizar a reagao de hidrogenolise variarao com base no tipo de material de partida e produtos desejados. Uma pessoa com conhecimentos comuns na tecnica, com o beneffcio dessa revelagao, reconhecera as condigoes apropriadas para utilizar para realizar a reagao. Em geral, a reagao de hidrogenolise e conduzida em temperaturas de 110°C a 300°C, e preferivelmente em 170°C a 220°C, e mais preferivelmente em 200°C a 225°C. Em algumas modalidades, a reagao de hidrogenolise e conduzida sob condigoes basicas, preferivelmente em um pH de 8 a 13, e ainda mais preferivelmente em um pH de 10 a 12. Em algumas modalidades, a reagao de hidrogenolise e conduzida em pressoes em uma faixa entre 60 KPa e 16500 KPa, e preferivelmente em uma faixa entre 1700 KPa e 14000 KPa, e ainda mais preferivelmente entre 4800 KPa e 11000 KPa.
[00317] O hidrogenio utilizado na reagao de hidrogenolise da presente invenção pode incluir hidrogenio extemo, hidrogenio reciclado, hidrogenio gerado in situ e qualquer combinagao dos mesmos.
[00318] Em algumas modalidades, os produtos de reagao discutidos acima podem ser convertidos em hidrocarbonetos mais elevados atraves de uma reagao de condensagao em um reator de condensagao (mostrado esquematicamente como reator de condensagao 110 na figura 1). Em tais modalidades, a condensagao dos produtos de reagao ocorre na presenga de um catalisador capaz de formar hidrocarbonetos mais elevados. Embora nao desejando ser limitado por teoria, acredita-se que a produgao de hidrocarbonetos mais elevados proceda atraves de uma reagao de adigao em etapas incluindo a formagao de ligagao de carbono-carbono ou carbonooxigenio. Os produtos de reagao resultantes incluem qualquer numero de compostos contendo essas fragoes, como descrito em mais detalhe abaixo.
[00319] Em certas modalidades, catalisadores de condensagao apropriados incluem um catalisador de acido, um catalisador de base, ou um catalisador de acido/base. Como utilizado aqui, o termo “catalisador de acido/base” se refere a um catalisador que tenha uma funcionalidade tanto de acido como de base. Em algumas modalidades o catalisador de condensagao pode incluir, sem limitagao, zeolitos, carbetos, nitretos, zirconia, alumina, silica, aluminossilicatos, fosfatos, oxidos de titanio, oxidos de zinco, oxidos de vanadio, oxidos de lantanio, oxidos de itrio, oxidos de escandio, oxidos de magnesio, oxidos de cerio, oxidos de bario, oxidos de calcio, hidroxidos, heteropoliacidos, acidos inorganicos, resinas modificadas por acido, resinas modificadas por base, e qualquer combinagao dos mesmos. Em algumas modalidades, o catalisador de condensagao pode incluir tambem um modificador. Modificadores apropriados incluem La, Y, Sc, P, B, Bi, Li, Na, K, Rb, Cs, Mg, Ca, Sr, Ba, e qualquer combinagao dos mesmos. Em algumas modalidades, o catalisador de condensagao pode incluir tambem um metal. Metais apropriados incluem Cu, Ag, Au, Pt, Ni, Fe, Co, Ru, Zn, Cd, Ga, In, Rh, Pd, Ir, Re, Mn, Cr, Mo, W, Sn, Os, ligas, e qualquer combinagao dos mesmos.
[00320] Em certas modalidades, o catalisador descrito na reagao de condensagao pode incluir um suporte de catalisador como descrito acima para a reagao de hidrogenagao. Em certas modalidades, o catalisador de condensagao e de auto-sustentagao. Como utilizado aqui, o termo “autosustentagao” significa que o catalisador nao necessita de outro material para servir como suporte. Em outras modalidades, o catalisador de condensagao e utilizado em combinagao com um suporte separado apropriado para suspender o catalisador. Em uma modalidade, o suporte de catalisador de condensagao e silica.
[00321] As condigoes sob as quais a reagao de condensagao ocorre variagao com base no tipo de material de parida e produtos desejados. Uma pessoa com conhecimentos comuns, com o beneficio dessa revelagao, reconhecera as condigoes apropriadas a utilizar para realizar a reagao. Em algumas modalidades, a reagao de condensagao e realizada em uma temperatura na qual a termodinamica para a reagao proposta e favoravel. A temperatura para a reagao de condensagao variara dependendo do poliol ou alcool de partida especifico. Em algumas modalidades, a temperatura para a reagao de condensagao esta compreendida em uma faixa de 80°C a 500°C, e preferivelmente de 125°C a 450°c, e mais preferivelmente de 125°C a 250°C. Em algumas modalidades, a reagao de condensagao e conduzida em pressoes em uma faixa entre 0 KPa a 9000 KPa, e preferivelmente em uma faixa entre 0 KPa e 7000 KPa, e ainda mais preferivelmente entre 0 KPa e 5000 KPa.
[00322] Os alcanos mais elevados formados pela invenção incluem, porem nao sao limitados a, alcanos de cadeia reta ou ramificada que tem de 4 a 30 atomos de carbono, alcenos de cadeia reta ou ramificada que tem de 4 a 30 atomos de carbono, cicloalcanos que tem de 5 a 30 atomos de carbono, cicloalcenos que tem de 5 a 30 atomos de carbono, arilas, arilas fundidas, alcoois, e cetonas. Alcanos apropriados incluem, porem nao sao limitados a, butano, pentano, penteno, 2-metil butano, hexano, hexeno, 2-metil pentano, 3metil pentano, 2,2-dimetil butano, 2,3-dimetil butano, heptano, hepteno, octano, octeno, 2,2,4-trimetil pentano, 2,3-dimetil hexano, 2,3,4-trimetil pentano, 2,3-dimetil pentano, nonano, noneno, decano, deceno, undecano, undeceno, dodecano, dodeceno, tridecano, trideceno, tetradecano, tetradeceno, pentadecano, pentadeceno, nonildecano, nonildeceno, eicosano, eicoseno, uneicosano, uneicoseno, doeicosano, doeicoseno, trieicosano, trieicoseno, tetraeiocosano, tetraeicoseno e isomeros dos mesmos. Alguns desses produtos podem ser apropriados para uso como combustlveis.
[00323] Em algumas modalidades, os cicloalcanos e os cicloalcenos sao nao substituldos. Em outras modalidades, os cicloalcanos e cicloalcenos sao mono-substituldos. Ainda em outras modalidades, os cicloalcanos e cicloalcenos sao multi-substituldos. Nas modalidades que compreendem os cicloalcanos e cicloalcenos substituldos, o grupo substituldo inclui, sem limitagao, uma alquila de cadeia reta ou ramificada tendo 1 a 12 atomos de carbono, um alquileno de cadeia reta ou ramificada tendo 1 a 12 atomos de carbono, uma fenila, e qualquer combinagao dos mesmos. Cicloalcanos e cicloalcenos apropriados incluem, porem nao sao limitados a, ciclopentano, ciclopenteno, cicloexano, cicloexeno, metil-ciclopentano, metil-ciclopenteno, etil-ciclopentano, etil-ciclopenteno, etil-cicloexano, etil-cicloexeno, isomeros e qualquer combinagao dos mesmos.
[00324] Em algumas modalidades, as arilas formadas sao nao substitufdas. Em outra modalidade, as arilas formadas sao mono-substituidas. Nas modalidades compreendendo as arilas substitufdas, o grupo substitufdo inclui, sem limitagao, uma alquila de cadeia reta ou ramificada tendo 1 a 12 atomos de carbono, um alquileno de cadeia ramificada ou reta tendo 1 a 12 atomos de carbono, uma fenila, e qualquer combinagao dos mesmos. Arilas apropriadas para a invenção incluem, porem nao sao limitadas a benzeno, tolueno, xileno, etil benzeno, para xileno, meta xileno e qualquer combinagao dos mesmos.
[00325] Os alcoois produzidos na invenção tern de 4 a 30 atomos de carbono. Em algumas modalidades, os alcoois sao cfclicos. Em outras modalidades, os alcoois sao ramificados. Em outra modalidade, os alcoois sao de cadeia reta. Alcoois apropriados para a invenção incluem, porem nao sao limitados a, butanol, pentanol, hexanol, heptanol, octanol, nonanol, decanol, undecanol, dodecanol, tridecanol, tetradecanol, pentadecanol, hexadecanol, heptil decanol, octil decanol, nonil decanol, eicosanol, uneicosanol, doeicosanol, trieicosanol, tetraeicosanol e isomeros dos mesmos.
[00326] As cetonas produzidas na invenção tern de 4 a 30 atomos de carbono. Em uma modalidade, as cetonas sao ciclicas. Em outra modalidade, as cetonas sao ramificadas. Em outra modalidade, as cetonas sao de cadeia reta. Cetonas apropriadas para a invenção incluem, porem nao sao limitadas a, butanona, pentanona, hexanona, heptanona, octanona, nonanona, decanona, undecanona, dodecanona, tridecanona, tetradecaona, pentadecanona, hexadecanona, heptil decanona, octil decanona, nonil decanona, eicosanona, uneicosanona, doeicosanona, trieicosanona, tetraeicosanona e isomeros dos mesmos.
[00327] Outra tai modificagao qufmica e interesterificagao. Glicerolipideos produzidos naturalmente nao tern uma distribuigao uniforme de constituintes de acido graxo. No contexto de oleos, interesterificagao se refere a permuta de radicals de acila entre dois esteres de glicerolipideos diferentes. O processo de interesterificagao prove um mecanismo pelo qual os constituintes de acido graxo de uma mistura de glicerolipideos podem ser reorganizados para modificar o padrao de distribuigao. Interesterificagao e um processo qufmico bem conhecido, e compreende genericamente aquecer (ate aproximadamente 200°C) uma mistura de oleos por um periodo (por exemplo, 30 minutos) na presenga de um catalisador, como um metal alcalino ou alquilato de metal alcalino (por exemplo, metoxido de sodio). Esse processo pode ser utilizado para randomizar o padrao de distribuigao dos constituintes de acido graxo de uma mistura de oleo, ou pode ser dirigido a produgao de um padrao de distribuigao desejado. Esse metodo de modificagao quimica de lipfdeos pode ser realizado em materiais fomecidos aqui, como biomassa microbiana com uma percentagem de peso de celula seca como lipideo de pelo menos 20%.
[00328] Interesterificagao dirigida, na qual um padrao de distribuigao especifico de acidos graxos e buscado, pode ser realizada por manter a mistura de oleo em uma temperatura abaixo do ponto de fusao de alguns TAGs que pode ocorrer. Isso resulta em cristalizagao seletiva desses TAGs, que remove eficazmente os mesmos da mistura de reagao a medida que cristalizam. O processo pode ser continuado ate que grande parte dos acidos graxos no oleo tenham precipitado, por exemplo. Um processo de interesterificagao dirigida pode ser utilizado, por exemplo, para produzir um produto com um teor mais baixo de caloria atraves da substituigao de acidos graxos de cadeia mais longa com copias de cadeia mais curta. Interesterificagao dirigida tambem pode ser utilizada para produzir um produto com uma mistura de gorduras que pode fomecer caractensticas de fusao e caractensticas estruturais desejadas procuradas em aditivos alimentfcios ou produtos (por exemplo, margarina) sem recorrer a hidrogenagao, que pode produzir trans isomeros indesejaveis.
[00329] Interesterificagao de oleos produzidos pelos metodos descritos aqui pode ser realizada em combinagao com um ou mais dos metodos e/ou materiais, ou produzir produtos, como relatado nos que se seguem: patentes US Nos. 6.080.853 (Nondigestible fat substitutes); 4.288.378 (Peanut butter stabilizer); 5.391.383 (Edible spray oil); 6.022.577 (Edible fats for food products); 5.434.278 (Edible fats for food products); 5.268.192 (Low calorie nut products); 5.258.197 (Reduce calorie edible compositions); 4.335.156 (Edible fat product); 7.288.278 (Food additives or medicaments); 7.115.760 (Fractionation process); 6.808.737 (Structural fats); 5.888.947 (Engine lubricants); 5.686.131 (Edible oil mixtures); e 4.603.188 (Curable urethane compositions).
[00330] Em uma modalidade de acordo com a invenção, transesterificagao do oleo, como descrito acima, e seguida por reagao do produto transesterificado com poliol, como relatado na patente US 6.465.642, para produzir poliesteres de acido graxo de poliol. Tai processo de separagao e esterificagao pode compreender as etapas como a seguir: reagir um ester de alquila inferior com poliol na presenga de sabao; remover sabao residual da mistura de produto; lavar com agua e secar a mistura de produto para remover impurezas; branquear a mistura de produto para refinamento; separar pelo menos uma porgao do ester de alquila inferior nao reagido do poliester de acido graxo de poliol na mistura de produto; e reciclar o ester de alquila inferior nao reagido separado.
[00331] A transesterificagao pode ser tambem realizada em biomassa microbiana com esteres de acido graxo de cadeia curta, como relatado na patente US 6.278.006. Em geral, a transesterificagao pode ser realizada por adicionar um ester de acido graxo de cadeia curta a um oleo na presenga de um catalisador apropriado e aquecer a mistura. Em algumas modalidades, o oleo compreende aproximadamente 5% a aproximadamente 90% da mistura de reagao em peso. Em algumas modalidades, os esteres de acido graxo de cadeia curta podem ser aproximadamente 10% a aproximadamente 50% da mistura de reagao em peso. Exemplos nao limitadores de catalisadores incluem catalisadores de base, metoxido de sodio, catalisadores de acido incluindo acido inorganicos como acido sulfurico e argilas acidificadas, acidos organicos como acido metano sulfonico, acido benzeno sulfonico, e acido tolueno sulfonico, e resinas acidas como Amberlyst 15, Metais como sodio e magnesio, e hidretos de metal tambem sao catalisadores uteis.
[00332] Outra modificagao quimica e hidroxilagao, que envolve a adigao de agua a uma ligagao dupla resultando em saturagao e incorporagao de uma fragao de hidroxila. O processo de hidroxilagao prove um mecanismo para converter um ou mais constituintes de acido graxo de um glicerolipfdeo em um acido graxo hidroxi. Hidroxilagao pode ser realizada, por exemplo, atraves do metodo relatado na patente US 5.576.027, acidos graxos hidroxilados, incluindo oleo de mamona e seus derivados, sao uteis como componentes em varias aplicagoes industrials, incluindo aditivos alimentfcios, tensoativos, agentes umectantes de pigmentos, agentes de desespumar, aditivos a prova de agua, agentes de plastificagao, agentes emulsificantes e/ou desodorantes cosmeticos, bem como em eletronica, produtos farmaceuticos, tintas, pinturas, adesivos e lubrificantes. Um exemplo de como a hidroxilagao de um glicendeo pode ser realizada e como a seguir: gordura pode ser aquecida, preferivelmente a aproximadamente 30 a 50°C combinada com heptano e mantida em temperatura por trinta minutos ou mais; acido acetico pode ser entao adicionado a mistura seguido por uma solugao aquosa de acido sulfurico seguido por uma solugao de peroxido de hidrogenio aquosa que e adicionada em pequenos incrementos a mistura durante uma hora; apos o peroxido de hidrogenio aquoso, a temperatura pode ser entao aumentada para pelo menos aproximadamente 60°C e agitada por pelo menos seis horas; apos a agitagao, a mistura e deixada assentar e uma camada aquosa inferior formada pela reagao pode ser removida enquanto a camada de heptano superior formada pela reagao pode ser lavada com agua quente tendo uma temperatura de aproximadamente 60°C; a camada de heptano lavada pode ser entao neutralizada com uma solugao de hidroxido de potassio aquosa a um pH de aproximadamente 5 a 7 e entao removida por destilagao a vacuo; o produto de reagao pode ser entao seco a vacuo a 100°C e o produto seco desodorizado a vapor sob condigoes a vacuo e filtrado a aproximadamente 50° ate 60° utilizando terra diatomacea.
[00333] Hidroxilagao de oleos microbianos produzidos pelos metodos descritos aqui podem ser realizados em combinagao com um ou mais dos metodos e/ou materiais, ou produzir produtos como relatado a seguir: patentes US 6.590.113 (Oil-based coatings and ink); 4.049.724 (Hydroxylation process); 6.113.971 (Olive oil butter); 4.992.189 (Lubricants and lube additives); 5.576.027 (Hydroxylated milk); 6.869.597 (Cosmetics).
[00334] Glicerolipideos hidroxilados podem ser convertidos em estolides. Estolides consistem em um glicerolipfdeo no qual um constituinte de acido graxo hidroxilado foi esterificado com outra molecula de acido graxo. A conversao de glicerolipideos hidroxilados em estolides pode ser realizada por aquecer uma mistura de glicerolipideos e acidos graxos e contatar a mistura com um acido mineral, como descrito por Isbell e outros, JAOCS 71(2): 169-174 (1994). Estolides sao uteis em uma variedade de aplicagoes, incluindo sem limitagao aquelas relatadas a seguir: patentes US 7.196.124 (Elastomeric materials and floor coverings); 5.458.795 (Thickened oils for high-temperature applications); 5.451.332 (Fluids for industrial applications); 5.427.704 (Fuel additives); e 5.380.894 (Lubricants, greases, plasticizers, and printing inks).
[00335] Outras reagoes quimicas que podem ser realizadas em oleos microbianos incluem reagir triacilglicerois com um agente de ciclopropanagao para aumentar a fluidez e/ou estabilidade oxidativa, como relatado na patente US 6.051.539; fabricagao de ceras de triacilglicerois, como relatado na patente US 6.770.104; e epoxidagao de triacilglicerois, como relatado em "The effect of acido graxo composition on the acrylation kinetics of epoxidized triacylglycerols", Journal of the American Oil Chemists' Society, 79:1, 59-63, (2001) e Free Radical Biology and Medicine, 37:1, 104-114 (2004).
[00336] A geragao de biomassa microbiana que contem oleo para combustivel e produtos qufmicos como descrito acima resulta na produgao de farelo de biomassa deslipidado. Farelo deslipidado e um subproduto de preparar oleo de algas e e util como ragao de animais para animais de fazenda, por exemplo, ruminantes, aves, sufnos e aquicultura. O farelo resultante, embora de teor reduzido de oleo, ainda contem protemas de qualidade elevada, carboidratos, fibra, cinza, oleo residual e outros nutrientes apropriados para uma ragao de animais. Como as celulas sao predominantemente lisadas pelo processo de separagao de oleo, o farelo deslipidado e facilmente digenvel por tais animais. Farelo deslipidado pode ser opcionalmente combinado com outros ingredientes, como grao, em uma ragao de animais. Como farelo deslipidado tern uma consistencia em po, pode ser prensado em pelotas utilizando um meio de extrusao ou expansor ou outro tipo de maquina, que sao comercialmente disponfveis.
[00337] A invenção, tendo sido descrita em detalhe acima, e exemplificada nos seguintes exemplos, que sao oferecidos para ilustrar, porem nao limitar, a invenção reivindica.
VII. EXEMPLOS EXEMPLO 1: Metodos para cultivar Prototheca
[00338] Cepas de Prototheca foram cultivadas para obter uma elevada percentagem de oleo por peso de celula seca. Celulas criopreservadas foram descongeladas em temperatura ambiente e 500 ul de celulas foram adicionadas a 4,5 ml de meio (4,2 g/L K2HPO4, 3,1 g/L NaH2PO4, 0,24 g/L MgSO4-7H2O, 0,25 g/L monoidrato de acido citrico, 0,025 g/L CaCL 2H2O, 2g/L extrato de levedura) mais 2% glicose e crescidas por 7 dias a 28°C com agitagao (200 rpm) em uma placa de 6 cavidades. Pesos de celula seca foram determinados por centrifugar 1 ml de cultura a 14.000 rpm por 5 min. Em um tubo Eppendorf pre-pesado. O sobrenadante de cultura foi descartado e a pelota de celula resultante lavada com 1 ml de agua deionizada. A cultura foi novamente centrifugada, o sobrenadante descartado, e as pelotas de celula colocadas a -80°C ate congelarem. As amostras foram entao liofilizadas por 24 h e pesos de celula seca calculados. Para determinagao do total de lipfdeos em culturas, 3 ml de cultura foram removidos e submetidos a analise utilizando um sistema Ankom (Ankon Inc., Macedon, NY) de acordo com o protocolo do fabricante. Amostras foram submetidas a extragao de solvente com um extrator Amkom XT 10 de acordo com o protocolo do fabricante. O total de lipfdeos foi determinado como a diferenga em massa entre amostras secas hidrolisadas por acido e amostras secas, extraidas com solvente. As medigoes de percentagem de peso de celula seca de oleo sao mostradas na Tabela 8. Tabela 8. Percentagem de oleo por peso de celula
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[00339] Amostras de microalgas das cepas listadas na Tabela 22 acima foram genotipadas. DNA genomico foi isolado de biomassa de algas com a seguir. Celulas (aproximadamente 200 mg) foram centrifugadas de culturas liquidas 5 minutos a 14.000 x g. Celulas foram entao ressuspensas em agua destilada esteril, centrifugadas 5 minutos a 14.000 x g e o sobrenadante descartado. Uma unica conta de vidro ~2 mm de diametro foi adicionada a biomassa e tubos foram colocados em -80°C por pelo menos 15 minutos. As amostras foram removidas e 150 |ul de tampao de trituragao (1% Sarkosyl, 0,25 M sacarose, 50 mM NaCl, 20 mM EDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, RNase A 0,5 ug/ul) foram adicionados. As pelotas foram ressuspensas por vortice brevemente, seguido pela adigao de 40 ul de 5M NaCl. As amostras foram submetidas a vortice brevemente, seguido pela adigao de 66 ul de CT AB a 5% (brometo de trimetilamonio de cetila) e um vortice breve final. Amostras foram a seguir incubadas a 65°C por 10 minutos apos o que foram centrifugadas a 14,000 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi transferido para um tubo novo e extrafdo uma vez com 300 p 1 de Fenol: cloroformio: alcool de isoamila 12:12:1, seguido por centrifugagao por 5 minutos a 14.000 x g. A fase aquosa resultante foi transferida para um tubo novo contendo 0,7 vol. De isopropanol (-190 pl), misturada por inversao e incubada em temperatura ambiente por 30 minutos ou durante a noite a 4°C. DNA foi recuperado atraves de centrifugagao a 14,000 x por 10 minutos. A pelota resultante foi entao lavada duas vezes com etanol a 70%, seguido por uma lavagem final com etanol a 100%. Pelotas foram secas em ar por 20 a 30 minutos em temperatura ambiente seguido por ressuspensao em 50 pl de 10 mM TrisCi, 1 mM EDTA (pH 8,0).
[00340] Cinco pl de DNA de algas total, preparado como descrito acima, foram diluidos 1:50 em 10 mM Tris, pH 8,0. Reagoes de PCR, volume final 20 pl, foram montadas como a seguir. Dez pl de 2 x iProof HF master mix (BIO-RAD) foram adicionados a 0,4 pl iniciador SZ02613 (5’TGTTGAAGAATGAGCCGGCGAC-3’ (SEQ ID NO:9) em lOmM concentragao de estoque). Essa sequencia iniciadora se estende da posigao 567-588 no numero de acessao Gen Bank L43357 e e altamente conservada em plantas superiores e genomas de plastfdio de algas. Isso foi seguido pela adigao de 0,4 pl iniciador SZ02615 (5’-CAGTGAGCTATTACGCACTC-3’ (SEQ ID NO: 10) em 10 mM de concentragao de estoque). Essa sequencia iniciadora e complementar a posigao 1112-1093 no. De acessao de Gen Bank L43357 e e altamente conservada em plantas superiores e genomas de plastfdio de algas. A seguir 5 pl de DNA total diluido e 3,2 pl de dH2O foram adicionados. Reales de PCR foram feitas como a seguir: 98°C, 45”; 98°C, 8”; 53°C, 12”; 72°C, 20” por 35 ciclos seguido por 72°C por 1 min. e retendo a 25°C. Para purificagao de produtos PCR, 20 pl de 10 mM Tris, pH 8,0, foi adicionado a cada reagao, seguido por extragao com 40 pl de fenol:cloroformio:alcool de isoamila 12:12:1, submetendo a vortice e centrifugando a 14,000 x g por 5 minutos. Reagoes de PCR foram aplicadas a colunas S-400 (GE Healthcare) e centrifugadas por 2 minutos a 3,000 x g. Produtos PCR purificados foram subseqiientemente clonados TOPO em PCR8/GW/TOPO e clones positives selecionados para placas LB/Spec. DNA de plasmfdeo purificado foi sequenciado nas duas diregoes utilizando iniciadores avangado e inverso M13, No total, doze cepas de Prototheca foram selecionadas para ter seu DNA rRNA 23 S sequenciado e as sequencias sao listadas na Listagem de sequencias. Um sumario das cepas e Numeros de listagem de sequencias e incluida abaixo. As sequencias foram analisadas para divergencia geral da sequencia UTEX 1435 (SEQ ID NO: 15). Dois pares emergiram (UTEX 329/UTEX 1533 e UTEX 329/UTEX 1440) como os mais divergentes. Nos dois casos, alinhamento em pares resultou em 75,0% de identidade de sequencia em pares. A percentagem de identidade de sequencia para UTEX 1435 tambem e inclufda abaixo.
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[00341] Amostras de lipideo de um subconjunto das cepas acima listadas foram analisadas para perfil de lipfdeo utilizando HPLC. Os resultados sao mostrados abaixo na tabela 9. Tabela 9. Diversidade de cadeias de lipfdeo em especie de microalgas
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[00342] Peptfdeos de transito de plastfdio de algas foram identificadas atraves da analise de bibliotecas de cDNA de UTEX 1435 (Prototheca moriformis) ou UTEX 250 (Chlorella protothecoides) como descrito nos exemplos 12 e exemplo 11 abaixo. cDNAs codificando proteinas potencialmente direcionadas ao plastfdio com base em homologia de hit BLAST para outras proteinas direcionadas ao plastfdio conhecidas foram submetidas a analise adicional pelos programas de software PSORT (http://psort.ims.u-tokyo.ac.jp/form.html), ChloroP (http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/) sao TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/) . Peptfdeos de transito de plastfdio candidatos identificados atraves de pelo menos um desses tres programas foram entao amplificados em PCR do DNA genomico apropriado. Abaixo esta um sumario das sequencias de aminoacidos sequencias de direcionamento de plastfdio de algas (PTS) que foram identificadas a partir dessa selegao. Sao tambem incluidas as sequencias de aminoacidos de tioesterases ACP-acila graxa de planta que sao utilizadas nos exemplos de expressao heterologa abaixo.
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EXEMPLO 2: cultivo de Prototheca em varios insumos A. Sorgo
[00343] As seguintes cepas mostraram ser capazes de utilizar sorgo como uma fonte de carbono unica: cepas de Prototheca moriformis UTEX 1435, UTEX 1437, UTEX 288, UTEX 1439, UTEX 1441 e UTEX 1434,e cepa Prototheca stag no ran UTEX 1442, A designagao “UTEX” indica o numero de cepa a partir da colegao de cultura de algas da Universidade de Texas, 1 University State A6700, Austin, Texas 78712-0183.
[00344] Sorgo puro foi adquirido de Maasdam Sorghum Mills (Lynnville, Iowa) com um perfil de agucar de frutose 21,0% peso/peso, dextrose 28,0% peso/peso, sacarose 16,0% peso/peso e maltose <0,5% peso/peso. As culturas foram cultivadas em meio liquido contendo 2%, 5%, ou 7% (v/v) de sorgo puro (dilufdo a partir do material puro) como a unica fonte de carbono e as culturas foram cultivadas heterotroficamente no escuro, agitando a -350 rpm. As amostras a partir das culturas foram retiradas em 24, 40, 48, 67 e 89 horas e o crescimento foi medido utilizando leituras A750 em um espectrofotometro. 0 crescimento foi observado para cada das cepas testadas como mostrado nas figures 1-2.
B. Celulose
[00345] Forragem de milho explodida, umida, Miscanthus, sorgo de forragem, polpa de beterraba e bagago de cana de agucar foram preparados pelo The National Renewable Energy Laboratory (Golden, CO) por cozinhar em uma solugao de acido sulfurico a 1,4% e desidratar a pasta resultante. As percentagens de solidos foram determinadas gravimetricamente por secagem e foram como a seguir: forragem de milho, 25% de solidos; Miscanthus, 28,7% de solidos; sorgo de forragem, 26,7% de solidos; e bagago de cana de agucar, 26% de solidos.
[00346] Amostras umidas de 100 gramas de materiais celulosicos explodidos (forragem de milho ou switch Grass) foram ressuspensas em agua deionizada ate um volume final de 420 mL e o pH foi ajustado para 4,8 utilizando 10N NaOH. Para polpa de beterraba, 9,8 gramas de solidos secos foram levados ate 350 mL com agua deionizada e pH foi ajustado para 4,8 com 10 N NaOH. Para todos os insumos acima, Accellerase 1000 (Genencor, Nova York) foi utilizado em uma razao de 0,25 ml de enzima por grama de biomassa seca para sacarificagao dos materiais celulosicos. As amostras foram incubadas com agitagao (110 rpm) a 50°C por 72 horas. O pH de cada das amostras foi ajustado para 7,0 com NaOH (com alteragao de volume desprezfvel), esterilizados com filtro atraves de um filtro de 0,22 |iim e utilizado nos processos detalhados abaixo. Para processos em escala maior, o mesmo procedimento para sacarificagao foi seguido exceto que uma etapa adicional de filtragao de fluxo tangential ( IFF) ou etapa de microfiltragao foi realizada para auxiliar na esterilizagao de filtro de insumos. Uma amostra de cada dos insumos preparada foi reservada para determinagao de concentragao de glicose e xilose utilizando um sistema baseado em HPLC/ELSD ou um kit baseado em hexocinase (Sigma). Adicionalmente, para polpa de beterraba, o material foi inicialmente levado ate o volume como com os outros insumos, o pH foi entao ajustado para 4,0 e um tratamento de pectinase foi realizado a 50°C por 24 horas. O pH foi entao ajustado para 4,8 se nenhuma etapa de lavagem foi conduzida ou 5,3 se etapas de lavagem foram conduzidas. Sacarificagao enzimatica foi entao realizada com o mesmo procedimento utilizado para os outros insumos como descrito acima.
[00347] A cepa Prototheca moriformis de microalgas UTEX 1435 foi avaliada em relagao a sua capacidade de crescer em uma serie de insumos celulosicos preparados como descrito acima (forragem de milho, polpa de beterraba, cana de sorgo, Miscanthus e controle de glicose). A cultura de microalgas foi cultivada em condigoes descritas no exemplo 1 acima com a excegao da fonte de carbono. A fonte de carbono era 4% de glicose (para condigoes de controle) ou 4% de glicose como medido por glicose dispomvel nos materiais celulosicos. O crescimento foi avaliado por leituras A750 e o tempo de cultivo foi de 168 horas, com leituras A750 em 48, 72, 96, 120, 144 e 168 horas apos iniciagao da cultura. Como pode ser visto na figura 7a, a cultura de Prototheca moriformis cresceu melhor em forragem de milho. Os outros insumos celulosicos utilizados, Miscanthus, cana de sorgo e polpa de beterraba, apresentaram todos, inibigao de crescimento.
[00348] Com base nos resultados acima com agucares celulosicos derivados de forragem de milho, acumulo de lipideo foi tambem avaliado em Prototheca moriformis utilizando mveis diferente de agucares celulosicos derivados de forragem de milho e glicose de reagente como controle. Culturas foram crescidas em 18g/L de glicose que era totalmente de agucares celulosicos derivados de forragem de milho (condigao de 100% de forragem de milho na figura 7b), 9g/L glicose de agucares celulosicos derivados de forragem de milho suplementados com 9g/L de glicose reagente (50% de forragem de milho suplementados com glicose a 180 g/L condigao na figura 7b); 9g/L de glicose de agucares celulosicos derivados de forragem de milho (50% de forragem de milho, nao suplementado; e 13 g/L de xilose reagente para controle de osmolaridade. Todas as culturas foram alimentadas com agucares celulosicos para manter a concentragao de glicose em 20 g/L, exceto para a cultura de controle, que foi alimentada com glicose reagente para manter a concentragao de glicose em 20 g/L. o crescimento foi medido com base no peso de celula seca da cultura e produtividade de lipfdeo foi determinada como uma percentagem de peso de celula seca. O total de lipfdeos foi determinado gravimetricamente utilizando um sistema de extragao de solvente/hidrolise de acido Ankom como descrito no exemplo 1 acima.
[00349] Como pode ser visto na figura 7b, com base em acumulo de biomassa (como medido por DCW), todas as concentragoes dos celulosicos derivados de forragem de milho excederam em desempenho (DCW mais elevado) o meio de controle que foi alimentado com glicose apenas. A produgao de lipfdeo como uma percentagem de DCW foi tambem calculada para todas as condigoes. Alem do acumulo de biomassa mais elevada visto para crescimento em forragem de milho, o acumulo de lipfdeo tambem foi mais elevado nas condigoes de celulosicos derivados de forragem de milho em comparagao com a condigao de controle de glicose. Esses dados demonstram que alem de fomecer agucares derivados de celulosico, forragem de milho prove nutrientes/componentes adicionais que contribuem para um acumulo aumentado de biomassa (crescimento) e rendimento de produto aumentado.
[00350] Como os insumos celulosicos contem componentes alem de glicose, alguns desses componentes adicionais podem acumular ate nfveis indesejaveis durante cultura a medida que mais agucares derivados de celulosico sao alimentados na cultura quando a fonte de carbono principal (normalmente, porem nao limitado a, glicose) e consumida. Por exemplo, a xilose presente no insumo de agucar derivado de celulosico pode acumular durante o cultivo em alta densidade de microalgas a nfveis inibidores para crescimento e produgao de produto final. Para testar os efeitos de acumulo de xilose durante cultivo de Prototheca, culturas foram cultivadas com 4% de glicose no meio e suplementadas com 0, 10 g/L, 25 g/L, 50 g/L e 100 g/L de xilose. Apos 6 dias de cultura, crescimento e acumulo de lipfdeos foram avaliados utilizando os metodos descritos acima. Como visto na Figura 7c, surpreendentemente, as concentragoes mais elevadas de xilose testada nao foram inibidoras para a capacidade de Prototheca moriformis crescer e acumular lipideo, e a cultura na realidade cresceu melhor e acumulou mais lipfdeos nas concentragoes mais elevadas de xilose. Para explorar esse fenomeno, um experimento similar foi realizado com sacarose, uma fonte de carbono que Prototheca moriformis do tipo selvagem e incapaz de metabolizar. Nenhum impacto positive foi observado com sacarose, sugerindo que o acumulo de lipfdeos e crescimento aumentado vistos com xilose sao atribuiveis a um mecanismo diferente da tensao osmotica de concentragoes elevadas de componentes nao metabolizados no meio e e especifico de xilose.
[00351] Alem de agucares nao metabolizados, sais podem acumular ate niveis inibidores como resultado de concentrar agucares derivados de lignocelulosico. Devido a etapa de hidrolise de acido com H2SO4 durante a preparagao tfpica de materiais celulosicos seguida por neutralizagao do acido com NaOH, Na2SO4 e formado durante a geragao de agucares lignocelulosicos. Para avaliar o impacto de concentragao de sal em crescimento e produgao de lipideo, culturas de Prototheca moriformis foram crescidas em concentragoes de Na2SO4 variando de 0-700 mM em meio suplementado com 4% de glicose. Como mostrado na figura 7d, uma inibigao de crescimento significativa foi observada, como medido por acumulo de DCW, onde concentragoes de Na2SC>4 excederam 25 mM, especificamente nas concentragoes de 80 mM, 240 mM e 700 mM. Alem disso, o impacto de antiespumante P2000 foi avaliado no mesmo teste. O composto antiespumante teve um impacto positive, significative sobre a produtividade de biomassa. A produtividade de lipideo foi tambem avaliada para cada condigao, e concentragoes de Na2SO4 acima de 80 mM, especificamente 240 mM e 700 mM, foram inibidoras enquanto a adigao de antiespumante P2000 aumentou significativamente a produtividade de lipfdeo. Desse modo, em uma modalidade, as etapas de cultura dos metodos da presente invenção incluem cultivo em meio contendo um agente antiespumante.
[00352] Com base nos resultados discutidos acima e resumidos na figura 7a, inibidores estavam provavelmente presentes nos insumos celulosicos que apresentam crescimento ruim. A presente invenção prove meio de remover tais compostos por lavar os materiais com agua quente (tratamento hidrotermico). A Figura 8 resume os resultados de crescimento, como medido por A750, utilizando agucar derivado de insumo celulosico com uma unica lavagem de agua quente. As condigoes de cultura foram identicas aquelas utilizadas nos processos resumidos na figura 7a. em comparagao com os resultados mostrados na figura 7a, apos apenas uma lavagem com agua quente, culturas de Prototheca moriformis cresceram melhor em todos os insumos celulosicos testados, especificamente bagago de cana de agucar, cana de sorgo, Miscanthus e polpa de beterraba, em comparagao com controle de glicose. A produtividade de lipfdeo tambem foi avaliada em cada das condigoes. Exceto para a condigao de polpa de beterraba, que foi comparavel ao controle de glicose, culturas cultivadas em agucares derivados de materiais celulosicos submetidos a uma lavagem com agua quente apresentaram melhor produtividade de lipfdeo do que o controle de glicose.
[00353] Um impacto potential de tratamento hidrotermico (lavagem com agua quente), de biomassa celulosica e a remogao de furfurais e hidroxi metil furfurais liberados pela explosao de acido do material. A presenga de furfurais e hidroxi metil furfurais pode ter contribufdo para crescimento limitado observado em alguns dos processos resumidos na figura 7a. para avaliar como o tratamento hidrotermico afetou os niveis de furfurais (FA) e hidroxi metil furfurais (HMF), sobrenadantes que resultam de uma a tres lavagens de biomassa celulosica derivados de bagago de cana de agucar (B), cana de sorgo (S), Miscanthus (M) ou polpa de beterraba (BP) foram ensaiados em relagao a FA e HMF por HPLC. Como mostrado na figura 8, nfveis de FA e HMF diminuem significativamente com cada etapa de lavagem. Esse resultado e compatfvel com a obscrvagao de que FA e HMF pode ser inibidor ao crescimento de microalgas (como visto na figura 7a) e que o tratamento hidrotermico remove esses compostos e resulta em crescimento aperfeigoado de microalgas, ainda melhor do que o crescimento nas condigoes de glicose de controle (como visto na figura 8).
[00354] O impacto sobre o perfil de lipfdeo de culturas de Prototheca moriformis crescidas nos varies agucares derivados de lignocelulosico tratados hidrotermicamente foi avaliada. Culturas de Prototheca moriformis foram cultivadas nos seguintes insumos celulosicos lavados 4x: Miscanthus, bagago de cana de agucar e cana de sorgo, com nfveis de glicose mantidos a 20 g/L atraves da alimentagao dos agucares celulosicos. Na conclusao da cultura, biomassa de microalgas de cada condigao foi analisada em relagao ao perfil de lipfdeo utilizando os metodos descritos no exemplo 1, Os resultados da analise de perfil de lipfdeo (expresso em % de area) sao resumidos na tabela 10 abaixo. Cada condigao foi testada em duplicata, e os resultados de cada das condigoes de teste em duplicata sao inclufdos. O crescimento em insumos celulosicos resultou em uma redistribuigao significativa no perfil de lipfdeos em comparagao com o controle de glicose. Por exemplo, houve um aumento significative em % de area de Cl8:0 em todas as condigoes de insumo celulosico em comparagao com a condigao de controle de glicose. Tabela 10. Perfil de lipfdeo de Prototheca moriformis crescida em agucares derivados de celulosico e glucose
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n.d. indica nenhum detectado
[00355] O fluxo de agucar celulosico foi gerado de forragem de milho explodida, sacarificada utilizando enzima Accellerase e concentrado utilizando evaporagao a vacuo. Esse fluxo de agucar foi testado em ensaios de crescimento de Prototheca moriformis a uma concentragao de glicose a 4%. Os resultados dos ensaios de crescimento mostraram crescimento muito ruim e o fluxo de agucar celulosico foi testado em relagao a condutividade (teor de sal). A condutividade era muito elevada, bem maior do que 700 mM de equivalentes de sodio, um mvel que foi mostrado como sendo inibidor ao crescimento como descrito acima e mostrado na Figura 7d. Os metodos da invenção incluem metodos nos quais o sal e reduzido ou removido de agucares derivados de lignocelulosico antes da utilizagao desses insumos na produgao de oleo de microalga derivado de lignocelulosico. Surpreendentemente, entretanto, nao se pode utilizar resinas para dessalinizar fluxos concentrados de agucar, deve-se primeiramente diluir o fluxo concentrado de agucar. Para demonstrar essa modalidade da invenção, agucares celulosicos derivados de material de forragem de milho foram diluidos oito vezes antes da remogao de sais de contaminagao com a resina. A condutividade initial do material de partida concentrado foi de 87 mS/cm enquanto aquela do fluxo diluido oito vezes foi de 10990 uS/cm em um pH de 5,61, Estudos anteriores tinham indicado que a falha em diluir o fluxo concentrado de agucar antes da deionizagao resultou em incapacidade de remover sais quantitativamente bem como uma perda significativa de glicose a partir do fluxo de agucar. Tres volumes de leito diferentes de resinas IEX (DOWEX Marathon MR3) foram utilizados (1:2, 1:4 e 1:10). A Tabela 11 resume os resultados que demonstram a capacidade de uma resina de permuta de ion de leito misto (IEX) reduzir os sais (como medido por condutividade) significativamente em um fluxo de agucar celulosico derivado de forragem de milho anteriormente concentrado em insumos dilufdos. Tabela 11. Capacidade de resina IEX reduzir sais.
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[00356] Um processo empregando um volume de leito 1:4 :insumo celulosico e re-concentragao do material oito vezes resultaria em uma concentragao de sodio esta compreendido na faixa para biomassa normal e acumulo de lipideo. Alternativamente, a remogao de sal ou deionizagao pode ser realizada antes da sacarificagao ou apos sacarificagao, porem antes da concentragao do fluxo de agucar. Se remogao de sal for realizada antes da concentragao do fluxo de agucar, uma etapa de diluigao do fluxo de agucar antes da remogao de sal provavelmente nao seria necessaria.
[00357] Esse exemplo demonstra a eficacia de lavagem de material celulosico explodido para o uso em produgao de oleo celulosico. Como descrito acima, concentragao de agucares derivados celulosicamente sem a remogao de sais (inerente a produgao de material celulosico explodido e tratamento subseqtiente) resulta em fermentagoes inferiores a ideais. Os materiais tratados no processo descrito abaixo foram do pH apropriado para sacarificagao subseqtiente. Alem disso, a condutividade desse material foi significativamente reduzida (mais de 100 vezes) a partir do insumo de partida. Portanto, os agucares concentrados subseqiientes para serem utilizados em fermentagoes nao foram inibidores devido a presenga de sais em excesso. Uma vantagem adicional e vista pela remogao de furfurais a partir do material celulosico. Qualquer xilose ou glicose removida na fragao hemicelulosica pode ser descartada ou preferivelmente reconcentrada para ser utilizada em fermentagoes.
[00358] Bagago de cana de agucar explodido, umido (NREL, Colorado) com uma massa initial de partida de 65 kg de peso umido e condutividade de 15.000 uS/cm, pH 2,4 foi levado ate 128 kg com agua deionizada e o pH ajustado para 4,6 com 10 N NaOH, fazendo a condutividade resultante 6,800 uS/cm). A percentagem de solidos foi avaliada por remogao de uma aliquota dos materiais suspenses para um recipiente de alummio tarado (peso = t), registrando o peso umido (peso = w) seguido por secagem por tres horas a 110°C. Apos secagem as amostras foram removidas para um dessecador e deixadas chegar a temperatura ambiente (25°C) em cujo ponto, foram novamente pesadas (peso = d). a percentagem de solidos foi calculada como: % solidos = [(d-t/w-t)] x 100. As condutividades foram medidas em um medidor Thermo Electron Orion Star Conductivity.
[00359] O bagago de cana de agucar foi lavado em um modo semicontmuo por misturar continuamente a pasta celulosica (percentagem initial de solidos de 8,2%) em uma temperatura de 50°C em um reator de ago inoxidavel (capacidade de 150 L). Celulosicos foram descarregados do recipiente de reator atraves de uma bomba de carga giratoria em uma taxa de fluxo de 1,9 a 3,8 kg/min. em uma centnfuga de decantar Modelo 660 Sharles. Permeado liquido foi retido em batelada (aliquotas de cerca de 35175 kg , vide a tabela 12 abaixo) e aliquotas homogeneas removidas para avaliagao de total de agucares (glicose e xilose) e percentagem de solidos como descrito na tabela 12, A condutividade e pH do material celulosico foram controlados atraves da adigao de agua deionizada e 10 N NaOH, respectivamente. As amostras 1 a 10 na Tabela 12 representam permeado centrifugo decantado e como tai solidos e agucares presentes nestas fragoes sao removidos dos materiais celulosicos lavados finals. Um calculo de equilibrio de massa de total de solidos em comparagao com solidos removidos menos solidos perdidos mais solidos finals para sacarificagao, resultou em uma recuperagao de 99% no processo acima. A figura 8 resume a concentragao de furfural e hidroximetil furfurais (mg/L) em cada dos 11 permeados de centrifuga coletados e descritos na tabela 12. Esses dados demonstram uma remogao clara de furfurais e hidroxi metil furfurais a partir do bagago de cana de agucar. Tabela 12. Equilibrio de massa para tratamento hidrotermico semi-contmuo de bagago de cana de agucar.
Figure img0020
[00360] Em outra demonstragao da capacidade de Prototheca utilizar insumo derivado de celulosico, Prototheca moriformis (UTEX 1435) foi cultivado em biorreatores de tres litres utilizando agucar derivada de celulosico como um insumo de carbono fixo. O inoculo foi preparado de celulas criopreservadas, que foram descongeladas em temperatura ambiente e 1 mL de celulas foi adicionado a 300 mL de meio inoculo baseado no meio de microalgas basal descrito no exemplo com 1 g/L (NHOzSO^ 4 g/L de extrato de levedura e uma solugao de elemento residual, mais 4% de glicose e cultivado por 1 dia a 28 °C com agitagao (200 rpm). Essa cultura foi utilizada para inocular um biorreator de tres litres contendo 1 L de meio mais 0,26 mL de Antiespumante 204 (Sigma, EUA). O fermentador foi controlado a 28°C e pH foi mantido a 6,8 por adigao de KOH. Oxigenio dissolvido foi mantido a 30% de saturagao por agitagao em cascata e fluxo de ar. Insumo de agucar celulosico de forragem de milho foi alimentado a cultura para manter 0-10 g/L de glicose. Dessalinizagao de insumos de agucar celulosico a menos de 300 mM de sal foi essential para assegurar peso de celula seca similar e desempenho de acumulo de lipideo em comparagao com controles de insumo de agucar purificado. Dessalinizagao do insumo de agucar celulosico foi realizada utilizando os metodos descritos acima. Amostras de fermentador foram removidas para monitorar desempenho de fermentagao. Acumulo de massa de celula foi monitorada por densidade optica e peso de celula seca. Concentragoes de Glicose, xilose, amonia, potassio, sodio e furfural foram tambem determinadas e monitoradas durante todo o curso de fermentagao. A concentragao de lipfdeo foi determinada por metodos gravimetricos discutidos acima.
EXEMPLO 3: Metodos para transformar Prototheca A. Metodo geral para transformacao biolfstica de Prototheca
[00361] Portadores de ouro S550d de Seashell Technology foram preparados de acordo com o protocolo do fabricante. Plasmideo linearizado (20 p.g) foi misturado com 50 pl de tampao de ligagao e 60 pl (30 mg) de portadores de ouro S550d e incubados em gelo por 1 min. O tampao de precipitagao (100 ul) foi adicionado, e a mistura foi incubada em gelo por mais um 1 min. apos submeter a vortice, particulas revestidas com DNA foram formadas em pelotas por rotagao a 10,000 rpm em uma microcentnfuga Eppendorf 5415C por 10 segundos. A pelota de ouro foi lavada uma vez com 500 pl de etanol a 100% frio, formada em pelota por rotagao breve na microcentrifuga, e ressuspensa com 50 pl de etanol gelado. Apos sonicagao breve (1-2 s), 10 pl de particulas revestidas com DNA foram imediatamente transferidas para a membrana de portador.
[00362] Cepas de Prototheca foram cultivadas em meio de proteose (2g/L extrato de levedura, 2,94mM NaNO3, 0,17mM CaC12*2H2O, 0,3mM MgSO4-7H2O, 0,4mM K2HPO4, l,28mM KH2PO4, 0,43mM NaCl) em um agitador giratorio ate atingir uma densidade de celulas de 2xl06 celulas/ml. As celulas foram colhidas, lavadas uma vez com agua destilada esteril, e ressuspensas em 50 ul de meio. 1 x 107 celulas foram espalhadas na terga parte central de uma placa de meio de proteose nao seletiva. As celulas foram bombardeadas com o sistema de Distribuigao de partfcula biolfstica PDS1000/He (Bio-Rad). Discos de ruptura (1100 e 1350 psi) foram utilizados, e as placas sao colocadas 9 e 12 cm abaixo da montagem de macroportador/tela. As celulas foram deixadas recuperar a 25°C por 12-24 h. Apos recuperagao, as celulas foram raspadas das placas com uma espatula de borracha, misturadas com 100 pl de meio e espalhadas em placas contendo a selegao de antibiotico apropriada. Apos 7-10 dias de incubagao a 25°C, colonias representando celulas transformadas eram visiveis nas placas de discos de ruptura de 1100 e 1350 psi e de 9 e 12 cm de distancias. Colonias foram captadas e colocadas em placas de agar seletivo para um Segundo tumo de selegao.
B. Transformagao de Prototheca com Gene de resistencia G418
[00363] Prototheca moriformis e outras cepas de Prototheca sensiveis a G418 podem ser transformadas utilizando os metodos descritos abaixo. G417 e um antibiotico de aminoglicoside que inibe a fungao de ribossomas 80S e desse modo inibe smtese de protema. O gene de resistencia correspondente funciona atraves de fosforilagao resultando em inativagao de G418, Cepas de Prototheca UTEX 1435, UTEX 1439 e UTEX 1437 foram selecionadas para transformagao. Todas as tres cepas de Prototheca foram genotipadas utilizando os metodos descritos acima. Todas as tres cepas de Prototheca tinham sequencias genomicas 23s rRNA (SEQ ID NO: 15).
[00364] Todos os cassetes de transformagao foram clonados como fragmentos EcoRI-SacI em pUC 19, Tecnicas de biologia molecular padrao foram utilizadas no construto de todos os vetores de acordo com Sambrook e Russel, 2001. O promotor beta-tubulin C. remhardtiU5'> UTR foi obtido de plasmfdeo pHyg3 (Berthold e outros, (2002), Protist: 153(4), pag. 401-412) por PCR como um fragmento EcoRI-AscI. A reductase de nitrato Chlorella vulgaris 3’UTR foi obtida de DNA genomico isolado de cepa UTEX 1803 atraves de PCR utilizando os seguintes pares de iniciador: Direto: 5’ TGACCTAGGTGATTAATTAACTCGAGGCAGCAGCAGCTCGGA TAGTATCG 3’ (SEQIDNO:35) Reverso: 5’ CTACGAGCTCAAGCTTTCCATTTGTGTTC CCATCCCACTACTTCC 3’ (SEQIDNO:36)
[00365] O promotor de desidrogenase glutamato Chlorella sorokiniana /UTR foi obtido atraves de PCR de DNA genomico isolado de cepa UTEX 1230 atraves de PCR utilizando os seguintes pares de iniciador: a vang ado: 5’ GATCAGAATTCCGCCTGCAACGCAAGG GCAGC 3’ (SEQIDNO:37) Reverso: 5’ GCATACTAGTGGCGGGACGGAGAGA GGGCG 3’ (SEQ ID NO:38)
[00366] Otimizagao de codon foi baseada nos codons na Tabela 1 para Prototheca moriformis. A sequencia do cassete de fosfotransferase neomicina (nptll) nao otimizado com codon foi sintetizada como um fragmento AscIXhol e foi baseado sobre a sequencia de numero de acessao Genbank YP_788126, O cassete nptll otimizado com codon foi tambem baseado nesse numero de acessao Genbank.
[00367] As tres cepas de Prototheca foram transformadas utilizando metodos biolfsticos descritos acima. Em resumo, as cepas de Prototheca foram cultivadas heterotroficamente em meio liquido contendo glicose a 2% ate atingirem a densidade desejada de celulas (IxlO7 celulas/mL a 5xl07 celulas/mL). As celulas foram colhidas, lavadas uma vez com agua destilada esteril e suspensas novamente a IxlO8 celulas/mL. 0,5 mL de celulas foram entao espalhadas em uma placa de meio solido nao seletivo e deixadas secar em um capuz esteril. As celulas foram bombardeadas com o Sistema de distribuipao de particula biolistico PDS-1000/He (BioRad). As celulas foram deixadas recuperar a 25°C por 24 horas. Apos recuperapao, as celulas foram removidas por lavagem das placas com 1 mL de meio esteril e transferindo para placas novas contendo 100 ug/mL G418. Celulas foram deixadas secar em um capuz esteril e colonias foram deixadas formar na placa em temperatura ambiente por ate tres semanas. As colonias de UTEX 1435, UTEX 1439 e UTEX 1437 foram captadas e colocadas em placas de agar seletivo para um Segundo tumo de selepao.
[00368] Um subconjunto de colonias que sobreviveram a um segundo tumo de selepao descrito acima, foi cultivado em pequeno volume e DNA genomico e RNA foram extraidos utilizando metodos de biologia molecular padrao. Southern blots foram feitos em DNA genomico extraido de nao transformado (WT), transformantes e DNA de plasmfdeo. DNA de cada amostra foi passado em geis agarose a 0,8% apos os seguintes tratamentos: nao digerido (U), digerido com Avril (A), digerido com Ncol (N), digerido com SacI (S). DNA desses geis foi manchado em membranas de Nylon+ (Amersham). Essas membranas foram sondadas com um fragmento que corresponde a regiao de codificagao inteira do gene nptll (sonda NeoR). A figura 4 mostra mapas dos cassetes utilizados nas transformagoes. A figura 5 mostra os resultados de analise de Southern blot em tres transformantes (todos gerados na cepa UTEX 1435) (1, 2 e 3) transformados com betatubulin: :neo::nit (SEQ ID NO: 39) (transformantes 1 e 2) ou desidrogenase glutamato:neo:nit (SEQ ID NO: 40) (transformante 3). O plasmideo de transformagao de desidrogenase glutamato:neo:nit foi passado como um controle e cortado com Ncol e Sacl. Avril nao corta nesse plasmideo. DNA genomico isolado de cepa UTEX 1435 nao transformada nao mostra hibridizagao a sonda de NeoR.
[00369] Transformantes adicionais contendo os construtos de desidrogenase glutamato:neo:nit (SEQ ID NO: 41) otimizada por codon e 0tubulina::neo::nit (SEQ ID NO:42) otimizada por codon foram captadas e analisadas por analise Southern blot. Como esperado, somente digestoes com Sacl mostram linearizagao do DNA de transformagao. Esses eventos de transformagao sao compativeis com eventos de integragao que ocorrem na forma de oligomeros do plasmideo de transformagao. Somente apos digestao com enzimas de restrigao que cortam no DNA de plasmideo de transformagao que essas moleculas cedem para o tamanho do plasmideo de transformagao.
[00370] Analise Southern blot foi tambem realizada em transformantes gerados apos transformagao de cepas de Prototheca UTEX 1437 e UTEX 1439 com o cassete de desidrogenase glutamato ::neo::nit. O blot foi sondado com a sonda NeoR e os resultado sao similares aos transformantes UTEX 1435. Os resultados sao indicatives de eventos de integragao caracterizados por oligomerizagao e integragao do plasmideo de transformagao. Esse tipo de evento de integragao e conhecido como correndo bem comumente em Dictyostelium discoideum (vide, por exemplo, Kuspa, A. e Loomis, W. (1992) PNAS, 89:8803-8807 e Morio e outros., (1995) J. Plant Res. 108:111-114).
[00371] Para confirmar adicionalmente a expressao do plasmideo de transformagao, analise Northen blot e analise RT-PCR foram realizadas em transformantes selecionados. A extragao de RNA foi realizada utilizando Reagente Trizol de acordo com as instrugoes do fabricante. A analise Northern blot foi feita de acordo com os metodos publicados em Sambrook e Russel, 2001. O total de RNA (15 |Hg) isolado de cinco transformantes UTEX 1435 e UTEX 1435 nao transformado (faixas de controle) foi separado em gel de formaldeido agarose a 1% e manchado em membrana de nailon. O blot foi hibridizado com a sonda neo-nao otimizada especifica para sequencias de transgene em transformantes 1 e 3. Os dois outros RNAs de transformantes expressam a versao otimizada de codon do neo-transgene e como esperado, baseado na homologia de sequencia entre os neo genes otimizado e nao otimizado, mostraram sinal de hibridizagao significativamente inferior.
[00372] RNA (1 |LLg) foi extraido de cepa de Prototheca nao transformada UTEX 1435 e dois transformantes UTEX 1435 representativos e transcritos inverses utilizando um iniciador oligo dT ou um iniciador especifico de gene. Subseqiientemente esses cDNAs (em duplicata) foram submetidos a analise qPCT em Termociclador ABI Veriti utilizando qufmica qPCR SYBR utilizando os seguintes iniciadores (nptll): Direto: 5’ GCCGCGACTGGCTGCTGCTGG 3’ (SEQIDNO:43) Reverso: 5’AGGTCCTCGCCGTCGGGCATG 3’(SEQ ID NO:44)
[00373] A contaminagao de DNA genomico possfvel foi descartada por uma amostra de controle negative sem transcriptase inversa. Os resultados indicaram que os genes NeoR utilizados para transformar essas cepas sao ativamente transcritos nos transformantes.
C. Transformacao de Prototheca com Invertase de sacarose heterdloga secretada
[00374] Todos os seguintes experimentos foram realizados utilizando placas de Agar/meio Ifquido com base no meio basal descrito em Ueno e outros, (2002) J. Bioscience and Bioengineering 94(2): 160-65, com a adigao de minerals residuals descritos na patente US numero 5,900,370, e lx coquetel de vitamina DAS (lOOOx solugao): tricina: 9g, tiamina HCL: 0,67 g, biotina: 0,01 g, cianocobalamina (vitamina B12): 0,008 g, pantotenato de calcio: 0,02 g e acido p-aminobenzoico: 0,04g.
[00375] Dois construtos de plasmfdeo foram montados utilizando tecnicas de DNA recombinante padrao. Os genes de invertase de sacarose de levedura (um otimizado com codon e um nao otimizado com codon), suc2, estavam sob o controle do promotor beta-tubulin Chlorella reinhardtii/5’ UTR e tinham a reductase de nitrato Chlorella vulgaris 3’UTR. As sequencias (incluindo as sequencias 5’UTR e 3’UTR) para o construto nao otimizado por codon (Cr0-tub::NCO-suc2::CvNitRed) , SEQ ID NO: 57, e construto otimizado por codon (Cr0-tub::CO-suc2::CvNitRed), SEQ ID NO: 58, sao listadas na Listagem de sequencias. A otimizagao de codon foi baseada na tabela 1 para Prototheca SP. A figura 6 mostra um diagrama esquematico dos dois construtos com os sitios de clonagem de restrigao relevantes e setas indicando a diregao de transcrigao. A selegao foi fomecida por Neo R (otimizado por codon utilizando a Tabela 1).
[00376] A preparagao do microportador de ouro/DNA; microportadores de ouro/DNA foram preparados imediatamente antes do uso e armazenados em gelo ate aplicagao em macroportadores. O DNA de plasmfdeo (no tampao TE) foi adicionado a 50 pg de tampao de ligagao. A saturagao das contas de ouro foi obtida em 15 pg de DNA de plasmfdeo para 3 mg de portador de ouro. O tampao de ligagao e DNA foram misturados bem atraves de vortice. O DNA e tampao de ligagao devem ser pre-misturados antes da adigao de ouro para assegurar ligagao uniforme de plasmfdeo com particulas de portador de ouro. 60 |Ltl de portador de ouro S550d (Seashell Technologies, San Diego, CA) foram adicionados a mistura de tampao de ligagao/DNA. Para um estoque de ouro em 50 mg/ml, a adigao de 60 pl resulta em uma razao otima de 15 pg DNA/ 3 mg de portador de ouro. A mistura de DNA/portador de ouro foi deixada incubar em gelo por ‘1 minuto e entao 100 pl de tampao de precipitagao foi adicionado. A mistura foi deixada incubar novamente em gelo por 1 minuto e entao brevemente submetida a vortice e centrifugada a 10,000 rpm em temperatura ambiente por 10 segundos para formar pelota do portador de ouro. O sobrenadante foi cuidadosamente removido com uma pipeta e a pelota foi lavada com 500 pl de etanol a 100% gelado. As partfculas de ouro foram repeletizadas por centrifugagao novamente a 10,000 rpm por 10 segundos. O etanol foi removido e 50 pl de etanol gelado foram adicionados a mistura de ouro. Imediatamente antes da aplicagao do ouro a macroportadores, o ouro/etanol foi suspense novamente com um breve pulso de 1-2 segundos no mvel 2 em um sonicador MISONIX utilizando a micro ponta. Imediatamente apos resuspensao, 10 pl das partfculas de ouro dispersas foram transferidas para o macroportador e deixadas secar em um capuz esteril.
[00377] As duas cepas de Prototheca moriformis (utex 1435 E 1441) foram cultivadas heterotroficamente em um meio liquido contendo glicose a 2% a partir de frascos criopreservados. Cada cepa foi cultivada ate uma densidade de 107 celulas/ml. Essa cultura de semente foi entao dilufda com meio novo ate uma densidade de 105 celulas/ml e deixada crescer por 12-15 horas para obter uma densidade final de celulas de aproximadamente 106 celulas/ml. As microalgas foram formadas em aliquotas em tubos conicos de 50 ml e centrifugadas por 10 minutos a 3500 rpm. As celulas foram lavadas com meio novo e centrifugadas novamente por 10 minutos a 3500 rpm. As celulas foram entao suspensas novamente em uma densidade de 1,25 x 108 celulas/ml em meio novo.
[00378] Em um capuz esteril, 0,4 ml das celulas preparadas acima foram removidos e colocados diretamente no centre de uma placa de Agar (sem agente de selegao). A placa foi suavemente oscilada com um movimento circular de mvel para distribuir uniformemente as celulas a um diametro nao maior do que 3 cm. As celulas foram deixadas secar sobre as placas no capuz esteril por aproximadamente 30-40 minutos e entao foram bombardeadas em uma pressao de disco de ruptura de 1350 psi e uma placa ate distancia de macroportador de 6 cm. As placas foram entao cobertas e envoltas com parafilme e deixadas incubadas sob luz baixa por 24 horas.
[00379] Apos a rccupcragao de 24 horas, 1 ml de meio esteril (sem glicose) foi adicionado ao gramado de celulas. As celulas foram suspensas novamente utilizando um loop esteril, aplicado em um movimento circular ao gramado de celulas e as celulas suspensas novamente foram coletadas utilizando uma pipeta esteril. As celulas foram entao revestidas sobre uma placa de Agar nova com 2% de glicose e 100 ug/ml de G418, O aparecimento de colonias ocorreu 7-12 dias apos revestimento. Colonias individuais foram captadas e crescidas em meio seletivo com glicose a 2% e 100 ug/ml G418. As celulas do tipo selvagem (nao transformadas) e transgenicas foram entao analisadas para introdugao bem sucedida, integragao e expressao do transgene.
[00380] DNA genomico de Prototheca moriformis UTEX 1435 e 1441 transformadas e suas copias do tipo selvagem (nao transformadas) foram isoladas utilizando metodos padrao. De forma resumida, as celulas foram centrifugadas por 5 minutos a 14,000 rpm em uma centnfuga Eppendorf de topo de mesa padrao (5418) e congeladas flash antes da extragao de DNA. Pelotas de celulas foram lisadas por adigao de 200 JLLL de tampao de lise (100 mM Tris HC1, pH 8,0, 1% de sarcosina de laurila, 50 mm NaCl, 20 mM EDTA, 0,25 M de sacarose, 0,5 mg/ml RNase A) para cada 100-200 mg de celulas (peso umido) e submetidas a vortice por 30-60 segundos. Brometo de trimetil amonio cetila (CTAB) e NaCl foram levados a 1% e 1 M, respectivamente, e extratos de celula foram incubados a 60-65°C por 10 minutos. Subsequentemente, os extratos foram clarificados atraves de centrifugagao a 14,000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante resultante foi extrafdo com um volume igual de fenol/cloroformio/alcool de isoamila (25:24:1). As amostras foram entao centrifugadas por 5 minutos a 14,000 rpm e a fase aquosa removida. DNA foi precipitado com 0,7 volumes de isopropanol. DNA foi peletizado via centrifugagao em 14.000 rpm por 10 minutos e lavado duas vezes com etanol 80%, e uma vez com etanol. Apos secagem, DNA foi suspense novamente em 10 mM Tris HC1, pH 8,0 e concentrates de DNA foram determinados utilizando ensaio de quantificagao de fluorescencia PicoGreen (Molecular Probes).
[00381] RNA de Prototheca moriformis UTEX 1435 e 1441 transformados e suas copias do tipo selvagem (nao transformada) foram isoladas utilizando metodos padrao. Em resumo, as celulas foram centrifugadas por 5 minutos a 14,000 rpm em uma centnfuga Eppendorf de topo de mesa padrao (modelo 5418) e congelado flash antes da extragao de RNA. As pelotas de celulas foram lisadas por adigao de 1 mL de reagente Trizol (Sigma) para cada 100 mg de celulas (peso umido) e por submeter a vortice por 1-2 minutos. As amostras foram incubadas em temperatura ambiente por 5 minutos e subseqiientemente ajustadas com 200 uL de cloroformio por 1 mL de reagente Trizol. Apos agitagao extensa, as celulas foram incubadas em temperatura ambiente por 15 minutos e entao submetidas a centrifugagao a 14000rpm por 15 minutos em uma microcentnfuga de topo de mesa refrigerada. A divisao de RNA para a fase aquosa superior foi removida e precipitada por adigao de isopropanol (500 pL por 1 ml de reagente Trizol). RNA foi coletado por centrifugagao por 10 minutos e a pelota resultante foi lavada duas vezes com 1 mL de etanol a 80%, seca, e suspensa novamente em agua livre de RNAse. A concentragao de RNA foi estimada por ensaio de quantificagao de fluorescencia de RiboGreen (Molecular Probes).
[00382] A expressao de gene fofotransferase de neomicina conferindo resistencia a antibiotico G418 e invertase de levedura foi ensaiada em Prototheca moriformis UTEX 1435 e 1441 e transformantes T98 (transformante UTEX 1435) e T97 (transformante UTEX 1441) utilizando analise PCR quantitativa de transcrigao inversa (RT-qPCR). 20 ng de RNA total (isolado como descrito acima) foi submetido a analise de RTOqPCR de uma etapa utilizando kit iScript SYBR Green RT-PCR (BioRad Laboratories) e pares de iniciador tendo como alvo o gene de resistencia a neomicina (iniciador avangado 5’CCGCCGTGCTGGACGTGGTG 3’ e iniciador inverso 5’ GGTGGCGGGGTCCAGGGTGT 3’; SEQ ID NOs: 65 e 66, respectivamente) e transcritos de invertase suc2 (iniciador avangado 5’ CGGCCGGCGGCTCCTTCAAC 3’ e iniciador inverso 5’ GGCGCTCCCGTAGGTCGGGT 3’; SEQ ID NO: 67 e 68, respectivamente). Transcritos beta-tubilin endogenos serviram como um controle positivo intemo para amplificagao de PCR e como uma referenda de normalizagao para estimar nfveis de transcrito relative.
[00383] Ambos os construtos otimizados por codon e nao otimizada por codon foram transformadas em celulas de Prototheca moriformis UTEX 1435 e 1441 como descrito acima. Inicialmente, transformantes foram obtidos com ambas os construtos e a presenga do transgene foi verificada por analise Southern blot seguido por RTPCR para confirmar a presenga do DNA e mRNA do transgene. Para a analise de Southern blot, DNA genomico isolado como descrito acima foi submetido a eletroforese em geis de agarose a 0,7% em lx tampao TAE. Geis foram processados como descrito em Sambrook e outros. (Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2nd Edigao. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Sondas foram preparadas por iniciagao aleatoria e hibridizagoes realizadas como descrito em Sambrook e outros. Transformantes dos construtos tanto otimizados por codon como nao otimizadas por codon mostraram a presenga do cassete de invertase, enquanto o controle nao transformado era negativo. mRNAS de invertase foi tambem detectado em transformantes com construtos tanto otimizados por codon como nao otimizados por codon.
[00384] Para confirmar que os transformantes estavam expressando uma proteina de invertase ativa, os transformantes foram revestidos em placas de sacarose. Os transformantes contendo o cassete otimizado nao codon falharam em crescer nas placas contendo sacarose, indicando que, embora o gene e o mRNA codificando a proteina SUC 2 estivessem presentes, a proteina nao estava (i) sendo traduzida, ou (2) sendo traduzida, porem nao acumulando a niveis suficientes para permitir crescimento em sacarose como a fonte de carbono unica. Para avaliar os niveis de invertase sendo expresses por esses transformantes, dois clones (T98 e T97) foram submetidos a um ensaio de invertase de celulas inteiras raspadas do meio solido e amostragem direta e quantificagao de agucares nos sobrenadantes de cultura apos 48 horas de crescimento no meio Ifquido contendo 2% de sacarose como a fonte de carbono unico.
[00385] Para o ensaio de invertase, as celulas (T98 e T97) foram cultivadas em placas contendo sacarose a 2%, raspadas e ensaiadas em relagao a atividade de invertase. 10 pl das celulas raspadas foram misturadas com 40 pl de 50 mM NaOAc pH 5,1, 12,5 pl de 0,5 M sacarose foi adicionado a mistura de celulas e incubado a 37°C por 10-30 minutos. Para parar a reagao, 75 pl de 0,2 M K2HPOO4 foram adicionados. Para avaliar glicose liberada, 500 pl de reagente reconstitufdo (glicose oxidase I peroxidase + o-Dianisidina) de Sigma (GAGO-20 kit de ensaio) foram adicionados a cada tubo e incubados a 37°C por 30 minutos. Uma curva padrao de glicose foi tambem criada nesse momento (faixa: 25 pug a 0,3 pg de glicose). Apos incubagao, 500 pl de 6N HC1 foram adicionados para parar a reagao e desenvolver a cor. As amostras foram lidas a 540 nm. A quantidade de glicose liberada foi calculada a partir da curva padrao de glicose utilizando a formula y=mx+c, onde yea leitura de 540 nm, e x e pg de glicose. O peso de glicose foi convertido em mols de glicose, e dada a relagao equimolar entre mols de sacarose hidrolisado em mols de glicose gerada, os dados foram expresses como nmols de sacarose hidrolisada por tempo unitario. O ensaio mostrou que ambos os clones T98 eT97 eram capazes de hidrolisar sacarose, indicando que uma invertase de sacarose funcional estava sendo produzida e secretada pelas celulas.
[00386] Para a analise de agucar em meio de cultura liquido apos 48 horas de crescimento de algas, celulas T97 e T98 foram cultivados em meio contendo sacarose a 2% por 48 horas e os meios de cultura foram processados para analise de agucar. Caldos de cultura de cada transformante (e controle de celula nao transformada negativo) foram centrifugados a 14,000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante resultante foi removido e submetido HPLC/ELSD (deteegao de dispersao de luz evaporativa). A quantidade de agucar em cada amostra foi determinada utilizando padroes extemos e analise de regressao linear. Os mveis de sacarose nos meios de cultura dos transformantes eram muito baixos (menos de 1,2 g/L, e na maioria dos casos Og/L). nos controles negatives, os mveis de sacarose permaneceram elevados, em aproximadamente 19 g/L apos 48 horas de crescimento.
[00387] Esses resultados foram compativeis com os resultados de atividade de invertase, e tornados juntos, indicaram que os transformantes otimizados por codon, T97 e T98, secretaram uma invertase de sacarose ativa que permitiu que as microalgas utilizassem sacarose como a fonte de carbono unica ao contrario dos (1) transformantes nao otimizados por codon e (2) as microalgas do tipo selvagem nao transformadas, os quais nao poderiam utilizar sacarose como a fonte de carbono unico no meio de cultura.
[00388] Cepas de Prototheca moriformis, T98 e T97, expressando um transgene de invertase de sacarose secretada funcional (SUC2) foram ensaiadas em relagao a crescimento e produgao de lipfdeo utilizando sacarose como a fonte de carbono unica.
[00389] Cepas do tipo selvagem (nao transformadas) T98 e T97 foram cultivadas em meios de crescimento (como descrito acima) contendo glicose a 4% ou sacarose a 4% como a fonte de carbono unica sob condigoes heterotroficas por aproximadamente 6 dias. O crescimento, como determinado por leituras de densidade optica A750 foram tiradas de todas as quatro amostras a cada 24 horas e o peso de celula seca das culturas e perfis de lipideo foram determinadas apos os 6 dias de crescimento. As leituras de densidade optica das cepas transgenicas cultivadas em condigoes tanto de glicose como de sacarose foram comparaveis com as cepas do tipo selvagem crescidas nas condigoes de glicose. Esses resultados indicam que as cepas transgenicas foram capazes de crescer em glicose ou sacarose como a fonte de carbono unica em uma taxa igual a cepas do tipo selvagem em condigoes de glicose. As cepas do tipo selvagem nao transformadas nao cresceram na condigao de sacarose somente.
[00390] A biomassa para a cepa do tipo selvagem crescida em glicose e cepa T98 crescida em sacarose foi analisada em relagao ao perfil de lipideo. Amostras de lipideo foram preparadas de biomassa seca (liofilizadas) utilizando um Sistema de Hidrolise de acido (Ankom Technology, NY) de acordo com as instrugoes do fabricante. Determinagoes de perfil de lipideo foram realizadas como descrito no exemplo 4. O perfil de lipideo para a cepa de Prototheca moriformis UTEX 1435 nao transformada, crescida em glicose como a fonte de carbono unica e duas cepas T98 colonais (UTEX 1435 transformada com um transgene de invertase de sacarose), crescida em sacarose como a fonte de carbono unica, sao revelados na Tabela 13 (UTEX 1435 do tipo selvagem e T98 clone 8 e cone 11 abaixo. C:19:0 lipideo foi utilizado com um controle de calibragem intemo. Tabela 13. Perfil de lipideo de clones UTEX 1435 e UTEX 1435 do tipo selvagem com transgene suc2.
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[00391] Oleo extrafdo de Prototheca moriformis UTEX 1435 do tipo selvagem (*via extragao de solvente ou utilizando uma prensa expelidora (vide os metodos no exemplo 44 acima) foi analisado em relagao a carotenoides, clorofila, tocoferois, outros esterois e tocotrienois. Os resultados sao resumidos abaixo na Tabela 14. Tabela 14. Analise de carotenoide, clorofila, tocoferol/esterois e tocotrienol em oleo extrafdo de Prototheca moriformis (UTEX 1435).
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[00392] A capacidade de utilizar sacarose como a fonte de carbono unica como o fator de selepao para clones contendo o construto de transgene suc2 em vez de G418 (ou outro antibiotico) foi avaliada utilizando os transformantes de gene suc2 positivo. Um subconjunto dos transformantes positivos foi cultivado em placas contendo sacarose como a fonte de carbono unica e sem selepao de antibiotico para 24 duplicates. Os clones foram entao desafiados com placas contendo glicose como a fonte de carbono unica e G418. Houve um subconjunto de clones que nao cresceu na condigao de glicose +G418, indicando uma perda de expressao do transgene. Um experimento adicional foi realizado utilizando uma placa contendo sacarose como a fonte de carbono unica e nenhum G418 e riscando um clone que expressa transgene suc2 em uma metade da placa e Prototheca moriformis do tipo selvagem na outra metade da placa. O crescimento foi visto com ambas as celulas Prototheca moriformis contendo transgene e do tipo selvagem. Prototheca moriformis do tipo selvagem nao demonstrou a capacidade de crescer em sacarose, portanto, esse resultado mostra que diferente de resistencia a antibiotico, o uso de selepao de invertase/sacarose nao e autonomo de celula. E muito provavel que os transformantes estavam secretando invertase de sacarose suficiente na placa/meios para suportar crescimento do tipo selvagem visto que a sacarose foi hidrolisada em frutose e glicose.
EXEMPLO 4: Prototheca recombinante com gene TE exogeno
[00393] Como descrito acima, as cepas de Prototheca podem ser transformadas com genes exogenos. Prototheca morifomis (UTEX 1435) foi transformada, utilizando metodos descritos acima, com gene de tioesterase Umbellularia califomica C12 ou gene de tioesterase Cinnamomum camphora C14 (ambos otimizados por codon de acordo com a tabela 1). Cada dos construtos de transformagao continha uma regiao de 5’UTR/promotor de desidrogenase de glutamato Chlorella sorokiniana (SEQ ID NO: 69) para acionar a expressao do transgene tioesterase. As regioes de codificagao de transgenes de tioesterases de tioesterase Umbellularia californica C12 (SEQ ID NO: 70) ou tioesterase C14 Cinnamomum camphora C14 (SEQ ID NO: 71), cada uma com a sequencia de direcionamento para plastfdio putativo nativa. Imediatamente apos a sequencia de codificagao de tioesterase esta a sequencia de codificagao para um tag 3x-FLAG terminal-c (SEQ ID NO: 72), seguido pela reductase de nitrato Chlorella vulgaris 3’UTR (SEQ ID NO: 73). Um diagrama dos construtos de tioesterase que foram utilizadas nas transformagoes de Prototheca moriformis e mostrado na figura 9.
[00394] A preparagao do DNA, microportador de ouro e celulas de Prototheca moriformis (UTEX 1435) foi realizada inutilizando os metodos descritos acima no exemplo 3, As microalgas foram bombardeadas utilizando a mistura de DNA microportador de ouro e revestidas em placas de selegao contendo glicose a 2% e 100 ug/ml de G418, As colonias foram deixadas desenvolver por 7 a 12 dias e colonias foram captadas de cada placa de transformagao e selecionadas para incorporagao de construto de DNA utilizando ensaios de Southern blots e expressao dos construtos de tioesterase foi selecionada utilizando RT-PCR.
[00395] Clones positivos foram captados de ambas as placas de transformagao de tioesterase C12eC14e selecionados para incorporagao de construto utilizando ensaios de Southern blot. Os ensaios de Southern blot foram realizando utilizando metodos padrao (e descritos acima no exemplo 3) utilizando sondas c otimizadas, com base na sequencia em SEQ ID NO: 70 e SEQ ID NO: 71, O DNA de plasmfdeo de transformagao foi passado como um controle positivo. Dos clones que foram positivos para incorporagao de construto, um subconjunto foi selecionado para analise de PCR quantitative de transcrigao inversa (RT-qPCR) para expressao de tioestearase C12 e tioesterase C14.
[00396] O isolamento de RNA foi realizado utilizando metodos descritos no exemplo 3 acima e RT-qPCR dos clones positivos foram realizados utilizando 20 ng de RNA total de cada clone utilizando o par de iniciadores abaixo descrito e kit iScript SYBR Green RT-PCR (Bio-Rad Laboratories) de acordo com o protocolo do fabricante. RNA total de Prototheca moriformis do tipo selvagem (nao transformado) foi inclufdo como um controle negativo. A expressao de mRNA foi expressa como expressao de vez relativa (RFE) em comparagao com o controle negativo. Os iniciadores que foram utilizados na selegao de RT-qPCR de transformagao de tioesterase C12 foram: Iniciadores de PCR de tioesterase U. califomica Cl2: Avangado: 5’ CTGGGCGACGGCTTCGGCAC 3’ (SEQ ID NO: 74) Reverso: 5’ AAGTCGCGGCGCATGCCGTT 3’ (SEQ ID NO: 75)
[00397] Os iniciadores que foram utilizados na selegao de RT-qPCR de transformagao de tioesterase C14 foram: Iniciadores de PCR de tioesterase C14 Cinnamomum camphora: Direto: 5’ TACCCCGCCTGGGGCGACAC 3’ (SEQ ID NO: 76) Reverso: 5’ CTTGCTCAGGCGGCGGGTGC 3’ (SEQ ID NO: 77)
[00398] Os resultados de RT-qPCR para expressao de tioesterase C12 nos clones positivos mostraram um RFE aumentado de aproximadamente 40 vezes para mais de 200 vezes de expressao aumentada em comparagao com controle negativo. Resultados similares foram vistos com expressao de tioesterase C14 nos clones positivos com um RFE de aumento de aproximadamente 60 vezes a mais de 1200 vezes de expressao aumentada em comparagao com controle negativo.
[00399] Um subconjunto dos clones positivos de cada transformagao (como selecionado por ensaios de Southern blotting e RT-qPCR) foi selecionado e crescido sob condigoes repletas de nitrogenio e analisado em relagao a produgao e perfil total de lipfdeo. Amostras de lipfdeo foram preparadas de biomassa seca de cada clone. 20-40 mg de biomassa seca de cada clone transgenico foram suspensos novamente em 2 mL de H2SO4 a 3% em MeOH, e 200 ul de tolueno contendo uma quantidade apropriada de um padrao intemo apropriado (C19:0) foi adicionado. A mistura foi sonicada brevemente para dispersar a biomassa, a seguir aquecida a 65-70°C por duas horas. 2 mL de heptano foram adicionados para extrair os esteres de metila de acido graxo, seguido por adigao de 2 mL de K2CO3 a 6% (aq) para neutralizar o acido. A mistura foi agitada vigorosamente, e uma porgao da carnada superior foi transferida para um frasco contendo Na2SO4 (anidro) para analise de cromatografia de gas utilizando metodos GC/FID FAME (detecgao de ionizagao de chama cromatografia de gas de ester metflico de acido graxo) padrao. O perfil de lipfdeo (expresso como % de area) dos clones positivos em comparagao com controle negativo do tipo de selvagem sao resumidos nas tabelas 15 e 16 abaixo. Como mostrado na tabela 15, o aumento em vezes de produgao C12 nos transformantes C12 variou de aproximadamente um aumento de 5 vezes (clone Cl2-5) a aumento de mais de 11 vezes (clone Cl 21). O aumento em vezes de produgao de C14 nos transformantes C14 variou de um aumento de aproximadamente 1,5 vezes ate um aumento de aproximadamente 2,5 vezes. Tabela 15. Sumario de perfil de lipfdeo total dos transformantes de tioesterase Prototheca moriformis C12
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Tabela 16. Sumario de perfil total de lipfdeos dos transformantes de tioesterase de Prototheca moriformis Cl4,
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[00400] Os experimentos acima descritos indicam a transformagao bem sucedida de Prototheca moriformis (UTEX 1435) com construtos de transgene de duas tioesterease diferentes (C12 e C14), que envolveram nao somente a expressao bem sucedida do transgene, como tambem o direcionamento correto da proteina expressa para o plastfdio e um efeito funcional (a alteragao esperada em perfil de lipideo) como resultado da transformagao. O mesmo experimento de transformagao foi realizado utilizando um construto de expressao que contem uma regiao de codificagao de tioesterase C8-10 Cuphea hookeriana otimizada por codon (de acordo com a tabela 1) com a sequencia de direcionamento de plastfdio nativo (SEQ ID NO: 78) nao fomeceu alteragao em perfil de lipfdeo. Embora a introdugao do transgene C8-10 Cuphea hookeriana em Prototheca moriformis (UTEX 1435) tenha sido bem sucedida e confirmada por analise Southern blot, nenhuma alteragao em produgao de acido graxo C8 ou CIO foi detectada nos transformantes em comparagao com a cepa do tipo selvagem.
EXEMPLO 5: Geragao de cepa de Prototheca moriformis com planta exogena TE com sequencia de direcionamento de plastfdio de alga
[00401] Para investigar se o uso de sequencias de direcionamento de plastfdio/cloroplasto de alga melhoraria a expressao de tioesterase de cadeia media (C8-14) e produgao de lipfdeo de cadeia media subseqiiente em Prototheca moriformis (UTEX 1435), varias sequencias de direcionamento de plastfdio de algas putativas foram clonadas de Chlorella protothecoides e Prototheca moriformis. Constructed de tioesterase com base em tioesterase Cuphea hookeriana C8-10, tioesterase Umbellularia califomica Cl2, e tioesterase Cinnamomum camphora C14 foram feitos utilizando um 5’UTR/promotor de desidrogenase de glutamato Chlorella sorokiniana e um 3’UTR reductase de nitrato Chlorella vulgaris. As sequencias de codificagao de tioesterase foram modificadas por remover as sequencias de direcionamento de plastfdio nativas e substituindo as mesmas com sequencias de direcionamento de plastfdio dos genomas Chlorella protothecoides e Prototheca moriformis. Os construtos de expressao de tioesterase e seus numeros de identificagao de sequencia correspondentes sao listados abaixo.
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[00402] Cada construto foi transformado em Prototheca moriformis (UTEX 1435) e selegao foi realizada utilizando G418 utilizando os metodos descritos no exemplo 4 acima. Varios clones positivos de cada transformagao foram captados e selecionados em relagao a presenga de transgene tioesterase utilizando analise Southern blotting. A expressao do transgene de tioesterase foi confirmada utilizando RT-PCR. Um subconjunto dos clones positivos (como confirmado por analise de Southern blotting e RT-PCR) de cada transformagao foi selecionado e cultivado para analise de perfil de lipideo. Amostras de lipideo foram preparadas de amostras de biomassa seca de cada clone e a analise de perfil de lipideo foi realizada utilizando metodos de hidrolise de acido descritos no exemplo 4. Alteragoes em percentagem de area do acido graxo correspondendo ao transgene de tioesterease foram comparadas com nlveis do tipo selvagem, e clones transformados com uma tioesterase com a sequencia de direcionamento de plastidic nativo.
[00403] Como mencionado no exemplo 4, os clones transformados com construtos de tioesterase Cuphea hookeriana C8-10 com a sequencia de direcionamento de plastfdio nativo tinham o mesmo nivel de acidos graxos C8 e CIO que o tipo selvagem. Os clones transformados com construtos de tioesterase C8-10 Cuphea hookeriana (Constructos 1-3) com sequencia de direcionamento de plastfdio de algas tiveram um aumento de mais de 10 vezes em acidos graxos CIO para o construto 3 e aumento de mais de 40 vezes em acidos graxos CIO para os construtos 1 e 2 (em comparagao como tipo selvagem). Os clones transformados com construtos de tioesterase Umbellularia californica C12 com a sequencia de direcionamento de plastfdio native tiveram um aumento modesto de 6-8 vezes em mveis de acido graxo C12 em comparagao com o tipo selvagem. Os clones transformados com os construtos de tioesterase C12 Umbellularia califomica com os construtos de direcionamento de plastfdio de algas (construtos 4-7) tiveram um aumento de mais de 80 vezes em nivel de acido graxo C12 para o construto 4, aproximadamente um aumento de 20 vezes em nivel de acido graxo C12 para o construto 6, aproximadamente um aumento de 10 vezes em nfvel de acido graxo C12 para o construto 7 e aproximadamente um aumento de 3 vezes em nfvel de acido graxo C12 para o construto 5 (todos comparados com o tipo selvagem). Os clones transformados com tioesterase Cinamomum camphora C12 com a sequencia de direcionamento de plastfdio nativo ou o construto 8 (com a sequencia de direcionamento de plastfdio desaturase ACP de estearoila Chlorella protothecoides) tiveram aproximadamente um aumento de 2-3 vezes em mveis de acido graxo C14 em comparagao como tipo selvagem. Em geral clones transformados com construtos de tioesterase de sequencia de direcionamento de plastfdio de algas tiveram um aumento em vezes superior nos mveis de acido graxo de comprimento de cadeia correspondente do que ao utilizar a sequencia de direcionamento de planta superior nativa.
A. Promotor Beta-tubulina Clamydomonas reinhartii
[00404] Constructos de expressao de tioesterase heterologas adicionais foram preparados utilizando o promotor beta-tubulina Chlamydomonas reinhardtii em vez do promotor desidrogenase glutamato C. sorokinana. Os elementos de construto e sequencia dos construtos de expressao sao listados acima. Cada construto foi transformado em celulas hospedeiras de Prototheca moriformis UTEX 1435 utilizando os metodos descritos acima. Perfis de lipfdeo foram gerados de um subconjunto de clones positives para cada construto a fim de avaliar o sucesso e produtividade de cada construto. Os perfis de lipfdeo comparam os mveis de acido graxo (expresso em % de area) com as celulas hospedeiras do tipo selvagem. A coluna “media” representa a media numerica do subconjunto de clones positivos. A coluna “amostra” representa o melhor clone positivo que foi selecionado (melhor sendo definido como a amostra que produziu a maior alteragao em % de area da produgao de acido graxo de comprimento de cadeia correspondente). A coluna “baixo-elevado” representa a menor % de area e a % de area mais elevada do acido graxo a partir dos clones que foram selecionados. Os resultados de perfis de lipideo dos construtos 9-23 sao resumidos abaixo.
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[00405] Os construtos 9-13 eram vetores de expressao contendo o construto tioesterase Cuphea hookeriana C8-10, Como pode ser visto nos sumarios de dados acima, os melhores resultados foram vistos com o construto 11, com o acido graxo C8 de amostra sendo 1,57% de area (em comparagao com 0 em tipo selvagem) e acido graxo CIO sendo 6,76 % de area (em comparagao com 0 em tipo selvagem). Houve tambem um aumento modesto em acidos graxos Cl2 (aproximadamente aumento de 2-5 vezes). Embora a sequencia de direcionamento de plastfdio nativo nao produzisse alteragao quando sob o controle do promotor desidrogenase de glutamato C. sorokinana, o mesmo construto de expressao acionado pelo promotor Betatubulina C. reinhardtii produziu alteragoes significativas em acidos graxos C8-10 na celula hospedeira. Isso e evidencia adicional das idiossincrasias de expressao heterologa de tioesterases em especies de Prototheca. Todos os clones contendo o construto de tioesterase C8-10 de promotor Beta-tubulina C. reinhardtii tiveram aumentos maiores em acidos graxos C8-10 do que os clones contendo o construto de tioesterase C8-10 de promotor de desidrogenase glutamato C. sorokinana. Os dados de perfil de lipfdeo para o construto 13 nao foram obtidos e, portanto, nao sao inclufdos acima.
[00406] Os construtos 14-18 eram vetores de expressao contendo o construto tioesterase C12 Umbellularia califomica. Como pode ser visto nos sumarios de dados acima, os melhores resultados foram vistos com os construtos 15 (sequencia de direcionamento de plastfdio de sintase difosfato isopentenil P. moriformis) e 17 (sequencia de direcionamento de plastfdio desaturase ACP estearoila C. protothecoides). A maior alteragao em produgao de acido graxo C12 foi vista com o construto 17, com mveis de acidos graxos C12 de ate 14,11% em area, em comparagao com 0,04% em area em tipo selvagem. Alteragoes modestas (aproximadamente 2 vezes) foram tambem vistas com nfveis de acido graxo C14, Quando comparado com os mesmos construtos com o promotor desidrogenase glutamato C. sorokinana, as mesmas tendencias eram verdadeiras com o promotor B.tubulin C. reinhardtii as sequencias de direcionamento de plastfdio de sintase difosfato isopentenil P. moriformis e desaturase ACP de estearofla C. protothecoides produziram a maior alteragao em nfveis de acido graxo C12 com os dois promotores.
[00407] Constructos 19-23 eram vetores de expressao contendo o construto de tioesterase C14 Cinnamomum camphora. Como pode ser visto nos sumarios de dados acima, os melhores resultados foram vistos com os construtos 22 e construto 23, A maior alteragao em produgao de acido graxo C14 foi vista com o construto 22, com nfveis de acido graxo C14 de ate 17,35% de area (quando os valores para C140 e C141 sao combinados), em comparagao com 1,40% em tipo selvagem. Alteragoes em acidos graxos C12 foram tambem vistas (5-60 vezes). Quando comparado com os mesmos construtos com o promotor de desidrogenase glutamato C. sorokinana, as mesmas tendencias eram verdadeiras com o promotor Beta-tubulina C. reinhardtii as sequencias de direcionamento de plastfdio desaturase ACP estearofla P. moriformis e desaturase ACP estearofla C. protothecoides produziram a maior alteragao em nfveis de acido graxo C14 com os dois promotores. Compativelmente com todos os construtos de expressao de tioesterase, os construtos de promotor Beta-tubulina C. reinhardtii produziram maiores alteragoes em nfveis de acido graxo C8-14 do que a desidrogenase glutamato C. sorokiniana.
[00408] Dois clones positivos do construto 22 foram selecionados e cultivados sob pressao seletiva elevada (50 mg/L G418). Apos 6 dias em cultura, os clones foram colhidos e seu perfil de lipfdeo foi determinado utilizando os metodos descritos acima. Os dados de perfil de lipfdeo sao resumidos abaixo e expresses em % de area.
[00409]
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[00410] Os dois clones, quando crescidos sob pressao seletiva elevada constante, produziram uma quantidade aumentada de acidos graxos C14 e Cl2, aproximadamente dobram os niveis vistos com o construto 22 acima. Esses clones fomeceram mais de 30% de area de acidos graxos Cl2-14, em comparagao com 1,5% de area de acidos graxos Cl2-14 vistos em celulas do tipo selvagem.
Exemplo 6: expressao heterdloga de Cuphea palustris e Ulmus americana Tioesterase em Prototheca
[00411] Dado o sucesso dos tioesterases de expressao heterologa acima descritos em especie de Prototheca, cassetes de expressao contendo sequencias otimizadas por codon (de acordo com a Tabela 1) que codificam tioesterases ACP-acila graxa de Cuphea palustris e Ulmus americana foram construidos e descritos abaixo.
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[00412] Ulmus americana (sequencia de codificagao otimizada por codon) pode ser inserida no cassete de expressao. A sequencia de codificagao otimizada por codon sem a sequencia de direcionamento de plastfdio nativo para a tioesterase Ulmus americana e listada como SEQ ID NO: 108 e pode ser fundida em qualquer sequencia de direcionamento de plastfdio desejado e elemento de expressao (isto e, promotor/5’ UTR e 3’UTR).
[00413] Esses cassetes de expressao podem ser transformados na especie Prototheca utilizando os metodos descritos acima. Clones positivos podem ser selecionados com a inclusao de um gene de resistencia a antibiotico (por exemplo, neoR) no construto de expressao e selecionado em meios/placas contendo G418, Clones positivos podem ser confirmados inutilizando ensaios Southern blot com sondas especificas para a regiao de codificagao de tioesterase heterologa e expressao do construto pode ser tambem confirmada utilizando RT-PCR e iniciadores especfficos para a regiao de codificagao da tioesterase heterologa. Confirmagao secundaria de clones positivos pode ser obtida por procurar alteragoes em mveis de acidos graxos no perfil de lipideo da celula hospedeira. Como visto nos exemplos acima, a expressao heterologa em especie de Prototheca de tioesterase pode ser idiossincratica para a tioesterase especifica. Elementos promotores e sequencias de direcionamento de plastfdio (e outros elementos reguladores de expressao) podem ser intercambiados ate que a expressao da tioesterase (e o aumento subseqtiente no acido graxo correspondente) atinja um nfvel desejado.
EXEMPLO 7: Transformantes duais expressao simultanea de duas proteinas heterdlogas
[00414] A cepa de microalgas Prototheca moriformis (UTEX 1435) foi transformada utilizando os metodos revelados acima com um construto de expressao que contem o gene de invertase de sacarose de levedura suc2 codificando a forma secretada da invertase S. cerevisiae. A expressao bem sucedida desse gene e direcionamento no periplasma resulta na capacidade da celula hospedeira crescer em (e utilizar sacarose) como uma fonte de carbono unica em condigoes heterotroficas (como demonstrado no exemplo 3 acima). O segundo conjunto de genes expresses sao tioesterases que sao responsaveis pela clivagem da fragao de acila a partir da proteina portadora de acila. Especificamente, tioesterases de Cuphea hookeriana (uma tioestererase que prefere C8-10), Umbellularia califomica (uma tioesterase que prefere C12) e Cinnamomum camphora (uma tioesterase que prefere C14). Esses cassetes de expressao de tioesterase foram clonados como fusoes com sequencias de direcionamento de plastfdio de microalgas terminais-N de Prototheca moriformis ou Chlorella protothecoides, que foram mostrados (nos exemplos acima) como sendo mais ideais do que as sequencias de direcionamento de plastfdio de planta superior nativas. A expressao bem sucedida dos genes de tioesterase e o direcionamento no plastfdio resultaram em alteragoes mensuraveis nos perfis de acido graxo na celula hospedeira. Essas alteragoes em perfis sao compatfveis com a especificidade enzimatica ou preferencia de cada tioesterase. Abaixo esta um sumario de construgoes de expressao dual que foram montadas e transformadas em Prototheca moriformis (UTEX 1435). Cada construto continha o gene de levedura suc2 sob o controle do promotor/5’UTR 0-tubulina C.reinhardtii e continha 3’UTR de reductase de nitrato C. vulgaris e uma tioesterase de planta superior com uma sequencia de direcionamento de plastfdio de microalgas substituindo a sequencia nativa sob o controle de 51 UTR de desidrogenase de glutamato C. sorokinana e continha 3’UTR de reductase de nitrato C. vulgaris. Abaixo esta um sumario da porgao de tioesterase das construgoes que foram montadas e transformadas em Prototheca moriformis (UTEX 1435). O cassete de expressao dual inteiro com o gene suc2 e o gene de tioesterase sao listados na Listagem de identificagao de sequencia.
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[00415] Constructos de expressao dual similares com os cassetes de tioesterase descritos no exemplo 5 (por exemplo, sob o controle de um promoter diferente como 5’UTR/promoter Beta-tubulina C. reinhardtii) tambem podem ser geradas utilizando metodos de biologia molecular padrao e metodos descritos aqui.
[00416] Clones positivos contendo cada das construgoes de expressao foram selecionados utilizando sua capacidade de crescer em placas contendo sacarose, onde sacarose e a fonte de carbono unica, como o fator de selegao. Um subconjunto desses clones positivos de cada transformagao de construto foi selecionado e a presenca do construto de expressao foi confirmada utilizando ensaios Southern blot. A fungao da invertase de sacarose de levedura foi tambem confirmada utilizando um ensaio de hidrolise de sacarose. Clones positivos foram selecionados e crescidos em meios contendo sacarose como a fonte de carbono unica em uma concentragao de partida de 40 g/L. Um controle negativo de Prototheca moriformis do tipo selvagem (UTEX 1435) crescido em meio contendo glicose como a fonte de carbono unica na mesma concentragao de partida de 40 g/L foi tambem inclufda. A utilizagao de sacarose foi medida durante todo o curso do experimento por medir o mvel de sacarose no meio utilizando um Analisador de Bioqufmica YSI 2700 com uma membrana especifica de sacarose. Apos seis dias em cultura, as culturas foram colhidas e processadas para perfil de lipideo utilizando os mesmos metodos como descrito acima. Os resultados de perfil de lipideo sao resumidos abaixo na tabela 17 e sao mostrados em % de area. Tabela 17. Perfis de lipfdeos de transformantes duais com invertase de sacarose suc2 e tioesterase
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[00417] Todos os clones positivos selecionados para o ensaio de utilizagao de sacarose foram capazes de hidrolisar a sacarose no meio e ao termino do penodo de cultura de 6 dias, nao houve mveis mensuraveis de sacarose nos meios. Esses dados, alem do uso bem sucedido de sacarose como uma ferramenta de selegao para clones positivos, indica que o gene de invertase de sacarose suc2 de levedura exogena foi atingido corretamente e expresso nos transformantes. Como mostrado na Tabela 17 acima, os clones que expressam o construto 24 (tioestearase C8-10) tiveram um aumento mensuravel em acidos graxos CIO (tao elevado quanto um aumento de oito vezes). De modo semelhante houve aumentos mensuraveis em clones que expressam o construto 25 (tioesterase C12) e construto 26 (tioesterase C14) nos acidos graxos de cadeia media correspondentes. Tornados juntos, os dados mostram a expressao simultanea bem sucedida em Prototheca moriformis duas proteinas recombinantes (por exemplo, invertase de sacarose e uma tioesterase ACP-acila de acido graxo), as quais conferem ambas as alteragoes fenotfpicas uteis e quantificaveis no organismo hospedeiro.
EXEMPLO 8: efeitos de glicerol sobre a produgao de acido graxo C10-C14 em transformantes de tioesterase C14
[00418] Clones de todas as transformagoes de tioesterase foram selecionados e adicionalmente avaliados. Um clone expressando Construgao 8 (Cinnamomum camphora C15 TE) foi cultivado heterotroficamente utilizando fontes de carbono diferentes; glicose somente, frutose somente e glicerol somente. A condigao de glicose somente resultou em crescimento de celulas mais elevado e produgao total de lipfdeos quando comparado com as condigoes de frutose somente e glicerol somente. Entretanto, a proporgao de acidos graxos Cl2-14 produzida na condigao de glicerol somente foi duas vezes mais elevada do que aquela obtida na condigao de glicose somente.
EXEMPLO 9: Expressao de invertase de Arabidopsis thaliana em Prototheca moriformis
[00419] A cepa de microalgas Prototheca moriformis (UTEX 1435) foi transformada utilizando metodos descritos acima, com um construto de expressao que contem uma invertase associada a parede de celula otimizada por codon (de acordo com a Tabela 1) a partir de Arabidopsis thaliana. A sequencia de invertase Arabidopsis foi modificada para incluir os 39 aminoacidos terminais-N de invertase de levedura (protema SUC2) para assegurar direcionamento eficiente no ER e finalmente periplasma. Para auxiliar a detecgao, um epitopo Flag foi adicionado a extremidade-C da protema recombinante. O transgene foi clonado em um vetor de expressao com uma regiao 5’UTR/promotor de desidrogenase de glutamato Chlorella sorokinianna e uma regiao 3’UTR de reductase nitrato Chlorella vulgaris. A sequencia de DNA desses cassetes de transgene e listada como SEQ ID NO: 89 e a sequencia de aminoacidos traduzida e listada como SEQ ID NO: 90. Clones positivos foram classificados e selecionados utilizando placas/meios contendo sacarose. Um subconjunto dos clones positivos foi confirmado em relagao a presenga do transgene e expressao de invertase utilizando analise Southern blot e analise Western blot para a invertase marcada com Flag. A partir dessas selegoes, 10 clones positivos foram escolhidos para ensaios de utilizagao de sacarose e produtividade de lipfdeo. Todos os 10 clones foram cultivados em meios contendo sacarose como a fonte de carbono unica e um transformante de invertase suc2 de controle positivo foi tambem incluido. O controle negativo, Prototheca moriformis do tipo selvagem, tambem foi cultivado, porem em meios contendo glicose. Apos seis dias, as celulas foram colhidas e secas e a percentagem total de lipfdeos por peso de celula seca foi determinada. O meio tambem foi analisado em relagao a consumo total de sacarose.
[00420] Todos os dez clones positivos foram capazes de hidrolisar sacarose, entretanto, a maioria dos clones cresceu aproximadamente metade bem como o tipo selvagem ou o transformante de invertase de levedura suc2 de controle positive como determinado por peso de celula seca no termino do experimento. Similarmente, todos os dez clones positivos produziram aproximadamente metade da quantidade total de lipideo quando comparado com o transformante de controle positive ou tipo selvagem.
EXEMPLO 10: Expressao heterdloga de invertase de levedura (suc2) em Prototheca krugani, Prototheca stagnora e Prototheca zopfii
[00421] Para testar a aplicabilidade geral dos metodos de transformagao para uso na especie do genero Prototheca, tres outras especies de Prototheca foram selecionadas: (prtotheca krugani (UTEX 329), Prototheca stagnora (UTEX 1442) e Prototheca zopfi (UTEX 1438). Essas tres cepas foram cultivadas no meio e condigoes descritas no exemplo 1 e seus perfis foram determinados utilizando os metodos descritos acima. Um sumario dos perfis de lipideo das tres cepas de Prototheca e resumido abaixo em % de area.
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[00422] Essas tres cepas foram transformadas com um cassete de expressao de invertase de levedura (suc2) (SEQ ID NO: 58) utilizando os metodos descritos no exemplo 3 acima. Esse cassete de expressao de invertase de levedura (suc2) foi demonstrado funcionar em Prototheca moriformis (UTEX 1435) acima no exemplo 3. Os transformantes foram selecionados utilizando meio/placas contendo sacarose. Um subconjunto dos clones positivos para cada especie de Prototheca foi selecionado e a presenga do transgene foi confirmada por analise Southern blot. Dez dos clones positivos confirmados de cada especie foram selecionados para analise de hidrolise de sacarose e produtividade de lipideo. Os clones foram cultivados em meio contendo sacarose como a fonte de carbono unica e comparados com sua copia do tipo selvagem crescida em glicose. Apos 6 dias, as culturas foram colhidas e secas e a percentagem total de lipideo e peso de celula seca foi avaliado. Os meios de cada cultura foram tambem analisados em relagao a hidrolise de sacarose utilizando um Analisador de Bioquimica YSI2700 para teor de sacarose durante o curso do experimento. Clones de todas as tres especies foram capazes de hidrolisar sacarose, com transformantes Prototheca stagnora e Prototheca zopfii sendo capazes de hidrolisar sacarose mais eficientemente do que Prototheca krugani. A produgao total de lipideos e peso de celula seca das tres especies de transformantes foram comparaveis com sua copia de tipo selvagem cultivada em glicose. Esses dados demonstram a transformagao bem sucedida e genes exogenos de expressao em multiplas especies do genero Prototheca.
EXEMPLO 11: Promotores derivados de algas e genes para uso em microalgas A. Sequencias de promotor e 5’UTR de Chlorella protothecoides
[00423] Uma biblioteca de cDNA foi gerada de Chlorella protothecoides cultivado de forma mixotrofica (UTEX 250) utilizando tecnicas padrao. Com base nas sequencias de cDNA, iniciadores foram projetados em certos genes de housekeeping conhecidos para “andar” a montante das regioes de codificagao utilizando um kit de Andar DNA de Seegene (Rockville, MD). As sequencias isoladas incluem uma actina (SEQ ID NO: 1) e fator de alongamento-la (EFla) (SEQ ID NO: 32) promotor/UTR, os quais contem ambos introns (como mostrado em letra minuscula) e exons (letra maiuscula em italico) e o sltio de partida previsto (em negrito) e dois elementos UTR/promotor de beta-tubulin: Isoforma A (SEQ ID NO: 33) e Isoforma B (SEQ ID NO: 34).
B. Sequencias de direcionamento de plastfdio e Enzima de biossmtese de lipfdeo de C. protothecoides
[00424] Da biblioteca de cDNA descrita acima, tres proteinas de codificagao de cDNAs funcionais em metabolismo de lipideo em Chlorella protothecoides (UTEX 250) foram clonadas utilizando os mesmos metodos como descrito acima. As sequencias de aminoacidos e nucleotideos para uma desaturase ACP acila (SEQ ID NOS: 45 e 46) e duas sintases de difosfato de geranila geranila (SEQ ID Nos: 47-50) sao incluldas na Listagem de sequencias abaixo. Adicionalmente, tres cDNAs com sequencias de sinal putativo de direcionamento ao plastfdio foram tambem clonados. As sequencias de aminoacido e nucleotideo para uma desidrogenase gliceraldeldo-3-fosfato (SEQ ID Nos: 51 e 52), uma proteina complexa que desprende oxigenio OEE33 (SEQ ID NOS: 53 E 53) e uma protease Clp (SEEQ ID nos: 55 e 56) sao incluldas na Listagem de sequencias abaixo. A sequencia de direcionamento de plastfdio putativa foi sublinhada tanto na sequencia de nucleotideos como de aminoacidos. As sequencias de direcionamento de plastfdio podem ser utilizadas para direcionar os produtos de transgenes para o plastfdio de microbios, como enzimas de modifica^ao de lipideo.
EXEMPLO 12: promotores/5’UTR que sao responsivos a nitrogenio a partir de Prototheca moriformis
[00425] Uma biblioteca de cDNA foi gerada de Prototheca moriformis (UTEX 1435) utilizando tecnicas padrao. As celulas Prototheca moriformis foram crescidas por 48 horas sob condigoes repletas de nitrogenio. A seguir um inoculo a 5% (v/v) foi entao transferido para abaixar nitrogenio e as celulas foram colhidas a cada 24 horas por sete dias. Apos aproximadamente 24 horas em cultura, o fomecimento de nitrogenio no meio estava totalmente esgotado. As amostras coletadas foram imediatamente congeladas utilizando gelo seco e isopropanol. O RNA total foi subseqiientemente isolado das amostras de pelota de celula congelada e uma porgao de cada amostra foi retida em reserva para estudos RT-PCR. O resto do RNA total colhido das amostras foi submetido a selegao poliA. Quantidades equimolares de RNA selecionado por poliA de cada condigao foram entao agrupadas e utilizadas para gerar uma biblioteca de cDNA em pcDNA3,0 vetor (Invitrogen). Aproximadamente 1200 clones foram aleatoriamente pegos da biblioteca de cDNA agrupada resultante e submetidos a seqiienciamento nas duas fitas. Aproximadamente 68 cDNAs diferentes foram selecionados entre essas 1200 sequencias e utilizados para projetar iniciadores especfficos de cDNA para uso em estudos de RT-PCR em tempo real.
[00426] O RNA isolado das amostras de pelota de celula que foram retidas em reserva foi utilizado como substrato nos estudos de RT-PCR em tempo real utilizando os conjuntos de iniciador especifico de cDNA gerados acima. Esse RNA reservado foi convertido em cDNA e utilizado como substrato para RT-PCR para cada dos 68 conjuntos de iniciador especifico de gene. Numeros CT OU ciclo limite foram utilizados para indicar abundancia de transcrito relativa para cada dos 68 cDNAs em cada amostra de RNA coletada durante todo o curso de tempo. cdDNAs que mostram aumento significativo (maior do que tres vezes) entre condigoes repletas de nitrogenio e com nitrogenio esgotado foram flagged como genes em potential cuja expressao foi regulada ascendentemente por deplegao de nitrogenio. Como discutido no relatorio descritivo, limitagao/deplegao de nitrogenio e um indutor conhecido de lipogenese em microorganismos oleaginosos.
[00427] Para identificar sequencias de promotores putativos/ 5’UTR dos cDNAs cuja expressao foi regulada ascendentemente durante limitagao / deplegao de nitrogenio, o DNA total foi isolado de Prototheca moriformis (UTEX 1435) crescida sob condigoes repletas de nitrogenio e foram entao submetidas a seqiienciamento utilizando tecnologia de seqiienciamento 454 (Roche). cDNAs flagged como sendo regulados ascendentemente pelos resultados de RT-PCR acima foram comparados utilizando BLAST contra contigs montados que se originam das 454 leituras de seqiienciamento genomico. As extremidades 5’ de cDNAs foram mapeadas para contigs especificos, e onde possivel maior do que 500 bp de DNA de flanquear 5’ foi utilizado para identificar putativamente promotores/UTRs. A presenga de promotores/5’UTR foi subseqiientemente confirmada e clonada utilizando amplificagao PCR de DNA genomico. Extremidades 5’ de cDNA individuals foram utilizadas para projetar iniciadores 3’ e extremidade 5’ das 454 montagens de contig foram utilizadas para projetar iniciadores especificos de gene 5’.
[00428] Como uma primeira selegao, um do promotor putativo, o promotor/5’UTR isolado de Aat2 (transportador de amonio, SEQ ID NO: 99) foi clonado no construto de tioesterase Cinnamomum camphora C14 com o peptfdeo de transito de desaturase ACP estearoila Chlorella protothecoides descrito no exemplo 5, acima, substituindo o promotor de desidrogenase glutamato C. sorokinana. Esse construto e listado como SEQ ID NO: 112. Para testar o promotor putativo, o construto de tioesterase e transformado em celulas de Prototheca moriformis para confirmar a atividade efetiva de promotor por selecionar para um aumento em acidos graxos Cl 4/C 12 sob condigoes de nitrogenio baixo/sem nitrogenio, utilizando os metodos descritos acima. Teste similar dos promotores regulados por nitrogenio putativo isolados da selegao genomica/cDNA pode ser feito utilizando os mesmos metodos.
[00429] Outros promotores regulados por nitrogenio putativos/5’UTRs que foram isolados da selegao genomica/cDNA foram:
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[00430] O aumento em vezes se refere ao aumento em vezes em abundancia de cDNA apos 24 horas de cultura em meio de nitrogenio baixo.
EXEMPLO 13: recombinagao homologa em especie de Prototheca
[00431] Recombinagao homologa de transgenes tem varias vantagens em relagao aos metodos de transformagao descritos nos exemplos acima. Primeiramente, a introdugao de transgenes sem recombinagao homologa pode ser imprevisfvel porque nao ha controle sobre o numero de copias do plasnudio que e introduzido na celula. Alem disso, a introdugao de transgenes sem recombinagao homologa pode ser instavel porque o plasmideo pode permanecer epissomal e e perdido durante divisoes subseqiientes de celulas. Outra vantagem de recombinagao homologa e a capacidade de “abater” alvos de gene, introduzir marcadores de epitopo, comutar promotores de genes endogenos e de outro modo alterar alvos de gene (por exemplo, a introdugao de mutagoes de ponto).
[00432] Dois vetores foram construfdos utilizando uma regiao especffica do genoma Prototheca moriformis (UTEX 1435), designada KE858, KE858 e um fragmento genomico de 1,3 kb, que abrange parte da regiao de codificagao para uma protema que compartilha homologia com a famflia de RNA de transferencia (tRNA) de protemas. Southern blots mostraram que a sequencia KE858 esta presente em uma unica copia no genoma de Prototheca moriformis (UTEX 1435). O primeiro tipo de vetor que foi constrmdo, designado SZ725 (SEQ ID NO: 103) consistiu no fragmento KE858 de 1,3 kb inteiro clonado em uma espinha dorsal de vetor pUC198 que tambem contem o gene de invertase de levedura otimizada (suc2) utilizado no exemplo 3 acima. O fragmento KE858 contem um sftio SnaBl exclusive que nao ocorre em nenhum outro lugar no construto de “targeting”. O segundo tipo de vetor que foi constrmdo, destinado SYZ726 (SEQ ID NO: 126), consistiu na sequencia KE858 que tinha sido rompida pela insergao do gene de invertase de levedura (suc2) no sftio SnaBl na sequencia genomica KE858. O fragmento de DNA inteiro contendo as sequencias KE858 que flanqueiam o gene de invertase de levedura pode ser excisado da espinha dorsal de vetor por digestao com EcoRI, que corta em qualquer extremidade da regiao KE858.
[00433] Os dois vetores foram utilizados para orientar recombinagao homologa do gene de invertase de levedura (suc2) par a regiao KE858 correspondente do genoma Prototheca moriformis (UTEX 1435). As extremidades de DNA lineares homologas a regiao genomica que estava sendo alvo para recombinagao homologa foram expostas por digestao do construto de vetor SZ725 com SnaBl e construto de vetor SZ725 com EcoRI. Os construtos de vetor digeridas foram entao introduzidas em culturas de Prototheca moriformis utilizando metodos descritos acima no exemplo 3. Transformantes de cada construto de vetor foram entao selecionados utilizando placas de sacarose. Dez transformantes clonalmente puros independentes de cada transformagao de vetor foram analisados para recombinagao bem sucedida do gene de invertase de levedura no local genomico desejado (utilizando Southern blots) e para estabilidade de transgene.
[00434] A analise Southern blot dos transformantes SZ725 mostrou que 4 dos 10 transformantes pegos para analise continham as faixas recombinantes previstas, indicando que um unico evento de cruzamento tinha ocorrido entre as sequencias KE858 no vetor e as sequencias KE858 no genoma. Ao contrario, todos os dez dos transformantes SZ726 continham as faixas recombinantes previstas, indicando que eventos de cruzamento duplo tinharn ocorrido entre o fragmento EcoRI de pSZ726 portando a sequencia KE858 que flanqueia o transgene de invertase de levedura e a regiao KE858 correspondente do genoma.
[00435] A expressao de invertase de sacarose e estabilidade de transgene foram avaliadas por cultivar os transformantes por mais de 15 geragoes na ausencia de selegao. Os quatro transformantes SZ725 e os dez transformantes SZ726 que eram positivos para o transgene por Southern blotting foram selecionados e 48 colonias unicas de cada dos transformantes foram cultivadas em serie: primeiramente sem selegao em meio contendo glicose e entao com selegao em meio contendo sacarose como a fonte de carbono unica. Todos os dez transformantes SZ726 (100%) retiveram sua capacidade de crescer em sacarose apos 15 geragoes, ao passo que aproximadamente 97% dos transformantes SZ725 retiveram sua capacidade de crescer em sacarose apos 15 geragoes. Transgenes introduzidos por um evento de cruzamento duplo (vetor SZ726) tern estabilidade extremamente elevada em relagao a duplicagoes de geragao. Ao contrario, transgenes introduzidos por um evento de cruzamento unico (vetor SZ725) podem resultar em alguma instabilidade durante duplicagoes de geragao porque copias tandem dos transgenes foram introduzidas, as regioes homologas repetidas flanqueando os transgenes podem recombinar e cortar o DNA transgenico localizado entre as mesmas.
[00436] Esses experimentos demonstram o uso bem sucedido de recombinagao homologa para gerar transformantes de Prototheca contendo um gene de invertase de sacarose heterologo que e estavelmente integrado nos cromossomos nucleares do organismo. O sucesso da recombinagao homologa permite que outras alteragoes genomicas em Prototheca, incluindo delegoes de gene, mutagoes de ponto e marcagao de epitopo de um produto de gene desejado. Esses experimentos tambem demonstram o primeiro sistema documentado para recombinagao homologa no genoma nuclear de uma microalga eucariotica.
A. Uso de recombinagao homologa para nocautear um gene de Prototheca moriformis endogeno
[00437] Na selegao genomica/cDNA de Prototheca moriformis descrita no exemplo 11 acima, um cDNA desaturase ACP estearofla endogeno (SAPD) foi identificado. Enzimas de desaturase ACP de estearofla e parte da via de smtese de lipideo e funcionam para introduzir ligagoes duplas nas cadeias de acila graxa. Em alguns casos, pode ser vantajoso nocautear ou reduzir a expressao de enzimas de via de lipideo para alterar um perfil de acido graxo. Um construto de recombinagao homologa foi criado para avaliar se a expressao de uma enzima de desaturase ACP estearofla endogena pode ser reduzida (ou nocauteada) e se uma redugao correspondente em acidos graxos insaturados pode ser observada no perfil de lipideo da celula hospedeira. Uma sequencia de codificagao de aproximadamente 1,5 kb de um gene desaturase ACP estearofla de Prototheca moriformis (UTEX 1435) foi identificada e clonada (SEQ ID NO: 104). O construto de recombinagao homologa foi constrmdo utilizando 0,5 kb da sequencia de codificagao SAPD na extremidade 5’ (sftio alvo 5’), seguido pelo promotor Beta-tubulina Chlamydomonas reinhadtii acionando um gene suc2 invertase de sacarose de levedura otimizada por codon com o Chlorella vulgaris 3’UTR. O resto (~lkb) da sequencia de codificagao SAPD de Prototheca moriformis foi entao inserido apos C.vulgaris 3’UTR para compor o sftio alvo 3’. A sequencia para esse cassete de recombinagao homologa e listada na SEQ ID NO: 105. Como mostrado acima, a taxa de sucesso para integragao do cassete de recombinagao homologa no genoma nuclear pode ser aumentada por linearizar o cassete antes de transformar as microalgas, deixando extremidades expostas. O cassete de recombinagao homologa que “mira” uma enzima SAPD endogena em Prototheca moriformis e linearizado e entao transformado na celula hospedeira (Prototheca moriformis, UTEX 1435). Uma integragao bem sucedida eliminara a regiao de codificagao de enzima SAPD endogena a partir do genoma hospedeiro atraves de um evento de recombinagao recfproca duplo, enquanto a expressao do gene suc2 recentemente inserido sera regulada pelo promotor Beta-tubulina C. reinhardtii. Os clones resultantes podem ser selecionados utilizando placas/meios contendo sacarose como a fonte de carbono unica. Clones contendo uma integragao bem sucedida do cassete de recombinagao homologa terao a capacidade de crescer em sacarose como a fonte de carbono unica e alteragoes em saturagao geral dos acidos graxos no perfil de lipfdeo servirao como um fator de confirmagao secundario. Adicionalmente, ensaios de Southern blotting utilizando uma sonda especffica para o gene suc2 de invertase de sacarose de levedura e RT-PCR podem tambem confirmar a presenga e expressao do gene de invertase em clones positivos. Como altemativa, o mesmo construto sem o promotor Beta-tubulina pode ser utilizado para cortar a regiao de codificagao de enzima SAPD endogena. Nesse caso, o gene suc6 de invertase de sacarose de levedura recentemente inserido sera regulado pelo promotor SAPD endogeno/5’UTR.
EXEMPLO 14: produgao de combustfvel A. Extracao de oleo de microalgas utilizando uma prensa de extrator e um meio auxiliar de prensa
[00438] Biomassa de microalgas contendo 38% de oleo por DCW foi seca utilizando um secador de tarnbor resultando em teor de umidade de 55,5%. A biomassa foi alimentada para uma prensa L250 francesa. 30,4 kg (67 lbs) de biomassa foram alimentados atraves da prensa e nenhum oleo foi recuperado. A mesma biomassa microbiana seca combinada com percentagem variavel de switchgrass como um meio auxiliar de prensa foi alimentada atraves da prensa. A combinagao de biomassa microbiana seca e 20% peso/peso de switchgrass fomeceu a melhor percentagem geral de recuperagao de oleo. As massas prensadas foram entao submetidas a extragao de hexano e o rendimento final para a condigao de 20% de switchgrass foi de 61,6% do oleo total dispomvel (calculado em peso). Biomassa com mais de 50% de oleo em peso de celula seca nao exigiu o uso de um meio auxiliar de pressao como switchgrass para liberar oleo.
B. Composicao de monossacarfdeo de biomassa deslipidada de Prototheca moriformis
[00439] Prototheca moriformis (UTEX 1435) foi cultivada em condigoes e meios de nutrientes (com 4% de glicose) como descrito no exemplo 45 acima. A biomassa de microalgas foi entao colhida e seca utilizando um secador de tarnbor. A biomassa de algas secas foi lisada e o oleo extrafdo utilizando uma prensa de extrator como descrito no exemplo 44 acima. O oleo residual na biomassa prensada foi entao extrafdo com solvente utilizando eter de petroleo. Eter de petroleo residual foi evaporado do farelo deslipidado utilizando um Rotavapor (Buchi Labortechnik AG, Sufga). A analise de composigao de Glicosila (monossacarfdeo) foi entao realizada no farelo deslipidado utilizando cromatografia de gas/espectrometria de massa, (GC/MS) combinada dos derivados per-O-trimetil silila (TMS) do monossacarfdeo metil glicosfdeo produzidos da amostra por metanolise acfdica. Uma amostra de farelo deslipidado foi submetida a metanolise em IM HC1 em metanol a 80°C por aproximadamente 20 horas, seguido por reN-acetilagao com piridina e anidrido acetico em metanol (para detecgao de amino agucares). As amostras foram entao per-O-trimetil sililadas por tratamento com Tri-Sil (Pierce) a 80°C por 30 minutos (vide os metodos em Merkle e Poppe (1994) Methods Enzymol. 230: 1-15 e York e outros, (1985) Methods Enzymol. 118:3-40). A analise de GC/MS do TMS metal glicosideo foi realizada em um HP 6890 GC com interface com um 5975b MSD, utilizando uma coluna capilar de silica fundida EC-1 All Tech (30m x 0,25 mm ID). Os monossacandeos foram identificados por seus tempos de retengao em comparagao com padroes, e o carater de carboidrato desses sao autenticados por seus espectros de massa. 20 microgramas por amostra de inositol foram adicionados a amostra antes de derivagao como padrao intemo. O perfil de monossacandeo da biomassa de Protoheca moriformis (UTEX 1435) deslipidada e resumido na tabela 18 abaixo. A percentagem total de carboidrato da amostra foi calculada como sendo 28,7%. Tabela 18. Analise de composigao de monossacandeo (glicosila) de biomassa deslipidada de Prototheca moriformis (UTEX 1435)
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n.d. = nenhum detectado
[00440] O teor de carboidrato e composigao de monossacandeo do farelo deslipidado toma o mesmo apropriado para uso como uma ragao de animal ou como parte de uma formulagao de ragao de animal. Desse modo, em um aspecto, a presente invenção prove farelo deslipidado tendo o teor de produto exposto na tabela acima.
C. Produgao de biodiesel a partir de oleo de Prototheca
[00441] Oleo sem goma de Prototheca moriformis UTEX 1435, produzido de acordo com os metodos descritos acima, foi submetido a transesterificagao para produzir esteres de metila de acido graxo. Os resultados sao mostrados abaixo:
[00442] O perfil de lipfdeo do oleo foi:
Figure img0057
Tabela 19. Perfil de biodiesel de oleo de triglicendeo de Prototheca moriformis.
Figure img0058
Figure img0059
Figure img0060
[00443] O perfil de lipideo do biodiesel foi altamente similar ao perfil de lipideo do oleo de insumo. Outros oleos fomecidos pelos metodos e composigoes da invenção podem ser submetidos a transesterificagao para fomecer biodiesel com perfis de lipideo incluindo (a) pelo menos 4% C8C14; (b) pelo menos 0,3% C8; (c) pelo menos 2% CIO; (d) pelo menos 2% C12; e (3) pelo menos 30% C8-C14.
[00444] O metodo de capacidade de filtragao de embeber frio pelo ASTM D6751 Al do biodiesel produzido foi de 120 segundos para um volume de 300 ml. Esse teste envolve filtragao de 300 ml de B100, resfriado a 40°F por 16 horas, deixado aquecer em temp, ambiente, e filtrado sob vacuo utilizando filtro de fibra de vidro de 0,7 micron com suporte de ago inoxidavel. Oleos da invenção podem ser transesterificados para gerar biodiesel com um tempo de embeber frio menor do que 120 segundos, menor do que 100 segundos e menor do que 90 segundos.
D. Producao de diesel renovavel
[00445] Oleo sem goma de Prototheca moriformis UTEX 1435, produzido de acordo com os metodos descritos acima e tendo o mesmo perfil de lipideo que o oleo utilizado para fazer biodiesel no exemplo X acima, foi submetido a transesterificagao para produzir diesel renovavel.
[00446] O oleo foi primeiramente hidrotratado para remover oxigenio e a espinha dorsal de glicerol, fomecendo n-parafinas. As n-parafinas foram entao submetidas a craqueamento e isomerizagao. Um cromatograma do material e mostrado na figura 13. O material foi entao submetido a filtragao fria, que removeu aproximadamente 5% do material Cl8. Apos a filtragao fria o total de volume de material foi cortado para ponto de inflamagao e avaliado para ponto de inflamagao, distribuigao de destilagao ASTM D-86, ponto de nevoa e viscosidade. O ponto de inflamagao foi de 63°C; a viscosidade foi de 2,86 cSt (centiStokes); o ponto de nevoa foi de 4°C. os valores de destilagao ASTM D86 sao mostrados na tabela 20: Tabela 20. Leituras em °C:
Figure img0061
[00447] O T10-T90 do material produzido foi de 57,9°C. os metodos de hidrotratamento, isomerizagao e outra modificagao covalente de oleos revelados aqui, bem como metodos de destilagao e fracionamento (como filtragao fria) revelados aqui, podem ser empregados para gerar composigoes de diesel renovavel com outras faixas T10-T90, como 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60 e 65°C utilizando oleos de triglicendeo produzidos de acordo com os metodos revelados aqui.
[00448] O T10 do material produzido foi de 242,1°C. os metodos de hidrotratamento, isomerizagao e outra modificagao covalente de oleos revelados aqui, bem como metodos de destilagao e fracionamento (como filtragao fria) revelados aqui, podem ser empregados para gerar composigoes de diesel renovavel com outros valores T10, como T10 entre 180 e 295, entre 190 e 270, entre 210 e 250, entre 225 e 245, e pelo menos 290.
[00449] O T90 do material produzido foi de 300°C. Os metodos de hidrotratamento, isomerizagao e outra modificagao covalente de oleos revelados aqui, bem como metodos de destilagao e fracionamento (como filtragao fria) revelados aqui, podem ser empregados para gerar composigoes de diesel renovavel com outros valores T90, como T90 entre 280 e 380, entre 290 e 360, entre 300 e 350, entre 310 e 340 e pelo menos 290.
[00450] O FBP do material produzido foi de 300°C. Os metodos de hidrotratamento, isomerizagao e outra modificagao covalente de oleos revelados aqui, bem como metodos de destilagao e fracionamento (como filtragao fria) revelados aqui, podem ser empregados para gerar composigoes de diesel renovavel com outros valores FBP, como FBP entre 290 e 400, entre 300 e 385, entre 310 e 370, entre 315 e 360, e pelo menos 300.
[00451] Outros oleos fomecidos pelos metodos e composigoes da invenção podem ser submetidos a combinagoes de hidrotratamento, isomerizagao e outra modificagao incluindo oleos com perfis de lipideo incluindo (a) pelo menos 4% C8-C14; (b) pelo menos 0,3% C8; (c) pelo menos 2% CIO; (d) pelo menos 2% C12; e(3) pelo menos 30% C8-C14.
EXEMPLO 15: Utilizagao de sacarose por Chlorella luteoviridis A. SAG 2214 Crescimento em glicose e sacarose
[00452] SAG 2214 (designado como Chlorella luteoviridis) foi testado para crescimento no escuro em meio contendo glicose ou sacarose. Culturas de liquido heterotrofico foram iniciadas utilizando inoculo de um fiasco congelado em meio contendo 4% de glicose ou 4% de sacarose como a fonte de carbono unica. Culturas foram cultivadas no escuro, agitando a 200 rpm. As amostras das culturas foram tiradas a 0, 24, 48 e 72 horas de pontos de tempo e o crescimento foi medido por absorvencia relativa em 750 nm (UV Mini1240, Shimadzu). SAG 2214 cresceu igualmente bem em glicose como em sacarose, mostrando que essa microalga pode utilizar sacarose tao eficazmente como glicose como uma fonte de carbono unica. O resultado desse experimento e representado graficamente na figura 3.
B. Produtividade de lipideo e perfil de acido graxo para SAG 2214
[00453] A cepa de microalgas SAG 2214 foi cultivada em meio Ifquido contendo glicose ou sacarose como a fonte de carbono unica em condigoes similares como descrito no exemplo 32 acima. Apos 7 dias, celulas foram colhidas para calculo de peso de celula seca. As celulas foram centrifugadas e liofilizadas por 24 horas. As pelotas de celula seca foram pesadas e o peso de celula seca por litro foi calculado. As celulas para analise de lipfdeo foram tambem colhidas e centrifugadas em 4000 x g por 10 minutos em temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e as amostras foram processadas para analise de lipfdeo e perfil de acido graxo utilizando procedimentos de cromatografia de gas padrao (GC/FID). Os resultados sao resumidos abaixo nas tabelas 21 e 22. Tabela 21. Produtividade de lipfdeo e DCW para SAG 2214,
Figure img0062
Tabela 22. Perfil de Acido graxo para SAG 2214,
Figure img0063
C. Comparacao genomica de SAG 2214 com outras cepas ChloreUa luteoviridis
[00454] A cepa de microalgas SAG 2214 provou ser de interesse geral devido a sua capacidade em crescer em sacarose como uma fonte de carbono (ilustrada acima). Alem das caracterfsticas de crescimento dessa cepa, sua relagao taxonomica com outras especies de microalgas foi tambem de interesse. Designada pela colegao SAG como uma cepa Chlorella luteoviridis, o gene rRNA 23s de SAG 2214 foi seqiienciado em comparado com a sequencia genomica 23s rRNA de nove outras cepas tambem identificadas pelas colegoes UTEX e SAG como Chlorella luteoviridis. Essas cepas eram UTEX 21, 22, 28, 257 e 258, e cepas SAG 2133, 2196, 2198 e 2203. Os metodos de genotipagem de DNA utilizados foram iguais aos metodos descritos acima no exemplo 1, Alinhamentos de sequencia e arvores nao enraizadas foram geradas utilizando software de analise de DNA Geneious. De outras cepas que eram genotipos, UTEX 21, 22, 28 e 257 tinham sequencia de DNA rRNA 23s identica (SEQ ID NO: 106). As outras cinco cepas Chlorella luteoviridis tinharn sequencias rRNA 23 s que eram altamente homologas a UTEX 21, 22, 28, e 257.
[00455] A sequencia de gene rRNA 23s de SAG 2214 (SEQ ID NO: 30) e decididamente diferente daquela das outras noves cepas C. luteoviridis, tendo uma grande insergao que nao foi encontrada nas outras cepas. A analise adicional dessa sequencia de gene rRNA 23s utilizando BLAST indicou que compartilhou a maior homologia com membros do genero Leptosira e Trebouxia (membros de porgao ficobionte de liquens). Esses resultados indicaram que SAG 2214 pode nao ser cepa Chlorella luteoviridis como categorizado pela colegao de cepas, porem em vez disso compartilha identidade de nucleotideo rRNA 23 s significativa com simbiontes de algas encontrados em Ifquen. A analise genomica juntamente com as caracterfsticas de crescimento indicam que SAG 2214 podem ser uma fonte para genes e proteinas envolvidas no metabolismo de sacarose, bem como peptfdeos de transito e sinalizagao responsaveis pela localizagao correta de tais enzimas. SAG 2214 e outras cepas com alto grau de similaridade genomica podem ser tambem cepas uteis para produgao de oleo utilizando sacarose como fonte de carbono fixo.
[00456] Embora a presente invenção tenha sido descrita com relagao a modalidades especificas da mesma, sera entendido que e capaz de modificagoes adicionais. Esse pedido pretende cobrir quaisquer variagoes, usos ou adaptagoes da invenção seguindo, em geral, os principios da invenção e incluindo tais afastamentos da presente revelagao como compreendidos em pratica conhecida ou costumeira na tecnica a qual a invenção pertence e como pode ser aplicado as caracterfsticas essenciais expostas acima.
[00457] Todas as referencias citadas aqui, incluindo patentes, pedidos de patente, e publicagoes sao pela presente incorporadas a tftulo de referenda na Integra, quer ou nao anteriormente especificamente incorporadas. As publicagoes mencionadas aqui sao citadas para fins de descrever e revelar reagentes, metodologias e conceitos que podem ser utilizados com relagao a presente invenção. Nada aqui deve ser interpretado como admissao de que essas referencias sao tecnica anterior em relagao as invengoes descritas aqui. Em particular, os seguintes pedidos de patente sao pela presente incorporadas a tftulo de referenda na integra para todas as finalidades: Pedido provisional US 60/941.581, depositado em 1 de junho de 2007, intitulado “Production of Hydrocarbons in Microorganisms”; Pedido provisional US 60/959.174, depositado em 10 de julho de 2007, intitulado “Production of Hydrocarbons in Microorganisms”; Pedido provisional US 60/968.291, depositado em 27 de agosto de 2007, intitulado “Production of Hydrocarbons in Microorganisms”; Pedido provisional US 61/024.069, depositado em 28 de Janeiro de 2008, intitulado “Production of Hydrocarbons in Microorganims”; Pedido PCT No. PCT/US08/65563, depositado em 2 de junho de 2008, intitulado “Production of Oil in Microorganisms”; Pedido de patente US 12/131.783, depositado em 2 de junho de 2008, intitulado “Use of Cellulosic Material for Cultivation of Microorganisms”; Pedido de patente US 12/131.773, depositado em 2 de junho de 2008, intitulado “Renewable Diesel and Jet Fuel from Microbial Sources”; Pedido de patente US 12/131.793, depositado em 2 de junho de 2008, intitulado “Sucrose Feedstock Utilization for Oil-Based Fuel Manufacturing”; Pedido de patente US 12/131.766, depositado em 2 de junho de 2008, intitulado “Glycerol Feedstock Utilization for Oil-Based Fuel Manufacturing”; Pedido de patente US 12/131.804, depositado em 2 de junho de 2008, intitulado “Lipid Pathway Modification in Oil-Bearing Microorganisms”; Pedido de patente US 61/118.590, depositado em 28 de novembro de 2008, intitulado “Production of Oil in Microorganisms”; Pedido de patente provisional US 61/118.994, depositado em 1 de dezembro de 2008, intitulado “Production of Oil in Microorganisms”; Pedido de patente provisional US 61/174.357, depositado em 3 de abril de 2009, intitulado “Production of Oil in Microorganisms”; Pedido de patente provisional US 61/219.525, depositado em 23 de junho de 2009, intitulado “Production of Oil in Microorganisms”; e Pedido PCT No.[[Numero do dossie do procurador 026172-005010PC]], depositado em 30 de novembro de 2009, intitulado “Production of Tailored Oils in Heterotrophic Microorganisms”.

Claims (20)

1. Composigao de oleo de triglicendeo, produzida pelocultivo de celulas de Prototheca recombinantes e extraidas a partir de ditas celulas por meio de extragao por solvente ou usando uma prensa expelidora, em que as celulas compreendem um gene exogeno que codifica uma acil-ACP tioesterase graxa, , caracterizada em que a composigao de oleo compreende um perfil de lipidios de: (a) pelo menos 4% de C8 a C14; e (b) um ou mais dos seguintes atributos: i. 0,1 0,4 micrograma/ml de carotenoides; totais; ii. menos do que 0,4 microgramas/ml de carotenoides totais; iii. menos de 0,001 micrograma/ml de licopeno; e iv. menos de 0,02 micrograma/ml de beta caroteno.
2. Composigao de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as celulas sao cultivadas na presenga de uma fonte de carbono fixa selecionada do grupo que consiste de sacarose, glicose, frutose, suco de cana e material celulosico despolimerizado, em que dito material celulosico e opcionalmente polpa de beterraba.
3. Composigao de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as celulas adicionalmente compreendem um gene exogeno que codifica uma sacarose invertase.
4. Composigao de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que as celulas sao cultivadas na presenga de sacarose.
5. Composigao de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as celulas sao cultivadas na presenga de sacarose obtida de sorgo, cana-de-agucar ou beterraba.
6. Composigao de acordo com qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 5, caracterizada pelo fato de que as celulas possuem um 23S rRNA compreendendo uma sequencia com pelo menos 70% de identidade de nucleotfdeos com as sequencias de nucleotfdeos de um ou mais deSEQIDNOs: 11-19.
7. Composigao de acordo com qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o gene exogeno ou genes exogenos sao otimizados em codon para expressao em Prototheca.
8. Composigao de acordo com qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 7, caracterizada pelo fato de que as celulas sao selecionadas do grupo que consiste de Prototheca moriformis, Prototheca krugani, Prototheca stagnora, Prototheca wickerhamii e Prototheca zopfii.
9. Composigao de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que as celulas sao Prototheca moriformis.
10. Composigao de acordo com qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o gene exogeno adicionalmente compreende uma sequencia de direcionamento ao plastfdio de microalga.
11. Composigao de acordo com qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 10, caracterizada pelo fato de que o gene exogeno que codifica o acil-ACP tioesterase graxa e otimizado em codon para expressao em Prototheca, em que a sequencia codificante do gene exogeno contem o codon mais ou o segundo mais preferido da Tabela 1 para pelo menos 60% dos codons da sequencia codificante.
12. Metodo para preparar um oleo misturado, caracterizado pelo fato de misturar ao composigao de oleo de triglicerideos como definido em qualquer uma das reivindicação 1 a 11 com um oleo selecionado do grupo consistindo em oleo de soja, oleo de semente de colza, oleo de canola, oleo de palma, oleo de semente de palma, oleo de coco, oleo de milho, oleo vegetal residual, oleo de sebo chines, oleo de oliva, oleo de girassol, oleo de semente de algodao, gordura de galinha, sebo bovino, sebo sumo, oleo de microalgas, oleo de macroalgas, oleo de Cuphea, oleo de linho, oleo de amendoim, gordura branca de escolha, toucinho, oleo de Camelina sativa, oleo de semente de mostarda, oleo de noz de caju, oleo de aveia, oleo de tremogo, oleo de canhamo brasileiro, oleo de calendula, oleo de canhamo, oleo de cafe, oleo de linhaga, oleo de noz, oleo de euforbia, oleo de semente de abobora, oleo de coentro, oleo de camelina, oleo de gergelim, oleo de agafrao, oleo de arroz, oleo de tungue, oleo de cacau, oleo de copra, oleo de papoula, oleo de ncino, oleo de noz peca, oleo de jojoba, oleo de jatrofa, oleo de macadamia, oleo de castanha do para, oleo de abacate, petroleo e uma fragao destilada dos mesmos.
13. Metodo para fabricar um composto quimico, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de realizar uma ou mais reagoes quimicas selecionadas do grupo consistindo em (a) transesterificagao, hidrogenagao, hidrocraqueamento, desoxigenagao, isomerizagao, esterificagao, hidroxilagao, hidrolise para gerar acidos graxos livres, e saponificagao na composigao de oleo como definida na reivindicação 1 a 11, ou(b) hidroprocessamento, desoxigenagao, e remogao de gas na composigao de oleo como definida em qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 11.
14. Metodo para preparar um composto quimico, caracterizado pelo fato de compreende as etapas de: (i) misturar a composigao de oleo de triglicendeo como definido em qualquer uma das reivindicaçoes 1 a 11 com um oleo selecionado do grupo consistindo em oleo de soja, oleo de semente de colza, oleo de canola, oleo de palma, oleo de semente de palma, oleo de coco, oleo de milho, oleo vegetal residual, oleo de sebo chines, oleo de oliva, oleo de girassol, oleo de semente de algodao, gordura de galinha, sebo bovino, sebo sumo, oleo de microalgas, oleo de macroalgas, oleo de Cuphea, oleo de linho, oleo de amendoim, gordura branca de escolha, toucinho, oleo de Camelina sativa, oleo de semente de mostarda, oleo de noz de caju, oleo de aveia, oleo de tremogo, oleo de canhamo brasileiro, oleo de calendula, oleo de canhamo, oleo de cafe, oleo de linhaga, oleo de noz, oleo de euforbia, oleo de semente de abobora, oleo de coentro, oleo de camelina, oleo de gergelim, oleo de agafrao, oleo de arroz, oleo de tungue, oleo de cacau, oleo de copra, oleo de papoula, oleo de ncino, oleo de noz peca, oleo de jojoba, oleo de jatrofa, oleo de macadamia, oleo de castanha do para, oleo de abacate, petroleo e uma fragao destilada dos mesmos; e (ii) realizar um ou mais reagoes quimicas selecionadas do grupo que consiste de (a) transesterificagao, hidrogenagao, hidrocraqueamento, desoxigenagao, isomerizagao, interesterificagao, hidroxilagao, hidrolise para gerar acidos graxos livres, e saponificagao na composigao de oleo obtida em (i), ou (b) hidroprocessamento, desoxigenagao e remogao de gas na composigao de oleo obtida em (i).
15. Metodo de acordo com qualquer uma das reivindicaçoes 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais reagoes quimicas e selecionada de hidrogenagao, hidrocraqueamento e desoxigenagao.
16. Metodo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a uma ou mais reagoes quimicas e hidrolise para liberar acidos graxos livres.
17. Metodo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a reagao de hidrolise da composigao de oleo e selecionada do grupo que consiste em hidrolise acida, hidrolise alcalina, hidrolise enzimatica, hidrolise catalitica e hidrolise de agua comprimida a quente, incluindo uma reagao de hidrolise catalitica em que o oleo e dividido em glicerol e acidos graxos.
18. Metodo, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os ditos acidos graxos sao submetidos a uma reagao quimica adicional selecionada do grupo consistindo em aminagao ou ozonolise.
19. Metodo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que uma ou mais reagoes e hidroprocessamento.
20. Metodo de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que uma ou mais reagoes quimicas e desoxigenação.
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