CN100335641C - 具有增强的异戊烯苯醌生物合成的转化植物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及转化植物，特别是与非转化的相同植物相比可产生大量质体醌、生育三烯酚和生育酚的转化植物。本发明也涉及生产所述植物的方法和培育所述植物的方法。本发明的植物还显示对对羟苯基丙酮酸双加氧酶抑制剂耐受的特性。

Description

具有增强的异戊烯苯醌生物合成的转化植物
发明领域
本发明涉及转化植物，特别是与非转化的相同植物相比，可产生大量质体醌、生育三烯酚和生育酚的转化植物。本发明也涉及生产这些植物的方法和培育这些植物的方法。本发明的植物还有对对羟苯基丙酮酸双加氧酶(以下称为HPPD)抑制剂的除草剂耐受的特性。
异戊烯苯醌是具有脂亲和性的一大类化合物，包括，尤其是质体醌、生育三烯酚和生育酚。在植物中，异戊烯醌是通过2，5-二羟苯乙酸途径合成的。
最熟知的异戊烯苯醌是维生素E，或α-生育酚；它是人或动物饮食中的必需成分，特别是在哺乳动物中不能自然产生，但在饮食中是需要的。维生素E的最公认的效果是对细胞膜脂质的抗氧化作用(Epstein等，1966，Radical Research28：322-335；Kamel-Eldin和Appelqvist，1996，Lipids 31：671-701)。
除了维生素E，还证明生育三烯酚虽然在人和动物饮食中不是必需的，有比维生素E特别有利的抗氧化特性(Kamat等，1997，Mol.Cell.Biochem.170，131-137)。这些化合物尤其已知保护细胞对抗自由基和预防心血管疾病或癌症的出现(Packer等，2001，J.Nutr.131(2)：3698-3738)。此外，生育三烯酚显示了通过抑制雌激素受体增殖的抗癌活性，这种活性是生育酚没有的(Guthrie等，1997，J.Nutr.127：544-548)。生育三烯酚还显示了比生育酚更佳的低胆固醇血症的活性(Pearce等，1992，J.Med.Chem.35：3595-3606；Qureshi等，2001，J.Nutr.131：2606-2618)，这使它们更能对抗动脉硬化。
质体醌在人或动物健康中没有已知的作用，但是它们在植物中起重要作用。这些分子存在于叶绿体膜中，它们的功能是在光合作用反应中电子传递(Grumbach，1984，《植物脂质的结构功能和代谢》(Structure Function和Metabolism ofplant lipids)，Siegenthaler和Eichenberger编)。
此外，异戊烯苯醌量的增加应给与植物更好抵抗氧化胁迫，特别是寒冷、干燥或强光。
通常在植物和光合生物中，2，5-二羟苯乙酸构成异戊烯苯醌的芳香族前体。2，5-二羟苯乙酸是对羟苯基丙酮酸双加氧酶(以下称为HPPD)的产物。在大多数生物体中，HPPD是参与芳香族氨基酸酪氨酸的分解代谢降解途径的酶(Goodwin，1972，刊于：《酪氨酸代谢：对羟苯基丙酮酸加氧酶的生化、生理和临床重要性》(Tyrosine Metabolism：The biochemical，physiological和clinicalsignificance of p-hydroxyphenylpyruvate oxygenase)，Goodwin B.L.，编，Oxford University press，1-94)。HPPD催化对羟苯基丙酮酸盐(HPP)，一种酪氨酸降解产物，转化成2，5-二羟苯乙酸的反应。
大多数植物通过前酪氧酸(arogenate)合成酪氨酸(Abou-Zeid等.1995Applied Env Microb 41：1298-1302；Bonner等，1995Plant Cells Physiol.36，1013-1022；Byng等，1981Phytochemistry 6：1289-1292；Connely和Conn 1986Z.Naturforsch 41c：69-78；Gaines等，1982 Plants 156：233-240)。在这些植物中，HPP只来源于酪氨酸降解。在另一方面，在生物体如酿酒酵母(Sacharomyces cerevisiae)或大肠埃希氏菌(Escherichia coli)中，HPP是酪氨酸前体，它是通过一种酶，即预苯酸脱氢酶(以下称为PDH)的作用合成的，此酶将预苯酸转化成HPP(Lingens等，1967 European J.Biochem 1：363-374；Sampathkumar和Morrisson 1982 Bioch Biophys Acta 701：204-211)。因此在这些生物体中，HPP的产生是直接与芳香族氨基酸生物合成途径(莽草酸途径)有关的，与酪氨酸降解途径无关(见图1)。
为了增加植物的异戊烯苯醌的生成合成，本专利申请的发明人设法通过过度表达PDH酶将所述前体的合成连接到″莽草酸″途径来增加HPP前体流入这些植物的细胞中。期望的效果是HPP前体的较大通量，这在整体上应增加异戊烯苯醌生物合成。
很显著的是，用编码PDH酶的基因转化植物使得它可能增加所述植物产生异戊烯苯醌。当用编码PDH酶的基因转化的植物还过度表达HPPD酶时，这种增加十分显著。
还注意到的是，用编码PDH酶的基因转化植物使得它可能增加所述植物对HPPD抑制剂的耐受性。当用编码PDH酶的基因转化的植物还过度表达HPPD酶时，这种增加十分显著。
在过去数年中，在证明此酶是“漂白”除草剂的新族的目标以后，对HPPD的兴趣大大增加。目标是HPPD的除草剂尤其为异唑类(EP 418 175，EP 470 856，EP 487 352，EP 527 036，EP 560 482，EP 682 659，US 5 424 276)，特别是异恶唑草酮，一种玉米的选择性除草剂，二酮腈(EP 496 630，EP 496 631)，特别是2-氰-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1，3-二酮和2-氰-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2，3-二氯苯基)丙烷-1，3-二酮，三酮(EP 625 505，EP 625 508，US5,506,195)，特别是磺草酮或甲基磺草酮，要么是吡唑特(pyrazolinates)。
目标是参与植物重要代谢途径的酶的除草剂的优点之一是它们对远缘种系发生起源的植物有广谱活性。但是，这种除草剂也有较大的缺点，当它们应用到作物以除去不需要的植物或“杂草”时，它们也作用于栽培的植物。该缺点可以通过使用对所述除草剂耐受的栽培植物来克服。这种植物通常是通过基因工程将编码对所述除草剂耐受的酶的基因导入植物的基因组中来获得的，以这样的方法这些植物在它们的组织中过度表达所述的酶。
至今，为了制备对除草剂耐受的的植物已经使用了三种应用基因工程的主要方法。第一种方法在于通过用编码解毒酶的基因来转化植物对除草剂解毒。这种酶将除草剂或除草剂的活性代谢产物转化成无毒降解产物，例如对溴苯腈或对草铵膦耐受的酶(EP 242 236，EP 337 899)。第二种方法在于用编码已突变为对除草剂或除草剂的活性代谢产物不太敏感的靶酶的基因来转化植物，例如草甘磷耐受酶(EP 293 356；Padgette等，1991，J.Biol.Chem.266：33)。第三种方法在于在植物中过度表达敏感性靶酶以产生大量的靶酶，如果可能产生的量比进入植物中的除草剂的量更多。尽管存在靶酶的抑制剂，这种方法仍可能保持足够水平的功能酶。
该第三种方法已经施行并可能获得对HPPD抑制剂耐受的植物(WO 96/38567)。此外，这种对敏感性(非突变的)靶酶的过度表达的简单方法已成功地首次使用，使得植物在农学水平耐受除草剂。
也知道大多数HPPD抑制除草剂是对于底物的竞争性抑制剂，结合缓慢并实际上是不可逆的(Ellis等，1996，Chem.Res.Toxicol.9：24-27；Viviani等，1998，Pestic.Biochem.Physiol.62：125-134)。因此它们的作用方式在于通过与结合位点优先结合来与HPP竞争。这种结合的结果是细胞停止合成2，5-二羟苯乙酸。
通过过度表达PDH酶使HPPD底物HPP的流量增加，本发明似乎构成获得除草剂耐受植物，特别是对HPPD抑制除草剂耐受的植物的第四种可能的方法。
描述
因此，本发明涉及转化植物，其特征在于它们包括：
(1)在植物中使PDH酶过度表达的功能基因，
(2)在植物中使HPPD酶过度表达的功能基因。
依照特定实施方案，本发明涉及转化植物，其特征在于它们包括：
(1)在植物中使PDH酶过度表达的功能基因，
(2)在植物中使HPPD酶过度表达的功能基因，
除了在植物中使植基/异戊二烯基转移酶过度表达的功能基因。
依照另一个特定实施方案，本发明涉及转化植物，其特征在于它们包括用以下基因转化的植物：
(1)在植物中使PDH酶过度表达的功能基因，和
(2)在植物中使HPPD酶过度表达的功能基因。
依照本发明的特定实施方案，本发明的转化植物可以由转化植物细胞表现。
本发明中的术语“转化植物”或“转化植物细胞”是指在其基因组中稳定整合至少一个转基因的植物或植物细胞，所述转基因起源于转化植物或任何其他生物体。优选本发明的转基因由包含来源于转化植物以外的至少一种有机体的成分的嵌合基因表现。特别是，本发明的转基因可在其他成分中包含起源自不同有机体的至少一种启动子、一种编码序列和一种终止子，所述生物体也不同于转化植物。
在“在植物中使PDH酶过度表达的功能基因”词句中，术语“PDH”应当解释为指显示转化预苯酸成HPP的PDH活性的任何天然或突变PDH酶。特别是，所述PDH酶可来源于任何类型的有机体。具有PDH活性的酶可以通过任何可能测定预苯酸底物量的减少，或测定酶反应产物(即，HPP或辅因子NADH或NADPH中的一个)积聚的任何方法来确定。特别是，PDH活性可通过实施例2描述的方法来测定。
编码PDH酶的许多基因在文献中有述，它们的序列可通过网站http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/来识别。特别已知的是Mannhaupt等.(1989，Gene 85，303-311)描述的酿母酵母(编号S46037)；杆菌属细菌，特别是Henner等.(1986，Gene 49(1)147-152)描述的枯草杆菌(编号P20692)；埃希氏属细菌，特别是Hudson等.(1984，J.Mol.Biol.180(4)，1023-1051)描述的大肠杆菌(编号KMECTD)，或者是欧文氏菌属细菌，特别是Xia等.(1992，J.Gen.Microbiol.138(7)，1309-1316)描述的草生欧文氏菌(编号S29934)的编码PDH酶的基因。
在“在植物中使HPPD酶过度表达的功能基因”的词句中，术语“HPPD”应当解释为指显示转化HPP成2，5-二羟苯乙酸的HPPD活性的任何天然、突变或嵌合HPPD酶。HPPD的酶活性可以通过可能测定HPP底物量的减少，或测定酶反应产物(即，2，5-二羟苯乙酸)积聚的任何方法来确定。特别是，HPPD活性可通过实施例1描述的方法和Garcia等.(1997，Biochem.J.325，761-769)或Garcia等.(1999，Plant Physiol.119，1507-1516)描述的方法测定。
特别是，所述的HPPD酶可来源于任何类型的生物体。编码HPPD酶的许多基因在文献中描述，特别是细菌如假单胞菌(Rüetschi等，1992，Eur.J.Biochem.，205，459-466，WO 96/38567)的基因，植物如拟南芥属(Arabidopsis)(WO 96/38567，Genebank AF047834)或胡萝卜(WO 96/38567，Genebank 87257)的基因，Coccicoides(Genebank COITRP)的基因，或哺乳动物如鼠或猪的基因。
本发明中术语“突变HPPD”是指对于天然HPPD至少有一次突变，且对HPPD抑制性除草剂比相应的天然HPPD有更耐受特性的HPPD。有利地，突变HPPD在HPPD的C末端部分突变，如专利申请WO 99/24585所述。突变HPPD包含如专利申请WO 99/24585所述的突变W336较佳。
术语“嵌合HPPD”是指包含来源于不同HPPD的成分的HPPD。这种嵌合HPPD有利地特别是专利申请WO 99/24586中所描述的。
有利地，HPPD是来源于荧光假单孢菌(Pseudomonas fluoescens)(WO 96/38567)或拟南芥(Arabidopsis thaliana)(WO 96/38567)。
在“在植物中使植基/异戊二烯基转移酶过度表达的功能基因”词句中术语“植基/异戊二烯基转移酶”应当解释为指如专利申请WO 02/089561描述的植基/异戊二烯基转移酶。特别是，所述的“在植物中使植基/异戊二烯基转移酶过度表达的功能基因”包括选自集胞藻属(Synechocysti)s slr1736基因(序列描述于http：//www.kazusa.or.jp/cyanobase网站上的Cyanobase中)，和拟南芥ATPT2基因(Smith等，1997，Plant J.11，83-92)。
本发明的转化植物或植物细胞比非转化植物产生的异戊烯苯醌的量大。较佳的是，本发明的转化植物或植物细胞与只用在植物中使PDH或HPPD酶过度表达的功能基因中的一种基因转化的转化植物或植物细胞相比产生更多量的异戊烯苯醌。较佳的是，本发明的转化植物或植物细胞产生的异戊烯苯醌是生育酚和/或生育三烯酚和/或质体醌。对于测定生育酚、生育三烯酚和质体醌的量的许多方法是本领域熟练技术人员已知的和可获得的。例如，生育酚、生育三烯酚和质体醌可按照Frazer等.(2000，Plant J.24：551-558)的方法测定。本发明中术语“更大量”是指量优选至少大2倍，优选至少大5倍，优选至少大10倍，优选至少大50倍，优选至少大100倍，优选至少大500倍，优选至少大1000倍。
本发明的转化植物还具有对HPPD抑制剂耐受的效果。
“对HPPD抑制剂耐受的转化植物”是指显示如上述的至少通常对非转化的相同植物是有毒的HPPD抑制剂的剂量耐受的特性的转化植物。通常对非转化的植物是有毒的HPPD抑制剂的剂量取决于使用的HPPD抑制剂和施加所述抑制剂的植物，和抑制剂施加到所述植物的阶段。但是，本领域熟练技术人员可以按照施用所述抑制剂后一定天数，该抑制剂导致植物死亡的致死效果相应的所述抑制剂的毒性来确定该剂量，所述致死效果可以在植物上先出现如通常在HPPD抑制剂中出现的“漂白”效果，或者确定包括减少植物生长的效果。较佳的是，本发明中对HPPD抑制剂耐受的转化植物可以耐受对于只使用在植物中使HPPD酶过度表达的功能基因转化的相同植物通常是有毒的HPPD抑制剂的剂量。
术语“HPPD抑制剂”是指能够结合于植物HPPD酶，以便短暂或永久地阻断其转化HPP成2，5-二羟苯乙酸的天然酶活性的，天然或人工来源的任何化合物。由于该特性，本发明的HPPD抑制剂在其施加的植物上诱导死亡或抑制生长，所述死亡常发生在所述植物的“漂白”以后。
通过HPPD抑制剂的实施例，可提及异唑类(EP 418 175，EP 470 856，EP487 352，EP 527 036，EP 560 482，EP 682 659，US 5 424 276)，特别是异恶唑草酮，一种玉米的选择性除草剂，二酮腈(以下称为DKN，在EP 496 630，EP 496 631中描述)，特别是2-氰-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1，3-二酮和2-氰-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2，3-二氯苯基)丙烷-1，3-二酮，三酮(EP625 505，EP 625 508，US 5,506,195)，特别是磺草酮或甲基硝草酮，要么是吡唑特。
本发明中“植物中的功能基因”是指在植物中能起功能的基因。能在植物中起功能的基因是能够在所述植物的至少一个组织中编码表达的蛋白质的基因。特别是，在本发明中使PDH酶和HPPD酶过度表达的植物中起功能的基团。蛋白质过度表达指在转化植物的组织中该蛋白质的表达与非转化的相同植物中存在的该蛋白质的表达相比有更高的水平，所述水平在所述植物的相同发育阶段进行测定。在本发明植物中的功能基因是可包含来源于该基因导入的植物以外的有机体的成分的嵌合基因较佳。
在本发明植物中的功能基因是包含相互功能性连接的，至少一个在植物中起功能的启动子、一个编码PDH酶和/或HPPD酶的序列、和一个在该相同植物中起功能的终止子元件的嵌合基因较佳。嵌合基因可包含的各种元件是，首先，用于蛋白质转录、翻译和成熟的调节元件，如启动子、编码信号肽或转运肽的序列、或构成聚腺苷酸化信号的终止子元件，和，第二，编码蛋白质的序列。“相互功能性连接的”是指嵌合基因的所述元件以功能协调和使编码序列表达的方式相互连接。通过实施例，当启动子能提供所述编码序列的表达时，一个启动子与一个编码序列功能性连接。本发明中嵌合基因的构造和其各种元件的组装可使用本领域熟练技术人员熟知的方法进行，特别是Sambrook等.(1989，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，Nolan C.编，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)描述的方法。构成嵌合基因的调节元件的选择主要取决于它们必须作用的植物，和本领域熟练技术人员能够选择的作用于特定植物的调节元件。
本发明可包含的嵌合基因的启动子可以是组成型、诱导型、或在空间上或时间上调节。
在可用于本发明嵌合基因的组成性启动子中，通过实施例可提及细菌启动子，如章鱼碱合酶基因的启动子或胭脂碱合酶基因的启动子(Sanders等，1987，Nucleic Acids Res.15，1543-1548)，病毒启动子，如控制花椰菜花叶病毒的19S或35SRNA的转录的基因的启动子(CaMV；Lawton等，1987，Plant Mol.Biol.9，315-324；Odell等，1985，Nature，313，810-812)，或者木薯叶脉花叶病毒的启动子(CsVMV；如在专利申请WO 97/48819中描述)。在植物来源的启动子中，要提及核酮糖-二羧化酶/加氧酶(RuBisCO)小亚单位基因的启动子，如申请EP 0507 698中描述的组蛋白基因启动子，或稻肌动蛋白基因的启动子(Wang等，1992，Mol.Cell.Biol.，12(8)：3399-3406；US 5,641,876)。
在可用于本发明嵌合基因的诱导启动子中，通过实施例可提及编码植物生长激素结合蛋白的基因的启动子(Schwob等，1993，Plant J.4(3)：423-432)，编码UDP-葡萄糖类黄酮糖基转移酶基因的启动子(Ralston等，1988，Genet.，119(1)，185-197)，编码MIP蛋白酶抑制剂的基因的启动子Cordero等，1994，PlantJ.，6(2)141-150)，或编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因的启动子(Martinez等，1989，J.Mol.Biol.，208(4)，551-565；Quigley等，1989，J.Mol.Evol.，29(5)，412-421；Kohler等，1995，Plant Mol.Biol.，29(6)，1293-1298)。
在可用于本发明嵌合基因的组织特异性启动子中，通过实施例可提及根部特异性启动子，例如，专利申请WO 00/29594描述的内容；花特异性启动子，如专利申请WO 98/22593，WO 99/15679或WO 99/43818描述的内容；或果实特异性启动子，特别是种子特异性启动子，如专利申请WO 91/13993，WO 92/17580，WO98/45460，WO 98/45461或WO 99/16890中描述的内容。
在可用于本发明嵌合基因的终止子元件中，通过实施例可提及编码来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂碱合酶基因的nos终止子元件(Bevan等，1983，Nucleic Acids Res.11(2)，369-385)，或申请EP 0 633 317中描述的组蛋白基因的终止子元件。
嵌合基因还可包括编码信号肽或转运肽的亚细胞靶向序列。该序列位于编码HPPD或PDH酶的序列的上游或下游，使得有可能引导所述的HPPD或PDH酶特定地进入宿主生物的细胞区室。例如，嵌合基因可包括编码用来引导HPPD和/或PDH酶到细胞质的特定区室，如线粒体、胞质体、内质网或液泡的信号肽或转运肽的序列。
这种序列的作用特别在Plant Molecular Biology(1998)第38期综述中描述，其中大部分用于在植物细胞的各种区室中运输蛋白质(将蛋白质分送到植物细胞的液泡中127-144页；核孔复合物145-162页；蛋白质转位入叶绿体包膜或经过叶绿体包膜91-207页；在叶绿体中多途径用靶向类囊体蛋白质209-221页；植物中输入线粒体蛋白质311-338页)。
根据一个实施方案，转运肽可以是叶绿体靶向信号或线粒体靶向信号，然后在叶绿体或线粒体中裂解。本发明的嵌合基因包含编码将HPPD和/或PDH酶靶向入叶绿体的转运蛋白的亚细胞靶向序列较佳。
转运肽可以是单链或双链。双链转运肽任选地被中间序列分开。通过实施例，本发明的较佳转运肽包含，在转录方向，编码植物基因转运肽的序列，该植物基因编码位于质体的酶；植物基因的成熟N-末端部分的部分序列，该植物基因编码位于质体的酶；和编码植物基因的第二转运肽的序列，该植物基因编码位于质体的酶。这种双链转运肽可见例如专利申请EP 0 508 909中的描述。
根据本发明，嵌合基因也可包含其他位于启动子和编码序列之间的调节序列，如转录激活物(增强子)，例如申请WO 87/07644描述的烟草花叶病毒(TMV)的转录激活物，Carrington和Freed(1990，J.Virol.64(4)：1590-7)描述的烟草蚀纹病毒(TEV)的转录激活物，或玄参花叶病毒(Figwort Mosaic Virus，US 5 994521)的转录激活物。本发明的嵌合基因还包含内含子，特别是在单子叶植物中促进基因表达的内含子，如专利申请WO 99/34005描述的稻肌动蛋白基因的内含子1，或玉米内含子adhl。
本发明的植物和植物细胞是转化植物和植物细胞。为了获得本发明的转化植物和植物细胞，本领域熟练技术人员可使用许多已知的转化植物的方法中的一种。
任选地，本发明的植物和植物细胞是用包含使HPPD或PDH过度表达的本发明中植物的功能基因的克隆、表达和/或转化载体来转化的。
可用于实施本发明的载体是，例如，质粒、粘粒、噬菌体或病毒。用于转化本发明的植物细胞或植物的载体是质粒较佳。大体上，载体的主要性质应在植物细胞中保持自身的能力和自我复制的能力，特别是依靠存在复制的起源。为了获得宿主生物的稳定转化，载体也可以装合入基因组中。本发明中载体的选择和将基因插入所述载体的技术详细描述于Sambrook等.(1989，《分子克隆：实验室手册》Nolan C.编，New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press)并且部分是本领域熟练技术人员的普通知识。有利的是，除本发明的基因以外，本发明使用的载体还包含编码选择标记的另一个基因。选择标记可能选择有效地转化的宿主生物，即，那些掺入载体的生物。在可使用的选择标记中，可提及包含抗生素抗性基因的标记，如，潮霉素磷酸转移酶基因(Gritz等，1983，Gene 25：179-188)的选择标记，还可提及包含除草剂耐受基因的标记，例如，耐受双丙氨磷的bar基因(White等，1990，Nucleic Acid Res.18(4)：1062)，耐受草甘膦的EPSPS基因(US 5,188,642)或可选择性的包含耐受异唑类的HPPD基因(WO 96/38567)。还可提及编码易识别酶如GUS酶的基因，或在转化细胞中编码色素或调节色素产生的酶的基因。这种选择标志基因在专利申请WO 91/02071，WO 95/06128，WO96/38567和WO 97/04103中特别加以描述。
在可用于获得本发明转化植物的转化方法中，其中一个是将要转化的植物细胞或组织置于聚乙二醇(PEG)和上文所述载体中(Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.168(1)，111-115；Mercenier和Chassy，1988，Biochimie 70(4)，503-517)。电穿孔是另一个方法，是将要转化的细胞或组织和载体置于电场(Andreason和Evans，1988，Biotechniques 6(7)，650-660；Shigekawa和Dower，1989，Aust.J.Biotechnol.3(1)，56-62)。另一个方法是通过微注射将载体直接注射到细胞或组织中(Gordon和Ruddle，1985，Gene 33(2)，121-136)。有利的是，可以使用“生物导弹”法。它是用吸附在载体上的微粒轰击细胞或组织(Bruce等，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(24)，9692-9696；Klein等，1992，Biotechnology 10(3)，286-291；US Patent No.4,945,050)。植物细胞或组织的转化可使用农杆菌属细菌较佳，用根癌农杆菌(Knopf，1979，Subcell.Biochem.6，143-173；Shaw等，1983，Gene 23(3)：315-330)或发根农杆菌(A.rhizogenes)(Bevan和Chilton，1982，Annu.Rev.Genet.16：357-384；Tepfer和Casse-Delbart，1987，Microbiol.Sci.4(1)，24-28)转化所述植物的细胞或组织较佳。用根癌农杆菌按照Ishida等.(1996，Nat.Biotechnol.14(6)，745-750)所述方案进行植物细胞或组织的转化较佳。本领域熟练技术人员可按照要转化植物的特性选择合适的方法。
本发明的主题还有生产本发明植物的方法。该方法是从上文所述的转化植物细胞再生转化植物。再生可通过任何合适的方法获得，该方法取决于植物的特性。
本发明还包含这些转化植物的部分，和这些植物的后代。术语“这些植物的部分”是指这些植物的任何器官，无论是在地面上或在地下。地面上的器官是茎、叶和花，包括雄性和雌性的生殖器官。地下的器官主要是根，但也可以是块茎。术语“后代”主要是指包含这些植物相互之间繁殖产生的胚的种子。通过延伸，术语“后代”可用于至少一个亲代是本发明转化植物杂交所产生的每个新代形成的所有种子。后代也可以通过所述转化植物的无性繁殖获得。本发明的种子可用包含至少一种活性产物的农业化学组合物包被，活性选自杀真菌、除草、杀虫、杀线虫、杀细菌或杀病毒活性。
本发明的转化植物可包含编码感兴趣的蛋白质的至少一个其他基因，该其他基因也通过人工手段，与植物中使PDH和/或HPPD过度表达的基因同时，之前或之后，导入植物的基因组。在编码感兴趣的蛋白质的基因中，可提及编码抗除草剂的另一个酶的基因，例如编码耐受双丙氨磷的bar酶的基因(White等，NAR18：1062，1990)，编码耐受草甘膦的EPSPS酶的基因(US 5,188,642；WO 97/04103)。还可提及编码杀虫毒素的基因，例如编码苏去金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)的δ-内毒素的基因(例如，见国际专利申请WO 98/40490)。对抗疾病的其他基因也可包含在这些植物中，例如专利申请EP 0 531 498或美国专利5,866,778所描述的编码草酸氧化酶的基因，和如专利申请WO 97/30082，WO 99/24594，WO 99/02717，WO 99/53053和WO 99/91089所描述的编码另一个抗细菌和/或抗真菌肽的基因。还可提及编码植物农学特性的基因，特别是美国专利5,552,306，美国专利5,614,313，和专利申请WO 98/46763和WO 98/46764所描述的编码delta-6脱饱和酶的基因，或者是专利申请WO 00/01833和WO00/36127所描述的编码丝氨酸乙酰转移酶(SAT)的基因。
编码感兴趣的蛋白的另外基因可通过载体整合。在此情况下，载体包含本发明中编码PDH酶和/或HPPD酶的基因，和至少一个编码另一个感兴趣的肽或蛋白的基因。
它们也可以按照上文所述的常规技术，通过至少一个包含所述另外基因的其他载体整合。
本发明的植物也可通过植物杂交获得，一个携带本发明中编码PDH酶和/或HPPD酶的基因，其它携带另一个编码至少一个感兴趣的其他肽或蛋白的基因。
本发明的转化植物可以是单子叶植物或双子叶植物。这些植物是农业重要性植物较佳。单子叶植物是小麦、玉米或稻较有利。双子叶植物是菜籽、大豆、烟草或棉花较有利。
本发明还涉及培植本发明转化植物的方法，其特征在于它是将所述转化植物的种子种植在适合培植所述植物的田间区域，对所述田间区域施用至少一种包含一个HPPD抑制剂的除草剂组合物，不要大体影响所述种子或所述转化植物，然后在这些植物达到需要的成熟程度时收获培育的植物，和任选地，从收获的植物中分离种子。
本发明还涉及将对HPPD抑制剂的耐受性给与植物的方法，其特征在于所述植物用以下基因同时或连续转化：
(1)在植物中使PDH酶过度表达的功能基因，
(2)在植物中使HPPD酶过度表达的功能基因。
本发明还涉及使用本发明的植物或植物细胞生产异戊烯苯醌，尤其是生育酚、生育三烯酚和/或质体醌。
本发明还涉及增加植物中异戊烯苯醌的量的方法，其特征在于所述植物用以下基因同时或连续转化：
(1)在植物中使PDH酶过度表达的功能基因，
(2)在植物中使HPPD酶过度表达的功能基因。
本发明还涉及生产异戊烯苯醌的方法，其特征在于包括在适合所述植物细胞或所述植物生长和繁殖的培养基中培育转化植物细胞或植物的步骤。
按照所述方法的特定实施方案，生产的异戊烯苯醌是维生素E代表的生育酚较佳。
按照所述方法的特定实施方案，生产的异戊烯苯醌是生育三烯酚较佳。
按照本发明的特定实施方案，生产异戊烯苯醌的所述方法包含在第一步骤中由培植的所述转化植物细胞或所述转化植物生产所述异戊烯苯醌的后续步骤。
当生产异戊烯苯醌的所述方法是使用本发明的转化植物细胞进行时，所述植物细胞是在促进植物细胞生存和生长的培养基中培育的。本领域熟练技术人员能够确定使得所述的植物细胞有最佳生长的培养基的成分。通过实施例，培育植物细胞的方法和培养基在Murashige和Skoog(1962，Physiol.Plant.15：473-497)及Gamborg等.(1968，Exptl.Cell Research，50：151-159)中描述。
此外，在所述方法是使用本发明的转化植物细胞进行时，所述产生的异戊烯苯醌可以被分泌或可以不被分泌入培养基中。当所述异戊烯苯醌被分泌入培养基中，所述方法的提取步骤可先于通过清除所述植物细胞回收培养基的步骤。通过清除所述植物细胞回收培养基的步骤可以通过分离液体部分中包括的固体部分的任何方法进行。特别是，过滤和离心是进行该步骤的合适手段。
当异戊烯苯醌不被分泌入培养基中时，提取步骤可以通过连续步骤进行，这些步骤是浓缩培育的植物细胞，破裂分离的植物细胞，离心破裂的细胞提取物，然后回收包含所述的异戊烯苯醌的上清液。细胞破裂步骤可使用本领域熟练技术人员已知的技术如机械研磨(通过压差，通过超声波作用，通过研碎)、酶裂解或渗透休克，所述技术可以单独使用或联合使用。
当所述生产异戊烯醌的方法是使用本发明的转化植物进行时，所述植物在适合植物生存和生长的基质上培育，该基质可以是天然或人工的。例如，天然基质可以是土壤、或土壤混合物，且所述植物可以在控制条件下培育，如在培养室中；在半控制条件下，如在温室中；或在天然条件下，如在露地进行。人工基质可以是，例如，液体基质或琼脂基质，其组成促进本发明植物的生存和生长。本领域熟练技术人员能够确定使得所述的植物最佳生长的所述人工基质的成分。通过培育植物的基质的实施例，可提及培养基如石纤维或蛭石，灌注包含营养元素N(氮)，P(磷)和K(钾)的营养溶液，或任何其他可使植物在这些培育基上生长的商品化营养溶液或合适的营养溶液。当本发明的植物在人工基质上培育时，通常是在培养室的控制条件下培育的。
此外，当所述方法使用本发明的转化植物进行时，产生的所述异戊烯苯醌通常固定在所述转化植物中。
本发明的转化植物，或所述植物的部分可被直接使用，或掺入用于人或动物饮食的食品组合物中，或者可提取它们包含的异戊烯苯醌。如上所述，术语“植物的部分”是指这些植物的任何器官，无论在地面上或地下。地面上的器官是茎、叶和花，包括雄性和雌性的生殖器官，琮有种子。地下的器官主要是根，但也可以是块茎。根据本发明的较佳实施方案，种子是用于食品的转化植物的部分。
发明还包含本发明的转化植物的种子，所述种子与非转化植物的种子相比富含异戊烯苯醌。此外，发明还包含本发明转化植物的种子或任何其他部分的食品组合物。从这些植物部分中，特别是从种子中产生的油，也是本发明的主题内容。
为了回收转化植物中产生的异戊烯醌，可通过连续步骤进行提取步骤，该连续步骤是碾磨培育植物，过滤和/或离心磨碎的植物材料，然后回收包含所述异戊烯醌的上清液，所述回收可包括脂质化合物的提取。碾磨步骤包含机械碾磨(通过压差，通过超声波作用，通过研碎)较佳，后面是酶裂解或渗透休克。
本方法中也可对获得的植物细胞或植物提取物中包含的异戊烯苯醌进行纯化的最终步骤。所述异戊烯苯醌的纯化可使用浓缩或分离化合物的任何技术进行，特别是本领域熟练技术人员熟知的微量过滤、超滤、电泳或色谱技术。为了获得纯净的异戊烯苯醌，本领域熟练技术人员可以使用测定所述异戊烯苯醌的方法以确定包含所述异戊烯苯醌的纯化组分。根据本方法，产生的所述异戊烯苯醌的纯度较佳是50％，60％，70％，80％，90％，95％，99％，或者100％较有利。
根据本发明的特定实施方案，本发明的转化植物除了在植物中使PDH酶过度表达的功能基因，和在植物中使HPPD酶过度表达的功能基因，还包含在植物中使香叶基-香叶基还原酶(以下称为GGR)过度表达的功能基因。在产生的异戊烯苯醌中，与生育三烯酚和质体醌相比这种植物优选产生生育酚，特别是维生素E。
GGR酶是一种催化香叶基-香叶基焦磷酸转化成植基焦磷酸的酶。根据特定实施方案，在植物中使GGR过度表达的功能基因，包含编码植物GGR基因的编码序列。通过实施例，可使用编码拟南芥属的GGR的序列，如Keller等，(1998，Eur.J.Biochem.251(1-2)：413-417)报道的，或者编号AJ 007789(烟草)，AF 069318松叶菊(Mesembryanthenum crystallinum)，Y14004(拟南芥属)，和Q55087(集胞藻sp PCC 6803)描述的。
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以下实施例用于阐明本发明，但不是限制本发明的范围。
在以下这些实施例中描述的所有方法或步骤是通过实施例给予的并与一种选择相符合，是在可用于获得相同结果的各种方法中选出的。该选择对结果的质量没有影响，因此为了获得相同的结果，本领域熟练技术人员可使用任何合适的方法。特别是，除非在实施例中另有规定，使用的所有重组DNA技术是按照Sambrook等.(1989，《分子克隆：实验室手册》，第2版，Nolan C.编，Cold Spring HarborLaboratory Press，NY)，在Sambrook和Russel(2001，《分子克隆：实验室手册》，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)，在Ausubel等.(1994，《新编分子生物学实验指南》，Current protocols，USA，第1卷和第2卷)，和在Brown(1998，《分子生物学LabFax》，第2版，Academic Press，UK)中描述的标准方案进行的。植物分子生物学的标准材料和方法是R.D.D.Croy(1993，《植物分子生物学LabFax》，BIOS Scientific Publications Ltd(UK)和Blackwell Scientific Publications(UK))描述的。进行PCR(聚合酶链反应)的标准材料和方法也是在Dieffenbach和Dveksler(1995，《PCR引物：实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY)和在McPherson等.(2000，《PCR-基础：从背景到实验台》，第1版，Springer Verlag，Germany)中描述的。
实施例1：HPPD活性的测量
HPPD活性可使用Garcia等.(1997，Biochem.J.325，761-769)或Garcia等.(1999，Plant Physiol.119，1507-1516)描述的方法测量。
实施例2：预苯酸脱氢酶活性的测量
预苯酸脱氢酶的活性是在25℃，在340nm，在包含50mM tris-HCl，pH 8.6，300μM预苯酸，和1mM的NAD或NADP的总体积为200μl的溶液中，用分光光度计监测NADH或NADPH的形成时测定的。
实施例3：过度表达HPPD的嵌合基因的构建
构建使得对HPPD抑制除草剂抵抗的植物能过度表达HPPD的嵌合基因。
它包括在转录方向组装：如专利申请EP 0 507 698所述的“双组蛋白”启动子(PdH4)，在Carrington和Freed(1990；J.Virol.64：1590-1597)描述的烟草蚀纹病毒翻译增强子(TEV)序列，在专利申请EP 0 508 909所述的编码最优化转运肽(OTP)的序列，专利申请WO 96/38567描述的拟南芥HPPD基因的编码部分，和然后Bevan等.(1983，Nucleic Acids Res.11(2)，369-385)中所述的胭脂碱合酶基因的nos终末子。该组装然后克隆入二元载体且结构为：
Figure C0382432600201
实施例4：过度表达PDH的嵌合基因的构建
构建过度表达PDH嵌合基因的构建包括在转录方向组装：如专利申请EP 0 507698所述的“双组蛋白”启动子(PdH4)，在Carrington和Freed(1990；J.Virol.64：1590-1597)描述的烟草蚀纹病毒翻译增强子(TEV)序列，在专利申请EP 0 508909所述的编码最优化转运肽(OTP)的序列，Mannhaupt等.(1989，Gene 85，303-311)描述的酵母PDH基因的编码部分和然后Bevan等.(1983，Nucleic AcidsRes.11(2)，369-385)中所述的胭脂碱合酶基因的nos终止子。该组装然后克隆入包含卡那霉素抗性基因(NPTII)的二元载体pRD224，以产生载体pRD 224-PDH。此载体的结构为：
该二元载体然后被用于转化土壤杆菌属菌株EHA 105并产生土壤杆菌属菌株EHA 105-pRD 224-PDH。该土壤杆菌属菌株用于转化烟草PBD6和烟草PBD6-ARA9(用使拟南芥HPPD过度表达的嵌合基因转化的烟草)。
在卡那霉素上选择该转化植物。
实施例5：用过度表达PDFH的表达盒转化烟草PBD6-ARA9
PBD6-ARA9烟草植物是用实施例3中描述的嵌合基因转化的烟草植物，和在专利申请WO 96/38567所述的过度表达拟南芥HPPD。获得PBD6-ARA9烟草植物的方法如Garcia等.(1999，Plant Physiol.119，1507-1516)所述。在实施例4中所述的用过度表达PDH的嵌合基因转化的PBD6-ARA9系被称为PBD6-ARA9系。
5.1：转化
按照叶盘技术(Horsch等，1985，Science 227：1229-1231)用非致的根癌农杆菌菌株EHA 105-pRD 224-PDH进行转化。
5.2：再生
ARA9-PDH烟草植物的再生是由在包含30g/l蔗糖和350mg/l of头孢噻肟和200mg/ml卡那霉素的Murashige和Skoog(MS)基础培养基上的叶状外植体进行的。该外植体是从温室植物中取得并按照叶盘技术(Horsch等，1985，Science227：1229-1231)以三个连续步骤进行再生的：
-首先包含在用含有0.05mg/l萘乙酸(ANA)和2mg/l苄氨基嘌啉(BAP)的补充30g/l蔗糖15天和200mg/ml卡那霉素的MS培养基上诱导根部。
-在该步骤中形成的绿根然后通过用不含激素、补充30g/l蔗糖和200mg/ml卡那霉素10天的MS培养基上发育。
-接着移出发育的根，然后在有半含量的盐、维生素和糖，有200mg/ml卡那霉素且不含激素的MS根培养基中培养。在大约15天后，生根的芽被转移到温室中。
转化植物的耐受性通过在二酮腈(DKN)处理过的土壤上播种来研究。
实施例6：PBD6-ARA9和ARA9-PDH烟草植物对HPPD抑制剂的耐受性
6.1.对二酮腈(DKN)的耐受性
13个被用作转化起始材料的ARA9-PDH系和PBD6-ARA9系在增加浓度的DKN：5，10和32ppm上播种。
在5ppm的DKN中，所有的PBD6-ARA9和ARA9-PDH系是有抗性的，特别是它们都过度表达拟南芥HPPD。在10ppm的DKN中，亲代系PBD6-ARA9被完全抑制。另一方面，所有的ARA9-PDH系的抗性佳，除了只有一个(ARA9-PDH4)被抑制。在32ppm的DKN中，所有对10ppm DKN抗性的ARA9-PDH系是抗性植物并生长正常，而只在重组HPPD中表达的亲代系PBD6-ARA9被完全抑制。显示最好耐受性的系是ARA9-PDH14，ARA9-PDH18和ARA9-PDH24系。
6.2.对磺草酮和甲基磺草酮的耐受性
对HPPD抑制剂磺草酮和甲基磺草酮进行相同的实验。发现ARA9-PDH18系对3μM甲基磺草酮和6μM磺草酮有耐受药性，其中Petit Havana型的野生型烟草系对0.375μM的这两种化合物敏感。
实施例7：对PBD6-ARA9和ARA9-PDH烟草植物中生育酚和生育三烯酚水平的测定
按照Folch方法(Folch等，1957，J.Biol.Chem.，226-497)从每个分析的植物的中等成熟叶子和嫩叶的样品中获得脂质提取物。它们的生育酚和生育三烯酚含量的分析是按照Frazer等.(2000，Plant J.24：551-558)的方法用HPLC进行的。这些含量然后根据参考产品进行量化，并用μg/g的固体表示。结果见表1。
表1：在PBD6，PBD6-ARA9(ARA9)和ARA9-PDH(PDH4，PDH 14，PDH 18，PDH24)植物的样品中生育酚和生育三烯酚水平
 中等成熟叶子   PBD6   ARA9   PDH 4   PDH 14   PDH 18   PDH 24
                            (μg/g的固体)
 α生育酚β/γ生育酚δ生育酚   62.21.73nd   64.731.93nd   66.92.16nd   89.74.56nd   91.034.28nd   83.44.01nd
 α生育三烯酚β/γ生育三烯酚δ生育三烯酚   ndndnd   ndndnd   ndndnd   64.582.04nd   66.992.23nd   55.351.98nd
  嫩叶   PBD6   ARA9   PDH 4   PDH 14   PDH 18   PDH 24
                           (μg/g的固体)
  α生育酚β/γ生育酚δ生育酚   73.51.83nd   64.732.37nd   68.71.86nd   76.23.32nd   75.43nd   83.43.5nd
  α生育三烯酚β/γ生育三烯酚δ生育三烯酚   ndndnd   ndndnd   ndndnd   275.2617.456.2   224.515.34.3   242.417.145.4
注：nd未测出
这些结果清楚地显示用使PDH和HPPD酶过度表达的嵌合基因和有大量异戊烯苯醌，特别是生育酚和生育三烯酚双重转化ARA9-PDH烟草植物与只用编码HPPD酶基因转化的PBD6-ARA9烟草植物的比较。最大的效果涉及生育三烯酚。该效果在高有分生组织的嫩叶中更明显。该组织特异性的原因与用于产生ARA9-PDH烟草植物的启动子有关，该启动子是优先在植物的快速生长组织，特别是分生组织(PdH4)中表达的启动子。使用其他类型的启动子有可能在该植物的其他组织中获得类似的效果。
而且，在不同的ARA9-PDH系之间观察到的差异来自不同的转化情况。旨在开发纯合子系最佳的系之间的杂交可能获得有关产生异戊烯苯醌和耐受HPPD抑制剂有均一性的系。

Claims (12)

1.一种增强植物对HPPD抑制剂耐受性的方法，包括用以下基因同时或连续转化植物：
(1)在植物中使PDH酶过度表达的基因，
(2)在植物中使HPPD酶过度表达的基因。
2.如权利要求1所述的方法，所述在植物中使PDH酶过度表达的基因包含酵母PDH编码基因的编码序列。
3.如权利要求2所述的方法，所述酵母PDH编码基因的编码序列是酿酒酵母基因的编码序列。
4.如权利要求1到3中任一项所述的方法，所述在植物中使HPPD过度表达的基因包含植物HPPD编码基因的编码序列。
5.如权利要求4中所述的方法，所述植物HPPD编码基因的编码序列是拟南芥基因的编码序列。
6.一种增强植物中异戊烯苯醌生物合成的方法，包括用以下基因同时或连续转化植物：
(1)在植物中使PDH酶过度表达的基因，
(2)在植物中使HPPD酶过度表达的基因。
7.如权利要求6所述的方法，所述异戊烯苯醌是生育三烯酚。
8.如权利要求6所述的方法，所述异戊烯苯醌以维生素E为代表。
9.如权利要求6-8中任一项所述的方法，所述在植物中使PDH酶过度表达的基因包含酵母PDH编码基因的编码序列。
10.如权利要求9所述的方法，所述酵母PDH编码基因的编码序列是酿酒酵母基因的编码序列。
11.如权利要求6-8中任一项所述的方法，所述在植物中使HPPD过度表达的基因包含植物HPPD编码基因的编码序列。
12.如权利要求11中所述的方法，所述植物HPPD编码基因的编码序列是拟南芥基因的编码序列。
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