CN103352022A - 一种生物培养专用多元微量元素添加剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物培养专用多元微量元素添加剂，尤其适用于植物细胞培养、真菌培养和动物细胞培养等多种生物活性材料培养过程中补充多元微量元素之用。本发明的多元微生物元素添加剂，命名为“超级动力素”，以生物体所需的全部微量元素经过与乙二胺四乙酸(EDTA)在高温回流下螯合而成，包括亚铁、镁、锌、铜、钼、硼、钴、锰、铈、镧等金属盐按一定比例与EDTA共溶解并沸腾回流7小时所获得深紫色澄清溶液，将该溶液以万分之一比例添加于生物培养基中。本发明的添加剂具有高度稳定性、宽pH耐受特性、细胞缓释吸收和成本低廉的特点，可有效促进培养物的健康生长，提高活性和繁殖速度，具有广泛的应用价值。

Description

一种生物培养专用多元微量元素添加剂

技术领域

本发明涉及一种生物培养添加剂，尤其涉及一种提供植物细胞、真菌和动物细胞培养的专用多元微量元素添加剂及其使用方法。 

背景技术

生物体是由由60多种元素所组成。根据元素在生物体内的含量不同，可分为常量元素和微量元素两大类。凡是占生物体总重量的万分之一以上的元素，如碳、氢、氧、氮、钙、磷、镁、钠等，称为常量元素；凡是占人体总重量的万分之一以下的元素，如铁、锌、铜、锰、铬、硒、钼、钴、氟等，称为微量元素(铁又称半微量元素)。微量元素在人体内的含量真是微乎其微，如锌只占人体总重量的百万分之三十三。铁也只有百万分之六十。 

微量元素虽然在生物体内的含量不多，但与生物体的生存和健康息息相关，对生命起至关重要的作用。它们的摄入过量、不足、不平衡或缺乏都会不同程度地引起生物体生理的异常或发生疾病。在生物体培养过程中，因为配方的限制，往往忽略微量元素的添加或者采用某些天然提取物替代微量元素，这些都会导致生物培养基中微量元素的缺乏。当培养物缺乏微量元素之后，势必会导致其生理代谢的异常或减缓，这种影响在短期内可能不易被察觉，但是长时间的缺乏微量元素，生物体内的某些酶活性逐渐降低，最终会导致细胞增殖减缓，从宏观上影响所培养生物体的健康和活性。 

在生命科学研究中，生物活性材料往往需要利用实验室培养模式来获得；而生物工业生产中，如发酵，同样要利用生物的生长和繁殖获得某些有价值的代谢物。无论是实验室还是工业生产，都需要保证目标生物体的健康和活性，由于培养基配制的某些限制，难以将完全的微量元素添加进去，从而影响了生物体的活性。在某些时候，即便添加了微量元素，但由于其以离子形式加入会被细胞快 速的吸收，而引起子代细胞摄取微量元素的不足。甚至在配制培养基时，由于微量元素成分会产生沉淀，严重干扰了培养基正常理化特性。基于这种考虑，本发明利用EDTA螯合手段，将生物体所需的多种微量元素充分混合并利用加热回流的方法促进EDTA与这些金属离子形成复杂的大分子螯合物，该螯合物在进行微量元素补充时会具有如下几个优势： 

1.该添加剂中的金属螯合物具有高度稳定性，遇冷、热、酸、碱等理化作用，均不易形成沉淀或改变特性。 

2.该添加剂可以缓慢且有效地补充培养基中的微量元素，而不会出现细胞的快速摄取现象。 

3.该添加剂可常温保存，数年不会变质，便于储存和运输。 

4.添加本品后，生物体的生长速度、生物活性均明显提高。 

发明内容

本发明的生物培养专用多元微量元素添加剂是针对生物培养中，培养基缺乏微量元素或添加微量元素后产生理化性质改变的问题，发明的一种利用EDTA加热回流螯合金属离子的多元复合添加剂，命名为“超级动力素”。该添加剂可以有效地解决植物细胞、真菌和动物细胞培养过程中微量元素的缺乏，同时不改变培养基的理化特性，有助于培养物缓慢的吸收微量元素，持久改善培养物缺乏微量元素的问题，促进细胞的健康生长并提高其生物活性。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案，添加剂成分按如下方法进行配制：5g磷酸二氢钾、1g硝酸镁、1g硝酸锌、0.5g硝酸镧、0.5g硝酸铈、0.2g硼酸、0.2g硝酸锰、0.2g钼酸钠、0.05g硫酸铜、0.05g氯化钴、1g EDTA.Na2(乙二胺四乙酸二钠盐)，分别溶解后定容至1000ml，调节pH至5.5，加热回流7-10小时，至溶液转变为澄清的深紫色。 

其中微量元素的配比，参考了植物组织培养常规MS培养基、真菌常规培养基和动物细胞培养基RPMI1640、DMEM等配方中微量元素的比例和缺乏的种类，对缺乏的微量元素进行了补充，特别选择添加稀土元素镧和铈，以提高细胞内酶活性和增强细胞活性。对大多数植物细胞、真菌和动物细胞来说，稀土元素均具有较强的促进代谢活性，并且在本配方的浓度下不会产生任何毒性。 

配制方法采用EDTA作为螯合剂，该化合物是目前使用最为普遍，造价最低廉的化合物，广泛应用于化学工业。该化合物具有生物兼容性，对细胞无毒害作用，并且该化合物可以有效地螯合多种金属离子，螯合后的离子具有稳定、缓释的作用。本发明对EDTA和金属盐进行了长达7-10小时的加热回流，其目的在于促进EDTA分子的打开并多元化、交错的螯合金属离子，并且使游离的金属离子能更加充分的进入EDTA分子螯合环中。这组金属螯合物可稳定的存在于溶液中，具有较强的抗温度变化、pH变化的能力，这种稳定性不会影响生物培养基中的成分。本发明的另一主要特征就是可以有效地促进细胞的生长，并提高其生物活性。实验表明添加本品的培养物在细胞活性、增殖速度、抗逆性等方面均有明显的提高，这对增加培养物的产量或次生代谢物均有很高的改善作用。 

本发明的添加剂具有高度稳定性、宽pH耐受特性、细胞缓释吸收和成本低廉的特点，可有效促进培养物的健康生长，提高活性和繁殖速度，具有广泛的应用价值。 

附图说明

图1.为本添加剂使用后不同植物愈伤组织增殖加快的情况(P＜0.01)； 

图2.为本添加剂促进灵芝和蛹虫草菌丝生长的情况(P＜0.01)； 

图3.为添加剂促进小鼠成纤维细胞3T3的增殖(P＜0.01)。 

具体实施方式

在生化培养箱中进行植物细胞、真菌和动物细胞的培养，对常规植物培养基MS配方，真菌PDA配方和动物细胞RPMI1640、DMEM进行添加测试，观察培养物生长速度、形态特征和线粒体酶活性的分析，以评价该添加剂的使用效果。 

1.植物细胞培养中的添加应用 

植物细胞培养主要是基于组织培养平台，利用MS培养基进行的实验。选择胡萝卜、秋海棠、花椰菜、瓜叶菊等植物的愈伤组织为实验原材料，培养条件为MS+NAA0.1mg/L+6BA0.01mg/L，37℃，恒湿培养瓶内培养，光照8h，3000lx。愈伤组织为黄绿色，增殖速度以湿重为测量方法。 

本添加剂使用方法，在制备MS培养基之处加入，按每升100μl。随后培养基添加凝固剂琼脂粉，进行煮沸溶解，灌装培养瓶，121℃高压灭菌。制备后培养基性状良好，与未添加本品的培养基从外观上未见明显差异，均无絮状沉淀出 现。将不同植物品种的愈伤组织切割成同样大小，接入培养基，20d后观察并称重以观察本添加剂的影响。 

结果显示，利用本添加剂后各种植物的愈伤组织均有明显的增重作用，颜色较未添加组更绿，且更易分化出幼苗，表明本添加剂有促进植物生长和分化的作用。其中不同植物愈伤组织增重的情况见图1： 

2.真菌培养中的添加应用 

真菌培养以大型真菌灵芝和蛹虫草为对象，以灵芝菌丝体形成的菌苔面积、蛹虫草悬浮培养菌丝球干重为模型检测本添加剂的促增殖活性。 

灵芝菌丝体培养条件为PDA培养基，25℃，恒湿试管，暗培养，检测指标为菌丝体形成菌苔的面积，以接种针接入新生菌丝体，计算面积，培养7d后再次计算面积，以S_7d/S_0d为测量指标；蛹虫草以蛋白胨液体培养基，25℃，振荡培养，检测指标为菌丝球干重，培养5d，以W_5d/W_0d为测量指标。 

本添加剂加入浓度仍为培养基体积的千分之一。结果表明灵芝菌丝体增殖速度加快，菌丝白且浓密，镜检菌丝叫对照粗壮且多分枝；蛹虫草菌丝球增殖速度加快，菌丝球较对照组圆整，质硬，体积大，颜色浅。增殖指标测试结果见图2： 

3.动物细胞培养中的添加应用 

动物细胞培养选择小鼠成纤维细胞系3T3为研究对象，培养基为RPMI1640，添加10％胎牛血清。测试时加入千分之一本添加剂，计算细胞增殖曲线。 

添加本品后，溶液质地无改变，细胞在含有添加剂的培养环境下污染率降低，细胞形态完整、边缘锐利、核区反光点明显、细胞紧密，表示细胞处于快速增殖状态。细胞生长曲线见下图3： 

4.添加剂稳定性测试 

本添加剂经过日光照射、高温煮沸、微波处理、-20℃冷冻处理后均不会造成理化性质的改变，生物学效果亦不改变；pH在3.2-11.4的范围内均不会出现理化性质的改变，该pH范围可兼容绝大多数生物培养体系。 

Claims (7)

1.一种生物培养专用多元微量元素添加剂，其特征在于：添加剂成分按如下方法进行配制：5g磷酸二氢钾、1g硝酸镁、1g硝酸锌、0.5g硝酸镧、0.5g硝酸铈、0.2g硼酸、0.2g硝酸锰、0.2g钼酸钠、0.05g硫酸铜、0.05g氯化钴、1g EDTA.Na₂(乙二胺四乙酸二钠盐)，分别溶解后定容至1000ml，调节pH至5.5，加热回流7-10小时，至溶液转变为澄清的深紫色。

2.根据权利1所述添加剂，其特征在于金属盐溶解混合后，须进行7-10小时的沸腾回流。

3.根据权利1所述添加剂，其特征在于金属盐溶解后和加热回流前，须调整pH至5.5。

4.根据权利1所述添加剂，其特征在于加热回流后溶液转变为澄清的紫色溶液。

5.按权利要求1所述的添加剂的配制方法，其特征在于，对植物细胞、真菌和大多数动物细胞培养的培养基中添加量为万分之一，即100μl/L。

6.根据权利5所述的添加剂使用方法，其特征在于，添加剂加入到常规生物培养基中均不会产生沉淀和改变溶液pH。

7.根据权利5所述的添加剂使用方法，其特征在于，添加剂均适用于常规的固体和液体生物培养基配方。

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