CN113862205B

CN113862205B - 产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌

Info

Publication number: CN113862205B
Application number: CN202110524461.9A
Authority: CN
Inventors: 费强; 向静; 郭树奇; 傅容湛
Original assignee: Xian Jiaotong University
Current assignee: Xian Jiaotong University
Priority date: 2021-05-13
Filing date: 2021-05-13
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2041-05-13
Also published as: CN113862205A

Abstract

本发明公开了产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌。将内源zwf2基因整合至嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z基因组中DoeA基因位点，在阻断四氢嘧啶水解的同时强化了四氢嘧啶的合成辅因子NADPH的供给；通过pAWP89质粒过表达氢气脱氢酶，加强甲烷、甲醇等的利用，由此获得可以以一碳化合物为底物合成羟基四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌，具有生产原料来源广、生产成本低、生产效率高的优点。

Description

产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及基因工程菌的构建及利用一碳化合物进行羟基四氢嘧啶生物合成的应用。

背景技术

羟基四氢嘧啶(5-hydroxy-1,4,5,6-tetrahydropyrimidine-2-methyl-4-carboxylic acid，Hydroxyzwfoine)是一种相容性溶质，对全细胞和生物大分子具有优异的保护作用。羟基四氢嘧啶的生物合成主要通过盐单胞菌发酵实现，然而盐单胞菌在发酵中以葡萄糖为底物，生产成本较高，且需要将培养温度从30℃提高到42℃，即进行变温发酵，不仅使发酵控制工艺变得复杂，而且不利于实现高密度发酵。

嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z中含有用于合成羟基四氢嘧啶的基因簇，该基因簇包含组成ectABC-ask操纵子的基因(Genome Sequence of theHaloalkaliphilic Methanotrophic Bacterium Methylomicrobium alcaliphilum20Z.Journal of Bacteriology,2012,194(2):551-552.)以及EctD基因。目前研究表明，由EctD基因编码的四氢嘧啶羟化酶可用于将四氢嘧啶转化为羟基四氢嘧啶(Halomonassocia NY-011T中四氢嘧啶合成基因簇ectABC和ectD的克隆及其功能鉴定.应用与环境生物学报,2017,023(001):140-145.)。然而，酶催化试验表明采用常规培养基(Halotolerance mechanisms of the methanotroph Methylomicrobiumalcaliphilum.Biotechnology and Bioengineering,2020,117:3459–3474.)培养嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z时，最终培养物中只检测出四氢嘧啶，未检测出羟基四氢嘧啶，即嗜甲烷菌体内的四氢嘧啶并未转化为羟基四氢嘧啶。嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z合成的四氢嘧啶在其体内存在更具竞争优势的下游代谢通路，例如，四氢嘧啶可以通过四氢嘧啶水解酶(DoeA)水解成Nα-乙酰基-L-2,4-二氨基丁酸，然后在Nα-乙酰基-L-2,4-二氨基丁酸脱乙酰酶(DoeB)的作用下转化成L-2，4-二氨基丁酸，再通过二氨基丁酸转氨酶(DoeD)反应生成天冬氨酸半醛，最后天冬氨酸半醛被天冬氨酸半醛脱氢酶(DoeC)氧化成天冬氨酸。迄今为止尚未见到由天然嗜甲烷菌合成羟基四氢嘧啶的报道。

嗜甲烷菌利用甲烷的第一步是通过颗粒甲烷单加氧酶(particulate methanemonooxygenase，pMMO)将甲烷同化为甲醇。pMMO反应过程中需要氢离子。嗜甲烷菌中含有编码氢气脱氢酶的基因，可以将氢气转化为氢离子，可用于促进pMMO的酶活力，从而提高嗜甲烷菌的甲烷利用效率。有研究报道了在采用NMS培养基，并以一碳化合物(例如，甲烷、甲醇)为唯一碳源的条件下，通过优化一碳化合物/氧气比可以提高嗜甲烷菌Methylomicrobiumalcaliphilum 20Z的生物燃料分子合成量(Enhanced biological fixation of methanefor microbial lipid production by recombinant Methylomicrobiumburyatense.Biotechnology for Biofuels,2018,11(1):129.)。

嗜甲烷菌基因组中的zwf2基因是葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因，目前研究表明，通过对不同种类发酵菌株基因组中的zwf2基因进行表达调控，可以改变NADPH的供给，而NADPH是嗜甲烷菌合成四氢嘧啶的上游代谢通路中的辅因子。但对于嗜甲烷菌而言，通过基于基因工程的代谢途径改造和/或培养条件优化实现对于羟基四氢嘧啶的生物合成仍属于嗜甲烷菌应用中的技术难题。

发明内容

本发明的目的在于提供高效、低成本产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种用于生产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷菌基因工程菌株，该基因工程菌株命名为mah01，是通过将克隆的zwf2基因整合至嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z基因组中的DoeA基因敲除位点而获得的。

优选的，所述mah01具体是通过将构建的内源zwf2基因供体片段导入嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z，并基于该供体片段与嗜甲烷菌Methylomicrobiumalcaliphilum 20Z基因组的同源重组，将嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z的DoeA基因替换(指包括启动子区、编码区、终止序列在内的完整基因序列替换)为zwf2基因而获得的。

优选的，所述供体片段包括如SEQ.ID.NO.1所示的zwf2基因序列。

优选的，所述供体片段还包括分别位于zwf2基因序列两侧的DoeA基因上游同源臂及DoeA基因下游同源臂。

优选的，所述供体片段具体包括依次串联的DoeA基因上游同源臂(例如，DoeA基因启动子区外侧的一段800～1000bp的基因组序列)、zwf2基因表达盒、抗性基因表达盒(例如，表达博来霉素抗性基因)和DoeA基因下游同源臂(例如，DoeA基因终止序列外侧的一段800～1000bp的基因组序列)。

另一种用于生产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷菌基因工程菌株，该基因工程菌株命名为mah02，是通过将用于过表达氢气脱氢酶的重组质粒导入供体菌后与上述mah01混合培养而获得的。

优选的，所述重组质粒包括如SEQ.ID.NO.2所示的内源hoxH基因序列、如SEQ.ID.NO.3所示的内源hoxY基因序列、如SEQ.ID.NO.4所示的内源hoxU基因序列、如SEQ.ID.NO.5所示的内源hoxF基因序列中的一种或多种。

优选的，所述重组质粒采用的骨架载体为pAWP89质粒，利用重组质粒过表达内源氢气脱氢酶([EC:1.12.1.2])hoxH(MEALZ_1304)、hoxY(MEALZ_1305)、hoxU(MEALZ_1306)、hoxF(MEALZ_1307)中的一种或多种。

一种利用嗜甲烷菌生产羟基四氢嘧啶的方法，包括以下步骤：

1)将上述mah01、mah02或嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z经活化、种子培养后以5～25％的接种量接种至氯化钠(NaCl)浓度为10～80g/L(例如，60g/L、30g/L)的NMS液体培养基中，接种后于25～35℃、200～400rpm的条件下培养48～84h，培养过程中向培养体系内补充一碳化合物(例如，甲烷、甲醇中的一种或两种；甲烷的初始添加量控制为培养体系气相体积的4％～30％，甲醇的初始添加量控制为培养体系液相体积的0.1％～1.2％)作为碳源；

2)培养结束后收集菌体。

优选的，所述步骤1)中，培养体系采用可封闭的气液两相体系，培养过程开始前按照培养体系内位于上方的气相空间(气相空间所含成分通常为空气，其下方为液相空间，液相空间所含成分通常为培养液)的体积的10％～30％向封闭的气液两相体系内添加碳源(添加的碳源的体积记为V1，注入气相空间即可)，其中气相空间与液相空间的体积比为9:1～7:3(例如，4:1左右)，然后开始培养，培养过程中按照一定的时间间隔(例如，6～24h)对培养体系进行换气(即利用环境新鲜空气自然置换气相空间成分)，在换气过程后封闭气液两相体系，并再次向封闭的气液两相体系内添加V1体积的碳源，然后继续培养，直至培养过程结束。

优选的，所述活化具体包括以下步骤：将保存的mah01、mah02或嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z接种在氯化钠浓度为7.5～30g/L的NMS平板中，然后于25～35℃静置培养3～5天。

优选的，所述种子培养具体包括以下步骤：将活化的mah01、mah02或嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z转接至氯化钠浓度为7.5～30g/L的NMS液体培养基中，然后于25～35℃、200～400rpm的条件下培养至OD600为2～5。

优选的，所述步骤2)还包括以下步骤：将菌体经超声破碎后冷冻离心，收集冷冻离心所得上清液进行过滤除菌。

优选的，所述NMS液体培养基还包括以下组分：0.2～1g/L MgSO₄·7H₂O、0.01～0.02g/L CaCl₂·6H₂O、0.5～2g/L KNO₃，以及40～60mL碳酸盐溶液、15～30mL磷酸盐溶液和1～2mL微量元素溶液。所述NMS液体培养基是为了实现嗜甲烷菌Methylomicrobiumalcaliphilum20Z、mah01、mah02对羟基四氢嘧啶的生物合成并提高产量而优化得到的。

本发明的有益效果体现在：

本发明将嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z作为出发菌株，将葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的编码基因(例如，嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z的zwf2基因)整合至嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z基因组中的DoeA基因位点，在阻断四氢嘧啶水解的同时强化了四氢嘧啶的合成辅因子NADPH的供给，由此获得的嗜甲烷菌基因工程菌株(命名为mah01)可以以低价值的一碳化合物(例如，甲烷、甲醇)为底物合成高附加值的羟基四氢嘧啶，具有生产原料来源广、生产成本低、羟基四氢嘧啶产量高的优点。

本发明在基因工程菌株mah01基础上，利用转化的重组质粒在mah01中过表达氢气脱氢酶，不仅加强了所得基因工程菌株mah02对一碳化合物(例如，甲烷、甲醇)的利用，而且提高了羟基四氢嘧啶的产量，具有生产效率高的优点。

本发明采用一碳化合物(例如，甲烷、甲醇)为唯一碳源，通过优化培养条件，以及过表达碳利用途径相关的基因(例如，嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z的zwf2基因以及表达内源氢气脱氢酶hoxH、hoxY等的基因)的策略，从而在简单、稳定的发酵培养条件下(例如，30℃、200rpm)实现了羟基四氢嘧啶的高效、低成本生物合成。

附图说明

图1为羟基四氢嘧啶标准品液相色谱图。

图2为嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z在NMS液体培养基中合成产物的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。所述实施例是用于使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制。

本发明依据前期在研究zwf2基因表达调控对嗜甲烷菌Methylomicrobiumalcaliphilum20Z的产四氢嘧啶发酵性能影响中的实验发现(即在一定培养条件下，菌体同时合成了四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶)，通过采用在嗜甲烷菌Methylomicrobiumalcaliphilum 20Z中过表达编码氢气脱氢酶、辅因子生成的基因等基因改造方法，并通过优化培养条件，不仅激活了内源四氢嘧啶羟化酶的催化活性，而且提高了羟基四氢嘧啶的产量。在对嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z进行基因改造时，具体的基因操作包括在过表达内源zwf2基因的同时实现DoeA基因的敲除，以及进一步利用pAWP89质粒过表达内源氢气脱氢酶[EC:1.12.1.2]，并由此获得两株基因工程菌株(分别命名为mah01以及mah02)。

实施例1

(1)活化嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z：将保存的嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z接种(划线)到含有0.75％NaCl的NMS平板，在该NMS平板上30℃静置培养活化嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z约4天，即得到活化后的嗜甲烷菌NMS alcaliphilum 20Z菌落；

上述步骤(1)中，含有0.75％NaCl的NMS平板是在1L NMS液体培养基中加入15g琼脂形成的；

其中，1L NMS液体培养基含有以下组分：1g MgSO₄·7H₂O、0.02g CaCl₂·6H₂O、1gKNO₃、7.5g NaCl、20mL磷酸盐溶液、50mL碳酸盐溶液和2mL微量元素溶液；用去离子水定容至1L；

上述磷酸盐溶液的配方为：每1L磷酸盐溶液含有5.44g KH₂PO₄和10.73g Na₂HPO₄；用去离子水定容至1L，用浓硫酸调整pH至6.8；

上述碳酸盐溶液的配方为：每1L碳酸盐溶液含有58.8g NaHCO₃和31.8g Na₂CO₃；用去离子水定容至1L；

上述微量元素溶液的配方为：每1L微量元素溶液含有1.0g EDTA二钠、2.0gFeSO₄·7H₂O、0.8g ZnSO₄·7H₂O、0.3g MnCl₂·4H₂O、0.03g H₃BO₃、0.2g CoCl₂·6H₂O、0.6gCuCl₂·2H₂O、0.02g NiCl₂·6H₂O和0.05g MoO·2H₂O；用去离子水定容至1L。

(2)将上述活化后的嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z菌落转移至已灭菌的含有0.75％NaCl的NMS液体培养基(配方参见上述1L NMS液体培养基)中，摇瓶培养(30℃、200rpm)，得到600nm吸光度下OD约为4的种子液。

(3)利用嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z合成羟基四氢嘧啶：将步骤(2)中培养获得的嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z种子液按10％(V/V)接种量接种至新的已灭菌的500mL摇瓶中培养，摇瓶中含有100mL新鲜无菌的NMS液体培养基，该NMS液体培养基中含有3％NaCl(即配方中NaCl浓度提高至30g/L，其他组分及浓度与上述1L NMS液体培养基相同)，在30℃、200rpm的培养条件下进行羟基四氢嘧啶的生物合成。在培养开始时刻以及培养过程每进行12h时，注入80mL(400mL×20％)甲烷与摇瓶内培养液(含有菌体和液体培养基)上方经封闭瓶口而保留的空气混合，以便保证培养过程中碳源、能源的供给。

(4)测定嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z中羟基四氢嘧啶含量。

所述步骤(3)培养后的菌株中羟基四氢嘧啶含量的具体测量步骤如下：

①每12小时取2mL培养液样品，4℃、8000rpm冷冻离心10min收集菌体；

②收集的菌体用1mL超纯水重悬后超声破碎6min，每超声3秒间隙9秒；

③超声破碎后的样品4℃、8000rpm冷冻离心10min，收集上清液，经0.22μm微孔过滤器过滤，保存于样品瓶中并置于4℃冰箱待测。

④测定羟基四氢嘧啶含量。上述样品瓶中的样品使用微量进样针进样2μL，使用岛津高效液相色谱仪LC-2030，色谱柱采用岛津InertSustain C18液相柱(4.6mm×250mm)，柱温25℃，流动相为5％甲醇与95％40mM磷酸二氢钠溶液(磷酸二氢钠溶液中添加10mM1-庚烷磺酸钠)等度洗脱，流速1mL/min，紫外检测波长210nm，保留时间10min。经高效液相色谱检测(图1及图2)，在培养至48h时培养液中的羟基四氢嘧啶产量最高可达到8.75mg/L。

实施例2

(1)活化嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z，参照实施例1。

(2)培养嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z种子液，参照实施例1。

(3)利用嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z合成羟基四氢嘧啶：将步骤(2)中培养获得的嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z种子液按10％(V/V)接种量接种至新的已灭菌的500mL摇瓶中培养，摇瓶中含有100mL新鲜无菌的NMS液体培养基，该NMS液体培养基中含有6％NaCl(即配方中NaCl浓度提高至60g/L，其他组分及浓度与上述1L NMS液体培养基相同)，在30℃、200rpm的培养条件下进行羟基四氢嘧啶的生物合成。在培养开始时刻以及培养过程每进行12h时，注入80mL(400mL×20％)甲烷与摇瓶内培养液(含有菌体和液体培养基)上方经封闭瓶口而保留的空气混合，以便保证培养过程中碳源、能源的供给。

(4)测定嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z中羟基四氢嘧啶含量，参照实施例1。经高效液相色谱检测，在培养至72h时培养液中的羟基四氢嘧啶产量最高可达到24.34mg/L。

实施例1和实施例2表明，采用一碳化合物(例如，甲烷)为碳源对嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z进行发酵培养时，可以通过优化培养条件，激活由EctD基因编码的四氢嘧啶羟化酶的催化活性，使得嗜甲烷菌Methylomicrobiumalcaliphilum 20Z体内合成的四氢嘧啶转化为羟基四氢嘧啶，但羟基四氢嘧啶产量相对较低，不利于满足工业生产需要。

实施例3

(1)过表达zwf2基因(并敲除DoeA基因)菌株的构建

①电转复合体片段(含有zwf2基因序列的DoeA基因敲除复合体片段，即作为zwf2基因敲入的供体片段)的构建

根据GenBank中嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z的基因组序列(GenBank登陆号:DQ016501)，设计引物LF-F和LF-R、zwf-F和zwf-R、Bleor-F和Bleor-R、RF-F和RF-R；引物序列见表1。

表1.构建电转复合体片段所用引物

采用天根基因组提取试剂盒，提取嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum20Z的基因组DNA。其中，嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z为接受赠与而获得(2017年7月)，20Z的原始来源参见文献报道(Isolation and Characterization ofHalotolerant Alkaliphilic Methanotrophic Bacteria from Tuva SodaLakes.Current Microbiology,1997,35(5):257-261.)

以嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z基因组DNA为模板，使用2×Phanta Max Master Mix高保真DNA聚合酶PCR分别扩增出大小在1000bp左右的DoeA基因上、下游同源臂片段和zwf2基因序列。琼脂糖凝胶电泳切胶纯化回收后于-20℃冰箱保存备用。以5GPZ基因组DNA为模板(还可以采用商品化质粒作为模板)扩增出447bp左右的博来霉素抗性基因序列，纯化回收后于-20℃冰箱保存备用。将DoeA基因上、下游同源臂片段、zwf2基因序列和博来霉素抗性基因序列以摩尔比1:1:1:1混合后作为模板进行重叠PCR，重叠PCR以LF-F和RF-R为引物；最后获得两端为同源臂、中间为zwf2基因和博来霉素抗性基因的线性片段(大小约为3914bp)。重叠PCR所得线性片段经琼脂糖凝胶电泳验证，电泳条带与设计大小一致，证明电转复合体片段构建成功。

②将电转复合体片段导入到嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z，使zwf2基因序列通过连接到DoeA基因敲除复合体片段上而整合到嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z基因组中，以内源zwf2基因替换DoeA基因

将经验证大小正确的电转复合体片段经琼脂糖凝胶电泳纯化回收，然后将回收片段通过电转化(1.3～2.0kv、200Ω、25μF、4.5～5ms)导入嗜甲烷菌Methylomicrobiumalcaliphilum20Z电转感受态细胞中，30℃、200rpm复苏20h(在含有0.75％NaCl的NMS液体培养基中摇瓶培养，且该培养基中添加有终浓度为0.1％的甲醇作为碳源)后将全部菌体涂布在含有博来霉素的NMS平板(即在含有0.75％NaCl的NMS平板中额外添加博来霉素)上，30℃倒置培养4天。挑选该NMS平板上的单菌落进行菌落PCR验证(up-F:GCCTTATGATTGAACGCGACGAC；down-R:tcagtcctgctcctcggcca)，通过所得条带大小(1937bp)可以判断电转复合体片段成功整合到嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum20Z基因组上。将筛选的阳性克隆在含有0.75％NaCl的NMS固体培养基(即NMS平板，且添加有终浓度为1％的甲醇及30μg/mL的博来霉素)中静置(30℃恒温箱)培养2～4天完成扩大培养，然后转到摇瓶(采用含有0.75％NaCl的NMS液体培养基，并额外添加博来霉素)中在30℃、200rpm条件下培养后保存菌种(在对数生长期时保存)，命名为嗜甲烷菌mah01。

上述嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z电转感受态细胞的制备：取一环活化后的嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z，转接到摇瓶(采用含有0.75％NaCl的NMS液体培养基)中，在30℃、200rpm条件下过夜培养至OD600值1～2，收集所有培养液，4℃、5000rpm离心10min。弃上清，用水洗两次后，加无菌水重悬至OD600值达到20～40，置于冰上备用。

(2)活化嗜甲烷菌mah01，参照实施例1。

(3)培养嗜甲烷菌mah01种子液，参照实施例1。

(4)利用嗜甲烷菌mah01合成羟基四氢嘧啶：将步骤(3)中培养获得的嗜甲烷菌mah01种子液按10％(V/V)接种量接种至新的已灭菌的500mL摇瓶中培养，摇瓶中含有100mL新鲜无菌的NMS液体培养基，该NMS液体培养基中含有6％NaCl(即配方中NaCl浓度提高至60g/L，其他组分及浓度与上述1L NMS液体培养基相同)，在30℃、200rpm的培养条件下进行羟基四氢嘧啶的生物合成。在培养开始时刻以及培养过程每进行12h时，注入80mL(400mL×20％)甲烷与摇瓶内培养液(含有菌体和液体培养基)上方经封闭瓶口而保留的空气混合，以便保证培养过程中碳源、能源的供给。

(5)测定嗜甲烷菌mah01中羟基四氢嘧啶含量，参照实施例1。经高效液相色谱检测，在培养至84h时培养液中的羟基四氢嘧啶产量最高可达到33.93mg/L。

实施例4

(1)过表达zwf2基因和氢转氢酶(并敲除DoeA基因)菌株的构建

a.构建重组质粒pAWP89-hoxH-hoxY

根据GenBank中嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z的hoxH和hoxY的编码基因序列，设计引物hox-F和hox-R来扩增hoxH与hoxY的串联基因序列(hoxH-hoxY片段)；设计引物P89-F和P89-R来扩增pAWP89质粒片段，引物hox-F和P89-R、hox-F和P89-F的5′端分别有一段20bp的反向互补区域，引物序列见表2。

表2.构建重组质粒pAWP89-hoxH-hoxY所用引物

以嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z基因组DNA为模板，使用2×Phanta Max Master Mix高保真DNA聚合酶PCR得到目的基因hoxH-hoxY片段(大小为2223bp)，纯化回收后保存于-20℃冰箱。以pAWP89质粒(实验室保存，可在addgene商业化购买)为模板，使用2×Phanta Max Master Mix高保真DNA聚合酶PCR得到载体片段(约5000bp)，纯化回收后使用限制性内切酶DPNI于37℃恒温酶切2h，80℃加热20分钟使DPNI酶失活，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收酶切后的载体片段，按照hoxH-hoxY片段与酶切后的载体片段摩尔比2:1的比例混合，使用C115连接酶50℃连接15分钟；将连接后所得重组质粒通过热转化方法转化到DH5a感受态细胞(于擎科生物公司购买)中。37℃、200rpm复苏40分钟(LB液体培养基)后将菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养12h后挑单菌落进行菌落PCR验证(Tac-F:gttatcccctgattctgtgg；aph-R:ggttgtaacactggcagagc)。将验证正确(根据所得条带大小为2456bp)的阳性克隆转接摇瓶(采用LB液体培养基，并额外添加30μg/mL卡那霉素)，37℃、200rpm条件下培养12h后保存并提取质粒进行测序验证。

上述热转化的具体步骤：将感受态细胞置于冰上解冻，取5～10μL重组质粒加入到100μL DH5α感受态细胞中，轻弹管壁混匀，冰上静置30min(重组质粒转化体积最多不应超过所用感受态细胞体积的十分之一)。42℃水浴热激45s后立即置于冰上冷却2～3min。热转化后加入900μL的LB液体培养基(不添加抗生素)，37℃、转速200～250rpm下摇菌1h。将所得原始菌液5000rpm离心5min，弃掉900μL上清液。剩余菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板上。

b.在mah01中过表达hoxH和hoxY基因

将mah01、带有重组质粒pAWP89-hoxH-hoxY的DH5α供体菌、辅助菌PRK600(实验室保藏，可从BioVector保藏中心购买)分别于含相应抗生素的培养基(mah01涂布于含有博来霉素的NMS平板、供体菌涂布于含有卡那霉素的LB平板、辅助菌PRK600涂布于含有氯霉素的LB平板)上培养，各取一环在平板(15％LB+85％NMS培养基；其中，NMS培养基中不加氯化钠，添加磷酸盐溶液50mL和碳酸盐溶液5mL，其他与上述1L NMS液体培养基相同)上混合培养两天，转移到含有卡那霉素和博来霉素的NMS平板(即在含有0.75％NaCl的NMS平板中额外添加博来霉素和卡那霉素)上培养，筛选出阳性克隆。将验证正确的阳性克隆转接到摇瓶(采用含有0.75％NaCl的NMS液体培养基，并额外添加博来霉素和卡那霉素)中，30℃、200rpm培养后保存菌种并再次PCR验证。将得到的嗜甲烷菌重组菌株命名为mah02。

(2)活化嗜甲烷菌重组菌株mah02，参照实施例1。

(3)培养嗜甲烷菌重组菌株mah02种子液，参照实施例1。

(4)利用嗜甲烷菌重组菌株mah02合成羟基四氢嘧啶：将步骤(3)中培养获得的嗜甲烷菌重组菌株mah02种子液按10％(V/V)接种量接种至新的已灭菌的500mL摇瓶中培养，摇瓶中含有100mL新鲜无菌的NMS培养基，该NMS培养基中含有6％NaCl(即配方中NaCl浓度提高至60g/L，其他组分及浓度与上述1L NMS液体培养基相同)，在30℃、200rpm的培养条件下进行羟基四氢嘧啶的生物合成。在培养开始时刻以及培养过程每进行12h时，注入80mL(400mL×20％)甲烷与摇瓶内培养液(含有菌体和液体培养基)上方经封闭瓶口而保留的空气混合，以便保证培养过程中碳源、能源的供给。

(5)测定嗜甲烷菌重组菌株mah02中羟基四氢嘧啶含量，参照实施例1。经高效液相色谱检测，在培养至84h时培养液中的羟基四氢嘧啶产量最高可达到49.90mg/L。

实施例3和实施例4表明，在优化的培养条件下，通过对嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z进行基因改造，可以明显提高羟基四氢嘧啶的产量，结合表3可以看出，即便采用mah01，其羟基四氢嘧啶产量也超过了现有报道中通过其他菌株生物合成羟基四氢嘧啶的最大产量，因而，更适合工业生产需要。

表3.羟基四氢嘧啶产量

总之，本发明利用一碳化合物(例如，甲烷、甲醇)为碳源，实现了嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z或其基因工程菌(两株基因工程菌分别命名为mah01、mah02)，在30℃、200rpm的培养条件下生成羟基四氢嘧啶；与其他利用生物合成生产羟基四氢嘧啶的方法相比，具有以下优势：

1)利用一碳化合物(例如，甲烷、甲醇)为碳源，原料成本低廉；

2)培养温度为30℃，与传统的培养温度42℃相比更节约能源，且避免了因为升高温度而对菌株生长的抑制，导致四氢嘧啶合成量下降，从而影响羟基四氢嘧啶的产量；

3)工艺操作简单，具有高效底物选择性，可以将菌体内合成的四氢嘧啶转化为羟基四氢嘧啶，且没有其他副产物生成。

<110> 西安交通大学

<120> 产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷工程菌

<160> 21

<210> 1

<211> 1470

<212> DNA

<213> M. alcaliphilum 20Z zwf2基因

<400> 1

atgaaatcaa atcaaaaatt caaaccttgc gacctggtca tatatggcgc gttaggcgat 60

ttatcgacac gcaaattatt aatttcgtta tatcggctcg aaaaatccga attgatcgag 120

cccgagactc gtatcatcgg tattgaccgg catgctctcg aagagggcgg cttcgttaaa 180

gttgctagga aaagtttaca gtcttatctt aatgagacga tcgaggatga agtctggcag 240

cgttactcgg ctcgaatgca atatctcatg atcgacctaa ctcagctcga tcaatataaa 300

caattgaatg cggtcatcga ttccaaatcc agagtgctgg tcaattattt agctgtcgcg 360

ccgtttttgt tcaaaaatat ttgccagggt ctcgataaag caaaaatttt gactcgagaa 420

tcgcgagtgg tgatggaaaa accgatcggc aacgatctga aatccaatcg ggaaatcaac 480

gatgccgttg ctgaagtgtt taacgaggat caggtattcc gtatcgatca ttatttaggc 540

aaggaaacgg ttctgaatct gttggcctta cgatttgcca attcgatttt tacgaccaat 600

tggaatcaca atactatcga ccacattcaa attaccgttg gcgaggaagt cggaatcgag 660

ggccgttggg agtatttcga taaaaccggg caactacggg atatgctgca aaatcattta 720

ttgcagatcc tgacctttat cacaatggaa ccgcccgcgt cgctggaagc cgaaagcatt 780

catagcgaaa aaatcaaggt gttgaaagcc ttgcgtccga ttaccgccga caatgtcgaa 840

gaagtcaccg tgcgcgggca atacaccgcc ggttatatga aaggacaagc cgtgccgggc 900

tataccgagg aggaaggtgc cgataaggag agtaccaccg aaagtttcgt cgcggtgcgt 960

gtcgatatcg ataattggcg ctgggccgga gtgccgatat atctgcgtac cggcaagcgc 1020

atgcaaaata agcgcaccga aatcgtcgtt tatttcaagc gtttgccaca caatatcttc 1080

aaggacagtt accgcgaatt gccgccgaat aaattgatca ttcatttgca accgaaagaa 1140

ggcgtggaaa tcgaaatgct caataaggta cccggaatcg gcggtagtat cacgttacag 1200

cagaataaac tggatttgag cttttctgaa acgttcaaaa acagcccgtt tttcggcggt 1260

tacgagcggc tgattttgga agcaatgcgg ggcgacccga ccttgttcct gagtcggcag 1320

gaaatcgaac aggcttgggc atgggtcgat tcaatacaag atgcttgggc gcgtagaaaa 1380

attgcgccaa aaccctattc cgcaggaagc tgggggccgg tcgcgtcggt ggcattgttg 1440

gcgcgtgacg gacgggcttg ggaagagtaa 1470

<210> 2

<211> 1494

<212> DNA

<213> M. alcaliphilum 20Z hoxH基因

<400> 2

atgtacgaac atttagaaac agccgccagc ccggaaaacc ttaaacgtgt cgtggtcgat 60

ccggtatcgc gggtcgaagg ccatggcaaa gtcacattat tgctcgatga aaacaataag 120

gtccaacagg cccgcttgca tatcgtcgag tttcgaggtt tcgaacgctt cattcaaggt 180

cgtccttatt gggagctacc tgttttagtg cagcgcctat gcggcatctg cccggtcagt 240

catcatttag ccgccgccaa ggcaatcgat cagctcgtcg gcatcgaccc ggaaaatctg 300

cctccagccg caaccaaatt aagacgcttg ctgcatttcg gccaagttat gcagtcccac 360

gccttacatt ttttccattt gtcgagcccg gatttattgt tcggcttcga aagcgagatc 420

ggcaaacgca gcatcatcgc ggtattggcc gagcaccctg aaatcggcgt acagggtgtc 480

aagcttcgca aatacggaca agaagtaatc cgcatgattt ccggcaagcg cattcacggc 540

accggagcaa tcgccggcgg catgaacaaa ccgttatccc gtgaagagcg cgattatttg 600

ttgaccgata tcgatcaaat gatcgaatgg gcggcagcaa cggtacaact ggtcaaaaga 660

gtccattgtt cgaatctgcc ttattacgac gatttcgcga cgatacgcag taattatctg 720

ggcctcaccc gtccggacgg tgcgctggag ctttatcacg gaggtctgcg cgcgaaaaga 780

gacaacggca aaaccatcct cgaccatgtc gattattgtc gctacaacga ttatattcat 840

gaagaagtcc gttcctggac ctacatgaag tttccttatt tgttgtcgga aggtaaggaa 900

aacggctggt accgcgtcgg cccactggcc cgcgtcaata actgcgacta tatcgacacc 960

ccgttggccg aggcggctcg catcgaattt aaacaacacg gcggtgaagc aatggttcat 1020

agcacgctgg caacccattg ggcgcgcatg atagaaacgc tacactgcgc cgaaagcatc 1080

aaagtcttac tgaacgaccc ggaaatcatg agtaacgacc tcgtcgcgca aggtgaaaag 1140

cgattcgaag gcatcggcgt gatcgaagcc cctcgcggca cactgtttca tcattatcaa 1200

gtcgatgaaa acgacattgt cacccgcgcc aatttgatcg tttcaacaac cagcaataac 1260

atggggatga acgaatcggt ccgtcaggtc gctgctgaat atttaaacgg tcgcgaattg 1320

accgaaccgc tattaaataa tctagaagtc gcgatccgcg cctacgaccc ttgtttatct 1380

tgcgcaaccc acgcggtcgg aaaaatgcct ttgcaattgg agttaatcga cgcggacggg 1440

caactcatcg ataaattagt taaacatagc gatggtgtta ttactccctt ttaa 1494

<210> 3

<211> 549

<212> DNA

<213> M. alcaliphilum 20Z hoxY基因

<400> 3

atgagagcca tgactaataa aatcagagtc gcaaccacat cgctagccgg ctgttttggt 60

tgccacatgt cgtttctcga catcgacgaa cgcatgctgc aactcgccga ggcggtcgaa 120

ttcgaccgtt cgccgattac cgacatcgaa cattgcacga attgcgacat cggcttaatc 180

gaaggaggcg tctgcaattc ggaaaacgtt catgtgctgc gcgaatttcg taaaaactgc 240

aaaacactgg tcgcggtcgg cgcctgcgcc atcaacggtg gcttgccggc gatgcgcaac 300

tttataccac tcgaagaatg ccttagcgaa gcgtacttag acggtattgg cgtcgaaaac 360

ccgcagattc caagcgaccc ggagctacct ttattgctgg acaaggttcg cccgattcat 420

gaaatcgtca agatcgacta tttcctaccg ggctgcccgc cgtcggccga tgttttttgg 480

aaatttttga ccgacctgct cgaaggccgc gaaccgtcac tgccttacga gttggtgcat 540

tatgattga 549

<210> 4

<211> 717

<212> DNA

<213> M. alcaliphilum 20Z hoxU基因

<400> 4

atgagcaaaa catttacctt ggacggcaag cccattccat tcgaagatgg acaaaccatc 60

atggatgccg ctactgcggc cggcgtttac attccgcatc tttgtcatca tccggaattc 120

acgccgcacg gcagctgtaa gttatgcaac gttaatgtca atggccgcac ttgttcggct 180

tgcacattcc cggcaactga gggccaagat gtattgagcg aaacgaccga aatcaatcag 240

gaccgccaaa aaatcacgca aatgcttttc gtcgaaggca atcatttttg cccgtcctgc 300

gaaaaatccg ggaactgcca attacaaggg gtcgcatacc atttgaatat gctcgacaat 360

cattttccgc atttttacgc ggaacgtaaa atggatgcga gccactcgga cgtcatgatc 420

gaccataatc gctgcatttt ttgcacctta tgcgttaggg ccagccaaca agccgacggt 480

aaagacgttt ttgcgatttc aggccgcggt attaacaagc acttgatcgt taattccgag 540

tccgggcagt taaaagacag cgatatcgat cccagcgacc gagccgcgca catctgtccg 600

accggagcga ttctgatcaa acgaaccggc tatacgatcc cgatcggaca acgtatttac 660

gatcataaac aaatcgatca agtcagcttg gaaacggagc atgagagcca tgactaa 717

<210> 5

<211> 1779

<212> DNA

<213> M. alcaliphilum 20Z hoxF基因

<400> 5

atggaatcgt tcattcaaaa tctcgttgaa acccacgcaa ggcgcccaac tcggctttta 60

gcaatattac gtgccgttca ggcgcgatac ttccacattc cgaaccaagc cattcgattg 120

ttatccaagg aattaaacat tccaacaaca cgcattatcg gcgttatcga attttatagc 180

tttcttcatt taacgcctcg cggacgttac gatatattga tcagcgattc gattaccgat 240

cacatgctcg gcaaacacaa cttgatggac tatctatcta acaaactttc cgtgtcaccc 300

ggcagcgttc gtgaagacgg cttggttagc ctagataata cttcatgcac cggcatgtgc 360

gatcaaggcc ctgccgggct catcaatggc cacgcgatca ctcgacttga ccggcctaga 420

atcgacgcga tcgcacaatt aatcgacgaa caaatggcag ttgaggattg gcccaaggaa 480

ttctttgagg tcggcgataa catctatcaa tccgatttat tattgagcag tcgccttacc 540

gccggagaag gtctacaatc gactttcgca cgcggcctaa aagaaacact atcggaaatc 600

gatcaatccg gactcagagg ccgaggcggc gcaggcttta aaacggcgat gaaatggcga 660

ttttgcgccg aagaatcgga acaagaacgc tatgtggtct gcaatgccga tgaaggcgaa 720

cccggaacat tcaaagaccg agtattacta aatagctatg ccgaccatgt tttcgaaggc 780

atgactattt gcgcggcact tatcggcgcc aagcgaggat ttctgtattt acgcggcgaa 840

tatcttcacc tttatcacaa attagaaaac gttctcgaac aacgccgtca gaacggtttg 900

ctcggtaaca atattctcgg caaaggccta gatttcgata tcgaaatttg cctcggtgcc 960

ggtgcttata tttgcggcga ggaatcggca ctcatcgaat cgctcgaagg caaatgcggt 1020

attccgcgaa accgcccgcc ctaccctgtt tcccaaggct atttaaacaa gccgaccgtc 1080

gtcaacaatg ttgaaacttt cgcagccacc gctaacattg ccttacacgg gggcgcttgg 1140

ttcgcagcta aaggcacgga aaaatcccaa gggaccaaaa ttcttagcat tagcggtgat 1200

tgcgcacgtc ccggcattta cgaatatcca tttggcgtta cgatacggaa aattctggag 1260

gattgcgatg cccatgatgt actcggcgtt caaatcggcg ggccttccgg cacctttatt 1320

tccaaccagg aactcgatcg catactagga ttcgaggatt tagccacggg cggctcattc 1380

atcgttttta attcgacacg caacattctc gatatcgtgc gtaatttcac tgacttcttc 1440

gcgcatgaaa gctgcggttt ctgcacgcct tgccgagtcg gtacttcgtt attgaaaaaa 1500

cagctcgaca aaatcgtcga cggccacggt tcggccggcg atgtggttgc acttgaagaa 1560

ctaactcgcc tagtcaaaaa ccatagccat tgcggcttag gccaaacggc ggccaacccg 1620

atcattcata ccttagagag gtatccggac ttataccaaa gccaattgaa aaaaatcagt 1680

tacgagcccg gcttcgattt gaacgcttcc cttgaaactg ccagacgcat ggcaaaccgt 1740

aatgatgcag gggcacatct agcccaggtg gaggaatag 1779

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> LF-F

<400> 6

caaaatgcaa ttcatgggac cg 22

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> LF-R

<400> 7

ttgatttcat aaagaggaga aagtcgtcgc gttcaatcat aagg 44

<210> 8

<211> 53

<212> DNA

<213> zwf-F

<400> 8

acgcgacgac tttctcctct ttatgaaatc aaatcaaaaa ttcaaacctt gcg 53

<210> 9

<211> 49

<212> DNA

<213> zwf-R

<400> 9

cattatacga gccgatgatt aattgtcaat tactcttccc aagcccgtc 49

<210> 10

<211> 53

<212> DNA

<213> Bleor-F

<400> 10

ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaggtat tcacacagga aac 53

<210> 11

<211> 42

<212> DNA

<213> Bleor-R

<400> 11

gccattgagt aaccctcctt gctcagtcct gctcctcggc ca 42

<210> 12

<211> 42

<212> DNA

<213> RF-F

<400> 12

tggccgagga gcaggactga gcaaggaggg ttactcaatg gc 42

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> RF-R

<400> 13

ggcattgatg atgcgcgaca 20

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> hox-F

<400> 14

tattcacaca ggaaacagct atgagagcca tgactaataa aatcaga 47

<210> 15

<211> 46

<212> DNA

<213> hox-R

<400> 15

acgcatcttc ccgacaacta ttaaaaggga gtaataacac catcgc 46

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> P89-F

<400> 16

tagttgtcgg gaagatgcgt g 21

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> P89-R

<400> 17

agctgtttcc tgtgtgaata cctcc 25

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> up-F

<400> 18

gccttatgat tgaacgcgac gac 23

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> down-R

<400> 19

tcagtcctgc tcctcggcca 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Tac-F

<400> 20

gttatcccct gattctgtgg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> aph-R

<400> 21

ggttgtaaca ctggcagagc 20

Claims

1.一种用于生产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷菌基因工程菌株，其特征在于：该基因工程菌株为经过基因改造的嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z，通过所述基因改造阻断嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z体内的四氢嘧啶水解以及强化四氢嘧啶的合成辅因子NADPH的供给；

所述基因工程菌株是通过将克隆的zwf2基因整合至嗜甲烷菌Methylomicrobiumalcaliphilum 20Z基因组中的DoeA基因敲除位点而获得的；

所述zwf2基因的序列如SEQ.ID.NO.1所示。

2.根据权利要求1所述一种用于生产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷菌基因工程菌株，其特征在于：所述基因工程菌株具体是通过将构建的内源zwf2基因供体片段导入嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z，并基于该供体片段与嗜甲烷菌Methylomicrobiumalcaliphilum 20Z基因组的同源重组，将嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z的DoeA基因替换为zwf2基因而获得的。

3.根据权利要求2所述一种用于生产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷菌基因工程菌株，其特征在于：所述供体片段还包括分别位于zwf2基因序列两侧的DoeA基因上游同源臂及DoeA基因下游同源臂。

4.一种用于生产羟基四氢嘧啶的嗜甲烷菌基因工程菌株，其特征在于：该基因工程菌株为经过基因改造的嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z，通过所述基因改造阻断嗜甲烷菌Methylomicrobium alcaliphilum 20Z体内的四氢嘧啶水解、强化四氢嘧啶的合成辅因子NADPH的供给以及过表达氢气脱氢酶；

所述基因工程菌株是通过将克隆的zwf2基因整合至嗜甲烷菌Methylomicrobiumalcaliphilum 20Z基因组中的DoeA基因敲除位点，并与含有用于过表达氢气脱氢酶的重组质粒的供体菌混合培养后而获得的；

所述zwf2基因的序列如SEQ.ID.NO.1所示；

所述重组质粒包括如SEQ.ID.NO.2所示的内源hoxH基因序列、如SEQ.ID.NO.3所示的内源hoxY基因序列、如SEQ.ID.NO.4所示的内源hoxU基因序列、如SEQ.ID.NO.5所示的内源hoxF基因序列中的一种或多种。

5.一种利用嗜甲烷菌生产羟基四氢嘧啶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的嗜甲烷菌基因工程菌株，经活化、种子培养后接种至氯化钠浓度为10～80g/L的NMS液体培养基中，接种后于25～35℃、200～400rpm的条件下培养48～84h，培养过程中向培养体系内补充一碳化合物，所述一碳化合物的添加比例为培养体系气相体积的20％～30％；

2)培养结束后收集菌体。

6.根据权利要求5所述一种利用嗜甲烷菌生产羟基四氢嘧啶的方法，其特征在于：所述NMS液体培养基还包括以下组分：0.2～1g/L MgSO₄·7H₂O、0.01～0.02g/L CaCl₂·6H₂O、0.5～2g/L KNO₃，以及40～60mL碳酸盐溶液、15～30mL磷酸盐溶液和1～2mL微量元素溶液。