CN113801833B

CN113801833B - 一种产d-阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用

Info

Publication number: CN113801833B
Application number: CN202111046434.1A
Authority: CN
Inventors: 范立海; 郭强; 郑辉东; 郑灵洁
Original assignee: Qingyuan Innovation Laboratory; Fuzhou University
Current assignee: Qingyuan Innovation Laboratory; Fuzhou University
Priority date: 2021-09-08
Filing date: 2021-09-08
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2041-09-08
Also published as: CN113801833A

Abstract

本发明提供了一种产D‑阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用。本发明利用dpe基因在大肠杆菌体内过表达，构建D‑果糖至D‑阿洛酮糖的代谢通路；再对大肠杆菌自身的fruA、manXYZ、mak三个基因进行敲除，有效缓解细胞对果糖的磷酸化作用，避免代谢底物的大量浪费；再过表达secY(ΔP)、secE、secG和sCVE四个基因，建立果糖向包内快速转运的新途径，保证代谢底物的供给；然后敲除galE和fruK两个基因，利用Ni²⁺下调FbaA蛋白的功能性，加强对重组菌果糖代谢通量的控制，保证底物向D‑阿洛酮糖的最大转化效率。本发明所得的重组菌单细胞工厂可为D‑阿洛酮糖的工业化生产提供实际有效策略。

Description

一种产D-阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用

技术领域

本发明属于微生物代谢工程领域，具体涉及一种产D-阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用。

背景技术

随着人们生活水平大幅度提高，低热量饮食逐渐成为一种潮流，阿斯巴甜、木糖醇和三氯蔗糖等化学品随之出现。稀有糖中D-阿洛酮糖（D-psicose）也属低热量的代表之一，它是D-果糖的C₃差向异构体，其甜度为蔗糖的70%，但热量仅为等量蔗糖的0.3%。据科学研究证实，D-阿洛酮糖在预防肥胖、调节血糖、降血脂以及抗氧化等方面更具有独特的生理学功能，未来它将在食品、饮料、保健、医药等领域拥有巨大的市场前景。

D-阿洛酮糖的制备方法包括化学合成法和生物合成法。前者普遍存在副产物多、分离步骤复杂、废弃物难处理等问题，导致了极高的生产成本，实现工业化生产困难。而生物合成法所需的反应条件温和，且具有特异性高、绿色环保等优势，对D-阿洛酮糖的生产十分有利。目前生物合成法是利用酶的催化作用，主要是两条路线：（1）以果糖为底物，通过D-阿洛酮糖-3-差向异构酶或D-塔格糖-3-差向异构酶将果糖一步催化为D-阿洛酮糖；（2）以葡萄糖为底物，通过D-木糖异构酶和D-阿洛酮糖-3-差向异构酶或D-塔格糖-3-差向异构酶进行级联催化，将葡萄糖先后催化为D-果糖和D-阿洛酮糖。

虽然酶催化用于D-阿洛酮糖的合成已经实现，但仍存在诸多挑战。酶的固定化方法、热稳定性、级联催化的最佳反应条件等问题优化依旧困难。如能通过细胞工厂生产D-阿洛酮糖，省去酶的制备及固定化程序，将会大大降低生产成本，节省生产时间。然而，微生物体内的代谢途径十分复杂，如何理性设计D-阿洛酮糖合成路径，保证底物的最佳转化效率，是能否实现细胞工厂生产D-阿洛酮糖的关键。

发明内容

本发明的目的在于针对上述问题，提供一种产D-阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用，在实现大肠杆菌发酵生产D-阿洛酮糖的同时，最大限度的降低D-果糖的损耗，保证D-阿洛酮糖的得率维持在较高水平，实现D-阿洛酮糖在细胞工厂中的高效生产。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

一种产D-阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂，所述重组菌单细胞工厂是利用重组载体在大肠杆菌中异源表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶，构建D-阿洛酮糖合成途径，再敲除果糖特异性PTS转移蛋白基因 fruA、甘露糖特异性PTS转移蛋白基因 manXYZ和果糖激酶基因 mak共三个基因，消除果糖在大肠杆菌中的磷酸化问题，然后构建并表达Sec蛋白转位通道三个亚基基因 secY(ΔP)、 secE、 secG和外膜致孔蛋白基因 sCVE共四个基因，搭建果糖向胞内转运的非磷酸化通道，再进一步敲除UDP-半乳糖4-差向异构酶基因 galE和1-磷酸果糖激酶基因 fruK共两个基因，利用NiCl₂抑制FbaA蛋白的活性，阻断大肠杆菌对D-阿洛酮糖代谢路径的同时理性控制碳代谢流量得到的。

上述一种产D-阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂的构建方法，包括以下步骤：

（1）在大肠杆菌JM109(DE3)中构建并表达D-果糖转化为D-阿洛酮糖的基因 dpe，得到菌株 E.coli (DPE);

（2）敲除导致果糖磷酸化的基因，包括 fruA， manXYZ和 mak，得到菌株 E.coli (DPE,ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)；

（3）构建并融合表达大肠杆菌转运果糖的非磷酸化通道的基因，包括 secY(ΔP)、 secE、 secG和 sCVE，得到菌株 E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)；

（4）敲除副产物代谢途径及果糖代谢途径的基因，包括 galE和 fruK，得到菌株 E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak, ΔGalE, ΔFruK)，同时通过Ni²⁺抑制剂，抑制FbaA活性，关闭果糖代谢总开关，实现完整的细胞工厂构建。

上述步骤（1）具体过程如下：使用 dpe-F和 dpe-R一对引物对人工合成的 dpe模板进行PCR扩增反应，利用BamH I和Hind III两个酶切位点将 dpe基因插入pRSFDuet-1，得到pRSFDuet- dpe重组载体，借助电化学转化法将重组载体转染进大肠杆菌JM109(DE3)中进行表达；所述基因 dpe核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物 dpe-F和 dpe-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

上述步骤（2）具体过程如下：依次使用 fruA-F/ fruA-R， manXYZ-F/ manXYZ -R，和 mak-F/ mak-R三对含有同源臂的引物序列以pkD13为模板进行PCR扩增，将得到的片段转染进含有pkD46的大肠杆菌JM109(DE3)中，在30℃的条件下进行同源重组，再利用pcp20质粒完成抗性消除，最后在42℃的条件下完成质粒的丢失，得到 E.coli (DPE, ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)；所述引物 fruA-F和 fruA-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述引物 manXYZ-F和 manXYZ-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；所述引物 mak-F和 mak-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。

上述步骤（3）具体过程如下：使用 secY(ΔP)-F/ secY(ΔP)-R、 secE-F/ secE-R、 secG-F/ secG-R和 sCVE-F/ sCVE-R四对引物以各自基因为模板进行PCR扩增，酶切后分别插入pETDuet-1和pRSFDuet- dpe两个质粒中，得到pETDuet- secY(ΔP)- secE和pRSFDuet- dpe- secG- sCVE，转染后得到菌株 E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)；所述基因 secY(ΔP)和 sCVE核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；所述引物 secY (ΔP)-F和 secY(ΔP)-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13所示；所述引物 secE-F和 secE-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；所述引物 secG-F和 secG-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；所述引物 sCVE-F和 sCVE-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示。

上述步骤（4）具体过程如下：使用 galE-F/ galE-R和 fruK-F/ fruK-R两对引物利用步骤（2）的方法继续完成 galE和 fruK两个基因的敲除，得到重组菌株 E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak, ΔGalE, ΔFruK)；再向培养基中添加8µM的NiCl₂以抑制FbaA活性；所述引物 galE-F和 galE-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；所述引物 fruK-F和 fruK-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示。

上述一种重组菌单细胞工厂在生产D-阿洛酮糖中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用重组菌单细胞工厂直接通过发酵法以D-果糖为底物生产D-阿洛酮糖，相比于现有的酶催化法更加简便，同时无需涉及酶的制备过程，通过碳代谢流量的合理设计，实现了底物向产物转化的最优代谢路线，可为D-阿洛酮糖的工业化生产提供实际有效策略，同时符合人们日渐形成的“绿色”新理念，即“原料绿色、过程绿色、产品绿色”。

附图说明

图1为大肠杆菌利用D-果糖产D-阿洛酮糖的代谢示意图。

图2为 E.coli (DPE)中 dpe基因表达后的SDS-PAGE蛋白质凝胶电泳图。Lane 1：蛋白质标准条带；Lane 2：空白对照，大肠杆菌携带空质粒；Lane 3： E.coli (DPE)。

图3为 E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)发酵结果图。图中包含D-果糖的消耗量，D-阿洛酮糖的生成量以及细胞密度。

图4为 E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak, ΔGalE, ΔFruK)发酵结果图。图中包含D-果糖的消耗量，D-阿洛酮糖的生成量以及细胞密度。

具体实施方式

以下结合实施实例对本发明做进一步说明，需要指出的是，本实施实例仅用于解释本发明，而非对本发明的限制。

本发明中完整的重组菌单细胞工厂的构建流程如图1所示。

实施例1

本实施例中的 dpe基因来自根瘤农杆菌（ATCC 33970），核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

利用质粒pRSFDuet-1过表达 dpe基因，实现D-阿洛酮糖-3-差向异构酶在大肠杆菌JM109(DE3)中高效表达。具体方法为，使用 dpe-F（SEQ ID NO.2）和 dpe-R（SEQ ID NO.3）一对引物对人工合成的 dpe模板进行PCR扩增反应，利用BamH I和Hind III两个酶切位点将 dpe插入pRSFDuet-1，得到pRSFDuet- dpe重组载体，借助电化学转化法将重组质粒转染进大肠杆菌JM109(DE3)中进行表达。

得到的菌株命名为 E.coli (DPE)，进行细胞培养。首先在LB试管中，37℃、220rpm过夜活化，转接至100ml LB培养基中37℃、220rpm培养至细胞密度约0.6-0.8之间，加入异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导剂0.4mM，30℃、220rpm培养8小时，诱导DPE蛋白质表达。LB培养基包括：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L NaCl；卡那霉素使用浓度为50mg/ml。8小时后，使用冷冻离心机4℃离心10分钟收集菌体，再用Tris-HCl缓冲液（50mM，pH7.5）重悬，保存于4℃冰箱中。采用超声波破碎细胞，利用蛋白质凝胶电泳检验蛋白质表达情况。如图2所示，与空白对照（lane 2）相比，在30kDa附近有大量蛋白质聚集（lane 3），表明 dpe基因在大肠杆菌中异源表达成功。

实施例2

本实施例中的 secY(ΔP)基因来自大肠杆菌JM109(DE3)中 secY基因并将其中60-74位氨基酸组成的帽子结构用一段短链氨基酸（Gly-Ser-Gly-Ser）组成的柔性片段替换，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示； sCVE基因是来自SARS冠状病毒中的小包膜E蛋白基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示； secE和 secG基因来自大肠杆菌JM109(DE3)自身基因的过表达，核苷酸序列分别可参考Gene ID: 948486和Gene ID: 947720。

在大肠杆菌中对磷酸化果糖的三个基因 fruA， manXYZ和 mak进行敲除，得到菌株E.coli (ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)；再将 secY(ΔP)、 secE、 secG和 sCVE四个基因融合表达，实现果糖非磷酸化转运途径的建立，初步建立D-阿洛酮糖生产的单细胞工厂，得到菌株 E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)。具体措施为使用λred同源重组的方法进行基因敲除工作。具体方法如下：

依次使用 fruA-F（SEQ ID NO.6）/ fruA-R（SEQ ID NO.7）， manXYZ-F（SEQ IDNO.8）/ manXYZ -R（SEQ ID NO.9），和 mak-F（SEQ ID NO.10）/ mak-R（SEQ ID NO.11）三对含有同源臂的引物序列以pkD13为模板进行PCR扩增，将得到的片段转染进含有pkD46的大肠杆菌JM109(DE3)中，在30℃的条件下进行同源重组，再利用pcp20质粒完成抗性消除，最后在42℃的条件下完成质粒的丢失。在此基础上，使用 secY(ΔP)-F（SEQ ID NO.12）/ secY(Δ P)-R（SEQ ID NO.13）、 secE-F（SEQ ID NO.14）/ secE-R（SEQ ID NO.15）、 secG-F（SEQ IDNO.16）/ secG-R（SEQ ID NO.17）和 sCVE-F（SEQ ID NO.18）/ sCVE-R（SEQ ID NO.19）四对引物以各自基因为模板进行PCR扩增，酶切后分别插入pETDuet-1和pRSFDuet- dpe两个质粒中，得到pETDuet- secY(ΔP)- secE和pRSFDuet- dpe-secG- sCVE重组载体。使用电化学转化法将上述重组载体转染至 E.coli(ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)，具体步骤如下：采用LB培养基培养培养 E.coli(ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)细胞，离心收集菌体，在冰浴中使用体积分数为10%的甘油清洗菌体3次（离心条件为4℃、6000 rpm、10min），得到 E.coli(ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)感受态细胞；取重组载体ETDuet- secY(ΔP)-secE和pRSFDuet- dpe-secG- sCVE各1µL加入 E.coli(ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)感受态细胞，使用电穿孔仪进行电击，条件为1mm电击杯、1.8 kV放电、放电时间4-5 mS，然后置于LB培养基中复苏培养2小时，进而得到菌株 E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)。

发酵验证菌株 E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)生产D-阿洛酮糖的能力。发酵培养基包括：20g/L果糖，5g/L yeast extract, 10g/L氯化钠，10g/Ltryptone，1mM MnCl₂；氨苄霉素使用浓度为100mg/ml，卡那霉素使用浓度为50mg/ml。发酵条件为30℃，220rpm，0.4mM的IPTG，接种量0.2vol%。如图3所示，实验结果表明，重组菌种 E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak )在24小时内消耗5.5g/L的D-果糖可以产生1.83g/L的D-阿洛酮糖，D-果糖的转化率为30.6%，D-阿洛酮糖的得率约为0.33g/g。

实施例3

继续对菌株 E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak)进行改善，目的是降低D-果糖的转化率，提高D-阿洛酮糖的得率。继续敲除D-阿洛酮糖下游代谢途径 galE基因，保证产生的D-阿洛酮糖不参与细胞代谢。同时敲除D-果糖下游代谢途径中的 fruK基因，防止果糖的过度浪费。同时利用Ni²⁺产生竞争性抑制FbaA的催化能力，下调果糖代谢的总开关，保证底物-产物的最大转化效率。

具体方法为使用 galE-F（SEQ ID NO.20）/ galE-（SEQ ID NO.21）R和 fruK-F（SEQID NO.22）/ fruK-R（SEQ ID NO.23）两对引物依次对 E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA,ΔManXYZ, ΔMak)中的 galE和 fruK进行敲除，得到菌株 E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak, ΔGalE, ΔFruK)。通过向培养基中添加8µM NiCl₂，抑制FbaA的催化能力。

发酵培养基包括：20g/L果糖，5g/L yeast extract，10g/L氯化钠， 10g/Ltryptone， 1mM MnCl₂，8µM NiCl₂；氨苄霉素使用浓度为100mg/ml，卡那霉素使用浓度为50mg/ml。发酵条件为30℃，220rpm，0.4mM的IPTG，接种量0.2vol%。如图4所示， E.coli (DPE, SecY[ΔP], ΔFruA, ΔManXYZ, ΔMak, ΔGalE, ΔFruK )的生长速率维持在0.17h^-1的正常水平，D-阿洛酮糖的得率提高到0.95g/g，总量达到3.3g/L。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大学

<120> 一种产D-阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂及其构建与应用

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tacatcgaaa aagttgcgaa actgggcttc gatatcctgg aagttgcggc gcaccacatc 120

aacgaataca gcgatgcgga actggctacc atccgtaaat ctgcgaaaga taacggtatc 180

attctgaccg cgggcatcgg cccgagcaaa accaaaaacc tgtctagcga agatgcggcg 240

gttcgtgcgg cgggtaaagc gttcttcgaa cgtaccctgt ctaacgttgc gaaactggat 300

atccacacca tcggcggcgc gctgcacagc tactggccga tcgattactc tcagccggtt 360

gacaaagcgg gcgattacgc gcgtggtgtt gaaggtatca acggcattgc agatttcgcg 420

aacgatctgg gtatcaacct gtgcatcgaa gttctgaacc gtttcgaaaa ccacgttctg 480

aacaccgcgg cggaaggtgt tgctttcgtg aaagacgttg gcaaaaacaa cgttaaagtt 540

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<213> 人工合成

<400> 22

ccatatcgaa ctgaccgagc cagctcagag aatcagtcac aaagcgttcc gtgtaggctg 60

gagctgcttc g 71

<210> 23

<211> 70

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 23

tcgcggttct taagcgtctc gctgatttat tgctcgacaa taaagctgac attccgggga 60

tccgtcgacc 70

Claims

1.一种产D-阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂，其特征在于：所述重组菌单细胞工厂是利用重组载体在大肠杆菌JM109(DE3)中过表达D-阿洛酮糖-3-差向异构酶基因dpe催化D-果糖转化为D-阿洛酮糖，再敲除果糖特异性PTS转移蛋白基因fruA、甘露糖特异性PTS转移蛋白基因manXYZ和果糖激酶基因mak共三个基因，从而减少果糖在细胞体内磷酸化后造成的浪费，同时过表达Sec蛋白转位通道的三个亚基基因secY(ΔP)、secE、secG以及外膜致孔蛋白基因sCVE共四个基因，构建大肠杆菌转运果糖的非磷酸化通道来加快底物进入细胞，并在此基础上敲除UDP-半乳糖4-差向异构酶基因galE和1-磷酸果糖激酶基因fruK共两个基因，利用Ni²⁺下调FbaA蛋白的功能性，控制碳代谢通量得到的；

其中，所述dpe基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述基因secY(ΔP)和sCVE核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述基因secE和secG在NCBI的基因ID分别为948486和947720。

2.根据权利要求1所述的产D-阿洛酮糖的重组菌单细胞工厂的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)在大肠杆菌JM109(DE3)中构建并表达将D-果糖转化为D-阿洛酮糖的基因dpe，得到菌株E.coli-DPE；

(2)在菌株E.coli-DPE中利用同源重组技术敲除导致果糖磷酸化的基因fruA、manXYZ和mak，得到菌株E.coli-DPEΔFruAΔManXYZΔMak；

(3)在菌株E.coli-DPEΔFruAΔManXYZΔMak中构建并表达大肠杆菌转运果糖的非磷酸化通道的基因secY(ΔP)、secE、secG和sCVE，得到菌株E.coli-DPESecY[ΔP]ΔFruAΔManXYZΔMak；

(4)在菌株E.coli-DPESecY[ΔP]ΔFruAΔManXYZΔMak中利用同源重组技术敲除副产物代谢途径及果糖代谢途径的基因galE和fruK，得到重组菌株E.coli-DPESecY[ΔP]ΔFruAΔManXYZΔMakΔGalEΔFruK，再通过Ni²⁺抑制剂NiCl₂，抑制FbaA活性，关闭果糖代谢总开关。

3.根据权利要求2所述的重组菌单细胞工厂的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)具体过程如下：使用dpe-F和dpe-R一对引物对人工合成的dpe基因模板进行PCR扩增反应，利用BamHI和HindIII两个酶切位点将dpe基因插入pRSFDuet-1，得到pRSFDuet-dpe重组载体，借助电化学转化法将重组载体转染进大肠杆菌JM109(DE3)中进行表达；所述dpe基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述引物dpe-F和dpe-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2和SEQID NO.3所示。

4.根据权利要求2所述的重组菌单细胞工厂的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)具体过程如下：依次使用fruA-F/fruA-R、manXYZ-F/manXYZ-R和mak-F/mak-R三对含有同源臂的引物序列以pkD13为模板进行PCR扩增，将得到的片段转染进含有pkD46的大肠杆菌E.coli-DPE中，在30℃的条件下进行同源重组，再利用pcp20质粒完成抗性消除，最后在42℃的条件下完成质粒的丢失，得到菌株E.coli-DPEΔFruAΔManXYZΔMak；所述引物fruA-F和fruA-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述引物manXYZ-F和manXYZ-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；所述引物mak-F和mak-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示。

5.根据权利要求2所述的重组菌单细胞工厂的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)具体过程如下：使用secY(ΔP)-F/secY(ΔP)-R、secE-F/secE-R、secG-F/secG-R和sCVE-F/sCVE-R四对引物以各自基因为模板进行PCR扩增，酶切后分别插入pETDuet-1和pRSFDuet-dpe两个质粒中，得到pETDuet-secY(ΔP)-secE和pRSFDuet-dpe-secG-sCVE，转染菌株E.coli-DPEΔFruAΔManXYZΔMak后得到菌株E.coli-DPESecY[ΔP]ΔFruAΔManXYZΔMak；所述基因secY(ΔP)和sCVE核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，所述基因secE和secG在NCBI的基因ID分别为948486和947720；所述引物secY(ΔP)-F和secY(Δ P)-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.12和SEQ IDNO.13所示；所述引物secE-F和secE-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；所述引物secG-F和secG-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；所述引物sCVE-F和sCVE-R核苷酸序列分别如SEQID NO.18和SEQ ID NO.19所示。

6.根据权利要求2所述的重组菌单细胞工厂的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)具体过程如下：依次使用galE-F/galE-R和fruK-F/fruK-R两对引物利用同源重组技术继续完成对菌株E.coli-DPESecY[ΔP]ΔFruAΔManXYZΔMak的galE和fruK两个基因的敲除，得到重组菌株E.coli-DPESecY[ΔP]ΔFruAΔManXYZΔMakΔGalEΔFruK，再向重组菌培养基中添加8μM的NiCl₂以抑制FbaA活性；所述引物galE-F和galE-R核苷酸序列分别如SEQ IDNO.20和SEQ ID NO.21所示；所述引物fruK-F和fruK-R核苷酸序列分别如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示。

7.如权利要求1所述的重组菌单细胞工厂在生产D-阿洛酮糖中的应用。