KR20050046764A - 개선된 프레닐퀴논 생합성을 이용한 형질전환 식물 - Google Patents

개선된 프레닐퀴논 생합성을 이용한 형질전환 식물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 형질전환된 식물, 특히 형질전환되지 않은 동일한 식물보다 플라스토퀴논, 토코트리에놀 및 토코페롤을 다량 생성하는 형질전환된 식물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 식물의 생성 방법 및, 이러한 식물의 배양 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 식물은 p-히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 효소의 제초 억제제에 대한 내성을 갖는다.

Description

개선된 프레닐퀴논 생합성을 이용한 형질전환 식물{TRANSFORMED PLANTS WITH ENHANCED PRENYLQUINONE BIOSYNTHESIS}
본 발명은 형질전환된 식물에 관한 것이며, 특히 형질전환되지 않은 동일한식물 보다 플라스토퀴논, 토코트리에놀 및 토코페롤을 상당량 생성하는 형질전환된 식물에관한 것이다. 또한, 본 발명은 이러한 식물의 생성 방법, 이러한 식물의 배양 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 의한 식물은 p-히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 효소 (이하에서는 이를 HPPD로 약칭함)의 제초 억제제에 대한 내성을 갖는 성질을 갖는다.
프레닐퀴논은 플라스토퀴논, 토코페롤 및 토코트리에놀을 더 포함하는 지질 친화성을 갖는 화합물의 커다란 기이다. 식물에 대하여서는 프레닐퀴논이 호모겐티세이트의 경로를 통하여 합성된다.
널리 공지된 프레닐퀴논으로는 천연으로는 생성되지 않으나 그를 위한 식이가 필요한, 및 동물, 특히 포유동물의 필수 영양소인 비타민 E 또는 α-토코페롤 등이 있다. 또한, 비타민 E의 널리 알려진 효과는 세포막의 지질상에서의 항산화 작용이다 [참조문헌, Epstein et al., 1966, Radical Research 28: 322-335; Kamel-Eldin and Appelqvist, 1996, Lipids 31: 671-701].
비타민 E 이외에, 토코트리에놀은, 사람 및 동물의 식이에서 필수적이지는 않지만, 이는 특히 비타민 E보다 높은 항산화성을 갖는다는 점이 특히 흥미로운 것으로 밝혀졌다 [참조문헌, Kamat et al., 1997, Mol. Cell.Biochem. 170, 131-137]. 이러한 화합물은 특히 자유 라디칼로부터 세포를 보호하며, 심혈관 질환 또는 암의 출현을 방지하는 것으로 알려져 있다 [참조문헌, Packer et al., 2001, J. Nutr. 131 (2): 3698-3738]. 또한, 토코트리에놀은 토코페롤을 갖지 않는 활성인 수용체 에스트로겐의 증식을 억제함으로써 항암 활성을 나타낸다[참조문헌, Guthrie et al., 1997, J. Nutr. 127: 544-548]. 또한, 이들은 동맥 경화증을 배척시키는 토코페롤 보다 저콜레스테롤혈증 활성이 훨씬 우수한 것으로 나타났다 [참조문헌: Pearce et al., 1992, J. Med. Chem. 35: 3595-3606; Qureshi et al., 2001, J. Nutr. 131: 2606-2618].
플라스토퀴논은 사람 또는 동물의 건강에서 그 역할이 공지되지 않았으나, 식물에서는 중요한 역할을 한다. 이러한 분자는 엽록체의 막에 존재하며, 광합성 반응중에 전자의 수송 기능을 갖는다 [참조문헌, Grumbach, 1984, Structure Function and Metabolisme of plant lipids, Siegenthaler and Eichenberger eds].
또한, 프레닐퀴논의 함량 증가는 식물에게 산화성 스트레스, 특히 저온, 건조 또는 강한 조명에 대한 우수한 내성을 부여한다.
일반적으로 광합성 식물 및 유기체에서, 호모젠티세이트는 프레닐퀴논의 방향족 전구체를 구성한다. 호모젠티세이트는 효소인 p-히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (이하에서는 HPPD로 지칭함)의 산물이다. 대부분의 유기체에서, HPPD는 방향족 아미노산 티로신의 이화 분해의 경로에 관련된 효소이다 [참조문헌, Goodwin, 1972, in Tyrosin Metabolism: The biochemical, physiological, and clinical significance of p-hydroxyphenylpyruvate oxygenase, Goodwin B.L., ed, Oxford University press, 1-94]. HPPD는 호모젠티세이트로의 티로신의 분해 산물인 p-히드록시페닐피루베이트 (HPP)의 전환 반응을 촉매화한다.
대부분의 식물은 아로게네이트를 경유하여 티로신을 합성한다 [참조문헌, Abou-Zeid et al., 1995, Applied Env Microb 41: 1298-1302; Bonner et al., 1995, Plant Cells Physiol. 36, 1013-1022; Byng et al., 1981, Phytochemistry 6: 1289-1292; Connely and Conn 1986 Z. Naturforsch 41c: 69-78; Gaines et al., 1982 Plants 156: 233-240]. 이러한 식물에서, HPP는 티로신의 분해로부터만 유도된다. 반대로, 효모 사카로마이세스 세레비시아에 (Sacharomyces cerevisiae) 또는 박테리아 에스케리챠 콜리(Escherichia coli)와 같은 유기체에 대하여, HPP는 티로신의 전구체이며, 이는 프레페네이트를 HPP로 형질전환시키는 효소인 프레페네이트 데히드로게나제 (prephenate dehydrogenase, 이하에서는 PDH로 지칭함)의 작용에 의하여 합성된다 [참조 문헌, Lingens et al., 1967 European J. Biochem 1: 363-374; Sampathkumar and Morrisson 1982 Bioch Biophys Acta 701: 204-211]. 이러한 유기체에서, HPP의 생성은 방향족 아미노산이 생합성 경로(시키메이트(shikimate의 경로)에 직접 연관되어 있으나, 티로신의 분해 경로에는 그러하지 않다 (도 1 참조).
식물에 의한 프레닐퀴논의 생합성을 증가시키기 위하여서는 본 출원의 발명자들은 PDH 효소의 과발현에 의한 "시키메이트"로서 공지된 경로에 전술한 전구체의 합성을 연관시켜 이들 식물의 세포에서의 HPP 전구체의 흐름을 증가시키는 것을 연구하였다. 예상되는 효과는 프레닐퀴논의 생합성을 전체적으로 증가시켜야만 하는 HPP 전구체의 상당한 흐름이다.
실제로, PDH 효소에 대한 암호화 유전자를 갖는 식물의 형질전환으로 인해서 전술한 식물에 의한 프레닐퀴논의 생성을 증가시킬 수 있게 된다는 점에 유의한다. 이러한 증가는, PDH 효소를 암호화하는 유전자를 사용하여 형질전환된 식물이 HPPD 효소를 과발현시킨 식물인 경우, 매우 상당하게 된다.
또한, PDH 효소에 대한 암호화 유전자를 사용한 식물의 형질전환은 HPPD 억제제에 대한 내성을 증가시킬 수 있음이 알려져 있다. 이러한 내성의 증가는, PDH 효소를 암호화하는 유전자를 사용하여 형질전환된 식물이 HPPD 효소를 과발현시킨 식물인 경우, 매우 상당하게 된다.
수년간, HPPD에 대한 관심은 이러한 효소가 "표백"으로 알려진 신규한 제초제계의 표적이 되는 것을 예시함으로써 상당히 증가하게 되었다. HPPD를 표적으로 하는 이와 같은 제초제는 특히 이속사졸 (EP 418,175호, EP 470,856호, EP 487,352호, EP 527,036호, EP 560,482호, EP 682,659호, US 5,424,276호), 특히 이속사플루톨, 옥수수의 선택적 제초제, 디케토니트릴 (EP 496,630호, EP 496,631호), 특히 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-CF3 페닐)프로판-1,3-디온 및 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-2,3-디클로로페닐)프로판-1,3-디온, 트리케톤 (EP 625,505호, EP 625,508호, US 5,506,195호), 특히 술코트리온 또는 메소트리온 또는 피라졸리네이트 등이 있다.
식물의 생체 대사 경로의 관련 효소의 표적을 갖는 제초제의 잇점 중의 하나는 특징적인 계통발생학적 기원의 식물에 대한 활성의 광역 스펙트럼이다. 그러나, 이러한 제초제는 또한 이들이 경작된 식물에 작용하여 바람직하지 않은 식물 또는 "유해한 식물"을 제거하기 위하여 배양물에 적용되는 경우에는 상당한 단점을 나타낸다. 이러한 단점은 제초제에 대한 내성을 갖는 경작된 식물의 사용에 의하여 완화될 수 있다. 이러한 식물은 일반적으로 이들의 조직에서의 전술한 효소를 과발현시키도록 제초제에 대한 내성을 갖는 효소를 암호화하는 유전자를 이의 게놈에 도입함으로써 유전자 공학에 의하여 얻는다.
현재까지 유전자 공학을 사용한 3 가지의 주요 전략을 사용하여 식물이 제초제에 대하여 내성을 갖게 된다. 제1의 전략은 해독 효소를 암호화하는 유전자를 사용하여 식물을 형질전환시킴으로써 제초제를 해독시키는 것으로 이루어진다. 이러한 효소는 제초제, 또는 이의 활성 대사물을, 예를 들면 브로목시닐 또는 바스타에 대하여 내성을 갖는 효소와 같이 비독성의 분해 산물로 전환시킨다 (EP 242,236호, EP 337,899호). 제2의 전략은 제초제 또는 이의 활성 대사물, 예를 들면 글리포세이트에 대한 내성을 갖는 효소에 대하여 덜 민감하도록, 변이된 표적 효소를 암호화하는 유전자를 사용하여 식물을 전환시키는 것으로 이루어진다 [참조 문헌, EP 293,356호; Padgette et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 33]. 제3의 전략은 표적 효소의 상당량, 필요할 경우 식물을 투과하는 제초제의 함량 보다 상당히 높은 양을 식물에서 생성하도록 민감한 표적 효소를 과발현시키는 것으로 이루어진다. 이러한 전략은 그의 억제제의 존재에도 불구하고, 충분한 수준의 기능적 효소를 유지할 수 있도록 한다.
이와 같은 제3의 전략을 수행하였으며, HPPD의 억제제에 대한 내성을 갖는 식물을 얻을 수 있다(WO96/38567호). 또한, 이러한 민감한 표적 효소 (비변이)의 단순한 과발현 전략은 제초제에 대한 내성을 농경학적 레벨에서 식물에게 부여하는데 있어서 최초로 성공적으로 사용되었었다.
또한, 대부분의 HPPD 억제 제초제는 느리게 또한 실질적으로 비가역적으로 결합하는, 기질에 대한 경쟁적 억제제가 되는 것으로 알려졌다 [참조문헌, Ellis et al., 1996, Chem. Res. Toxicol. 9: 24-27; Viviani et al., 1998, Pestic. Biochem. Physiol. 62: 125-134]. 그리하여, 이들의 작용 모드는 결합 부위에서 선별적으로 결합됨으로써 HPP와 경쟁에 유입되는 것으로 이루어진다. 이러한 결합의 결과는 세포의 호모젠티세이트 합성의 중단이다.
본 발명은 PDH 효소의 과발현에 의하여 HPPD의 HPP 기질의 흐름의 증가를 사용하는데, 이는 제초제, 특히 HPPD의 제초 억제제에 대하여 내성을 갖는 식물을 얻기 위하여 가능한 제4의 전략을 이루는 것으로 보인다.
설명
본 발명은
(1) PDH 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자,
(2) HPPD 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자
를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 식물에 관한 것이다.
특정의 구체예에 의하면, 본 발명은
(1) PDH 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자,
(2) HPPD 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자
를 포함하지만, 단 식물에서의 기능성 유전자는 피틸/프레닐 트랜스퍼라제 효소의 과발현이 가능한 것을 특징으로 하는 형질전환된 식물에 관한 것이다.
특정의 구체예에 의하면, 본 발명은
(1) PDH 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자,
(2) HPPD 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자
를 사용하여 형질전환된 식물로 이루어지는 것을 특징으로 하는 형질전환된 식물에 관한 것이다.
본 발명의 특정의 구체예에 의하면, 본 발명에 의하여 형질전환된 식물은 형질전환된 식물성 세포에 의하여 나타날 수 있다.
본 발명에 의한 "형질전환된 식물" 또는 "형질전환된 식물성 세포"라는 것은 형질전환된 식물 또는 임의의 기타의 유기체로부터 유래할 수 있는 트랜스겐 1 이상을 이의 게놈에서 안정한 방법으로 통합시킨 식물 또는 식물성 세포를 지칭한다. 본 발명에 의한 트랜스겐은 형질전환된 식물 이외에 적어도 또다른 유기체로부터 유도된 엘리먼트를 포함하는 키메라 유전자에 의하여 나타나는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명에 의한 트랜스겐은 기타의 엘리먼트에서 1 이상의 프로모터, 암호화 서열 및 상이한 유기체로부터 유래한 터미네이터를 포함할 수 있으며, 또한, 상기 유기체는 형질전환된 식물과는 상이하다.
"PDH 효소를 과발현시키는 식물에서의 기능성 유전자"라는 표현에서, 용어 PDH는 천연의 또는 변이된 임의의 PDH 효소를 지칭하는 것으로 해석하여야만 하며, 이는 프레페네이트의 HPP로의 형질전환의 PDH 활성을 나타낸다. 특히 전술한 PDH 효소는 임의의 유형의 유기체로부터 유래할 수 있다. PDH 활성을 사용한 효소의 식별은 기질 프레페네이트의 함량의 감소를 측정하거나 또는, 이른바 HPP 또는 보조인자 NADH 또는 NADPH 중 하나의 효소 반응으로부터의 생성물 함량을 측정할 수 있도록 하는 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있다. 특히, PDH 활성의 측정은 실시예 2에 설명된 방법에 의하여 수행될 수 있다.
PDH 효소에 대한 다수의 암호화 유전자는 문헌에 기재되어 있으며, 이의 서열은 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/에서 확인할 수 있다. 특히, 문헌 [Mannhaupt et al., 1989, Gene 85, 303-311]에 기재된 바와 같은 효모 사카로마이세스 세레비시아에 (Saccharomyces cerevisiae) (수탁 번호 S46037), 바실러스속의 박테리아, 특히 문헌 [Henner et al., 1986, Gene 49 (1), 147-152]에 기재된 바와 같은 B. 서브틸리스 종 (수탁 번호 P20692), 에스케리챠 속의 박테리아, 특히 문헌[Hudson et al., 1984, J. Mol. Biol. 180 (4), 1023-1051]에 기재된 바와 같은 E. 콜리(E. coli) 종 (수탁 번호 KMECTD) 또는, 에르위니아(Erwinia) 속의 박테리아, 특히 문헌 [Xia et al., 1992, J. Gen.Microbiol. 138 (7), 1309-1316]에 기재된 바와 같은 이. 헤르비콜라(E. herbicola) 종 (수탁 번호 S29934)와 같은 PDH 효소를 암호화하는 유전자가 알려져 있다.
"HPPD 효소를 과발현시킬 수 있는 식물에서의 기능성 유전자"라는 표현에서, 용어 HPPD는 호모젠티세이트로의 HPP의 형질전환의 HPPD 활성을 나타내는, 천연, 변이 또는 키메라의 임의의 HPPD 효소를 참조하여 해석하여야만 한다. HPPD의 효소 활성의 측정은 기질 HPP의 함량의 감소를 측정하거나 또는, 효소 반응으로부터 생성된 생성물, 이른바 호모젠티세이트의 축적량을 측정할 수 있도록 하는 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있다. 특히, HPPD 활성의 측정은 실시예 1에 설명된 방법에 의하여 수행될 수 있으며, 문헌 [Garcia et al., 1997, Biochem. J. 325, 761-769 또는 Garcia et al., 1999, Plant Physiol, 119, 1507-1516]에 기재된 방법에 의하여 수행될 수 있다.
특히, HPPD 효소는 유기체의 임의의 유형으로부터 유도될 수 있다. HPPD 효소를 암호화하는 다수의 유전자는 문헌에 기재되어 있으며, 특히, 슈도모나스(Pseudomonas)와 같은 박테리아 (Ruetschi et al., 1992, Eur. J. Biochem., 205, 459-466, WO96/38567호), 아라비도프시스(Arabidopsis)와 같은 식물 (WO96/38567호, Genebank AF047834) 또는 당근 (WO96/38567호, Genebank 87257), 코키코이드(Coccicoides) (Genebank COITRP) 또는 마우스 또는 돼지와 같은 포유류의 유전자 등이 있다.
"변이된 HPPD"라는 것은 천연 HPPD에 대한 최소의 변이를 갖고, 해당 천연 HPPD보다 HPPD의 제초 억제제에 대한 내성이 더 큰 성질을 갖는 HPPD를 의미한다. 변이된 HPPD는 C-말단, 예를 들면, WO99/24585호에 기재된 바와 같은 C-말단 부분에서 변이된 HPPD인 것이 유리하다. 변이된 HPPD는 WO99/24585호에 기재된 바와 같은 변이 W336를 포함한다.
키메라 HPPD라는 것은 각종의 HPPD로부터 유래하는 엘리먼트를 포함하는 HPPD를 의미한다. 특히, 이러한 키메라 HPPD는 WO99/24586호에 기재되어 있다.
HPPD는 슈도모나스 플루오레스센스 (Pseudomonas fluorescens) (WO 96/38567호) 또는 아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) (WO96/38567호)의 HPPD인 것이 이롭다.
"피틸/프레닐 트랜스퍼라제 효소를 과발현시킬 수 있는 식물에서의 기능성 유전자"의 표현에서, 용어 "피틸/프레닐 트랜스퍼라제"는 WO02/089561호에 기재된 바와 같은 피틸/프레닐 트랜스퍼라제 효소를 지칭하는 것으로 해석하여야만 한다. 특히 전술한 "피틸/프레닐 트랜스퍼라제 효소를 과발현시킬 수 있는 식물에서의 기능성 유전자"는 시네코시스티스(Synechocystis)의 유전자 slr1736으로부터 선택된 유전자 (웹사이트 http://www.kazusa.or.jp/cyanobase상에서 Cyanobase에 기재된 서열) 및 아라비도프시스 (Arabidopsis)의 유전자 ATPT2 (Smith et al., 1997, Plant J. 11, 83-92)로 이루어진다.
본 발명에 의한 형질전환된 식물 또는 식물성 세포는 형질전환되지 않은 식물보다 프레닐퀴논의 함량을 많이 생성시킨다. 본 발명에 의한 식물 또는 식물성 세포는 PDH 효소 또는 HPPD를 과발현시킬 수 있는 식물에서의 기능성 유전자를 단독으로 사용하여 형질전환된 식물보다 프레닐퀴논 함량이 더 높게 생성되는 것이 바람직하다. 본 발명에 의한 형질전환된 식물 또는 식물성 세포에 의하여 생성되는 프레닐퀴논으로는 토코페롤 및/또는 토코트리에놀 및/또는 플라스토퀴논 등이 있다. 토코페롤, 토코트리에놀 및 플라스토퀴논 함량의 여러 가지 측정 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들면, 토코페롤, 토코트리에놀 및 플라스토퀴논은 Frazer 등의 방법 [Frazer et al., 2000, Plant J. 24: 551-558]에 의하여 측정할 수 있다. 본 발명에서 "함량이 높다"는 것은 2 배 이상 높은, 바람직하게는 5 배 이상 높은, 바람직하게는 10 배 이상 높은, 바람직하게는 50 배 이상 높은, 바람직하게는 100 배 이상 높은, 바람직하게는 500 배 이상 높게 그리고 바람직하게는 1,000 배 이상 높은 함량을 의미한다.
또한, 본 발명에 의하여 형질전환된 식물은 HPPD의 억제제에 대한 내성을 갖게 된다.
"HPPD의 억제제에 대한 내성을 갖는 형질전환된 식물"은 적어도 형질전환되지 않은 동일한 식물에 대하여 정상의 독성을 갖는 HPPD의 억제제의 투여량에 대하여 내성을 갖는 특징을 나타내는 전술한 바와 같은 형질전환된 식물을 지칭한다. 형질전환되지 않은 식물에 대한 정상의 독성을 갖는 HPPD의 억제제 투여량은 사용된 HPPD의 억제제, 상기 억제제가 적용되는 식물뿐 아니라 전술한 식물에 적용되는 단계에 따라 결정된다. 그러나, 당업자라면 억제제의 상기 독성 성질이 전술한 억제제의 적용 소정 일 후에 식물의 사멸을 초래하는 억제제의 사멸 효과에 해당할 수 있으며, 이러한 사멸 효과는 HPPD의 억제제의 경우에서와 같이, HPPD의 억제제가 식물의 성장을 감소시키는 효과인 식물의 "백화"로 지칭되는 효과로 진행될 수 있다는 것을 숙지할 것이다. 본 발명에 의한 HPPD의 억제제에 대한 내성을 갖는 형질전환된 식물은 HPPD 효소의 과발현을 가능케 하는 식물에서의 기능성 유전자만을 사용하여 형질전환된 동일한 식물에 대하여 정상의 독성인 HPPD의 억제제 투여량에 대한 내성을 나타낸다
"HPPD의 억제제"는 HPP의 호모젠티세이트로의 형질전환의 천연 효소 활성을 일시적으로 또는 영구적으로 차단하도록 식물의 HPPD 효소에 결합될 수 있는 천연 또는 인공 기원의 모든 화합물을 의미한다. 이러한 성질에 의하여, 본 발명에 의한 HPPD의 억제제는 이것이 적용되는 식물 성장의 억제 또는 사멸을 유발하게 되며, 전술한 사멸은 식물의 "백화" 이후에 일반적으로 개입된다.
HPPD의 억제제의 예로는 이속사졸 (EP 418,175호, EP 470,856호, EP 487,352호, EP 527,036호, EP 560,482호, EP 682,659호, US 5,424,276호), 특히 옥수수의 선택적 제초제인 이속사플루톨, 디케토니트릴 (이하에서 이를 DKN으로 지칭하며, 이는 EP 496,630호, EP 496,631호에 기재됨), 특히 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-CF3페닐)프로판-1,3-디온 및 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-2,3-디클로로페닐)프로판-1,3-디온, 트리케톤 (EP 625,505호, EP 625,508호, US 5,506,195호), 특히 설코트리온 또는 메소트리온 또는 피라졸리네이트 등이 있다.
본 발명에 의한 식물에서의 기능성 유전자라는 것은 식물에서 기능할 수 있는 유전자를 의미한다. 식물에서 기능할 수 있는 유전자라는 것은 전술한 식물의 1 이상의 조직에서 암호화하는 단백질을 형질발현시킬 수 있는 유전자이다. 특히, 본 발명에 의한 식물에서의 기능성 유전자는 PDH 및 HPPD 효소를 과발현시킬 수 있다. 단백질의 과발현이라는 것은 형질전환되지 않은 동일한 식물에 존재하는 것보다 높은 레벨로 형질전환된 식물의 조직에서의 이러한 단백질의 발현을 의미하며, 전술한 레벨이라는 것은 전술한 식물의 동일한 성장 단계에서 측정한다. 본 발명에 의한 식물에서의 기능성 유전자는 도입되는 식물을 제외한 기타의 유기체로부터 유도되는 엘리먼트를 포함할 수 있는 키메라 유전자인 것이 바람직하다.
본 발명에 의한 식물에서의 기능성 유전자는 작동 방법에서 이들 사이에서 결합된 식물중에서의 1 이상의 기능성 프로모터, PDH 효소 및/또는 HPPD 효소에 대한 암호화 서열 및, 동일한 식물에서의 기능성 터미네이터 엘리먼트를 포함하는 키메라 유전자인 것이 바람직하다. 키메라 유전자가 포함할 수 있는 각종의 엘리먼트는 한편으로는 단백질의 전사, 번역 및 성숙의 조절 엘리먼트, 예컨대 프로모터, 신호 펩티드 또는 통과 펩티드에 대한 암호화 서열 또는 폴리아데닐화 신호를 구성하는 터미네이터 엘리먼트이거나 또는, 다른 한편으로는 단백질을 암호화하는 서열이 된다. "작동 방법에서 이들 사이에서 결합된"은 이들의 작동이 조정되며 암호화 서열이 발현되도록 이들 사이에서 키메라 유전자 엘리먼트가 결합되는 것을 의미한다. 이의 예로는 프로모터는 전술한 암호화 서열의 발현을 확인할 수 있을 경우 작동 방법에서 암호화 서열에 결합된다. 본 발명에 의한 키메라 유전자의 구조 및 이들 상이한 엘리먼트의 어셈블리는 당업자에게 공지된 기법을 사용하여 형성 가능한 것, 특히 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기재된 것일 수 있다. 키메라 유전자를 구성하는 조절 엘리먼트의 선택은 실질적으로 이들이 기능하여야만 하는 식물의 기능이 되며, 당업자라면 해당 식물에서 기능성 조절 엘리먼트를 선택할 수 있을 것이다.
본 발명에 의한 키메라 유전자를 포함할 수 있는 프로모터는 공간적으로 또는 임시적으로 조절 가능한 구성 프로모터, 유도성 프로모터가 될 수 있다.
본 발명의 키메라 유전자에 사용할 수 있는 구성 프로모터중에서는 예를 들면 옥토핀 신타제의 유전자 또는 노팔린 신타제의 유전자의 박테리아 프로모터 (Sanders et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15, 1543-1548), 코울리플라워의 모자이크 바이러스의 RNA19S 또는 35S 전사를 조절하는 유전자 등과 같은 바이러스 프로모터 (CaMV; Lawton et al., 1987, Plant Mol. Biol. 9, 315-324; Odell et al., 1985, Nature, 313, 810-812), 카사바의 엽맥의 모자이크 바이러스의 프로모터 (CsVMV; 예를 들면, WO97/48819호에 기재된 것) 등을 들 수 있다. 식물성 기원의 프로모터 중에서는 리불로스-비스카르복실라제/옥시게나제 (RuBisCO)의 작은 서브유닛의 유전자의 프로모터, EP 0,507,698호에 기재된 바와 같은 히스톤 유전자의 프로모터 또는, 쌀의 액틴 유전자의 프로모터 [Wang et al., 1992, Mol. Cell. Biol., 12(8): 3399-3406; US 5,641,876호] 등을 들 수 있다.
본 발명에 의한 키메라 유전자에 사용할 수 있는 유도성 프로모터중에서는 예를 들면 옥신을 결합시키는 단백질에 대한 암호화 유전자 프로모터 (Schwob et al., 1993, Plant J. 4 (3): 423-432), UDP-글루코스 플라보노이드 글리코실-트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자의 프로모터 (Ralston et al., 1988, Genet., 119 (1), 185-197), MIP 프로테이나제의 억제제를 암호화하는 유전자 프로모터 (Cordero et al., 1994, Plant J, 6 (2) 141-150), 또는 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제를 암호화하는 유전자 프로모터 (Martinez et al., 1989, J. Mol. Biol., 208 (4), 551-565; Quigley et al., 1989, J. Mol. Evol., 29 (5), 412-421; Kohler et al., 1995, Plant Mol. Biol., 29 (6), 1293-1298) 등이 있다.
본 발명에 의한 키메라 유전자에 사용될 수 있는 조직 특이성 프로모터중에서 예를 들면 WO00/29594호에 기재된 바와 같은 뿌리의 특이적 프로모터, WO98/22593호, WO99/15679호 또는 WO99/43818호에 기재된 바와 같은 꽃의 특이적 프로모터, WO91/13993호, WO92/17580호, WO98/45460호, WO98/45461호 또는 WO99/16890호에 기재된 바와 같은 열매, 특히 곡물의 특이적 프로모터 등이 있다.
본 발명의 키메라 유전자에 사용될 수 있는 터미네이터 엘리먼트중에서는 예를 들면 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)의 노팔린 신타제를 암호화하는 유전자의 nos 터미네이터 엘리먼트 (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res 11 (2), 369-385) 또는, EP 0,633,317호에 기재된 히스톤의 유전자의 터미네이터 엘리먼트 등을 들 수 있다.
또한, 키메라 유전자는 신호 펩티드 또는 통과 펩티드를 암호화하는 세포하 어드레스 서열을 포함할 수 있다. 이러한 HPPD 효소 및/또는 PDH 효소에 대한 암호화 서열로부터의 상류 또는 하류에 위치하는 서열은 유기체 숙주의 세포성 구획에서 특이적인 방법으로 전술한 HPPD 효소 또는 PDH 효소를 나타내도록 할 수 있다. 예를 들면, 키메라 유전자는 미토콘드리아, 색소체, 소포체 또는 액포등과 같은 특정의 구획에 대한 HPPD 효소 및/또는 PDH를 나타내도록 하는 신호 펩티드 또는 통과 펩티드를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
이러한 서열의 역할은 특히 문헌 [Plant Molecular Biology (1998)]의 보고의 38번에 기재되어 있는데, 이는 주로 식물성 세포의 각종 구획에서의 단백질의 수송에 기여한다 (식물 세포에서의 액포로의 단백질의 분류 pp 127-144; 핵 기공 복합체, pp 145-162; 엽록체 엔벨로프 막으로 그리고 이를 통과한 단백질의 전좌 pp 91-207; 엽록체에서의 틸라코이드 단백질을 표적화하기 위한 다수의 경로 pp 209-221; 식물에서의 미토콘드리아 단백질 유입 pp 311-338).
한 구체예에서, 통과 펩티드는 엽록체 또는 미토콘드리아를 어드레스하는 신호가 될 수 있으며, 그리하여 엽록체 또는 미토콘드리아로 분열된다. 바람직한 방법에서, 본 발명에 의한 키메라 유전자는 엽록체에서의 HPPD 효소 및/또는 PDH를 어드레스하는 통과 펩티드에 대한 암호화 어드레스 세포하 서열을 포함한다.
통과 펩티드는 단일이거나 또는 이중일 수 있다. 이중 통과 펩티드는 임의로 중간 서열에 의하여 분리된다. 예를 들면, 본 발명에 의한 바람직한 통과 펩티드는 전사 방향에서 플라스티디알 위치 결정으로 효소에 대한 암호화 식물성 유전자의 통과 펩티드에 대한 암호화 서열, 플라스티디알 위치 결정으로 효소에 대한 암호화 식물성 유전자의 N-말단 성숙 부분의 서열의 일부분, 그후 플라스티디알 위치 결정으로 효소를 암호화하는 식물성 유전자의 제2의 통과 펩티드에 대한 암호화 서열을 포함한다. 예를 들면, 이와 같은 이중 통과 펩티드는 EP 0,508,909호에 기재되어 있다.
본 발명에 의하면, 키메라 유전자는 WO87/07644호에 기재되어 있는 타바코 모자이크 바이러스 (VMT) 또는, 문헌 [Carrington & Freed, 1990, J. Virol. 64 (4): 1590-7]에 기재된 타바코 에치(etch) 바이러스(TEV) 또는, 문헌 [Figwort Mosaic Virus, US 5,994,521호]에 기재된 현삼속의 모자이크 바이러스 등과 같은 전사 활성체 (인핸서)와 같은 암호화 서열과 프로모터의 사이에 위치하는 기타의 조절 서열을 포함할 수 있다. 본 발명에 의한 키메라 유전자는 인트론(intron), 특히 단자엽 식물에서의 유전자 형태를 지지하는 인트론, 예컨대 WO99/34005호에 기재된 쌀의 액틴의 유전자의 인트론 1, 또는 옥수수의 인트론 adh1을 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 식물 및 식물성 세포는 형질전환된 식물 및 식물성 세포이다. 본 발명에 의하여 형질전환된 식물 및 식물성 세포를 얻기 위하여, 당업자는 공지의 다수의 식물의 형질전환 방법을 사용할 수 있을 것이다.
본 발명에 의한 식물 및 식물성 세포는 HPPD 또는 PDH를 과발현시키는 본 발명에 의한 식물에서의 기능성 유전자를 포함하는 형질발현 및/또는 형질전환의 클로닝 벡터를 사용하여 형질전환되는 것이 바람직하다.
본 발명의 실시에 유용할 수 있는 벡터의 예로는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지 또는 바이러스 등이 있다. 본 발명에 의한 식물 또는 식물성 세포의 형질전환 벡터는 플라스미드인 것이 바람직하다. 일반적인 방법에서, 벡터의 주요한 성질은 특히 복제 기원의 존재로 인한 식물의 세포에서의 유지 및 자동복제 능력이어야만 한다. 유기체 숙주의 안정한 형질변환을 위하여, 벡터는 게놈에서 통합될 수 있다. 본 발명에 의한 유전자 중 하나에서의 삽입 기법 뿐 아니라 이러한 벡터의 선택은 대개 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Press Laboratory]에 기재되어 있으며, 이는 당업자의 일반적인 지식의 일부이다. 유리한 방법에서, 본 발명에 사용된 벡터는 본 발명에 의한 유전자 이외에, 선택 마커를 암호화하는 또다른 유전자를 포함한다. 선택 마커는 실제로 형질전환된 유기체 숙주, 즉 벡터가 혼입된 것을 선택하도록 한다. 이용 가능한 선택 마커 중에서, 항체에 대한 내성을 갖는 유전자를 포함하는 마커, 예컨대 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제의 유전자의 마커 (Gritz et al., 1983, Gene 25: 179-188), 비알라포스에 대한 내성을 갖는 bar 유전자와 같은 제초제에 대한 내성을 갖는 유전자를 포함하는 마커 (White et al., 1990, Nucleic Acid Res. 18 (4): 1062), 글리포세이트에 대한 내성을 갖는 유전자 EPSPS (US 5,188,642호) 또는 이속사졸에 대한 내성을 갖는 유전자 HPPD (WO96/38567호) 등을 들 수 있다. 또한, 효소 GUS 등과 같은 식별이 용이한 효소, 형질전환된 세포에서의 안료의 생성을 조절하는 효소 또는 안료에 대한 암호화 유전자 등을 들 수 있다. 이러한 선택 유전자 마커는 특히 WO91/02071호, WO95/06128호, WO96/38567호 및 WO97/04103호에 기재되어 있다.
본 발명에 의한 형질전환된 식물을 얻는데 유용한 방법 중에는 식물의 조직 또는 세포를 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 전술한 벡터의 존재하에서 형질전환시키는 것으로 이루어진다 [참조문헌, Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genet. 168(1), 111-115; Mercenier and Chassy, 1988, Biochemistry 70 (4), 503-517]. 또다른 방법으로는 벡터 및 형질전환시키고자 하는 세포 또는 조직을 전기장으로 처리하는 것으로 이루어진 전기충격법이 있다 [참조문헌, Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6 (7), 650-660; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62]. 또다른 방법은 조직 또는 세포중의 벡터를 미량주사로 직접 주사하는 것으로 이루어진 방법이 있다 [참조문헌, Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33 (2), 121-136]. 또다른 방법으로는, "유전자 총" 기법과 같은 방법을 사용할 수 있다. 벡터를 흡착시킨 입자로 세포 또는 조직을 공격하는 것으로 이루어진다 [참조문헌, Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (24), 9692-9696; Klein et al., 1992, Biotechnology 10 (3), 286-291; 미국 특허 제4,945,050호]. 바람직하게는, 식물성 세포 또는 조직의 형질전환은 아그로박테리움(Agrobacterium) 속 박테리아를 사용하여, 바람직하게는 전술한 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6, 143-173; Shaw et al., 1983, Gene 23 (3): 315-330) 또는 에이 리조게네스(A. rhizogenes) (Bevan et Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet. 16: 357-384; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28)에 의하여 상기 식물의 세포 또는 조직의 감염에 의하여 실시한다. 바람직하게는, 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens)에 의한 식물성 세포 또는 조직의 형질전환은 문헌 [Ishida et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14 (6), 745-750]에 기재된 프로토콜에 의하여 수행한다. 당업자는 형질전환시키고자 하는 식물의 성질에 따라서 적절한 방법을 선택할 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 의한 식물의 제조 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 전술한 바와 같은 형질변형된 식물성 세포로부터 형질변형된 식물을 재생시키는 것으로 이루어진다. 이러한 재생은 식물의 성질에 따라 적절한 임의의 방법에 의하여 얻는다.
또한, 본 발명은 이러한 형질전환된 식물로부터의 부분 및, 이러한 식물의 자손을 포함한다. 이러한 "식물의 부분"이라는 것은 지상의 또는 땅속에 존재하는 이들 식물의 임의의 기관을 의미한다. 지상의 기관이라는 것은 줄기, 잎 그리고, 암술 및 수술의 생식 기관을 포함하는 꽃 등이 있다. 지하 기관이라는 것은 주로 뿌리이지만, 이는 구근이 될 수도 있다. 용어 "자손"이라는 것은 주로 이들 사이에서의 식물의 생식으로부터 발생한 배를 포함하는 종자를 의미한다. 광의로는, 용어 "자손"이라는 것은 1 이상의 부모가 본 발명에 의하여 형질전환된 식물인 교배로부터 생성된 각각의 새로운 세대로 형성된 모든 종자에도 적용된다. 또한, 자손은 전술한 형질전환된 식물의 식물 증식에 의하여 얻을 수 있다. 본 발명에 의한 종자는 살진균 활성, 제초 활성, 살충 활성, 선충구제 활성, 살균 활성 또는 살바이러스 활성으로부터 선택된 활성을 갖는 1종 이상의 활성 산물을 포함한다.
본 발명에 의하여 형질전환된 식물은 적어도 해당 단백질에 대한 또다른 암호화 유전자를 포함할 수 있으며, 이러한 또다른 유전자는 PDH 및/또는 HPPD를 과발현시키는 식물에서의 기능성 유전자와 동시에, 이전에 또는 이후에 식물의 게놈에 또다른 유전자를 인공적으로 도입한다. 해당 단백질에 대한 암호화 유전자중에서는 제초제에 대한 내성을 갖는 또다른 효소를 암호화하는 유전자, 예를 들면 비알라포스에 대한 내성을 갖는 bar 유전자 (White et al., NAR 18: 1062, 1990) 또는, 글리포세이트에 대한 내성을 갖는 EPSPS 효소를 암호화하는 유전자 (미국 특허 제5,188,642호; WO97/04103호) 등을 들 수 있다. 또한, 박테리아 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis)의 δ-엔도톡신을 암호화하는 유전자와 같은 살충 독소에 대한 암호화 유전자를 들 수 있다 (예를 들면 WO98/40490호 참조). 질환에 대하여 내성을 갖는 기타의 유전자, 예를 들면, EP 0,531,498호 또는 미국 특허 제5,866,778호에 기재된 바와 같은 효소 옥살레이트 옥시다제를 암호화하는 유전자 또는 WO97/30082호, WO99/24594호, WO99/02717호, WO99/53053호 및 W099/91089호에 기재된 것과 같은 기타의 펩티드 항박테리아 및/또는 항진균 펩티드를 암호화하는 유전자가 전술한 식물 중에 함유될 수 있다. 또한, 식물의 농경학적 성질에 대한 암호화 유전자, 특히 미국 특허 제5,552,306호, 미국 특허 제5,614,313호 및 WO98/46763호 및 WO 98/46764호에 기재된 바와 같은 효소 델타-6 불포화 효소에 대한 암호화 유전자 또는, WO00/01833호 및 WO00/36127호에 기재된 바와 같은 효소 세린아세틸트랜스퍼라제 (SAT)에 대한 암호화 유전자를 들 수 있다.
해당 단백질을 암호화하는 추가의 유전자는 벡터에 의하여 통합될 수 있다. 이러한 경우, 벡터는 PDH 효소 및/또는 HPPD 효소에 대한 본 발명에 의한 암호화 유전자 및, 적어도 또다른 해당 펩티드 또는 단백질에 대한 암호화 유전자를 포함한다.
이들은 상기에서 정의한 통상의 기법에 의하여 전술한 추가의 유전자를 포함하는 1 이상의 또다른 벡터에 의하여 통합될 수 있다.
본 발명에 의한 식물은 식물의 교배에 의하여 얻을 수 있으며, 이중 하나는 본 발명에 의한 PDH 효소 및/또는 HPPD 효소에 대한 암호화 유전자를 포함하며, 다른 하나는 적어도 또다른 해당 펩티드 또는 단백질에 대한 또다른 암호화 유전자를 지닌다.
본 발명에 의하여 형질전환된 식물은 단자엽 또는 쌍자엽이 될 수 있다. 이들 식물은 해당 농경학적 식물인 것이 바람직하다. 단자엽 식물은 소맥, 옥수수, 쌀 등인 것이 유리하다. 쌍자엽 식물은 평지, 대두, 타바코, 목화인 것이 유리하다.
또한, 본 발명은 본 발명에 의한 형질전환된 식물의 배양 방법에 관한 것으로서, 전술한 식물의 배양에 적절한 경작지의 지표면상에서 상기 형질전환된 식물의 종자를 파종하고, 전술한 종자 또는 전술한 형질전환된 식물에는 실질적으로 영향을 미치지 않으면서 HPPD 억제제를 포함하는 1 이상의 제초제 조성물을 상기 경작지의 상기 지표면에 적용한 후, 소정의 성숙도에 도달하면 경작된 식물을 수집하고, 필요할 경우 수집된 식물로부터 종자를 분리하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 HPPD의 억제제에 대한 내성을 식물에게 부여하는 방법에 관한 것으로서,
(1) PDH 효소를 과발현시킬 수 있는 식물에서의 기능성 유전자,
(2) HPPD 효소를 과발현시킬 수 있는 식물에서의 기능성 유전자
를 사용하여 동시에 또는 연속적으로 전술한 식물을 형질전환시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 프레닐퀴논, 특히 토코페롤, 토코트리에놀 및/또는 플라스토퀴논을 생성하기 위한 본 발명에 의한 식물 또는 식물성 세포의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 식물에서의 프레닐퀴논의 함량을 증가시키는 방법에 관한 것으로서,
(1) PDH 효소를 과발현시킬 수 있는 식물에서의 기능성 유전자,
(2) HPPD 효소를 과발현시킬 수 있는 식물에서의 기능성 유전자
를 사용하여 동시에 또는 연속적으로 전술한 식물을 형질전환시키는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 프레닐퀴논의 생성 방법에 관한 것으로서, 전술한 식물성 세포 또는 식물의 성장 및 증식에 적합한 배양 배지중에서 본 발명에 의하여 형질전환된 식물 또는 식물성 세포를 배양액에 넣는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
전술한 방법의 특정의 구체예에 의하면, 생성된 프레닐퀴논은 비타민 E로 나타나는 토코페롤인 것이 바람직하다.
전술한 방법의 특정의 구체예에 의하면, 생성된 프레닐퀴논은 토코트리에놀인 것이 바람직하다.
전술한 방법의 특정의 구체예에 의하면, 전술한 프레닐퀴논의 제조 방법은 제1의 단계에서 경작한 전술한 식물성 세포 또는 전술한 형질전환된 식물에 의하여 생성된 프레닐퀴논의 최종 추출 단계를 포함한다.
전술한 프레닐퀴논의 제조 방법을 본 발명에 의하여 형질전환된 식물성 세포를 사용하여 수행할 경우, 전술한 식물성 세포를 이의 생존 및 성장에 이로운 배양 배지중에서 경작한다. 당업자는 전술한 식물성 세포의 최적의 성장이 가능하도록 하는 전술한 배양 배지의 조성을 결정할 수 있을 것이다. 예를 들면, 식물성 세포의 배양 배지 및 방법은 문헌 [Murashige et Skoog, 1962, Physiol. Plant. 15: 473-497 및 Gamborg et al., 1968, Exptl. Cell Research, 50: 151-159]에 기재되어 있다.
또한, 전술한 방법을 본 발명에 의하여 형질전환된 식물성 세포를 사용하여 수행할 경우, 생성된 전술한 프레닐퀴논은 배양 배지중에서 분비될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수도 있다. 전술한 프레닐퀴논이 배양 배지중에서 분비될 경우, 전술한 방법의 추출 단계에 이어서 상기 식물성 세포의 제거에 의한 배양 배지의 회수 단계를 수행할 수 있다. 이러한 전술한 식물성 세포의 제거에 의한 배양 배지의 회수 단계는 액체 분획중에 포함된 고형 분획의 분리의 임의의 수단에 의하여 수행될 수 있다. 특히, 여과 및 원심분리는 이러한 단계의 수행에 적합한 방법이다.
프레닐퀴논이 배양 배지중에서 분비되지 않을 경우, 추출 단계는 배양된 식물성 세포의 농축, 분리된 식물성 세포의 세포성 파손, 파손된 세포성 추출물의 원심분리의 단계에 이어서, 전술한 프레닐퀴논을 포함하는 상청액의 회수의 연속 단계에 의하여 수행될 수 있다. 세포성 파손의 단계는 기계적 압착 (압력차에 의한, 초음파 작용에 의한, 분쇄에 의한), 효소 용해 또는, 삼투압 공격과 같은 당업자에게 공지된 기법을 사용하여 실시할 수 있으며, 전술한 기법은 개별적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
전술한 프레닐퀴논의 제조 방법이 본 발명에 의하여 형질전환된 식물을 사용하여 수행되는 경우, 전술한 식물을 이의 생존 및 성장에 적합한 기질상에서 배양시키며, 전술한 기질은 천연 또는 합성 기질일 수 있다. 천연의 기질의 예로는 토양 또는 토양 혼합물이 될 수 있으며, 전술한 식물은 예를 들면 배양실내에서와 같은 조절된 조건하에서, 예를 들면 온실에서와 같은 반-조절된 조건하에서 또는, 예를 들면 완전 토양과 같은 자연 조건하에서 배양될 수 있다. 인공 기질은 예를 들면 본 발명에 의한 식물의 생존 및 성장에 이로운 조성을 갖는 액체 또는 한천 기질을 들 수 있다. 당업자라면 전술한 식물의 최적의 성장이 가능하도록 전술한 인공 기질의 조성을 결정할 수 있을 것이다. 식물 배양 기질의 예로는 이러한 식물이 배지상에 유입되도록 하는, 영양 원소 N (질소), P (인), K (칼륨) 또는 임의의 기타의 영양원을 포함하는 영양원, 시판중인 액제 또는 변형 액제에 의하여 관개 처리하는 버미큘라이트, 암면형의 배지를 들 수 있다. 본 발명에 의한 식물을 인공 기질상에서 배양할 경우, 이들은 일반적으로 배양실에서의 조절된 조건하에서 배양된다.
또한, 전술한 방법을 본 발명에 의하여 형질전환된 식물을 사용하여 수행하는 경우, 생성된 상기의 프레닐퀴논은 일반적으로 전술한 형질전환된 식물에서 부동화된다.
본 발명에 의하여 형질전환된 식물 또는 상기 식물의 일부는 사람 또는 동물에게 공급하기 위한 식품 조성물에 직접 사용될 수 있거나 또는 혼입될 수 있거나 또는 이는 이를 포함한 프레닐퀴놀의 추출로 처리할 수 있다. 전술한 바와 같이, 이러한 "식물의 일부"라는 것은 지상의 또는 땅속에 존재하는 이들 식물의 임의의 기관을 의미한다. 지상의 기관이라는 것은 종자뿐 아니라, 줄기, 잎 그리고, 암술 및 수술의 생식 기관을 포함하는 꽃 등이 있다. 땅속 기관이라는 것은 주로 뿌리이지만, 이는 구근이 될 수도 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 의하면, 종자는 식품을 위한 형질전환된 식물의 일부가 된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 의한 형질전환된 식물의 종자를 포함하며, 전술한 종자는 형질전환되지 않은 식물의 종자에 비하여 프레닐퀴논이 풍부하다. 또한, 본 발명은 본 발명에 의하여 형질전환된 식물의 임의의 기타의 부분 또는 종자를 포함하는 식품 조성물을 포함한다. 이와 같은 식물의 부분, 특히 종자로부터 생성된 오일은 본 발명의 목적이 된다.
형질전환된 식물에서 생성된 프레닐퀴논을 회수하기 위하여서는, 경작된 식물의 분쇄 단계, 식물 분쇄물의 여과 단계 및/또는 원심 분리 단계에 이어서, 전술한 프레닐퀴논을 포함하는 상청액의 회수 단계를 연속적으로 수행할 수 있으며, 전술한 회수는 지질 화합물의 추출로 이루어질 수 있다. 분쇄 단계는 기계적 분쇄 (압력차에 의하여, 초음파 작용에 의하여, 분쇄에 의하여)로 이루어지는 것이 바람직하며, 그후 효소 용해 또는 삼투압 충격을 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법은 얻은 식물 또는 식물성 세포의 추출물에 함유된 프레닐퀴논의 최종 정제 단계를 수행할 수 있다. 전술한 프레닐퀴논의 정제는 당업자에게 주지된 화합물의 농축 또는 분리, 특히 정밀여과, 한외여과, 전기영동 또는 크로마토그래피의 임의의 기법에 의하여 수행될 수 있다. 정제된 프레닐퀴논을 얻기 위하여, 당업자는 전술한 프레닐퀴논을 포함하는 정제 분획을 구별하기 위한 전술한 프레닐퀴논의 측정법을 사용할 수 있을 것이다. 이러한 방법에 의하면, 생성된 상기 프레닐퀴논은 순도가 50%, 바람직하게는 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 유리하게는 100%가 될 수 있을 것이다.
본 발명의 특정의 구체예에 의하면, 본 발명에 의하여 형질전환된 식물은 PDH 효소를 과발현시킬 수 있는 식물에서의 기능성 유전자 및 HPPD 효소를 과발현시킬 수 있는 식물에서의 기능성 유전자 이외에, 효소 제라닐제라닐 리덕타제 (이하에서는 GGR로 약칭함)을 과발현시키는 식물에서의 기능성 유전자를 포함한다. 생성된 프레닐퀴논중에서, 이러한 식물은 토코트리에놀 및 플라스토퀴논과 비교하여 토코페롤, 특히 비타민 E를 선택적으로 생성한다.
효소 GGR은 제라닐제라닐 피로포스페이트를 피틸피로포스페이트로의 형질전환을 촉매화하는 효소이다. 특정의 구체예에 의하면, GGR을 과발현시킬 수 있는 식물에서의 기능성 유전자는 식물의 GGR에 대한 암호화 유전자의 암호화 서열을 포함한다. 예를 들면, 수탁 번호 AJ 007789 (타바코), AF 069318 [마셈브리안테눔 크리스탈리눔(Mesembryanthenum crystallinum)], Y14044 [아라비도프시스(Arabidopsis)], Q55087 [시네코시스티스 (Synechocystis sp.) PCC 6803]로 기재된 것 또는, 문헌 [Keller et al., 1998, Eur. J. Biochem. 251 (1-2): 413-417]에 개시된 바와 같은 아라비도프시스 (Arabidopsis)의 GGR에 대한 암호화 서열을 사용할 수 있다.
참조 문헌
하기의 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로서 이로써 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다.
이들 실시예에서 후술하는 모든 방법 또는 작업은 동일한 결과를 생성하기 위하여 이용 가능한 여러 가지 방법중에서 수행한 예 및 선택의 예로서 제시한 것일 뿐이다. 이러한 선택은 결과의 어떠한 품질에도 영향을 미치지 않으며 동일한 결과를 생성하기 위하여 당업자에 의하여 임의의 방법을 채택하여 사용할 수 있다. 특히, 실시예에서 특별히 언급되어 있지 않더라도, 사용된 DNA 재조합의 모든 기법은 문헌 [Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second edition, Nolan C.ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY], 문헌 [Sambrook and Russel, 2001, Molecular cloning: A laboratory manual, Third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY], 문헌 [Ausubel et al., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Current protocols, USA, Volumes 1 and 2], 및 문헌 [Brown, 1998, Molecular Biology LabFax, Second edition, Academic Press, U.K.]에 기재된 표준 프로토콜에 의하여 수행한다. 식물의 분자 생물학에 대한 방법 및 표준 물질은 문헌 [Croy R. D.D., 1993, Plant Molecular Biology LabFax, BIOS Scientific Publications Ltd (UK) and Blackwell Scientific Publications (UK)]에서 설명되어 있다. 또한, PCR (폴리머라제 연쇄 반응)에 대한 표준 물질 및 방법은 문헌 [Dieffenbach and Dveksler, 1995, PCR Primer: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY] 및 문헌 [McPherson et al., 2000, PCR-Basics: From background to bench, First edition, Springer Verlag, Germany]에서 설명된다.
실시예 1: HPPD 활성 측정
HPPD 활성은 문헌 [Garcia et al., 1997, Biochem. J. 325, 761-769] 또는 문헌 [Garcia et al., 1999, Plant Physiol. 119,1507-1516]에 설명된 방법에 의하여 측정될 수 있다.
실시예 2: 프레페네이트 데히드로게나제 활성 측정
프레페네이트 데히드로게나제의 활성은 총 부피 200 ㎕로 50 mM의 트리스-HCl, pH 8.6, 300 μM의 프레페네이트 및 1 mM의 NAD 또는 NADPH를 포함하는 용액중에서 25℃에서 340 ㎚에서의 후속의 분광계 분석에 의하여 NADH 또는 NADPH의 형성에 대하여 측정하였다.
실시예 3: 과발현된 HPPD의 키메라 유전자의 구성
HPPD를 억제하는 제초제에 대한 내성을 식물에게 부여하기 위한 HPPD를 과발현시킬 수 있는 키메라 유전자를 구성하였다.
이는 전사 방향으로 유럽 특허 출원 제0,507,698호에 기재된 바와 같이 "이중 히스톤"으로 지칭되는 프로모터 (PdH4), 문헌 [Carrington and Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597]에 기재된 타바코 에치 바이러스(TEV) 번역 인핸서의 서열, 유럽 특허 출원 제0,508,909호에 기재된 바와 같은 최적화된 통과 펩티드(OTP)에 대한 암호화 서열, WO96/38567호에 기재된 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 HPPD 유전자의 암호화 부분에 이어서, 문헌 [Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11 (2), 369-385]에 기재된 노팔린 신타제의 유전자의 nos 터미네이터를 구성하였다. 그후, 이러한 어셈블리를 바이너리 벡터내에서 클로닝 처리하고, 이는 하기와 같은 구조를 갖는다.
실시예 4: PDH를 과발현시키는 키메라 유전자의 구성
PDH를 과발현시키는 키메라 유전자의 구성은 전사 방향으로 유럽 특허 출원 0,507,698에 기재된 바와 같은 "이중 히스톤"으로 공지된 프로모터(PdH4), 문헌 [Carrington and Freed, 1990; J. Virol. 64: 1590-1597]에 기재된 바와 같은 타바코 에치 바이러스(TEV) 번역 인핸서의 서열, 유럽 특허 출원 0,508,909호에 기재된 바와 같은 최적화된 통과 펩티드(OTP)에 대한 암호화 서열, 문헌 [Mannhaupt et al., 1989, Gene 85, 303-311]에 기재된 바와 같은 효모의 PDH 유전자의 암호화 부분에 이어서, 문헌 [Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11 (2), 369-385]에 기재된 노팔린 신타제의 유전자의 nos 터미네이터를 구성하였다. 이러한 어셈블리는 벡터 pRD 224-PDH를 생성하기 위하여 카나마이신(NPTII)에 대한 내성을 갖는 유전자를 포함하는 바이너리 벡터 pRD 224내에서 클로닝 처리하였다. 이러한 벡터는 하기와 같은 구조를 갖는다.
그후, 이와 같은 바이너리 벡터를 사용하여 아가로박테리움 (Agrobacterium) EHA 105의 스트레인을 형질전환시키고, 아가로박테리움 (Agrobacterium) EHA 105-pRD 224-PDH의 스트레인을 생성하였다. 이러한 아가로박테리움의 스트레인을 사용하여 타바코 PBD6 및 타바코 PBD6-ARA9를 형질전환시켰다 [아라비도프시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)의 HPPD를 과발현시키는 키메라 유전자를 사용하여 형질전환시킨 타바코].
형질전환된 식물을 카나마이신에 대하여 선택하였다.
실시예 5: PDH를 과발현시킨 형질발현의 카세트를 사용한 타바코 PBD6-ARA9의 형질전환
타바코 PBD6-ARA9는 실시예 3에 기재된 바와 같고, W096/38567호에 기재된 에이. 탈리아나(A. thaliana)의 HPPD를 과발현시킨 키메라 유전자를 사용하여 형질발현된 타바코이다. 타바코 PBD6-ARA9의 입수 방법은 문헌 [Garcia et al., 1999, Plant Physiol. 119, 1507-1516]에 기재되어 있다. 실시예 4에 기재된 바와 같은 PDH를 과발현시키는 키메라 유전자를 사용하여 형질전환된 세포주 PBD6-ARA9를 세포주 ARA9-PDH로 지칭한다.
5.1: 형질전환
형질전환은 디스크 잎 기법 (Horsch et al., 1985, Science 227: 1229-1231)에 의하여 아그로박테리움 투메파시엔스 (Agrobacterium tumefaciens) EHA 105-pRD 224-PDH의 비발암유전자 스트레인을 사용하여 수행하였다.
5.2: 재생
타바코 ARA9-PDH의 재생은 30 g/ℓ의 수크로스와 350 ㎎/ℓ의 세포탁심 및 200 ㎎/㎖의 카나마이신을 포함하는 Murashige 및 Skoog (MS)의 기본 배지상에 잎 외식편으로부터 출발하여 수행하였다. 잎 외식편을 온실속의 식물로부터 취하고, 이를 디스크 잎 기법 (Horsch et al., 1985, Science 227: 1229-1231)에 의하여 하기와 같은 3 단계로 재생시켰다:
- 제1의 단계는 15 일간 0.05 ㎎/ℓ의 나프틸아세트산 (ANA) 및 2 ㎎/ℓ의 벤질아미노푸린 (BAP)을 포함하는 30 g/ℓ의 수크로스 및 200 ㎎/㎖의 카나마이신을 첨가한 MS 배지상에서 발아를 유도하는 것을 포함한다.
- 이러한 단계중에 형성된 녹색 발아를 10 일간 호르몬을 포함하지는 않으나, 200 ㎎/㎖의 카나마이신 및 30 g/ℓ의 수크로스를 첨가한 MS 배지상에서 배양에 의하여 전개시켰다.
- 전개된 발아를 취한 후, 호르몬은 포함하지 않으나, 이를 절반의 염, 비타민 및 당, 200 ㎎/㎖의 카나마이신을 포함하는 MS 정착 배지상에서 배양하였다. 약 15 일 경과시, 뿌리내린 발아를 온실로 옮겼다.
형질전환된 식물의 내성은 디케토니트릴(DKN)으로 처리한 토양에 파종하여 실험하였다.
실시예 6: HPPD의 억제제에 대한 타바코 PBD6-ARA9 및 ARA9-PDH의 내성
6.1. 디케토니트릴(DKN)에 대한 내성
형질전환을 위한 출발 물질로서 사용되어 온 13 세포주 ARA9-PDH 및 세포주 PBD6-ARA9는 DKN 5, 10 및 32 ppm로 농도를 증가시켜 파종하였다.
5 ppm의 DKN에 대해 모든 세포주 PBD6-ARA9 및 ARA9-PDH는 내성을 지니는데, 모두 에이. 탈리아나(A. thaliana)의 HPPD를 과발현시키기 때문이다. 10 ppm의 DKN에서 부모 세포주 PBD6-ARA9는 완전히 억제되었다. 반대로 모든 세포주 ARA9-PDH는 양호하게 내성을 지니지만, 단 하나의 세포주(ARA9-PDH4)는 억제된다. 32 ppm의 DKN에서, 10 ppm의 DKN에 대한 내성을 갖는 모든 세포주 ARA9-PDH는, 내성을 지니며 정상적으로 발아하는 식물을 갖는 반면, 부모 세포주 PBD6-ARA9는 재조합 HPPD만이 완전 억제되는 것으로 실험되었다. 최고의 내성을 나타내는 세포주는 세포주 ARA9-PDH14, ARA9-PDH18 및 ARA9-PDH24이다.
6.2. 술코트리온 및 메소트리온에 대한 내성
HPPD, 술코트리온 및 메소트리온의 억제제를 사용하여 동일한 실험을 실시하였다. 세포주 ARA9-PDH18은 3 μM의 메소트리온 및 6 μM의 술코트리온에 대하여 내성을 지니나, 쁘띠 하바나형 야생형 타바코 세포주는 0.375 μM의 2 종의 화합물에 대하여 민감한 것으로 입증되었다.
실시예 7: 타바코 PBD6-ARA9 및 ARA9-PDH에서의 토코페롤 및 토코트리에놀의 비율 측정
각각의 분석 식물의 중간 잎 및 매우 어린 잎의 샘플에 대한 Folch의 기법 (Folch et al., 1957, J. Biol. Chem., 226-497)에 의하여 지질 추출물을 얻었다. 토코페롤 및 토코트리에놀로부터의 이들의 함량 분석을 문헌 [Frazer et al., 2000, Plant J. 24: 551-558]의 방법에 의한 HPLC에 의하여 수행하였다. 그후, 기준 생성물에 대한 이들의 함량을 정량화하고, 그 결과를 건조 중량 1 g에 대한 ㎍의 단위로 측정하였다. 결과를 하기 표 1에 기재하였다.
식물 PBD6, PBD6-ARA9 (ARA9) 및 ARA9-PDH(PDH4, PDH14, PDH18, PDH24)의 샘플중의 토코페롤 및 토코트리에놀의 비율
중간 잎 PBD6 ARA9 PHD4 PDH14 PDH18 PDH24
(건조 중량 1 g에 대한 ㎍)
α토코페롤 62.2 64.73 66.9 89.7 91.03 83.4
β/γ토코페롤 1.73 1.93 2.16 4.56 4.28 4.01
δ토코페롤 nd nd nd nd nd nd
α토코트리에놀 nd nd nd 64.58 66.99 55.35
β/γ토코트리에놀 nd nd nd 2.04 2.23 1.98
δ토코트리에놀 nd nd nd nd nd nd
매우 어린 잎 PBD6 ARA9 PDH4 PDH14 PDH18 PDH24
(건조 중량 1 g에 대한 ㎍)
α토코페롤 73.5 64.73 68.7 76.2 75.4 83.4
β/γ토코페롤 1.83 2.37 1.86 3.32 3 3.5
δ토코페롤 nd nd nd nd nd nd
α토코트리에놀 nd nd nd 275.26 224.5 242.4
β/γ토코트리에놀 nd nd nd 17.45 15.3 17.14
δ토코트리에놀 nd nd nd 6.2 4.3 5.4
이러한 결과에 의하면, HPPD 효소를 암호화하는 유전자를 사용하여 단순히 형질전환된 타바코 PBD6-ARA9에 비하여, PDH 효소 및 HPPD를 과발현시킬 수 있는 키메라 유전자를 사용하여 이중으로 형질전환시킨 타바코 ARA9-PDH는 프레닐퀴논, 특히 토코페롤 및 토코트리에놀을 상당량 포함하는 것이 명백하다. 가장 중요한 효과는 토코트리에놀과 관련되어 있다. 이러한 효과는 어린 잎에서 분열 조직이 훨씬 더 많이 농축되어 있다. 이러한 특이성 조직의 기원은 식물의 급속한 성장을 갖는 조직, 특히 분열 조직에서 선택적으로 형질발현되는 프로모터(PdH4)인 타바코 ARA9-PDH를 생성하도록 사용된 프로모터와 관련되어 있다. 기타 유형의 프로모터의 사용은 식물의 기타의 조직에서 유사한 효과를 얻을 수 있어야만 한다.
또한, 각종 형질전환의 경우로 인하여 각종의 세포주 ARA9-PDH간에는 상이점이 관찰된다. 세포주 동질접합체로 작업하기 위한 최적의 세포주간의 교배는 HPPD의 억제제에 대한 내성 및, 프레닐퀴논의 생성과 관련한 균질한 세포주를 얻을 수 있어야만 한다.

Claims (15)

  1. (1) PDH 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자,
    (2) HPPD 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 식물.
  2. (1) PDH 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자,
    (2) HPPD 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 형질전환된 식물성 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, PDH를 과발현시키는 식물에서의 기능성 유전자는 효모의 PDH에 대한 암호화 유전자의 암호화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 식물 또는 식물성 세포.
  4. 제3항에 있어서, 효모의 PDH에 대한 암호화 유전자의 암호화 서열은 사카로마이세스 세레비시세아에(Saccharomyces cereviseae)의 유전자의 암호화 서열인 것을 특징으로 하는 것을 특징으로 하는 것인 식물 또는 식물성 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, HPPD를 과발현시킬 수 있는 식물에서의 기능성 유전자는 식물의 HPPD에 대한 암호화 유전자의 암호화 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 식물 또는 식물성 세포.
  6. 제5항에 있어서, 식물의 HPPD에 대한 암호화 유전자의 암호화 서열은 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 유전자의 암호화 서열인 것을 특징으로 하는 것인 식물 또는 식물성 세포.
  7. 식물의 배양에 적절한 경작지의 지표면상에서 형질전환 식물의 종자를 파종하고, 상기 형질전환된 종자 또는 형질전환된 식물에는 실질적으로 영향을 미치지 않으면서, HPPD 억제제를 포함하는 1 이상의 제초제 조성물을 경작지의 지표면에 적용한 후, 소정의 성숙도에 도달하면 경작된 식물을 수집하고, 필요할 경우 수집된 식물로부터 종자를 분리하는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 의하여 형질전환된 식물의 배양 방법.
  8. (1) PDH 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자,
    (2) HPPD 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자
    를 동시에 또는 연속적으로 사용하여 식물을 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 HPPD의 억제제에 대한 내성을 식물에게 부여하기 위한 방법.
  9. (1) PDH 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자,
    (2) HPPD 효소의 과발현이 가능한 식물에서의 기능성 유전자
    를 동시에 또는 연속적으로 사용하여 식물을 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 식물에서의 프레닐퀴논의 함량을 증가시키는 방법.
  10. 식물성 세포 또는 식물의 성장 및 증식에 적합한 배양 배지중에서 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 의하여 형질전환된 식물성 세포 또는 식물을 배양액에 넣는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 프레닐퀴논의 생성 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 프레닐퀴논은 토코트리에놀인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, 프레닐퀴논은 비타민 E로 나타나는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 효소 GGR을 과발현시킬 수 있는 식물에서의 기능성 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제8항 또는 제9항에 있어서, 효소 GGR을 과발현시키는 식물에서 기능성 유전자를 동시에 또는 연속적으로 사용하여 식물을 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 프레닐퀴논을 생성하기 위한 제1항에 의한 식물 또는 제2항에 의한 식물성 세포의 용도.
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