CN114480242B - 一种用于MK-n生产的大肠杆菌工程菌及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于MK‑n生产的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌工程菌含有异源引入的甲羟戊酸途径相关基因以及异戊二烯基二磷酸合酶相关基因；所述甲羟戊酸途径相关基因包括HMGS基因、HMGR基因、SceMK基因、ScePMK基因、MVD基因和IDI基因；所述异戊二烯基二磷酸合酶相关基因包括EmGGPPS基因和EmOPPS基因。本发明构建的大肠杆菌工程菌能够稳定产生维生素K2，具有潜在的应用前景。这是目前首次在大肠杆菌里实现同时合成MK‑n(n=4,5,6,7,8)的研究。

Description

一种用于MK-n生产的大肠杆菌工程菌及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种用于MK-n生产的大肠杆菌工程菌的构建方法，属于合成生物学技术领域。
背景技术
维生素K2是一种具有强抗氧化性的甲萘醌系列衍生物，是人体的一种活化剂，在促进凝血功能、预防癌症、调节血糖、防止血管硬化、防治骨质疏松症等方面发挥着重要功能。目前，维生素K2合成常用的方法包括化学合成法以及微生物发酵法两种。化学法合成维生素K2需要严苛的催化条件、原料昂贵且副产物较多，因此，现阶段很难实现大规模的生产。而利用微生物发酵法生产维生素K2具有不受气候和季节影响、生产周期短、易于大规模培养等优势，是一种经济可行的研究方法，成为当前研究的热点。大肠杆菌是一种模式生物，其遗传背景清晰、生长周期短、基因工程操作技术较为成熟且存在内源性的MEP途径，可合成MK-8，这使其成为萜类化合物生物合成的研究热点。
维生素K2的同系物都是由一个相同的甲萘醌母环和含有不同异戊二烯单元个数的侧链组成，通常用MK-n表示，其中M代表甲萘琨，K代表维生素K，n表示异戊二烯残基的数量。甲萘醌进一步细分为短链甲萘醌(MK-4)和长链甲萘醌(MK-7、MK-8和MK-9)。所有k族维生素都具有相似的功能，但其药代动力学行为不同，因此它们具有生理意义。长链甲萘醌只占人类摄入量的10％，但吸收量接近90％，部分原因是生物半衰期较长。此前，更多的研究人员在对MK-7生物合成和功能的研究。黄杆菌作为短异戊烯基侧链MK-4、MK-5、MK-6的生产菌株，目前对其维生素K2合成途径研究较少。而短链的维生素K2在凝血实验中生物活性较高。
在自然界的生物体中合成异戊二烯侧链的途径有两条，即甲羟戊酸途径(MVA途径)和磷酸戊糖途径(MEP途径)。MVA途径主要存在于真核生物中，MEP途径主要存在于原核生物中。大肠杆菌自身存在MEP途径，可以产生萜类化合物前体IPP/DMAPP，但自身合成能力较差且积累量较少，因此产异戊二烯基侧链的能力受到限制。提高大肠杆菌产异戊二烯基侧链的效率通常可采用两种方式：强化MEP途径和异源引入MVA途径。然而，有研究表明，在大肠杆菌中引入异源的MVA途径比强化其自身的MEP途径更能有效提高萜类化合物前体的产量，进而使大肠杆菌合成异戊二烯基侧链的效率更高。
黄杆菌是一种原核生物，却被鉴定到存在MVA途径，通过黄杆菌发酵生产的维生素K2包括MK-4、MK-5、MK-6及MK-7。迄今为止，尚无文献报道将黄杆菌的MVA途径在大肠杆菌中异源表达，且未见在大肠杆菌中合成了MK4和MK6的相关报道。因此，将在黄杆菌中已经鉴定到的MVA途径的相关基因及异戊二烯基二磷酸合酶基因引入大肠杆菌中，有些未在黄杆菌中鉴定到MVA途径的相关基因则来源于酿酒酵母。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于MK-n生产的大肠杆菌工程菌的构建方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种用于MK-n生产的大肠杆菌工程菌，所述大肠杆菌工程菌含有异源引入的甲羟戊酸途径相关基因以及异戊二烯基二磷酸合酶相关基因；所述甲羟戊酸途径相关基因包括HMGS基因、HMGR基因、SceMK基因、ScePMK基因、MVD基因和IDI基因；所述异戊二烯基二磷酸合酶相关基因包括EmGGPPS基因和EmOPPS基因。
优选的技术方案为：所述HMGR基因、HMGS基因、MVD基因、IDI基因、EmGGPPS基因和EmOPPS基因均来源于黄杆菌，而SceMK基因和ScePMK基因则来源于酿酒酵母。
优选的技术方案为：原始菌株是大肠杆菌BL21(DE3)，为Lon蛋白水解酶、ompT外膜蛋白水解酶缺陷型菌株；基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)，染色体上携带由lacUV5启动子控制的T7RNA聚合酶基因。
优选的技术方案为：所述HMGS基因为将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的基因；所述HMGR基因为将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原为甲羟戊酸的基因；所述SceMK基因为将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因；所述ScePMK基因为将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因；所述MVD基因为将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊烯基焦磷酸的基因；所述IDI基因为IPP异构酶基因，实现异戊烯基焦磷酸与其异构体3，3-二甲基丙烯基焦磷酸之间的相互转换；所述EmGGPPS基因和EmOPPS基因为催化维生素K2异戊二烯基侧链合成的基因。
优选的技术方案为：所述大肠杆菌工程菌含有PETA-3、PACD-2和PETD-2三个质粒；所述质粒PACD-2以pACYCDuet-1为骨架，自身携带有lacI基因和氯霉素抗性基因，组装有HMGS基因、HMGR基因、SceMK基因和IDI基因，复制子为P15A复制子，启动子为T7强启动子；所述质粒PETA-3以pET28a为骨架，自身携带有lacI基因和卡那霉素抗性基因，组装有ScePMK基因和MVD基因，复制子为pBR322 ori复制子，启动子为T7强启动子；所述质粒PETD-2以pETDuet-1为骨架，自身携带有lacI基因和氨苄青霉素抗性基因，组装有EmGGPPS基因和EmOPPS基因，复制子为pBR322质粒来源的ColE1复制子，启动子为T7强启动子。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种利用大肠杆菌工程菌生产MK-n的方法，包括以下步骤：先将构建好的大肠杆菌工程菌株接种到LB培养基中，过夜培养，再将该活化后的大肠杆菌菌株接入含MgSO4的LGN培养基中，待OD600达到0.6-1.0时加入0.05mM的IPTG进行诱导，诱导的条件为：28-32℃，150-200rpm，20-28h；待诱导4小时后，向其中加入终浓度为50mg/L的1,4-二羟基-2-萘甲酸。
优选的技术方案为：所述LGN培养基中，含有10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物，5g/LNacl，5g/L甘油，10g/L硝酸钠和0.15g/L MgSO4。
优选的技术方案为：所述LGN培养基中还含有50μg/mL氯霉素、50μg/mL卡那霉素、100μg/mL氨苄青霉素。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
1、本发明利用外源组合而来的甲羟戊酸途径强化了大肠杆菌的异戊烯基侧链合成能力。利用外源的EmGGPPS基因和EmOPPS基因增加了大肠杆菌中合成的维生素K2同系物的种类，使得大肠杆菌中除了合成MK8，还能合成MK4、MK5、MK6和MK7，值得注意的是，这是首次在大肠杆菌中实现了MK4和MK6合成。
2、本发明构建的大肠杆菌工程菌能够稳定产生维生素K2，具有潜在的应用前景。这是目前首次在大肠杆菌里实现同时合成MK-n(n＝4,5,6,7,8)的研究。
附图说明
图1是SDS-PAGE分析EmGGPPS和EmOPPS重组蛋白的结果。GB1-OPPS和MBP-GGPPS的分子量分别为45.9kDa和80.4kDa。
图2为J01菌株产生的EmOPPS在体内和体外的酶促测定。(A，B)GB1-EmOPPS与底物法尼基二磷酸(FPP)，异戊烯基二磷酸(IPP)30℃孵育两小时，随后水解酶催化产物，再经LC-MS分析。(C，D)LC-MS分析菌株J01菌株可以产生MK-n(n＝6,7,8)。水平图(A，C)是指HPLC的结果，垂直图(B，D)是指质谱。
图3是大肠杆菌J02菌株维生素K2种类鉴定示意图。大肠杆菌菌株J02具有生物合成MK-4、MK-5、MK-6、MK-7、MK-8的能力。MK-4(m/z＝445)、MK-5(m/z＝513)、MK-6(m/z＝581)、MK-7(m/z＝649)和MK-8(m/z＝717)。
图4不同发酵条件对MK-n产物的影响。LGN代表Luria-Bertani-甘油-硝酸钠培养基,Mini代表基础培养基。
图5是甲羟戊酸内脂的鉴定结果。
图6是不同菌株发酵后维生素K2产量的检测图。
图7是本发明构建的大肠杆菌工程菌维生素K2合成示意图。大肠杆菌产生的甲羟戊酸可以分泌到细胞外。此外，之前的一项研究还表明，MVA补料策略可以更广泛地用于类异戊二烯的生物合成。维生素K2作为一种重要的类异戊二烯产品；它的异戊烯基侧链需要甲羟戊酸MVA途径来提供前体作为底物。此外，大肠杆菌都具有独立生产MK-n(n＝4,5,6,7,8)的能力。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本实施例所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1-7。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整。提供以下实施例以便更好地理解本发明，而非限制本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买所得。
实施例1：一种用于MK-n生产的大肠杆菌工程菌及其构建方法
外源MVA途径和异戊二烯基二磷酸合酶的质粒构建：
质粒pACYCDuet-1的构建：
质粒PACD-2以pACYCDuet-1质粒为骨架，利用Gibson组装技术将HMGS和HMGR基因组装到MSC1的NcoI和BamHI位点之间生成质粒PACD-1，将SceMK和IDI基因组装到NdeI和KpnI位点之间形成质粒PACD-2。
质粒PETA-2的构建：是以pET28a为骨架，利用Gibson组装技术将ScePMK和MVD基因组装到NcoI和BamhI位点之间形成PETA-2。
质粒PETA-3的构建:利用Gibson组装技术将EmIDI和EmMenA基因组装到NcoI和BamhI位点之间形成PETA-3。
质粒PETD-2的构建：
质粒PETD-2以pETDuet-1为骨架，利用Gibson组装技术将MBP和GGPPS基因组装到MSC1的NcoI和BamhI位点之间形成质粒PETD-1，将GB1和OPPS基因组装到MSC2的NdeI和KpnI位点之间形成菌株PETD-2。
质粒构建：
所有使用的菌株和质粒列于表2。引物序列在表2中提供。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增伊丽莎白菌F2基因组中维生素K2生物合成的相关基因。PCR条件如下：94℃初始变性5min，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环，最后在72℃延伸10分钟。Pfu PCR MasterMix(天根，北京，中国)用于DNA扩增。四个基因(EmHMGR、EmHMGS、EmPVD和EmIDI)来源于伊丽莎白菌F2以及来自酿酒酵母的ScePMK和SceMK，被构建成两个质粒PETA-2、PACD-2。扩增片段EmHMGR和EmHMGS也被克隆到pACYCDuet-1载体的NcoI和BamHI位点以形成PACD-1。然后，将SceMK和EmIDI克隆到PACD-1的NdeI和KpnI位点，形成PACD-2。扩增片段EmPVD和ScePMK也被克隆到pET28a载体的NcoI和BamHI位点，形成载体PETA-2。来自大肠杆菌K12 EcMenA基因和来自伊丽莎白菌F2的EmMenE基因插入到PETA-2质粒的XhoI和SalI位点上构建形成PETA-3。使用Gibson组装试剂盒构建重组质粒。NEBuilder HiFi DNAMaster组装试剂盒购自New England Bio Labs(NEB，北京，中国)。通过在OD600＝0.6时添加50μM IPTG来诱导蛋白质表达。质粒小量制备试剂盒和DNA基因组提取试剂盒购自SangonBiotech(中国上海)
菌株构建：
我们构建了质粒PETA-1(pET-28a-GB1-EmOPPS)将其转化到大肠杆菌BL21中，以产生菌株J01。在本研究中，我们将EmGGPPS克隆到pETDuet-1中形成质粒pETD-1，然后将该质粒转化到大肠杆菌中。随后，将扩增的GB1-EmOPPS片段也克隆pETDuet-1-MBP-EmGGPPS载体中，形成pETD-2。最后，pETD-2载体转化为大肠杆菌中形成J02。
质粒：PETA-2和pACD2。然后将它们引入J02菌株以形成菌株H01。来自大肠杆菌K12的EcMenA和来自伊丽莎白菌F2的EmMenE基因被构建到质粒PETA-2中以生成质粒PETA-3。将PACD-2和PETA-3引入菌株J02以产生大肠杆菌菌株H02。
实施例中所用质粒见表1：
实施例中所用引物见表2：
EmOOPPS酶活性鉴定：
EmOPPS的体外酶活性实验如所前所述。简而言之，纯化后的EmGGPPS加入到缓冲液(100mmol L-1HEPES、5mmol L-1MgCl2、10mmol L-1KCl、pH 7.5、IPP和DMAPP作为底物)中在28℃下进行体外酶促反应。2小时后，将溶液与200μL的0.2mol L-1Tris-HCl(pH 9.5)混合，并在其中加入牛肠碱性磷酸酶(20mg mL-1,>10DEA units mg-1,Sigma-Aldrich)和2单位虾碱性磷酸酶(1单位/微升；TaKaRa，高松，日本)，随后在30℃下孵育过夜，目的是将磷酸盐产物水解成相应的醇。酶水解后，混合物用正己烷萃取并通过GC-MS(Agilent)分析。
大肠杆菌J01表达EmOPPS蛋白和大肠杆菌J02同时表达EmGGPPS和EmOPPS蛋白如图1。酶的活性鉴定结果如图2(A,B)所示。EmOPPS可以催化IPP和DMAPP生成C25和C30。为了进一步检测在体内酶活性，我们利用了大肠杆菌的维生素K2生物合成系统。在本研究中，异源引入EmOPPS的LC-MS显示了菌株J01可以生物合成MK-6、MK-7和MK-8三种产物(图2C和D)。结合体外的酶活性试验结果，我们证实了黄杆菌生物合成MK-6(m/z＝581)与EmOPPS有关。因此，本实验结果表明，EmOPPS在体内和体外均可以合成六戊烯基二磷酸(C30)。
维生素K2生产菌株的构建：
发酵培养基：向基础培养基(10g/L葡萄糖、14g/L KH2PO4、4g/L[NH4]2HPO4和1.8g/L一水柠檬酸)补充0.15g/L MgSO4。Luria-Bertani-甘油-硝酸钠(LGN)培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L NaCl、5g/L甘油和10g/L硝酸钠)也添加了0.15克/升MgSO4。大肠杆菌在密封的摇瓶中转速为100rpm摇床上进行微厌氧生长，温度为37℃。在含有450mL培养基(基础培养基/LGN培养基)的500mL摇瓶中培养26-28小时。对于有氧培养，大肠杆菌在含有100mL培养基(基础/LGN培养基)的500mL带挡板烧瓶中生长，并在37℃下以250rpm的速度剧烈摇晃。发酵72h后，测量发酵结束后干菌体重量(DCW)作为生物量。简而言之，收集发酵液并在12000g下离心5分钟，弃去上清液。用无菌蒸馏水洗涤湿细胞并冷冻干燥至恒重。
维生素K2的检测：维生素K2的提取和测量参照过去实验室Wei等人报道[9,10]。冷冻干燥后的菌体经过甲醇萃取，通过0.2um有机滤膜过滤后使用岛津高效液相色谱仪(Essensia LC-6)检测。色谱仪配备Shim-pack VP-ODS C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，Shimadzu)。流动相由甲醇和二氯甲烷(4:1,v/v)组成，流速为1mL/min。柱温保持在35℃，UV-Vis检测器在248nm下工作。甲萘醌同系物使用配备有LTQ Orbitrap XL ETD分析仪的液相色谱质谱(LC-MS)系统分析样品产物。HPLC(高效液相色谱)系统分离样品，流速为250μL/min，流动相由甲醇(100％)组成。在正电喷雾电离(ESI)模式下，电喷雾电位为4.5kv，源温度为275℃。
EmGGGPS和EmOPPS构建在质粒pACYCDuet-1上形成PETD-2，其表达结果如图1所示。质粒PETD-2导入到大肠杆菌BL21中，获得菌株J02，将质粒PETA-2,PACD-2导入到菌株J02中，获得菌株H01。实施例中所用菌株见表3。菌株J02具有生物合成MK-n(n＝4,5,6,7,8)(图.3)。在这里，我们同时进行了两种不同呼吸类型和不同发酵培养基对大肠杆菌中产MK-n的影响。在图4中，大肠杆菌在微厌氧条件下(LGN培养基，C1)分别可以产生MK-4(3.3％)、MK-6(51.6％)、MK-8(45.1％)。在微厌氧条件(Mini medium,C3)下分别产生MK-5(0.9％)、MK-6(74.6％)、MK-8(24.4％)。为了研究厌氧条件对大肠杆菌中MK-n产量的影响，还采用高效液相色谱法检测了使用LGN培养基(C2)下胞内产物MK-6(45.2％)、MK-7(22.3％)、MK-8(32.3％)。此外，MK-6(16.6％)、MK-8(83.4％)在厌氧条件(Mini medium,C4)下产生。从以上结果可以看出，黄杆菌来源的EmOPPS对大肠杆菌中MK-6的合成是有效的。此外，细胞内还有少量的MK-4、MK-5、MK-7，他们的比例较少。值得注意的是，HPLC仅检测到2到3个MK-n。由于HPLC的检测基线高于LC-MS，因此低浓度的MK-n可能未被检测到。尽管如此，从图4的四个图中，我们仍然知道含有pETD-2质粒的大肠杆菌具有合成MK-n(n＝4,5,6,7,8)、主要合成MK-6、MK-8产品，这是首次在大肠杆菌中同时合成一系列维生素K2。本实施案例也说明构建的大肠杆菌MK-n(n＝4,5,6,7,8)生产菌株在不同的培养条件下都可以稳定的产生MK-6。
提供前体供应增强维生素K2的生产
发酵培养基：向基础培养基(10g/L葡萄糖、14g/L KH2PO4、4g/L[NH4]2HPO4和1.8g/L一水柠檬酸)补充0.15g/L MgSO4。对于有氧培养，大肠杆菌在含有100mL培养基(基础培养基)的500mL带挡板烧瓶中生长，并在37℃下以250rpm的速度剧烈摇晃。发酵72h后，测量发酵结束后干菌体重量(DCW)作为生物量。简而言之，收集发酵液并在12000g下离心5分钟，弃去上清液。用无菌蒸馏水洗涤湿细胞并冷冻干燥至恒重。
维生素K2的检测：维生素K2的提取和测量参照过去实验室Wei等人报道。维生素K2分析通过高效液相色谱法(HPLC)使用eclipse plus C18柱(Shimadzu，Kyoto，Japan；250mm×4.6mm)和使用循环注射阀手动注射20μL样品。柱温保持在35℃。流动相由甲醇和二氯甲烷(4:1,v/v)组成，流速为1mL min-1。UV-Vis检测器在248nm下工作，用于检测甲萘醌。
将质粒PETA-3,PACD-2导入到菌株J02中，获得菌株H01。该菌株可以产生甲羟戊酸并且分泌到胞外(图.5)，增加前提底物使得维生素K2的产量获得了提升(图.4)。3摇瓶发酵生产维生素K2将质粒PETA-3、PACD-2导入到菌株J02中，获得菌株H02。MenA和IDI基因的引入进一步提高MK-n(n＝4,5,6,7,8)的产量，其产量达到4.5mg/L(图.6,7)。
表1质粒
Figure BDA0003531199860000071
表2：本实施例用到的引物
Figure BDA0003531199860000072
Figure BDA0003531199860000081
表3：菌株
Figure BDA0003531199860000082
参考文献
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以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。

Claims (4)

1.一种用于MK-n生产的大肠杆菌工程菌，其特征在于：所述大肠杆菌工程菌含有异源引入的甲羟戊酸途径相关基因以及异戊二烯基二磷酸合酶相关基因；所述甲羟戊酸途径相关基因包括HMGS基因、HMGR基因、SceMK基因、ScePMK基因、MVD基因和IDI基因；所述异戊二烯基二磷酸合酶相关基因包括EmGGPPS基因和EmOPPS基因；
所述HMGR基因、HMGS基因、MVD基因、IDI基因、EmGGPPS基因和EmOPPS基因均来源于黄杆菌，而SceMK基因和ScePMK基因则来源于酿酒酵母；
原始菌株是大肠杆菌BL21（DE3），为Lon蛋白水解酶、ompT外膜蛋白水解酶缺陷型菌株；基因型：F-ompThsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3)，染色体上携带由lacUV5启动子控制的T7RNA聚合酶基因；
所述HMGS基因为将乙酰乙酰辅酶A和乙酰辅酶A缩合为3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A的基因；所述HMGR基因为将3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原为甲羟戊酸的基因；所述SceMK基因为将甲羟戊酸磷酸化为甲羟戊酸-5-磷酸的基因；所述ScePMK基因为将甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化为甲羟戊酸-5-焦磷酸的基因；所述MVD基因为将甲羟戊酸-5-焦磷酸脱羧生成异戊烯基焦磷酸的基因；所述IDI基因为IPP异构酶基因，实现异戊烯基焦磷酸与其异构体3，3-二甲基丙烯基焦磷酸之间的相互转换；所述EmGGPPS基因和EmOPPS基因为催化维生素K2异戊二烯基侧链合成的基因；
所述大肠杆菌工程菌含有PETA-3、PACD-2和PETD-2三个质粒；所述质粒PACD-2以pACYCDuet-1为骨架，自身携带有lacI基因和氯霉素抗性基因，组装有HMGS基因、HMGR基因、SceMK基因和IDI基因，复制子为P15A复制子，启动子为T7强启动子；所述质粒PETA-3以pET28a为骨架，自身携带有lacI基因和卡那霉素抗性基因，组装有ScePMK基因和MVD基因，复制子为pBR322 ori复制子，启动子为T7强启动子；所述质粒PETD-2以pETDuet-1为骨架，自身携带有lacI基因和氨苄青霉素抗性基因，组装有EmGGPPS基因和EmOPPS基因，复制子为pBR322质粒来源的ColE1复制子，启动子为T7强启动子。
2.一种利用大肠杆菌工程菌生产MK-n的方法，其特征在于：包括以下步骤：先将权利要求1构建好的大肠杆菌工程菌接种到LB培养基中，过夜培养，再将该活化后的大肠杆菌工程菌接入含MgSO4的LGN培养基中，待OD600达到0 .6-1.0时加入0.05mM的IPTG进行诱导，诱导的条件为：28-32℃，150-200rpm，20-28h；待诱导4小时后，向其中加入终浓度为50mg/L的1,4-二羟基-2-萘甲酸。
3.根据权利要求2所述的利用大肠杆菌工程菌生产MK-n的方法，其特征在于：所述LGN培养基中，含有10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物，5g/LNaCl，5g/L 甘油，10g/L硝酸钠和0.15g/L MgSO4。
4.根据权利要求3所述的利用大肠杆菌工程菌生产MK-n的方法，其特征在于：所述LGN培养基中还含有50μg/mL氯霉素、50μg/mL卡那霉素、100μg/mL氨苄青霉素。
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