CN103114043B - 一种高效解磷青霉及其在促进马尾松生长中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效解磷青霉及其在促进马尾松生长中的应用，高效解磷青霉的分类命名为嗜松青霉（Penicilliumpinophilum）JP-NJ4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO：M2012167，保藏日期为：2012年5月14日，保藏地址：中国武汉武汉大学。该嗜松青霉JP-NJ4具有的优势包括：对难溶性无机磷酸盐：磷酸三钙（Ca₃（PO₄）₂）、磷酸铝（AlPO₄）、磷酸氢钙（CaHPO₄•2H₂O）具有较强的溶解能力；通过盆栽试验证实JP-NJ4菌剂接种马尾松苗可以明显的促进马尾松的生长。因此，该嗜松青霉JP-NJ4能为开发微生物菌肥提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。

Description

一种高效解磷青霉及其在促进马尾松生长中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种高效解磷青霉及其在促进马尾松生长中的应用，具体是一种马尾松根际解磷真菌嗜松青霉（Penicillium pinophilum）JP-NJ4及其应用。

背景技术

马尾松是我国南方最具代表性的造林树种，也是森林演替的先锋树种。但目前我国南方马尾松林面临严重的地力衰退问题，造成马尾松林生长不良，生物量下降。在马尾松林地衰退的过程中，磷素供应不足是突出而具普遍性的问题。在林业方面，磷对苗木质量影响较大，尤其是针叶树种表现的更加明显。充足的林素供应，可以加速苗木的生长，并在一定程度上提高苗木的抗逆性和抗病性。由于施入土壤中的可溶性磷肥大部分很快发生专性吸附和化学沉淀而被固定，大部分磷肥以难溶性的磷酸盐在土壤中积累，植物难以吸收利用。因此，通过生物技术途径来提高林地土壤磷的利用率是人们关注的热点之一。

解磷微生物（phosphate-solubilizing microorganisms，PSMs）是土壤中能够将难溶磷转化成植物能够直接吸收利用的可溶性磷的一类特殊的微生物功能类群，包括解磷真菌、解磷细菌和解磷放线菌等。目前，对解磷微生物的研究主要集中在解磷细菌方面，且其筛选研究主要针对农作物根际土壤，少量报道有来自林地或牧草等生态系统。解磷真菌（Solubilizing phosphorus fungus）在数量和种类上都少于解磷细菌，但有研究表明解磷真菌的溶磷能力要强于细菌，且解磷真菌的遗传性状更加稳定。但目前关于解磷真菌的研究较少。目前，如何开发和利用被土壤固定的磷素是我国林业生产中急需解决的问题。若能通过筛选利用来自林地土壤的高效解磷真菌来提高土壤固态磷的利用率，无疑是行之有效的方法。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种高效解磷青霉，其具有较强的解磷能力。本发明的另一目的是提供一种高效解磷青霉在促进马尾松苗生长中的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种高效解磷青霉，其分类命名为嗜松青霉（Penicillium pinophilum）JP-NJ4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2012167，保藏日期为：2012年5月14日，保藏地址：中国武汉武汉大学。

嗜松青霉JP-NJ4，从南京林业大学校园内30-40年生马尾松的根际土壤中筛选获得。JP-NJ4的生物学特征：该菌在PDA上25℃培养7d，菌落直径30mm左右；在PDA上培养21d后（图1），菌落黄绿色，边缘整齐，直径65-70mm左右，表面呈絮毡状，分生孢子梗顶端帚状枝轮生或单生，分生孢子球形或卵圆形，有时有少量的淡褐色渗出液，菌落反面橙红色。该菌在NBRIP上25℃培养7d，菌落直径26-30mm，溶磷圈直径18mm左右。如图2所示生长14d时菌落质地疏松，四周有绒毛状白色菌丝；如图3所示，菌落背面，呈现较浅的橙红色；溶磷圈呈半透明状。

JP-NJ4菌株18SrDNAITS序列，见SEQ ID NO.1所示。将序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，JP-NJ4菌株与Penicillium pinophilum的相似度为97%。结合形态特征和18SrDNA ITS序列分析，JP-NJ4菌株鉴定为嗜松青霉（Penicillium pinophilum）。

所述的高效解磷青霉在促进马尾松苗木生长中的应用。

所述的高效解磷青霉在溶解难溶性无机磷酸盐中的应用。

上述的嗜松青霉JP-NJ4对磷酸三钙、磷酸铝及磷酸氢钙具有较强的解磷能力。菌剂盆栽接种试验表明，JP-NJ4菌株可将土壤中难溶性无机磷转变为有效态磷供马尾松苗木吸收利用，明显促进马尾松苗木的生长。

有益效果：与现有技术相比，本发明的嗜松青霉JP-NJ4具有的优势包括：对难溶性无机磷酸盐：磷酸三钙（Ca₃（PO₄）₂）、磷酸铝（AlPO₄）、磷酸氢钙（CaHPO₄·2H₂O）具有较强的溶解能力；通过盆栽试验证实JP-NJ4菌剂接种马尾松苗可以明显的促进马尾松的生长。因此，本发明的嗜松青霉JP-NJ4能为开发微生物菌肥提供优良的菌株资源，并具有良好的应用开发前景。

附图说明

图1是JP-NJ4菌株在PDA培养基上生长21d的菌落特征；

图2是JP-NJ4菌株在NBRIP培养基上生长14d的菌落特征（正面）；

图3是JP-NJ4菌株在NBRIP培养基上生长14d的菌落特征（反面）；

图4是JP-NJ4菌株在摇瓶中培养时解磷能力和pH值的动态变化结果图；

图5是JP-NJ4菌株对马尾松苗生长的影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明。

根据下述实施例，可以使本领域的技术人员更好地理解本发明。实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实例中，PDA培养基的配方为：马铃薯20g，葡萄糖20g，琼脂18g，蒸馏水1000mL。

磷酸盐生长培养基（NBRIP）的配方为：葡萄糖10g，Ca₃（PO₄）₂5g，MgCl₂.6H₂O5g，KCl0.2g，MgSO₄.7H₂O0.25g，（NH₄）₂SO₄0.1g，蒸馏水1000mL，pH7.0。

解磷培养基A的配方为：用磷酸铝（AlPO₄）代替NBRIP中的Ca₃（PO₄）₂，其他成分和含量相同。

解磷培养基B的配方为：用磷酸铁（FePO₄·4H₂O）代替NBRIP中的Ca₃（PO₄）₂，其他成分和含量相同。

解磷培养基C的配方为：用磷酸氢钙（CaHPO₄·2H₂O）代替NBRIP中的Ca₃（PO₄）₂，其他成分和含量相同。

上述不同培养基A、B和C中的磷源按每升NBRIP培养基中加入相同含量的磷（1g）折算其加入量。

实施例1JP-NJ4菌株对难溶性磷酸盐的解磷试验

将嗜松青霉JP-NJ4菌株接种到PDA平板上，培养7d后，用灭菌的打孔器取菌块（直径6mm），并分别接种到装有50mLNBRIP液体培养基及不同磷源液体培养基A、B、C的100mL的三角瓶中，每瓶接种6个菌块，分别以相同体积未接菌的解磷培养基为对照（CK）。每个处理设三个重复。25℃，200r·min^-1振荡培养7d后，将发酵液离心10min（4℃，10000r·min^-1）；采用钼锑抗比色法，即取上述离心得到的上清液10mL加入50mL的容量瓶中，然后加入约25mL的去离子水，加入1~2滴2,4-二硝基酚指示剂，再加5mL钼锑抗显色剂，再加去离子水定容，混匀，静置0.5h之后，测定OD值。并计算上清液中的有效磷含量和解磷率。结果如表1所示。

其中，解磷率（%）=（接菌可溶性磷含量－对照可溶性磷含量）/加入难溶性磷酸盐的量×100。

表1JP-NJ4菌株对磷酸三钙、磷酸铁、磷酸铝和磷酸氢钙的溶解能力

注：P<0.01。

从表1可见，分别以难溶性磷酸盐：磷酸三钙（Ca₃（PO₄）₂）、磷酸铝（AlPO₄）、磷酸铁（FePO₄·4H₂O）、磷酸氢钙（CaHPO₄·2H₂O）为唯一磷源，培养7d后，JP-NJ4发酵液中可溶磷含量均高于对照，但对各磷源的溶解效果明显不同，其中对于磷酸三钙（Ca₃（PO₄）₂）和磷酸铝（AlPO₄）的溶解能力较强，对磷酸铁（FePO₄·4H₂O）和磷酸氢钙（CaHPO₄·2H₂O）的溶解效果稍弱。

实施例2JP-NJ4菌株解磷能力的动态变化

在NBRIP培养基上先活化JP-NJ4菌株，然后在PDA上活化2次，待JP-NJ4菌株在PDA上生长7d后，在培养基上取直径为6mm的菌块，接种于含有50mL的NBRIP培养基100mL的三角瓶中，25℃，200r.min^-1振荡培养，设7个重复，以空白培养基作为对照。每隔24h，取发酵液，将发酵液离心10min（4℃，10000r.min^-1），取离心得到的上清液100uL加入50mL的容量瓶中，然后加入约25mL的去离子水后，再加1～2滴2，4-二硝基酚指示剂，再加5mL钼锑抗显色剂，再加去离子水定容，混匀，静置半小时之后，测定OD值。然后根据磷标准曲线换算菌株的解磷能力。同时直接用pH计（Basic ph Meter PB-10）测定每次所取发酵液的pH值。

结果如图4所示，解磷真菌JP-NJ4菌株，经过8d的解磷能力的动态测定，该菌株在第2～6d溶磷量缓慢升高，在第6～7d时变化较大，上升速度快，并在第7d达到最大值，为1147.44mg/L，此后出现下降趋势。

实施例3JP-NJ4菌株对马尾松生长影响的盆栽试验

在NBRIP培养基上先活化JP-NJ4菌株，然后在PDA上转接活化2次后，取直径为6mm的菌块，接种于含有50mL的PD培养基100mL的三角瓶中，25℃，200r.min^-1振荡培养7d。发酵液（4℃，6000r.min^-1）离心5min，将离心后留存的菌丝体用磁力搅拌器打碎后，用无菌生理盐水调节菌悬液（7～8×10⁸cfu.mL^-1）制成菌剂。

JP-NJ4菌株接种马尾松苗木试验分为四种处理，每种处理均施入15mL对应物，A：菌悬液，B：发酵液离心后得到的上清液，C：空白培养基（PD），D：无菌生理盐水（CK）。每个处理20个重复，接种后的苗木置于温室（20℃）统一管理，适时浇水。

待接种处理的马尾松苗生长150d后，进行植株苗高、地径、植株鲜重和根重等的测定。

结果如表2和图5所示，嗜松青霉JP-NJ4的菌悬液或发酵上清液均对马尾松苗有明显的促生作用（p<0.05）。特别是JP-NJ4的菌悬液对马尾松苗生长的促进作用尤为显著，苗高和地径分别比CK增长了21.28%和15.57%，鲜重和根重分别比CK增长了65.14%和48.44%。

表2解磷真菌嗜松青霉JP-NJ4对马尾松生长的影响

SEQUENCE LISTING

<110> 南京林业大学

<120> 一种高效解磷青霉及其在促进马尾松生长中的应用

<130> 100

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 573

<212> DNA

<213> Penicillium pinophilum JP-NJ4

<400> 1

ttcctccggc ttattgatat gcttaagttc agcgggtaac tcctacctga tccgaggtca 60

accgtggtaa aatgtggtgg tgaccaaccc ccgcaggtcc ttcccgagcg agtgacagag 120

ccccatacgc tcgaggacca gacggacgtc gccgctgcct ttcgggcagg tccccggggg 180

gaccacaccc aacacacaag ccgtgcttga gggcagaaat gacgctcgga caggcatgcc 240

ccccggaatg ccagggggcg caatgtgcgt tcaaagattc gatgattcac ggaattctgc 300

aattcacatt acttatcgca tttcgctgcg ttcttcatcg atgccggaac caagagatcc 360

attgttgaaa gttttgacaa ttttcatagt actcagacag cccatcttca tcagggttca 420

cagcgcgctt cggcgggcgc gggcccgggg acgtgcgtcc cccggcgacc aggtggcccc 480

ggtgggcccg ccaaagcaac aggtgtatag agacaagggt gggaggttgg gccgcgaggg 540

cccgcactcg gtaatgatcc ttccgcaggt tcc 573

Claims (3)

1.一种高效解磷青霉，其分类命名为嗜松青霉（Penicillium pinophilum）JP-NJ4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2012167，保藏日期为：2012年5月14日，保藏地址为：中国武汉武汉大学。

2.权利要求1所述的高效解磷青霉在促进马尾松苗木生长中的应用。

3.权利要求1所述的高效解磷青霉在溶解难溶性无机磷酸盐中的应用。