CN111394290A - 产长叶烯的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于合成生物学领域，涉及一种产长叶烯的基因工程菌。该基因工程菌为含有长叶烯合成代谢途径的相关基因(包括法尼基焦磷酸合成酶基因ispA和长叶烯合成酶基因lgfS)的重组大肠杆菌；该重组大肠杆菌经过优化内源MEP合成途径的底盘改造和并通过引入异源MVA途径中关键酶基因优化代谢途径，所获得的产长叶烯的基因工程菌具有较高的长叶烯产量。将该基因工程接入发酵培养基，加入诱导剂IPTG，并在发酵培养过程中加入长链正构烷烃进行双相萃取发酵，长叶烯摇瓶产量达到1.77mg/L，具有较好的工业运用前景。

Description

产长叶烯的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于合成生物学领域，涉及产长叶烯的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

异戊二烯类化合物，也称萜烯或萜类化合物，是一类自然界中广泛存在的种类最多的化合物，已有40000多种不同的萜类化合物从植物、动物及微生物中分离出来。这类化合物丰富多样的结构为解决人类健康和社会问题提供了良好的化合物筛选库，并且一些化合物已广泛用于医药、保健食品、香料、农用化学品等。然而，这类化合物在天然宿主中的产量极少，很大程度上限制了这类化合物的工业生产及应用。目前解决该困难的有效方法之一，是通过合成生物学及途径工程手段对异源微生物或植物的代谢途径进行重组改造，引入目标产物合成的关键基因，通过途径优化等策略异源合成目标产物。该生物方法具有生产工艺简单、周期短、对环境友好、不依赖于土地及气候因素的优点。目前已有很多成功的实例，其中最具有代表性的当属青蒿素前体青蒿酸、紫杉醇前体紫杉二烯和番茄红素。

长叶烯是从属倍半萜烯类的一种有广阔市场价值的重要平台化学品，具有特殊的化学活性，由于其具有特殊的木香气味广泛用于合成长叶烯酯、长叶烷醇、异长叶烯、异长叶烯酮等香料产品，同时也是食品和化妆品的重要原料。另外它还具有高的水解稳定性，高的体积电阻率以及合适的粘度和闪点，可用作润滑油和驱虫剂的添加材料。长叶烯具备0.928g/mL的高密度及燃烧热，基于长叶烯的燃料比常规的海军喷气燃料的体积净燃烧热高出17％，其加氢产物可作为高密度燃料的原料。

一直以来，长叶烯的制备多从天然松木树脂中提取或者利用有机试剂通过一系列化学合成而得。但植物提取方法存在产率低、成本高以及资源有限等不可避免的限制因素，且因长叶烯复杂的环状骨架，化学方法能耗大、工序复杂，因此微生物发酵合成长叶烯的方法成为一种绿色、可持续、反应条件温和的有吸引力的替代方法。大肠杆菌因其遗传背景清晰、操作简便等优势成为首选宿主。

长叶烯属于萜烯类化合物，该类物质在生物体内可由两条天然代谢途径生成，分别是存在于真核细菌、古细菌、高等植物细胞液中的甲羟戊酸途径(MVA)，以及存在于植物质体、细菌和藻类的非甲羟戊酸途径(MEP)。基于上述两条代谢途径合成的相同C5前体物二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)，进而在系列合酶即香叶酯二磷酸合酶、法尼基焦磷酸合酶及长叶烯合酶的催化作用下可生成目的产物长叶烯。但是，目前针对生物法合成长叶烯的报道较少，且未能实现工业化生产。

因此，目前存在的问题是需要构建一种产长叶烯的基因工程菌以及利用该基因工程菌生产长叶烯的方法，利用该基因工程菌生产长叶烯，产量高、效率高、成本低、绿色环保，且易于工业化生产。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种产长叶烯的基因工程菌，该基因工程菌高产长叶烯，且易于工业化生产。

本发明的目标之二在于提供一种上述产长叶烯的基因工程菌的构建方法，该方法能够克服天然植物提取方法产量低、效率低、成本高以及植物生长受限等弊端，还有克服化学合成法成本高、污染大的不足。

本发明的目的之三在于提供上述基因工程菌在生产长叶烯中的应用，对该基因工程菌进行发酵培养生产长叶烯，产量高、效率高、成本低、绿色环保，且易于工业化生产。

为此，本发明首先提供了一种产长叶烯的基因工程菌。

根据本发明第一方面的一些实施方式，所述产长叶烯的基因工程菌为含有长叶烯合成代谢途径的相关基因的重组大肠杆菌。

本发明中，所述长叶烯合成的相关基因包括法尼基焦磷酸合成酶基因ispA和长叶烯合成酶基因lgfS。

在本发明的一些实施例中，所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA为来源于大肠杆菌JM109的内源性基因，并且其在重组大肠杆菌中过表达。

在本发明的一些优选的实施例中，所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA以大肠杆菌JM109基因组为模板扩增得到，其序列如SEQIDNO.2所示。

在本发明的另一些实施例中，长叶烯合成酶基因lgfS为来源于挪威云杉且经密码子优化的长叶烯合成酶基因lgfS，并且其在重组大肠杆菌中过表达。

在本发明的一些优选的实施例中，所述长叶烯合成酶基因lgfS基因的序列如SEQIDNO.1所示。

根据本发明第二方面的一些实施方式，所述产长叶烯的基因工程菌为经过底盘改造的重组大肠杆菌。

根据本发明，所述底盘改造包括优化内源MEP合成途径，其包括在重组大肠杆菌中过表达内源MEP合成途径中的关键酶基因1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr，以及在重组大肠杆菌中过表达来源于肺炎链球菌的异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi。

在本发明的一些实施例中，所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs来源于大肠杆菌JM109，其序列如SEQIDNO.13所示。

在本发明的另一些实施例中，所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr来源于大肠杆菌JM109，其序列如SEQIDNO.14所示。

在本发明的又一些实施例中，所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi以肺炎链球菌基因组为模板扩增得到，其序列如SEQIDNO.4所示。

根据本发明第三方面的一些实施方式，所述基因工程菌为经过代谢途径优化的重组大肠杆菌。

根据本发明，所述代谢途径优化包括在重组大肠杆菌中过表达异源MVA途径的上游关键酶基因，以及在重组大肠杆菌中表达异源MVA途径的下游关键酶基因。

本发明中，所述异源MVA途径的上游关键酶基因包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS。

在本发明的一些实施例中，所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS均来源于粪肠球菌。

在本发明的一些具体的实施例中，乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE的序列如SEQIDNO.5所示。

在本发明的另一些具体的实施例中，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS的序列如SEQIDNO.6所示。

本发明中，所述异源MVA途径的下游关键酶基因包括甲羟戊酸激酶基因mvk、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD。

在本发明的一些实施例中，所述甲羟戊酸激酶基因mvk来源于马氏八叠球菌，其序列如SEQIDNO.7所示。

在本发明的另一些实施例中，所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD均来源于肺炎链球菌。

在本发明的一些具体的实施例中，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk的序列如SEQIDNO.8所示。

在本发明的另一些具体的实施例中，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD的序列如SEQIDNO.9所示。

在本发明一些具体优选的实施例中，所述基因工程菌为含有质粒pfdiAES(prsf-lgfs-idi-ispA-mvaE-mvaS)、质粒pAdxsr(pACYC-dxs-dxr)和质粒pTmpkD(pTrc99a-mvk-pmk-mvaD)的重组大肠杆菌。

本发明还提供了如本发明第一至第三方面的实施方式所述的基因工程菌的构建方法，其包括步骤A，构建含有长叶烯合成代谢途径的相关基因的产长叶烯的重组大肠杆菌。

在本发明的一些实施例中，所述构建方法还包括步骤B，对产长叶烯的重组大肠杆菌进行底盘改造，获得经过底盘改造的产长叶烯的重组大肠杆菌。

在本发明的另一方面的实施例中，所述构建方法还包括步骤C，对产长叶烯的重组大肠杆菌进行代谢途径优化，获得经过代谢途径优化的产长叶烯的重组大肠杆菌。

本发明还提供了如本发明第一至第三方面的实施方式所述的基因工程菌或本发明上述方法构建的基因工程菌在生产长叶烯中的应用。

根据本发明，所述应用包括将所述基因工程菌接入发酵培养基，并加入诱导剂IPTG，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化获得长叶烯。

本发明中，所述发酵培养基包括M9发酵培养基、TB发酵培养基和LB发酵培养基中的一种或几种。

在本发明的一些实施例中，所述发酵培养的温度为30-37℃。

在本发明的另一些实施例中，所述发酵培养的时间为24-48h。

在本发明的又一些实施例中，所述发酵培养的摇床转速为180-200rpm。

根据本发明，所述应用还包括在发酵培养过程中加入长链正构烷烃进行双相萃取发酵。

在本发明的一些实施例中，以发酵液总体积计的诱导剂的浓度为0.1-1.2mM。

在本发明的另一些实施例中，所述长链正构烷烃的加入量为发酵培养液体积的10％-15％。

根据本发明，在发酵培养过程中，加入诱导剂IPTG诱导2-4h后再加入长链正构烷烃进行双相萃取发酵。

本发明中，所述长链正构烷烃包括正壬烷和/或正癸烷。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

本发明通过密码子优化合成长叶烯合成相关基因lgfs，使得该基因能够更容易在异源宿主内进行表达，同时通过构建代谢途径模块利用双重代谢途径增强长叶烯合成前体物法尼基焦磷酸的供应量来产长叶烯，通过这些技术使长叶烯摇瓶产量达到1.77mg/L，具有较好的工业运用前景。

附图说明

下面结合附图来对本发明作进一步详细说明：

图1是本发明的产长叶烯的基因工程菌中利用2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)和甲羟戊酸(MVA)生物合成长叶烯的代谢途径示意图。

图2是质粒pfdiAES示意图。

图3是质粒pAdxsr示意图。

图4是质粒pTmpkD示意图。

图5是本发明实施例4中的发酵产物长叶烯结构的GC分析总离子流图，其中，上图为D菌株发酵提取样品，下图为长叶烯标准品。

图6是本发明实施例4中的发酵产物长叶烯结构的GC分析质子图。

图7示出本发明产长叶烯基因工程菌菌株A-F的长叶烯产量；其中，菌株A为对照:prsfDuet-1-lgfs；菌株B:prsfDuet-1-lgfs-ispA-idi；菌株C:prsfDuet-1-lgfs-erg20-idi；菌株D:prsfDuet-1-lgfs-ispA-idi&pACYCDuet-1-dxs-dxr；菌株E:prsfDuet-1-lgfs-ispA-idi-mvaE-mvaS&pTrcc99a-mvk-pmk-mvaD；菌株F:prsfDuet-1-lgfs-ispA-idi-mvaE-mvaS&pTrcc99a-mvk-pmk-mvaD&pACYCDuet-1-dxs-dxr；菌株D是通过增强MEP途径两个关键酶dxs和dxr生产长叶烯；菌株E是通过外源引入MVA途径中五个关键酶来产长叶烯；而菌株F则是通过增强dxs、dxr与引入异源MVA途径的双重作用生产长叶烯。

图8示出本发明产长叶烯基因工程菌菌株D、E、F的培养基的筛选结果。

图9示出本发明产长叶烯基因工程菌菌株D、E、F的诱导剂IPTG浓度的优化结果。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将结合附图详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

除非另有定义，本文所用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

Ⅰ.术语

本发明所述用语“底盘微生物”亦称为“底盘微生物细胞”是指利用微生物细胞作为平台，置入功能化的生物系统，使该细胞能够具备人类需要的功能，用于生物合成。就好比汽车有了底盘才有基础，在这个基础上可以制造各种各样的车体，安装各种功能组件。所以，底盘微生物细胞需要本身的功能精简，但是要具备最基本的自我复制和代谢能力，这样就能成为一个可以不断添加功能的空白平台。

本发明所述用语“基因工程菌”是指将目的基因导入宿主生物体(即宿主细胞或底盘微生物或细菌体)内使其表达，产生所需要的蛋白的细菌，如大肠杆菌等。基因工程的核心技术是DNA的重组技术，因此，本发明中也将基因工程菌称为为重组微生物，例如重组大肠杆菌。

本发明所述用语“重组”是指利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后再将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。

本发明中所述用语“内源性基因”是指宿主菌或宿主菌相同种属的细胞自身基因组内的基因，例如，本发明中用于构建基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌BL21，其内源性基因可以来自大肠杆菌JM109(K12)。

本发明中所述用语“异源性基因”是指在构建基因工程菌过程中通过基因工程导入宿主菌的其他物种或细胞的基因，也可以是人工优化、改造或合成的基因。

本发明中所述用语“表达”是指代谢途径中基因的表达，指的是其本底启动子的表达。

本发明中所述用语“过表达”是指采用强或超强启动子在宿主菌或基因工程菌中表达某种基因。

本发明中所述“水”一词，在没有特别说明或限定的情况下是指去离子水、蒸馏水或超纯水。

Ⅱ.实施方案

如前所述，现有的制备长叶烯的方法，天然植物提取方法存在产量低、效率低、成本高以及植物生长受限等弊端；化学合成法成本高、污染大；而目前针对生物法合成长叶烯的报道较少，且未能实现工业化生产。鉴于此，本发明人对于生物法合成长叶烯的方法进行了大量的研究。

本发明人研究设计并发现，以大肠杆菌为表达宿主，通过密码子优化合成长叶烯合成酶基因lgfS，使得该基因能够更容易在异源宿主内进行表达，同时通过过表达法尼基焦磷酸合成酶基因ispA，由此可以构建获得高效产长叶烯基因工程菌。本发明人进一步研究设计并发现，通过底盘改造，可以增强长叶烯合成的前体物质法尼基焦磷酸(FPP)，使更多的FPP转化成长叶烯；通过构建代谢途径模块利用双重代谢途径增强长叶烯合成前体物法尼基焦磷酸的供应量来产长叶烯，可以获得高产长叶烯的基因工程菌，并由此获得本发明。

因此，本发明所提供的产长叶烯的基因工程菌是以大肠杆菌作为表达宿主构建获得。优选地，本发明中采用大肠杆菌BL21(菌种保藏编号为CGMCC 1.12875，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心)作为表达宿主。

在本发明第一方面的实施方式中，所述产长叶烯的基因工程菌为含有长叶烯合成代谢途径的相关基因的重组大肠杆菌，本发明中也称为产长叶烯的初始基因工程菌或者产长叶烯的初始重组大肠杆菌。

本发明中，所述长叶烯合成代谢途径的相关基因包括法尼基焦磷酸合成酶基因ispA(本发明中简称为“基因ispA”或“ispA”)和长叶烯合成酶基因lgfS(本发明中简称为“基因lgfS”或“lgfS”)，其中，法尼基焦磷酸合成酶基因ispA将异戊烯基焦磷酸分子和二甲基烯丙基焦磷酸分子组合以形成长叶烯前体-法尼基焦磷酸，而长叶烯合成酶基因lgfS将长叶烯前体-法尼基焦磷酸转化成长叶烯，二者构成长叶烯合成的代谢途径，为长叶烯合成的代谢途径中的两个关键酶基因。

本领域技术人员应该了解的是，长叶烯合酶基因lgfs是所用底盘菌株(即宿主菌菌株，大肠杆菌BL21)内没有的基因，必须外源合成并进行密码子优化。因此，本发明中，所述长叶烯合成酶基因lgfS以来源于挪威云杉(Picea abies)的lgfS基因(GenBankAccession No.:AY473625)为基础经密码子优化得到的，其序列如SEQ ID NO.1所示，且其在基因工程菌中过表达。

所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA为来源于大肠杆菌JM109(K12)(菌种保藏编号为CGMCC 1.8745，购于中国普通微生物菌种保藏管理中心)的内源性基因，并且其在重组大肠杆菌中过表达。所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA以大肠杆菌JM109基因组为模板扩增得到，其序列如SEQIDNO.2所示。

在本发明的一些具体优选的实施例中，采用质粒自带T7强启动子的质粒prsfDuet-1，将基因lgfs与基因ispA分别连接至两个T7启动子后的多克隆位点处，从而加强表达效果，实现过表达。

本发明人研究发现，在异源表达长叶烯合酶基因lgfS的基础上,过表达内源性法尼基焦磷酸合酶ispA基因，可以有效生产长叶烯。具体而言，本发明通过从大肠杆菌基因组DNA中扩增相应基因(即法尼基焦磷酸合酶ispA基因)构建了用于大肠杆菌过表达的2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径和甲羟戊酸途径。随后引入经基因合成和密码子优化的lgfs实现了从异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)生产长叶烯的通路，从而实现了重组大肠杆菌高效生产长叶烯。相关反应途径见图1。

为了提高初始重组大肠杆菌的长叶烯的生产能力，在本发明第二方面的实施方式中对本发明第一方面的实施方式所获得的产长叶烯的初始重组大肠杆菌进行底盘改造，获得经过底盘改造的产长叶烯的基因工程菌，本发明中也称为经过底盘改造的产长叶烯的重组大肠杆菌。

优选地，本发明中所述底盘改造优化内源MEP合成途径。

本发明中，所述内源MEP合成途径的关键酶基因包括异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi(本发明中简称为“基因idi”或“idi”)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs(本发明中简称为“基因dxs”或“dxs”)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr(本发明中简称为“基因dxr”或“dxr”)中的一种或多种；其中，异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi将异戊烯基焦磷酸(IPP)异构化生成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs在焦磷酸硫胺素及丙酮酸的存在下，利用D-甘油醛-3-磷酸(D-GAP)合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr在二价金属离子和NADPH的辅助下催化DXP重排转化成MEP。

在本发明的一些具体实施例中，通过优化内源MEP合成途径对本发明第一方面的实施方式所获得的产长叶烯的初始重组大肠杆菌进行底盘改造，其包括在重组大肠杆菌中过表达内源MEP合成途径中的关键酶基因1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr，以及在重组大肠杆菌中过表达来源于肺炎链球菌的异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi。

本领域技术人员应该了解的是，大肠杆菌MEP途径中本身含有idi，但是本发明中选择了肺炎链球菌来源的idi用于重组大肠杆菌中进行过表达，相当于在大肠杆菌自身idi表达基础上又表达了肺炎链球菌来源的idi。

优选地，所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi来源于肺炎链球菌，其GenBank登录号为WP_049527841.1，且以肺炎链球菌基因组为模板扩增得到，其序列如SEQIDNO.4所示。

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs来源于大肠杆菌JM109，其GenBank登录号为NP_414954.1，其序列如SEQIDNO.13所示。

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr来源于大肠杆菌JM109，其GenBank登录号为NP_414715.1，其序列如SEQIDNO.14所示。

本领域技术人员应该了解的是，由于大肠杆菌原核生物中，一个启动子可启动多个基因表达，因此，与基因lgfs与ispA相同，上述关键基因如idi、连接至lgfs、ispA之后，同样由T7启动，进行过表达；而dxs与dxr依次连接至质粒pACYCDuet-1的两个多克隆位点上，同样由质粒自带强启动子T7启动，进行过表达。

本发明上述产长叶烯的重组大肠杆菌为异源表达长叶烯合酶基因lgfS的基础上，过表达肺炎链球菌来源的异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi和内源性法尼基焦磷酸合酶基因ispA，有效提高长叶烯合成前体物法尼基焦磷酸(FPP)的供应量，进一步通过过表达内源MEP途径中两个关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr，从而提高由乙酰辅酶A合成目标产物的碳流量。也就是说本发明上述产长叶烯的重组大肠杆菌为异源表达长叶烯合酶基因lgfS的基础上，通过过表达内源中心代谢途径中关键酶基因，从而增强合成长叶烯前体物质法尼基焦磷酸(FPP)的代谢通量，产生更多的FPP转化成长叶烯。相关反应途径见图1。

在本发明第三方面的实施方式中，通过引入异源MVA途径中五个关键酶基因对本发明第二方面的实施方式所获得的经过底盘改造的产长叶烯的重组大肠杆菌进行进一步代谢途径优化，获得含有异源MVA途径的相关基因的重组大肠杆菌，使得重组大肠杆菌进一步提高了长叶烯前体物的供应量。

具体地，本发明中所述代谢途径优化包括在重组大肠杆菌中过表达异源MVA途径的上游关键酶基因，以及在重组大肠杆菌中表达异源MVA途径的下游关键酶基因。

本发明中，所述异源MVA途径的上游关键酶基因包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE(本发明中简称为“基因mvaE”或“mvaE”)和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS(本发明中简称为“基因mvaS”或“mvaS”)，其中，所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE将两分子乙酰辅酶A缩合成一分子乙酰乙酰辅酶A，所述3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS将乙酰辅酶A和乙酰乙酰辅酶A缩合成HMG-CoA。

优选地，所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS均来源于粪肠球菌，二者的GenBank登录号为AF290092.1；其中，乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE序列如SEQIDNO.5所示，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS的序列如SEQIDNO.6所示。

本发明中，所述异源MVA途径的下游关键酶基因包括甲羟戊酸激酶基因mvk(本发明中简称为“基因mvk”或“mvk”)、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk(本发明中简称为“基因pmk”或“pmk”)和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD(本发明中简称为“基因mvaD”或“mvaD”)，其中，甲羟戊酸激酶基因mvk将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊烯基焦磷酸。

优选地，所述甲羟戊酸激酶基因mvk来源于马氏八叠球菌，其GenBank登录号为NC_003901.1，其序列如SEQIDNO.7所示。

同样优选地，所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD均来源于肺炎链球菌；其中，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk的GenBank登录号为NC_003098.1，其序列如SEQIDNO.8所示；甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD的GenBank登录号为YP_003446847.1，其序列如SEQIDNO.9所示。

本领域技术人员应该了解的是，由于大肠杆菌原核生物中，一个启动子可启动多个基因表达，因此，与基因ispA、idi相同，上述所述异源MVA途径的上游关键酶基因mvaE、mvaS连接至ispA、idi之后，同样由T7启动，有过表达作用；但下游模块的三个基因连在一个不含强启动子的质粒上，因此没有过表达。

本发明向含有内源MEP合成途径关键酶基因的产长叶烯的重组大肠杆菌中引入异源MVA途径中上下游两个模块，通过过表达上游模块中两个关键酶基因(即乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS)，使得更多的碳流量由乙酰辅酶A转入甲羟戊酸；继而通过引入下游模块中三个关键酶基因(即所述甲羟戊酸激酶基因mvk，以及甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD)转化更多的长叶烯合成前体物FPP，使得含有双重代谢途径的重组菌也实现长叶烯的生产。相关反应途径见图1。

本领域技术人员应该了解的是，此处所谓的“含有双重代谢途径的重组菌”指的是前面构建工作已经过表达了大肠杆菌内源MEP代谢途径得到一株重组菌，获得并提高了长叶烯产量；而这一步工作是将异源MVA代谢途径引入到上述重组菌中，得到一株新的重组菌，该菌含有两条途径来产生前体物IPP、FPP，即含有双重途径来生产长叶烯。

在本发明的一些具体优选的实施例中，所述产长叶烯的基因工程菌为含有为含有质粒pfdiAES(prsf-lgfs-idi-ispA-mvaES)(如图2所述)、质粒pAdxsr(pACYC-dxs-dxr)(如图3所述)和质粒pTmpkD(pTrc99a-mvk-pmk-mvaD)(如图4所述)的重组大肠杆菌。

为实现上述实施方案，本发明还提供了一种产长叶烯的基因工程菌的制备方法，其包括步骤A，在大肠杆菌中异源表达长叶烯合成酶基因lgfS，并过表达法尼基焦磷酸合成酶基因ispA，由此在大肠杆菌中构建长叶烯合成代谢途径，获得含有长叶烯合成代谢途径的相关基因的产长叶烯的重组大肠杆菌。

由于长叶烯合酶基因lgfs是所用底盘菌株内没有的基因，必须外源合成并进行密码子优化。因此，所述长叶烯合成酶基因lgfS以来源于挪威云杉(Picea abies)的lgfS基因(GenBank Accession No.:AY473625)为基础经密码子优化得到的，其序列如SEQ ID NO.1所示。

所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA为来源于大肠杆菌JM109的内源性基因，其以大肠杆菌JM109基因组为模板扩增得到，其序列如SEQIDNO.2所示。

本发明人研究发现，在步骤A中，在大肠杆菌中异源表达长叶烯合成酶基因lgfS，并以酿酒酵母来源的erg20代替大肠内源ispA，所述基因erg20的序列如SEQ No.3所示，而其质粒构建或表达手段均与ispA相同，同样也能够获得含有长叶烯合成代谢途径的相关基因的产长叶烯的基因工程菌，结果显示酿酒酵母来源的erg20的长叶烯产量略低于大肠内源ispA(参见图7)，说明大肠内源FPP合酶ispA表达效果更佳。

根据本发明的一些实施例，所述方法还包括步骤B，通过优化内源MEP合成途径对本发明第一方面的实施方式所获得的产长叶烯的初始重组大肠杆菌进行底盘改造，获得经过底盘改造的长叶烯的重组大肠杆菌。

具体地，所述底盘改造包括在重组大肠杆菌中过表达内源MEP合成途径中的关键酶基因1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr，以及在重组大肠杆菌中过表达来源于肺炎链球菌的异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi。

本发明通过在异源表达长叶烯合酶基因lgfS的基础上，过表达异戊烯基焦磷酸异构酶idi和法尼基焦磷酸合酶ispA基因，有效提高长叶烯合成前体物法尼基焦磷酸(FPP)的供应量，进一步通过过表达内源MEP途径中两个关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(dxs)和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶(dxr)基因，从而提高由乙酰辅酶A合成目标产物的碳流量，使得重组大肠杆菌中长叶烯产量明显上升。

所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi来源于肺炎链球菌，其GenBank登录号为WP_049527841.1，且以肺炎链球菌基因组为模板扩增得到，其序列如SEQIDNO.4所示。

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs来源于大肠杆菌JM109，其GenBank登录号为NP_414954.1，其序列如SEQIDNO.13所示。

1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr来源于大肠杆菌JM109，其GenBank登录号为NP_414715.1，其序列如SEQIDNO.14所示。

根据本发明的另一些实施例，所述方法还包括步骤C，通过引入异源MVA途径的关键酶基因对本发明第二方面的实施方式所获得的经过底盘改造的产长叶烯的重组大肠杆菌进行进一步代谢途径优化，获得含有异源MVA途径的相关基因的重组大肠杆菌。

所述代谢途径优化包括在重组大肠杆菌中过表达异源MVA途径的上游关键酶基因，以及在重组大肠杆菌中表达异源MVA途径的下游关键酶基因；优选地，所述异源MVA途径的上游关键酶基因包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS；所述异源MVA途径的下游关键酶基因包括甲羟戊酸激酶基因mvk、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD。

所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS均来源于粪肠球菌，二者的GenBank登录号为AF290092.1；其中，乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE序列如SEQIDNO.5所示，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS的序列如SEQIDNO.6所示。

所述甲羟戊酸激酶基因mvk来源于马氏八叠球菌，其GenBank登录号为NC_003901.1，其序列如SEQIDNO.7所示。

所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD均来源于肺炎链球菌；其中，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk的GenBank登录号为NC_003098.1，其序列如SEQIDNO.8所示；甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD的GenBank登录号为YP_003446847.1，其序列如SEQIDNO.9所示。

本发明向含有内源MEP合成途径的关键酶基因的产长叶烯的重组大肠杆菌中引入异源MVA途径中上游模块中两个关键酶基因(即乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS)，使得更多的碳流量由乙酰辅酶A转入甲羟戊酸进而转化更多的长叶烯合成前体物FPP；另外还引入异源MVA途径中下游模块中三个关键酶基因(即所述甲羟戊酸激酶基因mvk，以及甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD)，使得重组菌进一步提高了长叶烯前体物的供应量。

本领域技术人员应该了解的是，本发明中对于上述构建基因工程菌的步骤A到步骤C的次序及其各步骤中的具体操作次序没有特别的限制，例如，上述构建基因工程菌的步骤A到步骤C既可以依字母顺序进行，也可以以任意次序进行；类似地，上述构建基因工程菌的步骤A到步骤C中的具体操作也可以以任意次序进行。

在一些具体的实施例中，例如，所述产长叶烯的基因工程菌的构建方法包括：

步骤A，在大肠杆菌中过表达长叶烯合酶基因lgfS和法尼基焦磷酸合成酶基因ispA，构建长叶烯合成代谢途径，获得含有长叶烯合成代谢途径的相关基因的产长叶烯的重组大肠杆菌；

步骤B，在步骤A中构建的有长叶烯合成代谢途径的相关基因的产长叶烯的重组大肠杆菌中过表达来源于肺炎链球菌的异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi，并过表达内源MEP合成途径的关键酶基因，例如1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr，通过优化内源MEP合成途径的关键酶基因对重组大肠杆菌进行底盘改造，获得经过底盘改造的产长叶烯的重组大肠杆菌；

步骤C，在步骤B构建的经过底盘改造的产长叶烯的重组大肠杆菌中过表达异源MVA途径中的上游关键酶基因，例如乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE、3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS，并在重组大肠杆菌中表达异源MVA途径中的上游关键酶基因，例如甲羟戊酸激酶基因mvk、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD，获得经过代谢途径优化的产长叶烯的重组大肠杆菌作为本发明的产长叶烯的基因工程菌。

在另一些具体的实施例中，所述产长叶烯的基因工程菌的构建方法包括：

质粒pfdiAES以prsfDuet-1为骨架载体、启动子为lac启动子、复制子为质粒自带的RSFori复制子，所获得的包含lgfs、idi、ispA、mvaE以及mvaS基因，pfdiAES的序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID NO.9所示；质粒pAdxsr以pACYCDuet-1为骨架载体、启动子为lac启动子、复制子为p15Aori复制子，所获得的包含dxs、dxr基因，pAdxsr的序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID NO.10所示；质粒pTmpkD以pTrc99a为骨架载体、启动子为lac启动子、复制子为ColE1ori，所获得的包含mvk、pmk和mvaD基因，pTmpkD的序列(不含骨架载体序列)如SEQ ID NO.11所示；由此构建获得的产长叶烯的基因工程菌为含有为含有质粒pfdiAES(prsf-lgfs-idi-ispA-mvaES)、质粒pAdxsr(pACYC-dxs-dxr)和质粒pTmpkD(pTrc99a-mvk-pmk-mvaD)的重组大肠杆菌。

质粒pfdiAES含有甲羟戊酸途径前两个基因：来源于粪肠球菌的mvaE基因(乙酰辅酶A乙酰基转移酶)和mvaS基因(HMG-CoA还原酶)以及来源于肺炎链球菌的idi基因(异戊烯基焦磷酸异构酶)。质粒pTmpkD含有甲羟戊酸途径后三个基因：来自于马氏八叠球菌的mvk(甲羟戊酸激酶)、来源于肺炎链球菌的pmk(甲羟戊酸-5-磷酸激酶)和mvaD(甲羟戊酸-5-焦磷酸激酶)。所有基因均通过PCR扩增获得，所用引物见表1。

表1引物列表

发明人研究发现，在异源表达长叶烯合酶基因lgfS的基础上,过表达内源性法尼基焦磷酸合酶ispA基因及肺炎链球菌来源的异戊烯基焦磷酸异构酶idi基因，可以有效生产长叶烯。具体而言，本发明通过从大肠杆菌和肺炎链球菌基因组DNA中分别扩增相应基因(即法尼基焦磷酸合酶ispA基因和异戊烯基焦磷酸异构酶idi基因)构建了用于大肠杆菌过表达的2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径；同时引入了异源甲羟戊酸途径增强前体物供应。随后经密码子优化和基因合成构建了从异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)生产长叶烯的通路，从而实现了重组大肠杆菌高效生产长叶烯。相关反应途径见图1。

本发明所涉及的上述基因工程菌或上述方法制备的基因工程菌在生产长叶烯中的应用，可以理解为利用上述基因工程菌或上述方法制备的基因工程菌生产长叶烯的方法。

在本发明的一些实施例中，将所述基因工程菌接入发酵培养基，并加入诱导剂IPTG，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化获得长叶烯。本发明人研究发现通过控制发酵诱导条件，可以进一步提高长叶烯的产量。

例如，在本发明的一些具体的实施例中，所述发酵诱导条件为：

(1)所述发酵培养基包括M9发酵培养基、TB发酵培养基和LB发酵培养基中的一种或几种，优选为M9发酵培养基；

(2)所述发酵培养的温度为30-37℃，优选为30℃；

(3)所述发酵培养的时间为24-48h；

(4)所述发酵培养的摇床转速为180-200rpm，优选为200rpm；

(5)以发酵液总体积计的诱导剂的浓度为0.1-1.2mM。

本发明中，长叶烯为挥发性产物，以正壬烷可有效萃取发酵过程中产生的长叶烯，以便下一步提取检测。例如，在本发明的一些具体优选的实施例中，在发酵培养过程中加入长链正构烷烃作为有机相进行双相萃取发酵，其中，所述长链正构烷烃的加入量为发酵培养液体积的10％-15％；优选地，发酵培养过程中，加入诱导剂IPTG诱导2-4h后再加入长链正构烷烃进行双相萃取发酵。

本发明中，所述长链正构烷烃包括正壬烷和/或正癸烷，优选为正壬烷。

本发明对大肠杆菌从三个方面来进行改造，包括长叶烯合成途径的构建、内源MEP途径的过表达和异源MVA途径关键基因的引入，将构建好的重组菌株在包含葡萄糖的培养基中进行培养，经适量的诱导剂诱导，采用正壬烷的双相发酵系统萃取产物，分离纯化获得长叶烯，成功提升发酵生产长叶烯的产量，摇瓶发酵水平达到1.77mg/L。本发明选用的大肠杆菌是遗传背景最为清晰、培养操作方法最为成熟的原核宿主。

Ⅲ、实施例

以下通过具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法并采用常规的实验设备。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。

实施例1：重组质粒的构建

经化学合成同时密码子优化过的lgfS基因通过酶切位点BamHI和NcoI克隆到质粒prsfDuet-1，得到质粒prsf-lgfS。以大肠杆菌JM109、肺炎链球菌的基因组为模板扩增得到基因ispA与idi，ispA-idi基因片段通过NaeI和PacI酶切位点，以Gibson自组装的方式与prsf-lgfs连接，得到质粒prsf-lgfs-ispA-idi；类似的，以酿酒酵母、肺炎链球菌的基因组为模板扩增得到基因erg20与idi，以相同方式得到质粒prsf-lgfs-erg20-idi。

以粪肠球菌的基因组为模板扩增得到mvaE和mvaS基因，分别以BamHI和SalI将基因mvaS克隆到质粒prsf-lgfs-ispA-idi的第一个多克隆位点，用酶切位点BglII和XhoI将基因mvaE克隆到质粒prsf-lgfs-ispA-idi的第二个多克隆位点。从而得到质粒pfdiAES。

以大肠杆菌JM109基因组为模板扩增得到dxs、dxr两个基因，分别以BamHI和SbfI酶切位点克隆到质粒pACYCDuet-1的第一个多克隆位点，以NdeI和KpnI克隆到pACYCDuet-1的第二个多克隆位点。得到质粒pAdxsr。

以马氏八叠球菌基因组为模板扩增得到mvk基因，并以肺炎链球菌基因组为模板扩增到pmk和mvaD两个基因，通过Gibson自组装的方式一次性连接到pTrc99a质粒上，得到质粒pTmpkD。该方法是一种可将多个DNA片段在体外通过变性解链，退火组装成重组质粒的快速方法，连接时不需要限制性内切酶。构建过程中，通过overlap的方法，PCR扩增出以上三个基因片段，在相邻片段之间设计一段15-25bp的同源臂，再将扩增得到的片段与线性化的载体骨架按照摩尔比3:1的比例，50℃连接45min-1h，即可转化大肠杆菌trans10感受态，进而筛选验证得到重组质粒。

实施例2：重组菌株的构建

(1)感受态细胞的制备

将-80℃保存的大肠杆菌的甘油菌接种到4mL的LB试管中，过夜培养之后，以一定的接种量接入20mL LB培养基中，使初始OD600为0.2左右。在37℃摇床培养约2h，当OD600达0.8左右取出用于制备感受态细胞。

将培养好的菌落装入1.5mL离心管，冰浴使菌体冷却到0℃，之后4℃、5000rpm冷冻离心5min收集菌体，用100μL预冷的10％的甘油重悬菌体(四管菌体混一管)，然后4℃、5000rpm冷冻离心5min收集菌体。重复洗涤三次，洗涤完成后用100μL 10％的无菌甘油重悬菌体，用于电转化(MicropulserTM电转化仪，BIO-Rad)。

(2)大肠杆菌感受态细胞的电转化

在制备的大肠杆菌感受态细胞中加入2μL构建成功的重组质粒，轻柔的混匀，之后将混合液移入预冷的0.2cm电击杯中，电击条件为：2.5kv，电击5ms。电击完毕后立即加入1mL LB培养基，轻柔的混匀后吸出放入1.5mL离心管中，然后置于37℃复苏1h。复苏完成之后吸取一定量的菌液涂布于对应抗性平板上，37℃倒置过夜培养，对长出的单菌落进行菌落PCR验证、划线纯化等操作，然后挑取合适的阳性克隆，将其接种到4mL的LB培养基的试管中，过夜培养之后，进行甘油菌的保存，将保存的甘油菌放置在-80℃冰箱中存放。

实施例3：重组菌株的摇瓶发酵验证

(1)发酵培养基如表3、4、5所示

表3 M9发酵培养基配方

表4 M9盐成分(10X)

表5 M9微量元素配方(100X)

(2)重组菌株的摇瓶培养

吸取-80℃冰箱中存放的重组菌株A-F的甘油菌100μL分别接种于4mL的LB试管培养基中，37℃、200rpm摇床培养12-14h。之后将六株菌种子液按照10％的接种量接种到20mLLB种子培养基中，同样在37℃、200rpm摇床培养12-14h。待种子培养完成之后，按照10％的接种量将种子液分别接种到配好的50mL无菌发酵培养基中，同时各加入终浓度为0.1mMIPTG，对目的基因进行诱导表达，接着在加完诱导剂后3h左右，加入培养基体积15％的正壬烷，在30℃、200rpm摇床条件下培养48h左右。根据设定时间点进行取样，每次取样为正壬烷1mL，培养基1mL用于测定生物量及葡萄糖浓度。正壬烷相12000rpm离心10min后收集上清进行GC-MS分析测定正壬烷中长叶烯含量，最终在发酵48h后，对比A-F六株菌的长叶烯产量(正壬烷中长叶烯含量)结果如图7所示。

实施例4：代谢物及产物的检测

(1)生物量测定

取发酵液用去离子水进行适当稀释之后，用紫外分光光度计(752型，上海光谱仪器有限公司)测定其在600nm波长下的吸光值，选用比色皿进行吸光值的测定，装液量是1mL。

(2)葡萄糖浓度

用HPLC检测发酵液中的葡萄糖浓度。使用BIO-RAD-HPX-87H柱子，以5mM硫酸为流动相，柱温65℃，流速0.6mL/min，进样体积20μL，以示差检测器进行检测。

(3)长叶烯的测定

用GC-MS检测双相发酵液中的长叶烯及其含量。

使用GC-MS分析条件如下：安捷伦7890A气相色谱设备5975MS，气相色谱柱为TR-5MS(30m×0.25mm ID×0.25μm film)气相柱子，进样口温度250℃，气体流速1.1mL min^-1，转移线温度在300℃，离子源温度200℃，扫描分子量范围50-300。柱子升温程序：100℃下保持4min，以30℃min^-1速度上升到250℃，保留1分钟，使用electron impact(EI)检测器。

通过与标准品对比寻找特征离子碎片204(倍半萜烯物质的特征，长叶烯属于倍半萜烯，因此也具有该特征)，并搜索库(GC/MS仪器自带的检索谱库NIST08)里的分子式最终确定化合物长叶烯(longifolene)的出峰位置和质谱图。图5为D菌株发酵产物长叶烯结构的GC分析总离子流图；其中，下图为长叶烯标准品的检测结果，可以看出，经GC/MS检测长叶烯标准品的出峰时间为4.275min；上图为D菌株发酵提取样品(正壬烷相样品)的检测结果，明显得到出峰时间为4.28min的长叶烯峰。为进一步确认物质结构，对该峰进行质谱分析，结果如图6所示，D样品的物质结构与标准品完全一致，且同样得到204的离子碎片。由此可确认重组菌D可有效产生目的产物长叶烯，类似地，以相同方法确认B、C、E、F菌株同样具有产生长叶烯的能力。

将长叶烯标准品粉末溶解于乙酸乙酯中配制成1g/L母液，并稀释成不同浓度待测液，进行GC/MS检测，以不同浓度标准品溶液检测到的峰面积作为纵坐标，以对应浓度作为横坐标绘制标准曲线，然后再以来自不同菌株(例如A-F菌株)的待测样品进行检测得到峰面积，根据此峰面积计算实际浓度(正壬烷相中实际长叶烯的含量)(mg/L)再乘以浓缩系数即获得长叶烯最终的产量。其中，所述有机相浓缩系数是指所加入的有机相(长链正构烷烃，例如正壬烷)与发酵培养液体积的比值(以百分比表示)。

采用上述方法对A-F菌株的产量进行定量分析，结果如图7所示。从图7可以看出，与对照菌株A相比，经过基因改造的工程菌B-F的发酵液中均能检测到长叶烯的产生，且相对于菌株A，菌株B-F分别作了不同的基因改造，相应的长叶烯产量也因改造方式不同出现差异，且产量差异明显。进一步分析可以看出，在增强合成长叶烯前体物FPP供应量的基础上，即过表达了ispA/idi与erg20/idi的菌株B、C中，明显检测到长叶烯的产生，产量分别为0.25mg/L和0.13mg/L。菌株E和F中分别产生了0.26mg/L和0.42mg/L的长叶烯。而经过表达内源MEP途径中两个关键酶基因dxs、dxr的D菌株经诱导48h长叶烯摇瓶产量达到1.77mg/L，后续仍持续增加。

根据上述的发酵方法和检测方法对各重组菌株进行发酵验证及产物测定，结果如图7-9所示。

如前所述，图7示出A-F菌株产生的长叶烯产量，显示出不同的基因改造对菌株生产能力造成不同的影响。具体地，对照菌株A中未能有效检测到长叶烯的产生，菌株B(prsfDuet-1-lgfs-ispA-idi)的产量为0.25mg/L高于菌株C(prsfDuet-1-lgfs-erg20-idi)的产量0.13mg/L，由此说明大肠内源FPP合酶ispA的效果优于酵母来源的FPP合酶。而菌株D(prsfDuet-1-lgfs-ispA-idi&pACYCDuet-1-dxs-dxr)产量达到了1.77mg/L；与此同时，引入MVA途径的菌株E(prsfDuet-1-lgfs-ispA-idi-mvaE-mvaS&pTrcc99a-mvk-pmk-mvaD)产量检测到有0.26mg/L，同时引入MVA和增强MEP的菌株F(prsfDuet-1-lgfs-ispA-idi-mvaE-mvaS&pTrcc99a-mvk-pmk-mvaD&pACYCDuet-1-dxs-dxr)产量为0.42mg/L，可以看到，引入MVA途径后，E、F菌株长叶烯产量没有明显提高，怀疑该途径中中间代谢物过量积累，对宿主菌产生代谢负担和细胞毒性，不能表现出较高的生产能力，后续将针对该环节进行详细探究。以上结果显示菌株D生产长叶烯的能力最强，为最佳重组菌。

图8通过筛选三种不同培养基TB、M9与LB，结果显示对于D、E、F三种菌而言，M9培养基营养丰富发酵效果最佳，其次为TB，LB由于成分简单且含量低很明显效果低于M9。同时仅增强MEP代谢途径的菌株D产量明显高于引入异源MVA途径的菌株E和F，再次说明菌株D的中间代谢物较为平衡，菌株生产能力较强。

图9展示了经过对不同浓度梯度0.1、0.5、0.8、1.2mM诱导剂的筛选，得出最适宜生产长叶烯的IPTG浓度为0.1mM，其中0.5与0.8mM的产量相差不大，而1.2mM产量次于0.1mM，同时也满足菌株D产量最高的规律。

结论：

(1)五株菌均可产生长叶烯，证明我们构建的利用2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径和异源甲羟戊酸途径生产长叶烯的重组菌株是可行的。

(2)D菌株产量是F菌株的4倍以上，证明我们构建的过表达内源MEP途径关键酶基因的工程菌是相对高效的。

(3)B、C菌株产量与A相比可证明过表达ispA和idi关键酶基因能够显著提高长叶烯的量。

(4)通过筛选三种不同培养基与不同浓度梯度IPTG得到最适发酵条件，即以M9为发酵培养基，IPTG加入0.1mM时为最佳。

从上述实施例可以看出，本发明以原核生物大肠杆菌作为宿主细胞，从三个方面来对其进行改造，包括长叶烯合成途径的构建、内源2-C-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸(MEP)途径的加强、外源甲羟戊酸(MVA)途径的引入以及重组菌在含葡萄糖的培养基中进行培养，经IPTG诱导剂诱导，采用正壬烷的双相发酵系统萃取产物，最后成功获得可产长叶烯且具有最适发酵条件的工程菌。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明做出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

<110> 北京化工大学

<120> 产长叶烯的基因工程菌及其构建方法与应用

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1737

<212> DNA

<213> （经密码子优化的长叶烯合成酶基因lgfS）

<400> 1

atggcgcaga ttagcaaatg cagcagcctg agcgcggaac tgaacgaaag cagcattatc 60

agccatcatc atggcaacct gtgggatgat gattttatcc agagcctgaa aagcagcaat 120

ggcgcgccgc agtatcatga acgcgcggcg aaactggtgg aagaaatcaa aaacctggtg 180

gtgagcgaaa tgaaagattg caacgatgat ctgattcgcc gcctgcagat ggtggatatt 240

tttgaatgcc tgggcattga tcgccatttt cagcatgaaa ttcaggtggc gctggattat 300

gtgtatcgct attggaacca gctggaaggc attggtattg gcagccgcga tagcctgatt 360

aaagatttta acgcgaccgc gttaggcttt cgcgcgttac gtctgcatcg ctataacgtg 420

agcagcgatg tgctggaaaa cttcaaaaac gagaacggcc agtttttttg cagcagcacc 480

gtggaagaaa aagaagtgcg ctgcatgctg accttatttc gcgcgagcga aattagcttt 540

ccgggcgaaa aagtgatgga tgaagcgaaa gcgtttacca ccgaatatct gaccaaagtg 600

ctgaccggcg tggatgtgac cgatgtgaac caaagcctgc tgcgcgaagt gaaatatgcg 660

ctggaatttc cgtggcattg cagcttacct cgttgggaag cgcgcagctt tattgaaatt 720

tgcggccaga acgatagctg gctgaaaagc attatgaaca aacgcgtgct ggaactggcg 780

aaactggatt ttaacatttt acagtgggcg catcatcgcg aactgcagtt actgagcagc 840

tggtggagcc agagcgatat tgcgcagcag aacttttatc gcaaacgcca cgtggaattt 900

tatctgtggg tggtgattgg cacctttgaa ccggaattta gcacctgccg cattaccttt 960

gcgaaaatta gcaccctgat gaccattctg gatgatctgt atgataccca tggcaccctg 1020

gaacagctga aaatttttac cgaaggcgtg aaacgctggg atctgagctt agtggatcgc 1080

ctgccggatt atatcaagat caccttcgag ttctttctga acaccagcaa cgaactgatt 1140

gcggaagtgg cgaaaaccca ggaacgcgat atgagcgcgt atattcgcaa aacctgggaa 1200

cgctatctgg aagcgtatct gcaggaagcg gaatggattg cggcgcgtca tgtgccgacc 1260

tttgatgagt atatgaagaa cggcattagc agcagcggca tgtgcattct gaacctgtat 1320

agcctgctgc tgatgggtca gttactgccg gatgatgtgc tggaacagat tcatagcccg 1380

agcaaaattc atgaactggt ggaattaacc gcgcgcctgg tggatgatag caaagatttc 1440

gaaacgaaaa aagtgggcgg cgaattagcg agcggcattg aatgctatgt gaaggataac 1500

ccggaatgca ccctggaaga tgcgagcaac catctgaacg gcctgctgga tctgaccgtg 1560

aaagaactga actgggaatt tgtgcgccat gatagcgtgg cgctgtgctt taaaaaattc 1620

gcgttcaacg tggcacgtgg cttacgcctg atttataaat atcgcgacgg ctttgatgtg 1680

agcaaccagg aaatgaagac ccatatcttc aagatcctga ttgatccgct gacctaa 1737

<210> 2

<211> 900

<212> DNA

<213> （法尼基焦磷酸合成酶基因ispA）

<400> 2

atggactttc cgcagcaact cgaagcctgc gttaagcagg ccaaccaggc gctgagccgt 60

tttatcgccc cactgccctt tcagaacact cccgtggtcg aaaccatgca gtatggcgca 120

ttattaggtg gtaagcgcct gcgacctttc ctggtttatg ccaccggtca tatgttcggc 180

gttagcacaa acacgctgga cgcacccgct gccgccgttg agtgtatcca cgcttactca 240

ttaattcatg atgatttacc ggcaatggat gatgacgatc tgcgtcgcgg tttgccaacc 300

tgccatgtga agtttggcga agcaaacgcg attctcgctg gcgacgcttt acaaacgctg 360

gcgttctcga ttttaagcga tgccgatatg ccggaagtgt cggaccgcga cagaatttcg 420

atgatttctg aactggcgag cgccagtggt attgccggaa tgtgcggtgg tcaggcatta 480

gatttagacg cggaaggcaa acacgtacct ctggacgcgc ttgagcgtat tcatcgtcat 540

aaaaccggcg cattgattcg cgccgccgtt cgccttggtg cattaagcgc cggagataaa 600

ggacgtcgtg ctctgccggt actcgacaag tatgcagaga gcatcggcct tgccttccag 660

gttcaggatg acatcctgga tgtggtggga gatactgcaa cgttgggaaa acgccagggt 720

gccgaccagc aacttggtaa aagtacctac cctgcacttc tgggtcttga gcaagcccgg 780

aagaaagccc gggatctgat cgacgatgcc cgtcagtcgc tgaaacaact ggctgaacag 840

tcactcgata cctcggcact ggaagcgcta gcggactaca tcatccagcg taataaataa 900

<210> 3

<211> 1059

<212> DNA

<213> （来源于酿酒酵母基因组的erg20）

<400> 3

atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60

gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120

gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt gtccgttgtg 180

gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240

aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttacttctt ggtcgccgat 300

gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360

gttggggaaa ttgccatcaa tgacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420

aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaggtc 480

accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540

gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcaa gactgcttac 600

tattctttct acttgcctgt cgcattggcc atgtacgttg ccggtatcac ggatgaaaag 660

gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca aattcaagat 720

gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780

gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc agaacaaaga 840

aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900

attttcaatg acttgaaaat tgaacagcta taccacgaat atgaagagtc tattgccaag 960

gatttgaagg ccaaaatttc tcaggtcgat gagtctcgtg gcttcaaagc tgatgtctta 1020

actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaatag 1059

<210> 4

<211> 1011

<212> DNA

<213> （异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi）

<400> 4

atgacgacaa atcgtaagga cgagcatatc ctctatgccc ttgagcagaa aagttcctat 60

aatagctttg atgaggtgga gctgattcat tcttccttgc ctctttacaa tctggatgaa 120

atcgatcttt cgacagagtt tgctggtcgg aagtgggact ttccttttta tatcaatgcc 180

atgactggtg gaagtaataa gggaagagaa atcaatcaaa agctggctca ggtggcggaa 240

tcctgtggta ttttatttgt aacgggttct tatagcgcag ccctcaaaaa tccaacggat 300

gattcttttt ctgtcaagtc tagtcatccc aatctcctcc ttggaaccaa tattggattg 360

gacaagcctg tcgagttagg acttcagact gtagaagaga tgaatcctgt tctattgcaa 420

gtgcatgtca atgtcatgca ggaattactc atgcccgagg gagaaaggaa gtttagaagc 480

tggcaatcgc atctagcaga ttatagcaag caaattcccg ttcctattgt cctcaaggaa 540

gtgggctttg gaatggatgc caagacaatc gaaagagcct atgaattcgg tgttcgtaca 600

gtggacctat cgggtcgtgg tggcaccagc tttgcctata tcgaaaaccg tcgtagtggc 660

cagcgtgatt acctcaatca atggggtcag tctaccatgc aggcccttct caatgcccaa 720

gaatggaaag ataaggtcga actcttggtt agtggagggg ttcggaatcc gctggatatg 780

attaagtgct tggtttttgg tgctaaggct gtgggattgt cacgaaccgt tctggaattg 840

gttgaaacct acacagttga agaagtgatt ggcattgttc aaggctggaa agcagatcta 900

cgcttgatta tgtgttccct taactgtgcc accatagcag atctacaaaa agtagactat 960

cttctttatg gaaaattaaa agaagcaaat gatcagatga aaaaggcgta a 1011

<210> 5

<211> 2412

<212> DNA

<213> （乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE）

<400> 5

atgaaaacag tagttattat tgatgcatta cgaacaccaa ttggaaaata taaaggcagc 60

ttaagtcaag taagtgccgt agacttagga acacatgtta caacacaact tttaaaaaga 120

cattccacta tttctgaaga aattgatcaa gtaatctttg gaaatgtttt acaagctgga 180

aatggccaaa atcccgcacg acaaatagca ataaacagcg gtttgtctca tgaaattccc 240

gcaatgacgg ttaatgaggt ctgcggatca ggaatgaagg ccgttatttt ggcgaaacaa 300

ttgattcaat taggagaagc ggaagtttta attgctggcg ggattgagaa tatgtcccaa 360

gcacctaaat tacaacgatt taattacgaa acagaaagct acgatgcgcc tttttctagt 420

atgatgtacg atgggttaac ggatgccttt agtggtcaag caatgggctt aactgctgaa 480

aatgtggccg aaaagtatca tgtaactaga gaagagcaag atcaattttc tgtacattca 540

caattaaaag cagctcaagc acaagcagaa gggatattcg ctgacgaaat agccccatta 600

gaagtgtcag gaacgcttgt ggagaaagat gaagggattc gccctaattc gagcgttgag 660

aagctaggaa cgcttaaaac agtttttaaa gaagacggta ctgtaacagc agggaatgca 720

tcaaccatta atgatggggc ttctgctttg attattgctt cacaagaata tgccgaagca 780

cacggtcttc cttatttagc tattattcga gacagtgtgg aagtcggtat tgatccagcc 840

tatatgggaa tttcgccgat taaagccatt caaaaactgt tagcgcgcaa tcaacttact 900

acggaagaaa ttgatctgta tgaaatcaac gaagcatttg cagcaacttc aatcgtggtc 960

caaagagaac tggctttacc agaggaaaag gtcaacattt atggtggcgg tatttcatta 1020

ggtcatgcga ttggtgccac aggtgctcgt ttattaacga gtttaagtta tcaattaaat 1080

caaaaagaaa agaaatatgg agtggcttct ttatgtattg gcggtggctt aggactcgct 1140

atgctactag agagacctca gcaaaaaaaa aacagccgat tttatcaaat gagtcctgag 1200

gaacgcctgg cttctcttct taatgaaggc cagatttctg ctgatacaaa aaaagaattt 1260

gaaaatacgg ctttatcttc gcagattgcc aatcatatga ttgaaaatca aatcagtgaa 1320

acagaagtgc cgatgggcgt tggcttacat ttaacagtgg acgaaactga ttatttggta 1380

ccaatggcga cagaagagcc ctcagtgatt gcggctttga gtaatggtgc aaaaatagca 1440

caaggattta aaacagtgaa tcaacaacgc ttaatgcgtg gacaaatcgt tttttacgat 1500

gttgcagatc ccgagtcatt gattgataaa ctacaagtaa gagaagcgga aatttttcaa 1560

caagcagagt taagttatcc atctatcgta aaacggggcg gcggcttaag agatttgcag 1620

tatcgtgctt ttgatgaatc atttatatct gtcgactttt tagtagatgt taaggatgca 1680

atgggggcaa atatcgttaa cgctatgttg gaaggtgtgg tcgagttgtt ccgtgaatgg 1740

tttgcggagc aaaaaatttt attcagtatt ttaagtaatt atgccacgga gtcggttgtt 1800

acgatgaaaa cggctattcc agtttcacgt ttaagtaagg ggagcaatgg ccgggaaatt 1860

gctgaaaaaa ttgttttagc ttcacgctat gcttcattag atccttatcg ggcagtcacg 1920

cataacaaag gaatcatgaa tggcattgaa gctgtagttt tagctacagg aaatgataca 1980

cgcgctgtta gcgcttcttg tcatgctttt gcggtgaagg aaggtcgcta ccaaggcttg 2040

actagttgga cgctggatgg cgaacaacta attggtgaaa tttcagttcc gcttgcttta 2100

gccacggttg gcggtgccac aaaagtctta cctaaatctc aagcagccgc tgatttgtta 2160

gcagtgacgg atgcaaaaga actaagtcga gtagtagcgg ctgttggttt ggcacaaaat 2220

ttagcggcgt tacgggcctt agtctctgaa ggaattcaaa aaggacacat ggctctacaa 2280

gcacgttctt tagcgatgac ggtcggagct actggtaaag aagttgaggc agtcgctcaa 2340

caattaaaac gtcaaaaaac gatgaaccaa gaccgagcct tggctatttt aaatgattta 2400

agaaaacaat aa 2412

<210> 6

<211> 1152

<212> DNA

<213> （3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS）

<400> 6

atgacaattg ggattgataa aattagtttt tttgtgcccc cttattatat tgatatgacg 60

gcactggctg aagccagaaa tgtagaccct ggaaaatttc atattggtat tgggcaagac 120

caaatggcgg tgaacccaat cagccaagat attgtgacat ttgcagccaa tgccgcagaa 180

gcgatcttga ccaaagaaga taaagaggcc attgatatgg tgattgtcgg gactgagtcc 240

agtatcgatg agtcaaaagc ggccgcagtt gtcttacatc gtttaatggg gattcaacct 300

ttcgctcgct ctttcgaaat caaggaagct tgttacggag caacagcagg cttacagtta 360

gctaagaatc acgtagcctt acatccagat aaaaaagtct tggttgtagc agcagatatt 420

gcaaaatatg gattaaattc tggcggtgag cctacacaag gagctggggc ggttgcaatg 480

ttagttgcta gtgaaccgcg catcttggct ttaaaagagg ataatgtgat gctgacgcaa 540

gatatctatg acttttggcg tccaacaggc catccgtatc ctatggtcga tggtcctttg 600

tcaaacgaaa cctacatcca atcttttgcc caagtctggg atgaacataa aaaaagaacc 660

ggtcttgatt ttgcagatta tgatgcttta gcgttccata ttccttacac aaaaatgggc 720

aaaaaagcct tattagcaaa aatctccgac caaactgaag cagaacagga acgaatttta 780

gcccgttatg aagaaagcat cgtctatagt cgtcgcgtag gaaacttgta tacgggttca 840

ctttatctgg gactcatttc ccttttagaa aatgcaacga ctttaaccgc aggcaatcaa 900

attgggttat tcagttatgg ttctggtgct gtcgctgaat ttttcactgg tgaattagta 960

gctggttatc aaaatcattt acaaaaagaa actcatttag cactcctgga taatcggaca 1020

gaactttcta tcgctgaata tgaagccatg tttgcagaaa ctttagacac agacattgat 1080

caaacgttag aagatgaatt aaaatatagt atttctgcta ttaataatac cgttcgctct 1140

tatcgaaact aa 1152

<210> 7

<211> 948

<212> DNA

<213> （甲羟戊酸激酶基因mvk）

<400> 7

gtgctcaaat tcagcaaaat tgaaaaactg ttgaggaata atatggtttc atgttctgcg 60

cccgggaaaa tctatctttt cggagaacat gcggttgttt acggagaaac cgcaatagcg 120

tgtgcagtag agttaaggac ccgggtgcgg gcggagttaa atgactccat aactatccag 180

tctcagatcg gcaggacagg tcttgatttt gaaaaacatc cctatgtctc tgcagtgatt 240

gaaaaaatga gaaaatctat ccccataaat ggtgtttttt taactgttga ttccgacatt 300

cctgttgggt cagggctcgg ctcatctgct gctgttacga ttgcaagcat aggagctctc 360

aacgaacttt tcggattcgg gctttcgctt caggaaattg cgaaactggg gcatgaaatt 420

gagataaaag ttcagggtgc agcgagccct actgacacct atgtttctac tttcggagga 480

gtcgttacca tccctgaaag gagaaagctt aagactcctg actgtggaat tgttataggg 540

gacaccggag ttttttcttc tacaaaagag cttgtggcaa acgtcaggca gctccgcgaa 600

agttaccctg atcttatcga acctcttatg acttctattg gcaaaatctc cagaatcggt 660

gagcaacttg tactttccgg ggactatgct tctattggca ggcttatgaa tgtaaatcag 720

ggactgcttg atgcacttgg agttaatatc cttgagcttt cacagcttat ctattctgca 780

agggcagcag gagctttcgg ggcaaaaatt actggagcgg gaggcggtgg ttgtatggtt 840

gcgctaactg caccggagaa atgtaatcag gtagcggaag ccattgcagg tgcggggggc 900

aaagtgacca ttacaaaacc cacggaacag gggttgaagg tcgattga 948

<210> 8

<211> 1008

<212> DNA

<213> （甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk）

<400> 8

atgattgctg ttaaaacttg cggaaaactc tatttggcag gtgaatatgc tattttagag 60

ccagggcagt tagctttgat aaaggatatt cccatctata tgagggctga gattgctttt 120

tctgatagct accgtatcta ttcagatatg tttgatttcg cagtggactt aaggcccaat 180

cctgactata gcttgattca agaaacgatt gctttgatgg gagacttcct cgctgttcgt 240

ggtcagaatt taagaccttt ttctctagaa atctgtggca aaatggaacg agaagggaaa 300

aagtttggtc taggttctag tggcagcgtc gttgtcttgg ttgtcaaggc tttactggct 360

ctctataatc tttcggttga tcagaatctc ttgttcaagc tgactagcgc tgtcttgctc 420

aagcgaggag acaatggttc catgggcgac cttgcctgta ttgtggcaga ggatttggtt 480

ctctaccagt catttgatcg ccagaaggtg gctgcttggt tagaagaaga aaacttggcg 540

acagttctgg agcgtgattg gggatttttt atctcacaag tgaaaccaac tttagaatgt 600

gatttcttag tgggatggac caaggaagtg gctgtatcga gtcacatggt ccagcaaatc 660

aagcaaaata tcaatcaaaa ttttttaact tcctcaaaag aaacggtggt ttctttggtc 720

gaagccttgg agcaggggaa agccgaaaaa gttatcgagc aagtagaagt agccagcaag 780

cttttagaag gcttgagtac agatgtttac acgcctttgc ttagacagtt gaaagaagcc 840

agtcaagatt tgcagaccgt tgccaagagt agtggtgctg gtggtggtga ctgtggcatc 900

gccctgagtt ttgatgcgca atcaaccgaa accttaaaaa atcgttgggc cgatctgggg 960

attgagctct tatatcaaga aaggatagga catgacgaca aatcgtaa 1008

<210> 9

<211> 954

<212> DNA

<213> （甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD）

<400> 9

atggatagag agcctgtaac agtacgttcc tacgcaaata ttgctattat caaatattgg 60

ggaaagaaaa aagaaaaaga gatggtgcct gctactagca gtatttctct aactttggaa 120

aatatgtata cagagacgac cttgtcgcct ttaccagcca atgtaacagc tgacgaattt 180

tacatcaatg gtcagctaca aaatgaggtc gagcatgcta agatgagtaa gattattgac 240

cgttatcgtc cagctggtga gggctttgtc cgtatcgata ctcaaaacaa tatgcctact 300

gcagcgggcc tgtcctcaag ttctagtggt ttgtccgccc tggtcaaggc ttgtaatgct 360

tatttcaagc ttggattgga tagaagtcag ttggcacagg aagccaaatt tgcctcaggc 420

tcttcttctc ggagttttta tggaccacta ggagcctggg ataaggatag tggagaaatt 480

taccctgtag agacagactt gaaactagct atgattatgt tggtgctaga ggacaagaaa 540

aaaccaatct ctagccgtga cgggatgaaa ctttgtgtgg aaacctcgac gacttttgac 600

gactgggttc gtcagtctga gaaggactat caggatatgc tgatttatct caaggaaaat 660

gattttgcca agattggaga attaacggag aaaaatgccc tggctatgca tgctacgaca 720

aagactgcta gtccagcctt ttcttatctg acggatgcct cttatgaggc tatggacttt 780

gtccgccagc ttcgtgagaa aggagaggcc tgctacttta ccatggatgc tggtcccaat 840

gttaaggtct tctgtcagga gaaagacttg gagcatttat cagaaatttt cggtcagcgt 900

tatcgcttga ttgtgtcaaa aacaaaggat ttgagtcaag atgattgctg ttaa 954

<210> 10

<211> 7513

<212> DNA

<213> （pfdiAES，不含载体骨架序列）

<400> 10

atggcgcaga ttagcaaatg cagcagcctg agcgcggaac tgaacgaaag cagcattatc 60

agccatcatc atggcaacct gtgggatgat gattttatcc agagcctgaa aagcagcaat 120

ggcgcgccgc agtatcatga acgcgcggcg aaactggtgg aagaaatcaa aaacctggtg 180

gtgagcgaaa tgaaagattg caacgatgat ctgattcgcc gcctgcagat ggtggatatt 240

tttgaatgcc tgggcattga tcgccatttt cagcatgaaa ttcaggtggc gctggattat 300

gtgtatcgct attggaacca gctggaaggc attggtattg gcagccgcga tagcctgatt 360

aaagatttta acgcgaccgc gttaggcttt cgcgcgttac gtctgcatcg ctataacgtg 420

agcagcgatg tgctggaaaa cttcaaaaac gagaacggcc agtttttttg cagcagcacc 480

gtggaagaaa aagaagtgcg ctgcatgctg accttatttc gcgcgagcga aattagcttt 540

ccgggcgaaa aagtgatgga tgaagcgaaa gcgtttacca ccgaatatct gaccaaagtg 600

ctgaccggcg tggatgtgac cgatgtgaac caaagcctgc tgcgcgaagt gaaatatgcg 660

ctggaatttc cgtggcattg cagcttacct cgttgggaag cgcgcagctt tattgaaatt 720

tgcggccaga acgatagctg gctgaaaagc attatgaaca aacgcgtgct ggaactggcg 780

aaactggatt ttaacatttt acagtgggcg catcatcgcg aactgcagtt actgagcagc 840

tggtggagcc agagcgatat tgcgcagcag aacttttatc gcaaacgcca cgtggaattt 900

tatctgtggg tggtgattgg cacctttgaa ccggaattta gcacctgccg cattaccttt 960

gcgaaaatta gcaccctgat gaccattctg gatgatctgt atgataccca tggcaccctg 1020

gaacagctga aaatttttac cgaaggcgtg aaacgctggg atctgagctt agtggatcgc 1080

ctgccggatt atatcaagat caccttcgag ttctttctga acaccagcaa cgaactgatt 1140

gcggaagtgg cgaaaaccca ggaacgcgat atgagcgcgt atattcgcaa aacctgggaa 1200

cgctatctgg aagcgtatct gcaggaagcg gaatggattg cggcgcgtca tgtgccgacc 1260

tttgatgagt atatgaagaa cggcattagc agcagcggca tgtgcattct gaacctgtat 1320

agcctgctgc tgatgggtca gttactgccg gatgatgtgc tggaacagat tcatagcccg 1380

agcaaaattc atgaactggt ggaattaacc gcgcgcctgg tggatgatag caaagatttc 1440

gaaacgaaaa aagtgggcgg cgaattagcg agcggcattg aatgctatgt gaaggataac 1500

ccggaatgca ccctggaaga tgcgagcaac catctgaacg gcctgctgga tctgaccgtg 1560

aaagaactga actgggaatt tgtgcgccat gatagcgtgg cgctgtgctt taaaaaattc 1620

gcgttcaacg tggcacgtgg cttacgcctg atttataaat atcgcgacgg ctttgatgtg 1680

agcaaccagg aaatgaagac ccatatcttc aagatcctga ttgatccgct gacctaagga 1740

tccgaattcg agctcggcgc gcctgcaggt cgacaagctt gcggccgcat aatgcttaag 1800

tcgaacagaa agtaatcgta ttgtacacgg ccgcataatc gaaattaata cgactcacta 1860

taggggaatt gtgagcggat aacaattccc catcttagta tattagttaa gtataagaag 1920

gagatataca tatgaaaaca gtagttatta ttgatgcatt acgaacacca attggaaaat 1980

ataaaggcag cttaagtcaa gtaagtgccg tagacttagg aacacatgtt acaacacaac 2040

ttttaaaaag acattccact atttctgaag aaattgatca agtaatcttt ggaaatgttt 2100

tacaagctgg aaatggccaa aatcccgcac gacaaatagc aataaacagc ggtttgtctc 2160

atgaaattcc cgcaatgacg gttaatgagg tctgcggatc aggaatgaag gccgttattt 2220

tggcgaaaca attgattcaa ttaggagaag cggaagtttt aattgctggc gggattgaga 2280

atatgtccca agcacctaaa ttacaacgat ttaattacga aacagaaagc tacgatgcgc 2340

ctttttctag tatgatgtac gatgggttaa cggatgcctt tagtggtcaa gcaatgggct 2400

taactgctga aaatgtggcc gaaaagtatc atgtaactag agaagagcaa gatcaatttt 2460

ctgtacattc acaattaaaa gcagctcaag cacaagcaga agggatattc gctgacgaaa 2520

tagccccatt agaagtgtca ggaacgcttg tggagaaaga tgaagggatt cgccctaatt 2580

cgagcgttga gaagctagga acgcttaaaa cagtttttaa agaagacggt actgtaacag 2640

cagggaatgc atcaaccatt aatgatgggg cttctgcttt gattattgct tcacaagaat 2700

atgccgaagc acacggtctt ccttatttag ctattattcg agacagtgtg gaagtcggta 2760

ttgatccagc ctatatggga atttcgccga ttaaagccat tcaaaaactg ttagcgcgca 2820

atcaacttac tacggaagaa attgatctgt atgaaatcaa cgaagcattt gcagcaactt 2880

caatcgtggt ccaaagagaa ctggctttac cagaggaaaa ggtcaacatt tatggtggcg 2940

gtatttcatt aggtcatgcg attggtgcca caggtgctcg tttattaacg agtttaagtt 3000

atcaattaaa tcaaaaagaa aagaaatatg gagtggcttc tttatgtatt ggcggtggct 3060

taggactcgc tatgctacta gagagacctc agcaaaaaaa aaacagccga ttttatcaaa 3120

tgagtcctga ggaacgcctg gcttctcttc ttaatgaagg ccagatttct gctgatacaa 3180

aaaaagaatt tgaaaatacg gctttatctt cgcagattgc caatcatatg attgaaaatc 3240

aaatcagtga aacagaagtg ccgatgggcg ttggcttaca tttaacagtg gacgaaactg 3300

attatttggt accaatggcg acagaagagc cctcagtgat tgcggctttg agtaatggtg 3360

caaaaatagc acaaggattt aaaacagtga atcaacaacg cttaatgcgt ggacaaatcg 3420

ttttttacga tgttgcagat cccgagtcat tgattgataa actacaagta agagaagcgg 3480

aaatttttca acaagcagag ttaagttatc catctatcgt aaaacggggc ggcggcttaa 3540

gagatttgca gtatcgtgct tttgatgaat catttatatc tgtcgacttt ttagtagatg 3600

ttaaggatgc aatgggggca aatatcgtta acgctatgtt ggaaggtgtg gtcgagttgt 3660

tccgtgaatg gtttgcggag caaaaaattt tattcagtat tttaagtaat tatgccacgg 3720

agtcggttgt tacgatgaaa acggctattc cagtttcacg tttaagtaag gggagcaatg 3780

gccgggaaat tgctgaaaaa attgttttag cttcacgcta tgcttcatta gatccttatc 3840

gggcagtcac gcataacaaa ggaatcatga atggcattga agctgtagtt ttagctacag 3900

gaaatgatac acgcgctgtt agcgcttctt gtcatgcttt tgcggtgaag gaaggtcgct 3960

accaaggctt gactagttgg acgctggatg gcgaacaact aattggtgaa atttcagttc 4020

cgcttgcttt agccacggtt ggcggtgcca caaaagtctt acctaaatct caagcagccg 4080

ctgatttgtt agcagtgacg gatgcaaaag aactaagtcg agtagtagcg gctgttggtt 4140

tggcacaaaa tttagcggcg ttacgggcct tagtctctga aggaattcaa aaaggacaca 4200

tggctctaca agcacgttct ttagcgatga cggtcggagc tactggtaaa gaagttgagg 4260

cagtcgctca acaattaaaa cgtcaaaaaa cgatgaacca agaccgagcc ttggctattt 4320

taaatgattt aagaaaacaa taacagggga cgacccccct ataaggaggt ataaaatgac 4380

aattgggatt gataaaatta gtttttttgt gcccccttat tatattgata tgacggcact 4440

ggctgaagcc agaaatgtag accctggaaa atttcatatt ggtattgggc aagaccaaat 4500

ggcggtgaac ccaatcagcc aagatattgt gacatttgca gccaatgccg cagaagcgat 4560

cttgaccaaa gaagataaag aggccattga tatggtgatt gtcgggactg agtccagtat 4620

cgatgagtca aaagcggccg cagttgtctt acatcgttta atggggattc aacctttcgc 4680

tcgctctttc gaaatcaagg aagcttgtta cggagcaaca gcaggcttac agttagctaa 4740

gaatcacgta gccttacatc cagataaaaa agtcttggtt gtagcagcag atattgcaaa 4800

atatggatta aattctggcg gtgagcctac acaaggagct ggggcggttg caatgttagt 4860

tgctagtgaa ccgcgcatct tggctttaaa agaggataat gtgatgctga cgcaagatat 4920

ctatgacttt tggcgtccaa caggccatcc gtatcctatg gtcgatggtc ctttgtcaaa 4980

cgaaacctac atccaatctt ttgcccaagt ctgggatgaa cataaaaaaa gaaccggtct 5040

tgattttgca gattatgatg ctttagcgtt ccatattcct tacacaaaaa tgggcaaaaa 5100

agccttatta gcaaaaatct ccgaccaaac tgaagcagaa caggaacgaa ttttagcccg 5160

ttatgaagaa agcatcgtct atagtcgtcg cgtaggaaac ttgtatacgg gttcacttta 5220

tctgggactc atttcccttt tagaaaatgc aacgacttta accgcaggca atcaaattgg 5280

gttattcagt tatggttctg gtgctgtcgc tgaatttttc actggtgaat tagtagctgg 5340

ttatcaaaat catttacaaa aagaaactca tttagcactc ctggataatc ggacagaact 5400

ttctatcgct gaatatgaag ccatgtttgc agaaacttta gacacagaca ttgatcaaac 5460

gttagaagat gaattaaaat atagtatttc tgctattaat aataccgttc gctcttatcg 5520

aaactaaacg aacctactca agcacaaata aggaggtacc acatgacgac aaatcgtaag 5580

gacgagcata tcctctatgc ccttgagcag aaaagttcct ataatagctt tgatgaggtg 5640

gagctgattc attcttcctt gcctctttac aatctggatg aaatcgatct ttcgacagag 5700

tttgctggtc ggaagtggga ctttcctttt tatatcaatg ccatgactgg tggaagtaat 5760

aagggaagag aaatcaatca aaagctggct caggtggcgg aatcctgtgg tattttattt 5820

gtaacgggtt cttatagcgc agccctcaaa aatccaacgg atgattcttt ttctgtcaag 5880

tctagtcatc ccaatctcct ccttggaacc aatattggat tggacaagcc tgtcgagtta 5940

ggacttcaga ctgtagaaga gatgaatcct gttctattgc aagtgcatgt caatgtcatg 6000

caggaattac tcatgcccga gggagaaagg aagtttagaa gctggcaatc gcatctagca 6060

gattatagca agcaaattcc cgttcctatt gtcctcaagg aagtgggctt tggaatggat 6120

gccaagacaa tcgaaagagc ctatgaattc ggtgttcgta cagtggacct atcgggtcgt 6180

ggtggcacca gctttgccta tatcgaaaac cgtcgtagtg gccagcgtga ttacctcaat 6240

caatggggtc agtctaccat gcaggccctt ctcaatgccc aagaatggaa agataaggtc 6300

gaactcttgg ttagtggagg ggttcggaat ccgctggata tgattaagtg cttggttttt 6360

ggtgctaagg ctgtgggatt gtcacgaacc gttctggaat tggttgaaac ctacacagtt 6420

gaagaagtga ttggcattgt tcaaggctgg aaagcagatc tacgcttgat tatgtgttcc 6480

cttaactgtg ccaccatagc agatctacaa aaagtagact atcttcttta tggaaaatta 6540

aaagaagcaa atgatcagat gaaaaaggcg taactcgagc gcccgacaca tattaaactc 6600

tacggttaac taaatggact ttccgcagca actcgaagcc tgcgttaagc aggccaacca 6660

ggcgctgagc cgttttatcg ccccactgcc ctttcagaac actcccgtgg tcgaaaccat 6720

gcagtatggc gcattattag gtggtaagcg cctgcgacct ttcctggttt atgccaccgg 6780

tcatatgttc ggcgttagca caaacacgct ggacgcaccc gctgccgccg ttgagtgtat 6840

ccacgcttac tcattaattc atgatgattt accggcaatg gatgatgacg atctgcgtcg 6900

cggtttgcca acctgccatg tgaagtttgg cgaagcaaac gcgattctcg ctggcgacgc 6960

tttacaaacg ctggcgttct cgattttaag cgatgccgat atgccggaag tgtcggaccg 7020

cgacagaatt tcgatgattt ctgaactggc gagcgccagt ggtattgccg gaatgtgcgg 7080

tggtcaggca ttagatttag acgcggaagg caaacacgta cctctggacg cgcttgagcg 7140

tattcatcgt cataaaaccg gcgcattgat tcgcgccgcc gttcgccttg gtgcattaag 7200

cgccggagat aaaggacgtc gtgctctgcc ggtactcgac aagtatgcag agagcatcgg 7260

ccttgccttc caggttcagg atgacatcct ggatgtggtg ggagatactg caacgttggg 7320

aaaacgccag ggtgccgacc agcaacttgg taaaagtacc taccctgcac ttctgggtct 7380

tgagcaagcc cggaagaaag cccgggatct gatcgacgat gcccgtcagt cgctgaaaca 7440

actggctgaa cagtcactcg atacctcggc actggaagcg ctagcggact acatcatcca 7500

gcgtaataaa taa 7513

<210> 11

<211> 3233

<212> DNA

<213> （pAdxsr，不含载体骨架序列）

<400> 11

atgagttttg atattgccaa atacccgacc ctggcactgg tcgactccac ccaggagtta 60

cgactgttgc cgaaagagag tttaccgaaa ctctgcgacg aactgcgccg ctatttactc 120

gacagcgtga gccgttccag cgggcacttc gcctccgggc tgggcacggt cgaactgacc 180

gtggcgctgc actatgtcta caacaccccg tttgaccaat tgatttggga tgtggggcat 240

caggcttatc cgcataaaat tttgaccgga cgccgcgaca aaatcggcac catccgtcag 300

aaaggcggtc tgcacccgtt cccgtggcgc ggcgaaagcg aatatgacgt attaagcgtc 360

gggcattcat caacctccat cagtgccgga attggtattg cggttgctgc cgaaaaagaa 420

ggcaaaaatc gccgcaccgt ctgtgtcatt ggcgatggcg cgattaccgc aggcatggcg 480

tttgaagcga tgaatcacgc gggcgatatc cgtcctgata tgctggtgat tctcaacgac 540

aatgaaatgt cgatttccga aaatgtcggc gcgctcaaca accatctggc acagctgctt 600

tccggtaagc tttactcttc actgcgcgaa ggcgggaaaa aagttttctc tggcgtgccg 660

ccaattaaag agctgctcaa acgcaccgaa gaacatatta aaggcatggt agtgcctggc 720

acgttgtttg aagagctggg ctttaactac atcggcccgg tggacggtca cgatgtgctg 780

gggcttatca ccacgctaaa gaacatgcgc gacctgaaag gcccgcagtt cctgcatatc 840

atgaccaaaa aaggtcgtgg ttatgaaccg gcagaaaaag acccgatcac tttccacgcc 900

gtgcctaaat ttgatccctc cagcggttgt ttgccgaaaa gtagcggcgg tttgccgagc 960

tattcaaaaa tctttggcga ctggttgtgc gaaacggcag cgaaagacaa caagctgatg 1020

gcgattactc cggcgatgcg tgaaggttcc ggcatggtcg agttttcacg taaattcccg 1080

gatcgctact tcgacgtggc aattgccgag caacacgcgg tgacctttgc tgcgggtctg 1140

gcgattggtg ggtacaaacc cattgtcgcg atttactcca ctttcctgca acgcgcctat 1200

gatcaggtgc tgcatgacgt ggcgattcaa aagcttccgg tcctgttcgc catcgaccgc 1260

gcgggcattg ttggtgctga cggtcaaacc catcagggtg cttttgatct ctcttacctg 1320

cgctgcatac cggaaatggt cattatgacc ccgagcgatg aaaacgaatg tcgccagatg 1380

ctctataccg gctatcacta taacgatggc ccgtcagcgg tgcgctaccc gcgtggcaac 1440

gcggtcggcg tggaactgac gccgctggaa aaactaccaa ttggcaaagg cattgtgaag 1500

cgtcgtggcg agaaactggc gatccttaac tttggtacgc tgatgccaga agcggcgaaa 1560

gtcgccgaat cgctgaacgc cacgctggtc gatatgcgtt ttgtgaaacc gcttgatgaa 1620

gcgttaattc tggaaatggc cgccagccat gaagcgctgg tcaccgtaga agaaaacgcc 1680

attatgggcg gcgcaggcag cggcgtgaac gaagtgctga tggcccatcg taaaccagta 1740

cccgtgctga acattggcct gccggacttc tttattccgc aaggaactca ggaagaaatg 1800

cgcgccgaac tcggcctcga tgccgctggt atggaagcca aaatcaaggc ctggctggca 1860

taacctgcag gtcgacaagc ttgcggccgc ataatgctta agtcgaacag aaagtaatcg 1920

tattgtacac ggccgcataa tcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg 1980

ataacaattc cccatcttag tatattagtt aagtataaga aggagatata catatgatga 2040

agcaactcac cattctgggc tcgaccggct cgattggttg cagcacgctg gacgtggtgc 2100

gccataatcc cgaacacttc cgcgtagttg cgctggtggc aggcaaaaat gtcactcgca 2160

tggtagaaca gtgcctggaa ttctctcccc gctatgccgt aatggacgat gaagcgagtg 2220

cgaaacttct taaaacgatg ctacagcaac agggtagccg caccgaagtc ttaagtgggc 2280

aacaagccgc ttgcgatatg gcagcgcttg aggatgttga tcaggtgatg gcagccattg 2340

ttggcgctgc tgggctgtta cctacgcttg ctgcgatccg cgcgggtaaa accattttgc 2400

tggccaataa agaatcactg gttacctgcg gacgtctgtt tatggacgcc gtaaagcaga 2460

gcaaagcgca attgttaccg gtcgatagcg aacataacgc catttttcag agtttaccgc 2520

aacctatcca gcataatctg ggatacgctg accttgagca aaatggcgtg gtgtccattt 2580

tacttaccgg gtctggtggc cctttccgtg agacgccatt gcgcgatttg gcaacaatga 2640

cgccggatca agcctgccgt catccgaact ggtcgatggg gcgtaaaatt tctgtcgatt 2700

cggctaccat gatgaacaaa ggtctggaat acattgaagc gcgttggctg tttaacgcca 2760

gcgccagcca gatggaagtg ctgattcacc cgcagtcagt gattcactca atggtgcgct 2820

atcaggacgg cagtgttctg gcgcagctgg gggaaccgga tatgcgtacg ccaattgccc 2880

acaccatggc atggccgaat cgcgtgaact ctggcgtgaa gccgctcgat ttttgcaaac 2940

taagtgcgtt gacatttgcc gcaccggatt atgatcgtta tccatgcctg aaactggcga 3000

tggaggcgtt cgaacaaggc caggcagcga cgacagcatt gaatgccgca aacgaaatca 3060

ccgttgctgc ttttcttgcg caacaaatcc gctttacgga tatcgctgcg ttgaatttat 3120

ccgtactgga aaaaatggat atgcgcgaac cacaatgtgt ggacgatgtg ttatctgttg 3180

atgcgaacgc gcgtgaagtc gccagaaaag aggtgatgcg tctcgcaagc tga 3233

<210> 12

<211> 2939

<212> DNA

<213> （pTmpkD，不含载体骨架序列）

<400> 12

gtgctcaaat tcagcaaaat tgaaaaactg ttgaggaata atatggtttc atgttctgcg 60

cccgggaaaa tctatctttt cggagaacat gcggttgttt acggagaaac cgcaatagcg 120

tgtgcagtag agttaaggac ccgggtgcgg gcggagttaa atgactccat aactatccag 180

tctcagatcg gcaggacagg tcttgatttt gaaaaacatc cctatgtctc tgcagtgatt 240

gaaaaaatga gaaaatctat ccccataaat ggtgtttttt taactgttga ttccgacatt 300

cctgttgggt cagggctcgg ctcatctgct gctgttacga ttgcaagcat aggagctctc 360

aacgaacttt tcggattcgg gctttcgctt caggaaattg cgaaactggg gcatgaaatt 420

gagataaaag ttcagggtgc agcgagccct actgacacct atgtttctac tttcggagga 480

gtcgttacca tccctgaaag gagaaagctt aagactcctg actgtggaat tgttataggg 540

gacaccggag ttttttcttc tacaaaagag cttgtggcaa acgtcaggca gctccgcgaa 600

agttaccctg atcttatcga acctcttatg acttctattg gcaaaatctc cagaatcggt 660

gagcaacttg tactttccgg ggactatgct tctattggca ggcttatgaa tgtaaatcag 720

ggactgcttg atgcacttgg agttaatatc cttgagcttt cacagcttat ctattctgca 780

agggcagcag gagctttcgg ggcaaaaatt actggagcgg gaggcggtgg ttgtatggtt 840

gcgctaactg caccggagaa atgtaatcag gtagcggaag ccattgcagg tgcggggggc 900

aaagtgacca ttacaaaacc cacggaacag gggttgaagg tcgattgagg aggcagatca 960

aatgattgct gttaaaactt gcggaaaact ctatttggca ggtgaatatg ctattttaga 1020

gccagggcag ttagctttga taaaggatat tcccatctat atgagggctg agattgcttt 1080

ttctgatagc taccgtatct attcagatat gtttgatttc gcagtggact taaggcccaa 1140

tcctgactat agcttgattc aagaaacgat tgctttgatg ggagacttcc tcgctgttcg 1200

tggtcagaat ttaagacctt tttctctaga aatctgtggc aaaatggaac gagaagggaa 1260

aaagtttggt ctaggttcta gtggcagcgt cgttgtcttg gttgtcaagg ctttactggc 1320

tctctataat ctttcggttg atcagaatct cttgttcaag ctgactagcg ctgtcttgct 1380

caagcgagga gacaatggtt ccatgggcga ccttgcctgt attgtggcag aggatttggt 1440

tctctaccag tcatttgatc gccagaaggt ggctgcttgg ttagaagaag aaaacttggc 1500

gacagttctg gagcgtgatt ggggattttt tatctcacaa gtgaaaccaa ctttagaatg 1560

tgatttctta gtgggatgga ccaaggaagt ggctgtatcg agtcacatgg tccagcaaat 1620

caagcaaaat atcaatcaaa attttttaac ttcctcaaaa gaaacggtgg tttctttggt 1680

cgaagccttg gagcagggga aagccgaaaa agttatcgag caagtagaag tagccagcaa 1740

gcttttagaa ggcttgagta cagatgttta cacgcctttg cttagacagt tgaaagaagc 1800

cagtcaagat ttgcagaccg ttgccaagag tagtggtgct ggtggtggtg actgtggcat 1860

cgccctgagt tttgatgcgc aatcaaccga aaccttaaaa aatcgttggg ccgatctggg 1920

gattgagctc ttatatcaag aaaggatagg acatgacgac aaatcgtaaa taggaggtaa 1980

tactcatgga tagagagcct gtaacagtac gttcctacgc aaatattgct attatcaaat 2040

attggggaaa gaaaaaagaa aaagagatgg tgcctgctac tagcagtatt tctctaactt 2100

tggaaaatat gtatacagag acgaccttgt cgcctttacc agccaatgta acagctgacg 2160

aattttacat caatggtcag ctacaaaatg aggtcgagca tgctaagatg agtaagatta 2220

ttgaccgtta tcgtccagct ggtgagggct ttgtccgtat cgatactcaa aacaatatgc 2280

ctactgcagc gggcctgtcc tcaagttcta gtggtttgtc cgccctggtc aaggcttgta 2340

atgcttattt caagcttgga ttggatagaa gtcagttggc acaggaagcc aaatttgcct 2400

caggctcttc ttctcggagt ttttatggac cactaggagc ctgggataag gatagtggag 2460

aaatttaccc tgtagagaca gacttgaaac tagctatgat tatgttggtg ctagaggaca 2520

agaaaaaacc aatctctagc cgtgacggga tgaaactttg tgtggaaacc tcgacgactt 2580

ttgacgactg ggttcgtcag tctgagaagg actatcagga tatgctgatt tatctcaagg 2640

aaaatgattt tgccaagatt ggagaattaa cggagaaaaa tgccctggct atgcatgcta 2700

cgacaaagac tgctagtcca gccttttctt atctgacgga tgcctcttat gaggctatgg 2760

actttgtccg ccagcttcgt gagaaaggag aggcctgcta ctttaccatg gatgctggtc 2820

ccaatgttaa ggtcttctgt caggagaaag acttggagca tttatcagaa attttcggtc 2880

agcgttatcg cttgattgtg tcaaaaacaa aggatttgag tcaagatgat tgctgttaa 2939

<210> 13

<211> 1863

<212> DNA

<213> （1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs）

<400> 13

atgagttttg atattgccaa atacccgacc ctggcactgg tcgactccac ccaggagtta 60

cgactgttgc cgaaagagag tttaccgaaa ctctgcgacg aactgcgccg ctatttactc 120

gacagcgtga gccgttccag cgggcacttc gcctccgggc tgggcacggt cgaactgacc 180

gtggcgctgc actatgtcta caacaccccg tttgaccaat tgatttggga tgtggggcat 240

caggcttatc cgcataaaat tttgaccgga cgccgcgaca aaatcggcac catccgtcag 300

aaaggcggtc tgcacccgtt cccgtggcgc ggcgaaagcg aatatgacgt attaagcgtc 360

gggcattcat caacctccat cagtgccgga attggtattg cggttgctgc cgaaaaagaa 420

ggcaaaaatc gccgcaccgt ctgtgtcatt ggcgatggcg cgattaccgc aggcatggcg 480

tttgaagcga tgaatcacgc gggcgatatc cgtcctgata tgctggtgat tctcaacgac 540

aatgaaatgt cgatttccga aaatgtcggc gcgctcaaca accatctggc acagctgctt 600

tccggtaagc tttactcttc actgcgcgaa ggcgggaaaa aagttttctc tggcgtgccg 660

ccaattaaag agctgctcaa acgcaccgaa gaacatatta aaggcatggt agtgcctggc 720

acgttgtttg aagagctggg ctttaactac atcggcccgg tggacggtca cgatgtgctg 780

gggcttatca ccacgctaaa gaacatgcgc gacctgaaag gcccgcagtt cctgcatatc 840

atgaccaaaa aaggtcgtgg ttatgaaccg gcagaaaaag acccgatcac tttccacgcc 900

gtgcctaaat ttgatccctc cagcggttgt ttgccgaaaa gtagcggcgg tttgccgagc 960

tattcaaaaa tctttggcga ctggttgtgc gaaacggcag cgaaagacaa caagctgatg 1020

gcgattactc cggcgatgcg tgaaggttcc ggcatggtcg agttttcacg taaattcccg 1080

gatcgctact tcgacgtggc aattgccgag caacacgcgg tgacctttgc tgcgggtctg 1140

gcgattggtg ggtacaaacc cattgtcgcg atttactcca ctttcctgca acgcgcctat 1200

gatcaggtgc tgcatgacgt ggcgattcaa aagcttccgg tcctgttcgc catcgaccgc 1260

gcgggcattg ttggtgctga cggtcaaacc catcagggtg cttttgatct ctcttacctg 1320

cgctgcatac cggaaatggt cattatgacc ccgagcgatg aaaacgaatg tcgccagatg 1380

ctctataccg gctatcacta taacgatggc ccgtcagcgg tgcgctaccc gcgtggcaac 1440

gcggtcggcg tggaactgac gccgctggaa aaactaccaa ttggcaaagg cattgtgaag 1500

cgtcgtggcg agaaactggc gatccttaac tttggtacgc tgatgccaga agcggcgaaa 1560

gtcgccgaat cgctgaacgc cacgctggtc gatatgcgtt ttgtgaaacc gcttgatgaa 1620

gcgttaattc tggaaatggc cgccagccat gaagcgctgg tcaccgtaga agaaaacgcc 1680

attatgggcg gcgcaggcag cggcgtgaac gaagtgctga tggcccatcg taaaccagta 1740

cccgtgctga acattggcct gccggacttc tttattccgc aaggaactca ggaagaaatg 1800

cgcgccgaac tcggcctcga tgccgctggt atggaagcca aaatcaaggc ctggctggca 1860

taa 1863

<210> 14

<211> 1197

<212> DNA

<213> （1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr）

<400> 14

atgaagcaac tcaccattct gggctcgacc ggctcgattg gttgcagcac gctggacgtg 60

gtgcgccata atcccgaaca cttccgcgta gttgcgctgg tggcaggcaa aaatgtcact 120

cgcatggtag aacagtgcct ggaattctct ccccgctatg ccgtaatgga cgatgaagcg 180

agtgcgaaac ttcttaaaac gatgctacag caacagggta gccgcaccga agtcttaagt 240

gggcaacaag ccgcttgcga tatggcagcg cttgaggatg ttgatcaggt gatggcagcc 300

attgttggcg ctgctgggct gttacctacg cttgctgcga tccgcgcggg taaaaccatt 360

ttgctggcca ataaagaatc actggttacc tgcggacgtc tgtttatgga cgccgtaaag 420

cagagcaaag cgcaattgtt accggtcgat agcgaacata acgccatttt tcagagttta 480

ccgcaaccta tccagcataa tctgggatac gctgaccttg agcaaaatgg cgtggtgtcc 540

attttactta ccgggtctgg tggccctttc cgtgagacgc cattgcgcga tttggcaaca 600

atgacgccgg atcaagcctg ccgtcatccg aactggtcga tggggcgtaa aatttctgtc 660

gattcggcta ccatgatgaa caaaggtctg gaatacattg aagcgcgttg gctgtttaac 720

gccagcgcca gccagatgga agtgctgatt cacccgcagt cagtgattca ctcaatggtg 780

cgctatcagg acggcagtgt tctggcgcag ctgggggaac cggatatgcg tacgccaatt 840

gcccacacca tggcatggcc gaatcgcgtg aactctggcg tgaagccgct cgatttttgc 900

aaactaagtg cgttgacatt tgccgcaccg gattatgatc gttatccatg cctgaaactg 960

gcgatggagg cgttcgaaca aggccaggca gcgacgacag cattgaatgc cgcaaacgaa 1020

atcaccgttg ctgcttttct tgcgcaacaa atccgcttta cggatatcgc tgcgttgaat 1080

ttatccgtac tggaaaaaat ggatatgcgc gaaccacaat gtgtggacga tgtgttatct 1140

gttgatgcga acgcgcgtga agtcgccaga aaagaggtga tgcgtctcgc aagctga 1197

<210> 15

<211> 45

<212> DNA

<213> （引物gibson-lgfsF）

<400> 15

tttaataagg agatatacca tggccatggc gcagattagc aaatg 45

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> （引物gibson-lgfsR）

<400> 16

cttgtcgacc tgcagcggat ccttaggtca gcggatcaat cagg 44

<210> 17

<211> 32

<212> DNA

<213> （引物dxr-NdeI-F）

<400> 17

aaacatatga tgaagcaact caccattctg gg 32

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> （引物dxr-KpnI-R）

<400> 18

aaaggtacct cagcttgcga gacgcat 27

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> （引物dxs-BamHI-F）

<400> 19

aaaggatcca atgagttttg atattgccaa atacccg 37

<210> 20

<211> 29

<212> DNA

<213> （引物dxs-SbfI-R）

<400> 20

aaactgcagg ttatgccagc caggccttg 29

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> （引物ispA-idi-F）

<400> 21

caattggata tcggccggca tgacgacaaa tcgtaaggac 40

<210> 22

<211> 45

<212> DNA

<213> （引物ispA-idi-R）

<400> 22

gcagcctagg ttaattaatt atttattacg ctggatgatg tagtc 45

<210> 23

<211> 44

<212> DNA

<213> （引物mvaE-BglⅡ-F）

<400> 23

aaaagatcta tgaaaacagt agttattatt gatgcattac gaac 44

<210> 24

<211> 47

<212> DNA

<213> （引物mvaE-XhoI-R）

<400> 24

aaactcgagt tattgttttc ttaaatcatt taaaatagcc aaggctc 47

<210> 25

<211> 45

<212> DNA

<213> （引物mvaS- BamHI-F）

<400> 25

aaaggatcca tgacaattgg gattgataaa attagttttt ttgtg 45

<210> 26

<211> 39

<212> DNA

<213> （引物mvaS- SalI-R）

<400> 26

aaagtcgact tagtttcgat aagagcgaac ggtattatt 39

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> （引物pmk-F）

<400> 27

atgattgctg ttaaaacttg cgg 23

<210> 28

<211> 26

<212> DNA

<213> （引物pmk-R）

<400> 28

ttacgatttg tcgtcatgtc ctatcc 26

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物mvk-F）

<400> 29

gtgctcaaat tcagcaaaat tgaaaaac 28

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> （引物mvk-R）

<400> 30

tcaatcgacc ttcaacccct g 21

<210> 31

<211> 26

<212> DNA

<213> （引物mvaD-F）

<400> 31

atggatagag agcctgtaac agtacg 26

<210> 32

<211> 28

<212> DNA

<213> （引物mvaD-R）

<400> 32

ttaacagcaa tcatcttgac tcaaatcc 28

Claims (10)

1.一种产长叶烯的基因工程菌，其为含有长叶烯合成代谢途径的相关基因的重组大肠杆菌；优选地，所述长叶烯合成的相关基因包括法尼基焦磷酸合成酶基因ispA和长叶烯合成酶基因lgfS。

2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA为来源于大肠杆菌JM109的内源性基因，并且其在重组大肠杆菌中过表达；优选地，所述法尼基焦磷酸合成酶基因ispA以大肠杆菌JM109基因组为模板扩增得到，其序列如SEQIDNO.2所示；和/或，所述长叶烯合成酶基因lgfS为来源于挪威云杉且经密码子优化的长叶烯合成酶基因lgfS，并且其在重组大肠杆菌中过表达；优选地，所述长叶烯合成酶基因lgfS基因的序列如SEQIDNO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述产长叶烯的基因工程菌为经过底盘改造的重组大肠杆菌；优选地，所述底盘改造包括优化内源MEP合成途径，其包括在重组大肠杆菌中过表达内源MEP合成途径中的关键酶基因1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr，以及在重组大肠杆菌中过表达来源于肺炎链球菌的异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶基因dxs来源于大肠杆菌JM109，其序列如SEQIDNO.13所示；和/或，所述1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构化酶基因dxr来源于大肠杆菌JM109，其序列如SEQIDNO.14所示；和/或，所述异戊烯基焦磷酸异构酶基因idi以肺炎链球菌基因组为模板扩增得到，其序列如SEQIDNO.4所示。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为经过代谢途径优化的重组大肠杆菌；所述代谢途径优化包括在重组大肠杆菌中过表达异源MVA途径的上游关键酶基因，以及在重组大肠杆菌中表达异源MVA途径的下游关键酶基因；优选地，所述异源MVA途径的上游关键酶基因包括乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS；和/或，所述异源MVA途径的下游关键酶基因包括甲羟戊酸激酶基因mvk、甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE和3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS均来源于粪肠球菌，其中，乙酰辅酶A乙酰基转移酶基因mvaE的序列如SEQIDNO.5所示，3-羟-3-甲基戊二酰辅酶A合酶基因mvaS的序列如SEQIDNO.6所示；和/或，所述甲羟戊酸激酶基因mvk来源于马氏八叠球菌，其序列如SEQIDNO.7所示；和/或，所述甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk和甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD均来源于肺炎链球菌，其中，甲羟戊酸-5-磷酸激酶基因pmk的序列如SEQIDNO.8所示，甲羟戊酸-5-二磷酸脱羧酶基因mvaD的序列如SEQIDNO.9所示。

7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为含有质粒pfdiAES(prsf-lgfs-idi-ispA-mvaES)、质粒pAdxsr(pACYC-dxs-dxr)和质粒pTmpkD(pTrc99a-mvk-pmk-mvaD)的重组大肠杆菌。

8.如权利要求1-7任意一项所述产长叶烯的基因工程菌的构建方法，其包括步骤A，构建含有长叶烯合成代谢途径的相关基因的产长叶烯的重组大肠杆菌；优选地，所述构建方法还包括步骤B，对产长叶烯的重组大肠杆菌进行底盘改造，获得经过底盘改造的产长叶烯的重组大肠杆菌；和/或，所述方法还包括步骤C，对产长叶烯的重组大肠杆菌进行代谢途径优化，获得经过代谢途径优化的产长叶烯的重组大肠杆菌。

9.如权利要求1-7中任意一项所述的基因工程菌或如权利要求8所述的方法构建获得的基因工程菌在生产长叶烯中的应用；优选地，所述应用包括将所述基因工程菌接入发酵培养基，并加入诱导剂IPTG，进行发酵培养，然后对所获得的发酵培养液进行分离纯化获得长叶烯；进一步优选地，所述发酵培养基包括M9发酵培养基、TB发酵培养基和LB发酵培养基中的一种或几种；更进一步优选地，所述发酵培养的温度为30-37℃；和/或，所述发酵培养的时间为24-48h；和/或，所述发酵培养的摇床转速为180-200rpm。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用还包括在发酵培养过程中加入长链正构烷烃进行双相萃取发酵；优选地，以发酵液总体积计的诱导剂的浓度为0.1-1.2mM；和/或，优选地，所述长链正构烷烃的加入量为发酵培养液体积的10％-15％；进一步优选地，在发酵培养过程中，加入诱导剂IPTG诱导2-4h后再加入长链正构烷烃进行双相萃取发酵；更进一步优选地，所述长链正构烷烃包括正壬烷和/或正癸烷。

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