CN111201321A - 基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物及用其制备伸长的2-酮酸和c5-c10化合物的方法 - Google Patents

基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物及用其制备伸长的2-酮酸和c5-c10化合物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111201321A
CN111201321A CN201880057654.4A CN201880057654A CN111201321A CN 111201321 A CN111201321 A CN 111201321A CN 201880057654 A CN201880057654 A CN 201880057654A CN 111201321 A CN111201321 A CN 111201321A
Authority
CN
China
Prior art keywords
xaa
ala
gly
leu
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880057654.4A
Other languages
English (en)
Inventor
P·桑格哈尼
E·C·史乐
S·A·格林沃尔特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Dow Global Technologies LLC
Original Assignee
Dow Global Technologies LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dow Global Technologies LLC filed Critical Dow Global Technologies LLC
Publication of CN111201321A publication Critical patent/CN111201321A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01085—3-Isopropylmalate dehydrogenase (1.1.1.85)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/03—Acyl groups converted into alkyl on transfer (2.3.3)
    • C12Y203/03013—2-Isopropylmalate synthase (2.3.3.13)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01033—3-Isopropylmalate dehydratase (4.2.1.33)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag

Abstract

基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物(例如LeuCD′酶复合物)、包含基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物(例如LeuCD′)的微生物体；和用基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物(例如LeuCD′)制备C7‑C11 2‑酮酸的方法。所述基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物(例如LeuCD′酶复合物)、微生物体和制备C7‑C11 2‑酮酸的方法可用于在体内和在体外产生C6‑C1o醛、烷烃、醇和羧酸。

Description

基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物及用其制备伸长的 2-酮酸和C5-C10化合物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月29日提交的美国临时专利申请第62/565,271号的优先权，其全部内容以引用的方式并入本文中。
序列表
本申请通过引用合并2018年9月13日创建并提交的100,791字节的ASCII文本文件“2018_09_13_Sequence_Listing_DOW80959WO.txt”中的材料。
技术领域
本公开大体上涉及基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物(例如，LeuCD′酶复合物)，包含基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的微生物体及用基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物制备C7-C11 2-酮酸的方法。
背景技术
对获得和使用化石燃料的未来稀缺性、成本和环境影响的担忧刺激了人们开发廉价可再生生物质作为燃料和由其制造的化学品的替代来源。随着原油价格的上涨，生物基化学品和工业产品已成为其石油衍生产品的有吸引力的替代品。使用厌氧微生物体的发酵过程为将生物质和农业废物转化为有用产品提供了有希望的途径，同时解决了处理低价值农产品和食品加工副产品/废物时可能遇到的问题。可由低成本生物质原料制备的一些有用产品是C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸和C5-C9烷烃，包含特别是C6-C10醇。
C6-C10醇使用石油化学和天然原料方法产生。石油化学方法以乙烯齐聚反应为基础。例如，齐格勒法(Ziegler process)在高压下使用铝介导乙烯齐聚反应以产生三烷基铝形态。三烷基铝形态在干燥空气下氧化并水解，得到末端醇的泊松分布(Poissondistribution)，其长度范围为C2-C26(仅包含偶数碳链原子)。通过乙烯齐聚反应，例如通过壳牌高级烯烃工艺(Shell higher olefin process)(即SHOP)产生烯烃的加氢甲酰化，然后还原产生具有奇数碳链原子的醇。天然油(例如棕榈仁和椰子)的脂肪酸通过氢化、酯交换和还原的油脂化学转换的转化也用于产生长链醇，其中大部分醇的碳链长度大于G10。当前产生方法的显著缺点是对窄碳链长度分布缺乏选择性。此外，齐格勒法也不是完美的，因为其副产品是水合氧化铝(即Al2O3·[H2O]x)。因此，需要识别产生C6-C10醇、C5-C9烷烃和C6-C10羧酸的更好和更便宜的方法。然而，微生物体经常无法以经济上可行的速率或产率产生许多基于石油化学的产品。例如，虽然代谢工程已被广泛用于构建途径和/或将代谢物通向感兴趣的途径，但乙醇是目前使用微生物体产生的最常见的生物化学品。在生物燃料和化学工业中，正在积极地寻求经济上可行的产生C6-C10醇和C6-C10羧酸的方法。
通过微生物发酵成功产生天然氨基酸已经引起了对利用氨基酸生物合成途径产生目标化学品(包含较长链醇、烷烃和羧酸)的显著兴趣。特别感兴趣的是2-酮酸，其为氨基酸生物合成中的关键中间物，可用于细胞内化学物质的生物合成。亮氨酸生物合成途径中的三种酶参与延长2-酮酸，并且可以将2-酮丁酸、2-酮异戊酸和/或2-甲基-2-酮戊酸转化为更长链的2-酮酸。在不提及任何特定微生物体的情况下，这些酶一般称为异丙基苹果酸合成酶、异丙基苹果酸异构酶和异丙基苹果酸脱氢酶。确切地说，在大肠杆菌(E.coli)中，这些酶分别称为LeuA(GenBank：登录号NC 000913.3基因ID：947465)，LeuCD(GenBank：登录号NC 000913.3基因ID：945076和基因ID：945642)和LeuB(GenBank：登录号NC 000913.3基因ID：944798)。通过大肠杆菌的LeuA基因产物的工程化延长细胞内2-酮酸的长度的可行性扩大了可由2-酮酸产生的生物化学物质的范围。在大肠杆菌中，LeuABCD基因的产物将2-酮酸的长度延长一个碳单位。在亮氨酸生物合成期间观察到这种延长，其中LeuABCD基因的产物共同作用以将2-酮异戊酸(5-碳酸)转化为2-酮异己酸(6-碳酸)。另外，LeuA活性位点的扩增允许将C4酮酸、2-丁酮酸(即2-酮丁酸)递归延长至C9 2-酮酸、2-酮壬酸(即2-酮-壬酸)。然而，需要继续开发LeuABCD基因和使其工程化以允许有效产生C7-C11 2-酮酸并避免在用于延长2-酮酸的途径的后期阶段中的主要瓶颈。
因此，持续需要用于产生更长链醛、烷烃、醇和羧酸的经济上可行且有效的方法。
发明内容
本文提供基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物，例如LeuCD′酶复合物，包含基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的微生物体及用基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物制备C7-C11 2-酮酸的方法。在实施例中公开基因修饰的LeuCD′酶复合物。所述基因修饰的LeuCD′酶复合物包括(a)基因修饰的LeuC′亚单位，其包含：(1)氨基酸序列，其与具有C端的SEQ ID NO：1具有至少80％同源性；和(2)与(a)(1)的氨基酸序列的C端偶联的C端氨基酸或肽，其中所述C端氨基酸选自任何天然存在的氨基酸，且其中C端肽包含氨基酸序列：(Xaa)1(Xaa)2(Xaa)3(Xaa)4(Xaa)5(Xaa)6(Xaa)7(Xaa)8(Xaa)9(Xaa)10(SEQ ID NO：39)。(SEQ ID NO：39)的(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9和(Xaa)10各自独立地选自任何天然存在的氨基酸，或者不存在，条件是(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的至少两个存在于C端肽中。基因修饰的LeuCD′酶复合物还包括(b)LeuD亚单位，其包含与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列，其中所述基因修饰的LeuCD′酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性。
在实施例中公开了微生物体，其包含至少一种基因修饰的LeuCD′酶复合物。所述LeuCD′酶复合物包含(a)基因修饰的LeuC′亚单位，其包含：(1)氨基酸序列，其与具有C端的SEQ ID NO：1具有至少80％同源性；和(2)与(a)(1)的氨基酸序列的C端偶联的C端氨基酸或肽，其中所述C端氨基酸选自任何天然存在的氨基酸，且其中C端肽包含氨基酸序列：(Xaa)1(Xaa)2(Xaa)3(Xaa)4(Xaa)5(Xaa)6(Xaa)7(Xaa)8(Xaa)9(Xaa)10(SEQ ID NO：39)。(SEQ IDNO：39)的(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9和(Xaa)10各自独立地选自任何天然存在的氨基酸，或者不存在，条件是(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的至少两个存在于C端肽中。所述LeuCD′酶复合物还包含(b)LeuD亚单位，其包含与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列，其中所述基因修饰的LeuCD′酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性。
在实施例中公开了制备C7-C11 2-酮酸的方法。所述方法包含：(I)提供C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种，其具有：(A)至少一种具有异丙基苹果酸合成酶活性的异丙基苹果酸合成酶；(B)至少一种具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的异丙基苹果酸脱氢酶；及(C)至少一种基因修饰的LeuCD′酶复合物。所述基因修饰的LeuCD′酶复合物包含(1)基因修饰的LeuC′亚单位，其包含：(i)氨基酸序列，其与具有C端的SEQ ID NO：1具有至少80％同源性；和(ii)与(I)(C)(1)(i)的氨基酸序列的C端偶联的C端氨基酸或肽，其中所述C端氨基酸选自任何天然存在的氨基酸，且其中C端肽包含氨基酸序列：(Xaa)1(Xaa)2(Xaa)3(Xaa)4(Xaa)5(Xaa)6(Xaa)7(Xaa)8(Xaa)9(Xaa)10(SEQ ID NO：39)。(SEQ ID NO：39)的(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9和(Xaa)10各自独立地选自任何天然存在的氨基酸，或者不存在，条件是(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的至少两个存在于C端肽中。所述经基因修饰的LeuCD′酶复合物还包含(2)LeuD亚单位，其包含与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列。在所述C4-C102-酮酸底物的所述至少一种转化为所述C7-C11 2-酮酸的条件下提供所述C4-C10 2-酮酸底物。所述基因修饰的LeuCD′酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性，并且C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种转化为C7-C11 2-酮酸通过一种或多种生化反应发生。
应当理解，以下概述和详细描述都是示例性和说明性的，并且旨在提供对要求保护的本公开的进一步说明。以下概述和描述均不旨在将本公开的范围限定或限制于概述或描述中提到的特定特征。
附图说明
图1.2-酮酸的伸长。图1示出通过异丙基苹果酸合成酶(大肠杆菌中的LeuA)、异丙基苹果酸异构酶(大肠杆菌中的LeuCD)、异丙基苹果酸脱氢酶(大肠杆菌中的LeuB)(统称为大肠杆菌中的“LeuABCD途径”)的递归活性的2-酮酸的伸长，如(1)至(3)中所描绘。在伸长后，通过(4)中的(硫氨素依赖性)脱羧酶的活性将所得的伸长的2-酮酸(IV)转化为醛(V)，最后通过(5)中的醇脱氢酶的活性转化为醇(VI)。
图2.产生1-庚醇的两种途径。图2显示了产生1-庚醇的两种相关但不同的路径。在第一种路径中，伍德-永达尔(Wood-Ljungdahl)途径将合成气转化为乙酰CoA，另一途径则将乙酰CoA转化为丙酮酸。然后将丙酮酸转化为2-酮丁酸，且最后引发LeuABCD途径，其中将2-酮丁酸转化为C7-C11 2-酮酸(在本实施例中为2-酮-辛酸)。一旦形成伸长的2-酮酸(在本实施例中是2-酮辛酸)，(硫氨素依赖性)脱羧酶(即DC)将其转化为C6-C10醛，且醇脱氢酶将C6-C10醛转化为C6-C10醇(在本实施例中是1-庚醇)。在第二种路径中，潜在的糖分解代谢途径之一(在本实施例中是糖酵解或戊糖磷酸途径)将C5或C6糖转化为丙酮酸，且其后按照与第一种路线中相同的途径序列以得到庚醇；
图3.LeuCD活性位点的同源模型。图3显示了LeuCD活性位点的模型，其形成在LeuC亚单位和LeuD亚单位的界面处。使用同源建模并使用猪乌头酸酶(PDB ID代码1ACO)和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的异丙基苹果酸异构酶小亚单位(PDB ID代码3Q3W)的晶体结构作为模板来创建模型。活性位点用2-己基苹果酸(即2-HM)和4Fe-4S簇建模。LeuC亚单位中残基Val-35和Leu-411以及LeuD亚单位中Leu-31和His-88的各种组合在本发明公开的基因修饰的LeuCD′酶复合物中被修饰；
图4.异丙基苹果酸异构酶的大亚单位中高度保守的氨基酸残基。显示了高度保守的氨基酸残基，这些氨基酸残基是在从大肠杆菌LeuC序列分出的异丙基苹果酸异构酶的大亚单位的非冗余蛋白质序列的多达1-60％比对后识别的。在蛋白质序列中高度保守的氨基酸残基用阴影表示，并且被认为在2-酮酸伸长期间在LeuC的功能中起重要作用。加框的氨基酸残基被认为形成异丙基苹果酸异构酶的活性位点；
图5.异丙基苹果酸异构酶的小亚单位中高度保守的氨基酸残基。显示了高度保守的氨基酸残基，这些氨基酸残基是在从大肠杆菌LeuD序列分出的异丙基苹果酸异构酶的小亚单位的非冗余蛋白质序列的多达1-60％比对后识别的。在蛋白质序列中高度保守的氨基酸残基用阴影表示，并且被认为在2-酮酸伸长期间在LeuD的功能中起重要作用。加框的氨基酸残基被认为形成异丙基苹果酸异构酶的活性位点；
图6.pZE_LeuABCD-KA6载体。显示了pZE_LeuABCD-KA6载体，其与修饰的载体pOC-CL-###一起用于醇产生研究；
图7.pOC-CL-0###载体。显示了典型的修饰的pOC-CL-###载体，其与pZE_LeuABCD-KA6载体一起用于醇产生研究；
图8A-8B.LeuD和LeuC变异体盒。图8A显示了LeuD变异体基因盒，而图8B显示了LeuC变异体基因盒；
图9.含有′+1途径酶以及WT和变异体LeuCD酶的大肠杆菌的血清瓶发酵的醇效价的统计分析。图9(上图)显示了使用SAS JMP 11.2.0对含有WT和变异体LeuC和LeuD酶的+1途径大肠杆菌菌株产生的庚醇效价进行的ANOVA分析和学生t检验，其中使用90％置信区间。图9(下图)显示了使用SAS JMP11.2.0对含有WT和变异体LeuC和LeuD酶的+1途径大肠杆菌菌株产生的辛醇效价进行的ANOVA分析和学生t检验，其中使用90％置信区间。
图10a.变异体LeuCD酶对2-异丙基苹果酸的活性。图10a显示了具有带有N端(His)6标签的LeuC亚单位(即WT leuC(N-His))的变异体LeuCD酶和具有带有C端(His)6标签的LeuC亚单位的LeuCD酶的变异体(即WT leuC(C-His))关于每单位时间由LeuB转化为2-酮异己酸(即2-酮异己酸(nmol/h))的苹果酸3-异丙基苹果酸(通过LeuCD异构化2-异丙基苹果酸产生)的摩尔数的条形图；和
图10b.变异体LeuCD酶对2-己基苹果酸的活性。图10b显示了具有带有N端(His)6标签的LeuC亚单位(即WT leuC(N-His))的变异体LeuCD酶和具有带有C端(His)6标签的LeuC亚单位的LeuCD酶的变异体(即WT leuC(C-His))关于每单位时间由LeuB转化为2-酮壬酸(即2-酮壬酸(nmol/h))的苹果酸3-己基苹果酸(通过LeuCD异构化2-异丙基苹果酸产生)的摩尔数的条形图。
具体实施方式
尽管认为以下术语是本领域普通技术人员很好理解的，但是阐述了定义以便于解释当前描述的标的物。
除非上下文另外明确地说明，否则如本文所使用的单数形式“一(a/an)”和“所述”包含复数个指示物。因此，例如，除非上下文另外明确地说明，否则对“一个”部件的提及包含具有两个或更多个这个部件的方面。
如本文所用且取决于上下文，术语“基因修饰的”和“修饰的”是指具有有意改变的氨基酸序列，即非野生型氨基酸序列的异丙基苹果酸异构酶酶复合物，例如LeuCD。取决于上下文，基因修饰的和修饰的还可以指具有基因组的微生物体，所述基因组已经有意地改变以包含基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物，例如基因修饰的LeuCD′。
如本文所用，术语“氨基酸”是指天然存在的L α-氨基酸或残基。本文使用天然存在的氨基酸或残基的常用的一个字母和三个字母的缩写。氨基酸还包括D-氨基酸或残基以及通常不并入蛋白质或肽例如正亮氨酸中的天然存在的氨基酸或残基。
如本文所用，术语“同源性”和“同源”是指具有一定百分比同一性，例如至少约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的两个蛋白质(或其区域)的氨基酸序列。如本领域普通技术人员已知的，可以确定同源性百分比。例如，为了确定两个氨基酸序列的同一性百分比，出于最佳比较目的，将序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸序列中的一个或两个中引入间隙以用于最佳比对，并且出于比较目的，非同源序列可以忽略不计)。然后，比较相应氨基酸位置处的氨基酸残基。当第一序列中的位置被与第二序列中的相应位置处相同的氨基酸残基占据时，那么分子在所述位置是相同的(如本文所用，氨基酸“同一性”等同于氨基酸“同源性”)。如本领域所知，两个序列之间的同一性百分比是序列共有的相同位置的数量的函数，考虑到需要引入以用于最佳比对两个序列的间隙的数量和每个间隙的长度。通常使用序列分析软件测量多肽的序列同源性。
当同源用于蛋白质或肽时，认识到不同的氨基酸残基位置通常可因保守氨基酸取代而不同。例如，具有LeuC或LeuD功能的氨基酸序列可通过使用这些蛋白质的氨基酸序列作为查询对非冗余蛋白质序列(即nr)数据库进行蛋白质-蛋白质BLAST(即blastp)搜索来识别。可以使用默认参数在国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)(即NCBI)网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)上进行搜索。
如本文所用，术语“肽”和“肽”是指具有至少两个氨基酸和至多三十个氨基酸的分子。在实施例中，肽包含具有通过肽键偶联的具有至少两个连续氨基酸至三十个连续氨基酸的链的分子(即，至少两个氨基酸至三十个氨基酸的氨基酸序列)。在实施例中，本文描述的肽包含两个至三十个连续氨基酸的链，或四个至二十个连续氨基酸的链，或六个至十五个连续氨基酸的链，或八个至十个氨基酸的链，或十个连续氨基酸的链。
如本文所用，术语“底物”或“合适的底物”是指通过酶的作用转化或意图转化为另一种化合物的任何物质或化合物。术语不仅包含单一化合物，还包括化合物的组合，例如溶液、混合物和含有至少一种底物或其衍生物的其它物质。此外，底物和适合的底物可不仅涵盖提供适合用作起始物质的碳源的化合物，例如任何生物质衍生的糖，还涵盖用于与如本文所述的微生物体相关的途径的中间物和终产物代谢物。
现将详细参考基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的各种实施例，例如LeuCD′酶复合物，包含基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的微生物体及用基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物制备C7-C11 2-酮酸的方法。基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物，包含基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的微生物体及制备C7-C11 2-酮酸的方法可用于产生生物基化学品及工业产品作为使用化石燃料的替代品。基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物，包含基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的微生物体及制备C7-C11 2-酮酸的方法可用于在体内及在体外产生更长链烷烃、醇及羧酸。
现在将详细描述基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的实施例。此后，将描述包含基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的微生物体。然后，将描述用基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物制备C7-C11 2-酮酸的方法的实施例。
I.基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物
在实施例中公开了具有异丙基苹果酸异构酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物。异丙基苹果酸异构酶酶复合物是包含两个亚单位的异二聚体：一个大亚单位(例如，大肠杆菌中的LeuC，SEQ ID NO：1；GenBank：登录号NC 000913.3基因ID：945076)和一个小亚单位(例如，大肠杆菌中的LeuD，SEQ ID NO：2；GenBank：登录号NC 000913.3基因ID：945642)。已知异丙基苹果酸异构酶酶复合物在大肠杆菌、志贺氏菌(Shigella)、例如弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)(GenBank：登录号WP_025757828)、肠内菌科(Enterobacteriaceae)(GenBank：登录号WP_001140654)、肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)(GenBank：登录号WP_087787525)和(Citrobacter freundii)(GenBank：登录号WP_086538719)。具有LeuC或LeuD功能的额外氨基酸序列可通过使用这些蛋白质的氨基酸序列作为查询对非冗余蛋白质序列数据库进行蛋白质-蛋白质BLAST(即blastp)搜索来识别。在实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物(例如基因修饰的LeuCD′酶复合物)包含于来自过度表达基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的细胞的细胞提取物中。
在实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物包含：(a)基因修饰的大亚单位，和(b)小的亚单位，其在复合时赋予异丙基苹果酸异构酶活性。在实施例中，基因修饰的大亚单位包含：(1)具有C端的大亚单位的氨基酸序列，和(2)与大亚单位的氨基酸序列的C端偶联的C端氨基酸或肽。大亚单位的氨基酸序列可是本领域普通技术人员已知的任何野生型或基因修饰的氨基酸序列，当与基因修饰的异丙基苹果酸异构酶的小亚单位复合时赋予异丙基苹果酸异构酶活性。
在实施例中，遗传修饰的大亚单位是遗传修饰的LeuC′亚单位。在实施例中，基因修饰的LeuC′亚单位包括具有C端的LeuC的野生型氨基酸序列或具有C端的LeuC的基因修饰的氨基酸序列。LeuC的野生型氨基酸序列是SEQ ID NO：1。在SEQ ID NO：1中，C端是位置466处的氨基酸，即赖氨酸。在一些实施例中，基因修饰的LeuC′亚单位包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，基因修饰的LeuC′亚单位包含与SEQ IDNO：1具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。
在一些实施例中，基因修饰的LeuC′亚单位包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的氨基酸序列，其包含至少一种特别涵盖的氨基酸取代。在进一步的实施例中，基因修饰的LeuC′亚单位包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的氨基酸序列，其中丙氨酸或甘氨酸取代Val-35和/或其中缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代Leu-411。在说明性的非限制性实施例中，基因修饰的LeuC′亚单位包含与SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的氨基酸序列及选自以下的至少一个氨基酸取代：(i)丙氨酸取代Val-35；(ii)甘氨酸取代Val-35；(iii)丙氨酸取代Val-35，缬氨酸取代Leu-411；(iv)丙氨酸取代Val-35和丙氨酸取代Leu-411；(v)丙氨酸取代Val-35，甘氨酸取代Leu-411；(vi)甘氨酸取代Val-35，缬氨酸取代Leu-411。
在实施例中，基因修饰的大亚单位包含偶联至其氨基酸序列的C端的C端氨基酸或肽。在一些实施例中，基因修饰的大亚单位包含与其氨基酸序列的C端偶联的C端氨基酸，例如单个C端氨基酸。在一些实施例中，基因修饰的大亚单位包含与基因修饰的LeuC′亚单位的氨基酸序列的C端偶联的C端氨基酸，如本文先前所述。在一些实施例中，C端氨基酸选自任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，C端氨基酸基本上由单一氨基酸组成或由单一氨基酸组成。
在一些实施例中，基因修饰的大亚单位包含C端肽。在一些实施例中，基因修饰的大亚单位包含与基因修饰的LeuC′亚单位的氨基酸序列的C端偶联的C端肽，如本文先前所述。在实施例中，C端肽具有氨基酸序列：
(Xaa)1(Xaa)2(Xaa)3(Xaa)4(Xaa)5(Xaa)6(Xaa)7(Xaa)8(Xaa)9(Xaa)10(Xaa)11(Xaa)12(Xaa)13(Xaa)14(Xaa)15(Xaa)16(Xaa)17(Xaa)18(Xaa)19(Xaa)20(Xaa)21(Xaa)22(Xaa)23(Xaa)24(Xaa)25(Xaa)26(Xaa)27(Xaa)28(Xaa)29(Xaa)30(SEQ ID NO：38)
其中(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9、(Xaa)10、(Xaa)11、(Xaa)12、(Xaa)13、(Xaa)14、(Xaa)15、(Xaa)16、(Xaa)17、(Xaa)18、(Xaa)19、(Xaa)20、(Xaa)21、(Xaa)22、(Xaa)23、(Xaa)24、(Xaa)25、(Xaa)26、(Xaa)27、(Xaa)28、(Xaa)29和(Xaa)30各自独立地选自任何天然存在的氨基酸，或不存在。在一些实施例中，(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9、(Xaa)10、(Xaa)11、(Xaa)12、(Xaa)13、(Xaa)14、(Xaa)15、(Xaa)16、(Xaa)17、(Xaa)18、(Xaa)19、(Xaa)20、(Xaa)21、(Xaa)22、(Xaa)23、(Xaa)24、(Xaa)25、(Xaa)26、(Xaa)27、(Xaa)28、(Xaa)29和(Xaa)30独立选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val，或不存在。在实施例中，存在(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9、(Xaa)10、(Xaa)11、(Xaa)12、(Xaa)13、(Xaa)14、(Xaa)15、(Xaa)16、(Xaa)17、(Xaa)18、(Xaa)19、(Xaa)20、(Xaa)21、(Xaa)22、(Xaa)23、(Xaa)24、(Xaa)25、(Xaa)26、(Xaa)27、(Xaa)28、(Xaa)29或(Xaa)30中的至少两个。
在实施例中，C端肽具有氨基酸序列：
(Xaa)1(Xaa)2(Xaa)3(Xaa)4(Xaa)5(Xaa)6(Xaa)7(Xaa)8(Xaa)9(Xaa)10(SEQ ID NO：39)
其中(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9和(Xaa)10各自独立地选自任何天然存在的氨基酸，或不存在。在一些实施例中，(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9和(Xaa)10独立地选自Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val，或不存在。在一些实施例中，如果存在，则(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9和(Xaa)10独立地选自疏水性、中性亲水性、极性、酸性、带电、碱性、链取向影响的和芳香族天然存在的氨基酸。疏水性天然存在的氨基酸可包含His、Trp、Tyr、Phe、Met、Leu、Ile、Val和Ala。中性亲水性天然存在的氨基酸可包含Cys、Ser和Thr。极性天然存在的氨基酸可包含Ser、Thr、Gln和Gln。酸性天然存在的氨基酸可包含Asp和Glu。带电的天然存在的氨基酸可包含：Asp和Glu(带负电)；和Arg、Lys和His(带正电)。碱性天然存在的氨基酸可包含His、Lys和Arg。链取向影响的天然存在的氨基酸可包含Gly和Pro。芳香族天然存在的氨基酸可包含Trp、Tyr、Phe和His。
在一些实施例中，如果存在，那么(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)9和(Xaa)10中的每个独立地选自中性亲水性和极性天然存在的氨基酸。在一些实施例中，如果存在，那么(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)9和(Xaa)10中的每个独立地选自Ser、Cys、Thr、Gln和Gln。在进一步的实施例中，如果存在，那么(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)9和(Xaa)10中的每个独立地选自Ser和Thr。在更进一步的实施例中，如果存在，那么(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)9和(Xaa)10中的每个为Ser。
在一些实施例中，如果存在，那么(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7和(Xaa)8中的每个选自疏水性、带正电、碱性和芳香族天然存在的氨基酸。在一些实施例中，如果存在，那么(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7和(Xaa)8中的每个独立地选自His、Trp、Tyr、Phe、Met、Leu、Ile、Val、Ala、Arg和Lys。在进一步的实施例中，如果存在，那么(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7和(Xaa)8中的每个独立地选自His、Lys和Arg。在更进一步的实施例中，如果存在，那么(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7和(Xaa)8中的每个为His。
在一些实施例中，(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7和(Xaa)8中的每个为His，且(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3和(Xaa)4中的每个不存在于SEQ ID NO：39中；在这些实施例中，氨基酸序列SEQ ID NO：39为HisHisHisHisHisHis或(His)6。在一些实施例中，(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的至少两个存在于SEQID NO：39中。在再进一步的实施例中，(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的至少四个存在于SEQ ID NO：39中。在更再进一步的实施例中，(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的至少六个存在于SEQ ID NO：39中。在进一步的实施例中，全部(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10存在于SEQ ID NO：39中。
在说明性非限制性实施例中，(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3和(Xaa)4各自为Ser(且均存在)，且(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7和(Xaa)8各自为His(且均存在)；在此说明性实施例中，SEQ ID NO：39为SerSerHisHisHisHisHisHisSerSer(SEQ ID NO：40)。在其它说明性非限制性实施例中，C端肽SEQ ID NO：40连接到野生型LeuC亚单位的氨基酸序列的C端，得到氨基酸序列SEQ ID NO：41。
在实施例中，C端氨基酸或肽通过肽键偶合到大亚单位的C端。在一些实施例中，如本文先前所描述，C端氨基酸或肽通过肽键偶合到基因修饰的LeuC′亚单位的C端。在说明性非限制性实施例中，C端肽的N端通过肽键偶合到大亚单位，例如基因修饰的LeuC′亚单位。在SEQ ID NO：38中，如果存在，N端为(Xaa)1，且如果存在，C端为(Xaa)30。在SEQ ID NO：39中，如果存在，N端为(Xaa)1，且如果存在，C端为(Xaa)10。
在一些实施例中，C端肽包括长度为两个到三个连续氨基酸的氨基酸链，或长度为四个到二十个连续氨基酸的氨基酸链，或长度为六个到十五个连续氨基酸的氨基酸链，或长度为八个到十个连续氨基酸的氨基酸链，或长度为十个连续氨基酸的氨基酸链。在一些实施例中，C端肽包括长度为六到十个连续氨基酸的氨基酸链。在一些实施例中，大亚单位的C端肽基本上由或由SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39组成。在一些实施例中，大亚单位的C端肽基本上由或由SEQ ID NO：40组成。
在实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物包含小亚单位，其在与大亚单位复合时赋予异丙基苹果酸异构酶活性。在实施例中，基因修饰的小亚单位包含可是本领域普通技术人员已知的任何野生型或遗传修饰的氨基酸序列，当与基因修饰的异丙基苹果酸异构酶的大亚单位复合时赋予异丙基苹果酸异构酶活性。在一些实施例中，小亚单位是LeuD亚单位。在实施例中，LeuD亚单位包含LeuD的野生型氨基酸序列或LeuD的基因修饰的氨基酸序列。LeuD的野生型氨基酸序列是SEQ ID NO：2。在一些实施例中，LeuD亚单位包含与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列。在一些实施例中，LeuD亚单位包含与SEQ ID NO：2具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列。
在一些实施例中，LeuD亚单位包含与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列，其包含至少一个特别涵盖的氨基酸取代。在进一步的实施例中，LeuD亚单位包含与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列，其中丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸或丝氨酸独立地取代Leu-31和/或His-88。在说明性的非限制性实施例中，LeuD亚单位包含与SEQ IDNO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列，其中至少一个氨基酸取代选自：(i)丙氨酸取代Leu-31；(ii)甘氨酸取代Leu-31；(iii)缬氨酸取代Leu-31；(iv)丙氨酸取代Leu-31，和丝氨酸取代His-88；(v)甘氨酸取代Leu-31，和丙氨酸取代His-88；(vi)甘氨酸取代Leu-31，和丝氨酸取代His-88；和(vii)缬氨酸取代Leu-31，丙氨酸取代His-88。
在其中大亚单位是基因修饰的LeuC′且小亚单位是LeuD的实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物是基因修饰的LeuCD′酶复合物。在一些实施例中，基因修饰的LeuCD′酶复合物包含改变LeuC和LeuD的野生型氨基酸序列的氨基酸取代。在一些实施例中，LeuC和LeuD的本文先前所描述的氨基酸取代已被识别为：在将较长链的2-烷基苹果酸(例如C4-C62-烷基苹果酸)异构化为其相应的3-烷基苹果酸时，与野生型大肠杆菌LeuCD酶复合物(LeuC：EcoGene登录号EG11576，基因ID 945076；和LeuD：EcoGene登录号EB11575，基因ID：945642)相比较，表现出改善的活性和催化效率(即，kcat/Km)。野生型LeuC序列(SEQID NO：1)和野生型LeuD序列(SEQ ID NO：2)内的各种位点(即位置)已被识别为是获得改进的关键。LeuC的野生型序列内所识别的关键位点包含Val-35、Leu-411及其组合。LeuD的野生型序列内所识别的关键位点包含Leu-31、His-88及其组合。在LeuC中，可进行以下更改：丙氨酸或甘氨酸取代Val-35和/或缬氨酸，丙氨酸或甘氨酸取代Leu-411。在LeuD中，可进行以下更改：其中缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代Leu-31和/或其中丝氨酸或丙氨酸取代His-88。取代可在LeuC或LeuD中的单位点(即构成三碱基对的单个氨基酸)取代到LeuC和LeuD内的多位点(例如2-4个位点)取代之间变化。SEQ ID NO：3-37是包含一个或多个这些取代的LeuC和LeuD变异体的氨基酸序列。
参考图4，与大肠杆菌LeuC氨基酸序列多达60％不同的异丙基异构酶酶复合物的大亚单位的氨基酸序列的比对表明80％以上的比对序列共享图4中284个加阴影的氨基酸残基。基于这个比对，图4中加阴影的氨基酸可被认为是以与大肠杆菌LeuC相同方式赋予LeuC功能(包括折叠、底物结合、特异性、催化等)所必需的。另外，且不受理论束缚，据信LeuCD的活性位点包含LeuC的以下氨基酸残基：V32-S37、D62-N64、G106-V110、G127-T131、C220-M222、G345-T348、G406-A412、S428-N431和G434-Q436(如图4中加框所示)。
类似地，参考图5，与大肠杆菌LeuD氨基酸序列多达60％不同的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的小亚单位的氨基酸序列的比对表明80％以上的比对序列与大肠杆菌LeuD氨基酸序列共享101个加阴影的氨基酸。基于这个比对，图5中加阴影的氨基酸可被认为是以与大肠杆菌LeuD相同方式赋予LeuD功能(包括折叠、底物结合、特异性、催化等)所必需的。另外，且不受理论束缚，据信LeuCD的活性位点包含LeuD的以下氨基酸残基：T22-D23、P27-L31和G83-E87(如图5中加框区域所示)。
在实施例中，据信不是异丙基苹果酸异构酶的功能所必需的氨基酸(例如，图4中LeuC的未加阴影的氨基酸残基，和图5中LeuD的未加阴影的氨基酸残基)可以保守或非保守地取代，且据信与野生型大肠杆菌LeuCD相比，这种氨基酸取代不会显著降低修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的功能特性。在实施例中，据信不形成异丙基苹果酸异构酶的活性位点，但仍被认为是异丙基苹果酸异构酶酶复合物的功能所必需的氨基酸(例如，图4中LeuC的加阴影的但未加框的氨基酸残基，和图5中Leu5中加阴影的但未加框的氨基酸残基)可被保守地取代，且据信与野生型大肠杆菌LeuCD相比，这种氨基酸取代不会显著降低修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的功能特性。在实施例中，据信氨基酸的大多数保守和非保守氨基酸取代被认为形成异丙基苹果酸异构酶酶复合物的活性位点(例如，在图4中LeuC的加阴影的和框出的氨基酸残基和图5中LeuD的加阴影的和框出的氨基酸残基)与野生型大肠杆菌LeuCD相比，除了本文先前描述的那些特定的氨基酸取代以外，会降低基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的功能特性。据信具有所涵盖的取代的异丙基苹果酸异构酶酶复合物(例如LeuCD′)的基因修饰的大和/或小亚单位将赋予异丙基苹果酸异构酶活性。换句话说，据信与野生型大肠杆菌LeuCD相比，本文所涵盖的氨基酸取代不会显著降低修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的功能特性。
本文所描述的基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物(包含基因修饰的亮LeuCD′酶复合物)可通过所属领域的一般技术人员已知的任何方法产生。例如，可通过化学合成和/或重组技术来产生基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物。重组技术可包含：将编码目的蛋白质或肽(例如，基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物，其亚单位和/或本文先前所述的C端肽)的基因(天然或合成)插入适当的载体中；将载体插入适当的宿主细胞(例如靶微生物体)中；培养宿主细胞以引起基因表达；且回收或分离在宿主细胞中表达的目的蛋白质或肽。
如本领域普通技术人员已知的，本文所描述的基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物(包含基因修饰的LeuCD′酶复合物)也可通过定点诱变被修饰为包含本文所涵盖的氨基酸取代。定点诱变将导致至少一种核酸向不同核酸的转化，这可以影响氨基酸取代。也可以采用本文所描述的任何产生方法的组合。
已详细描述基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的实施例。现将描述包含基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的微生物体。其后，将描述用基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物制备C7-C11 2-酮酸的方法的实施例。
II.包含基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的微生物体
在实施例中，公开了包含基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的微生物体。基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物如本文先前所描述，且具有异丙基苹果酸异构酶活性。在一些实施例中，微生物体包含至少一种基因修饰的LeuCD′酶复合物。LeuCD′酶复合物如本文先前所描述。
在实施例中，基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物(例如基因修饰的LeuCD′酶复合物)在微生物体中表达且具有异丙基苹果酸异构酶活性。在一些实施例中，微生物体为已知的或被认为具有一种或多种所需代谢途径和/或其它特征，例如由C6-C10产物抑制生长的抗性，如本文随后更详细地描述。例如，微生物体可具有能够产生合适的底物(例如2-酮丁酸、2-酮异戊酸和/或2-甲基-2-酮戊酸)的原生代谢途径，原生型“+1”途径(或LeuABCD途径，参照大肠杆菌命名)，和/或能够将“+1”途径的产物转化为C7-C11 2-酮酸、C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸和/或C5-C9烷烃的原生途径。这些途径将在本文随后详细地描述。
关于具有能够产生合适底物的原生代谢途径的微生物体，可在具有能够产生乙酰CoA的代谢途径的微生物体中表达基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物。在实施例中，参考图2，乙酰CoA的产生可通过合成代谢(例如伍德-永达尔)或分解代谢(例如糖酵解或磷酸戊糖途径)路径进行。在一些实施例中，微生物体具有也称为“合成气体(合成气)固定途径”的伍德-永达尔途径，其中合成气转化成乙酰CoA。某些产生乙酸的细菌具有伍德-永达尔途径。例如，梭菌属(genus Clostridium)的细菌，包含扬氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)(即C.Ijungdahlii)，具有伍德-永达尔途径。在伍德-永达尔途径中，合成气可通过将二氧化碳还原为一氧化碳再转化为乙酰CoA而转化为乙酰CoA。这可通过两种酶的作用来完成：一氧化碳脱氢酶和乙酰CoA合成酶。一氧化碳脱氢酶催化二氧化碳的还原，并且乙酰CoA合成酶将所得的一氧化碳与甲基结合以形成乙酰CoA。从这一点来看，乙酰CoA可继续通过额外途径，通过铁氧还蛋白氧化还原酶(即PFO)的还原而转化为丙酮酸。
在一些实施例中，仍参考图2，微生物体具有糖分解代谢途径，例如糖酵解或戊糖磷酸途径。在这些实施例中，微生物体通过糖分解代谢将合适的(例如，非合成气)含碳底物，例如包含葡萄糖、蔗糖和/或戊糖的C5或C6糖直接转化为丙酮酸。此类糖分解代谢途径可存在于微生物体中，包含例如丙酮丁醇梭杆菌(Clostridium acetobutylicum)、大肠杆菌(Escherichia coli)(即E.coli)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)。
在将合成气或非合成气底物转化为丙酮酸(通过伍德-永达尔途径或糖分解代谢途径)后，丙酮酸可通过丙酮酸羧化酶(即PC)、天冬氨酸转氨酶(即AAT)、ThrABC(其包含ThrA(双功能天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶)、ThrB(高丝氨酸激酶)和ThrC(苏氨酸合酶)和天冬氨酸半醛脱氢酶(即ASD)的活性转化为L-苏氨酸。然后可以通过苏氨酸脱水酶(即Ilva)将L-苏氨酸转化为2-酮丁酸。在一些实施例中，丙酮酸通过IIvBN/IIvGM、IIVC和IIVD的活性转化为2-酮异戊酸。在一些实施例中，丙酮酸通过多个生化反应转化为2-甲基-2-酮戊酸。
在产生2-酮丁酸、2-酮异戊酸和/或2-甲基-2-酮戊酸后，亮氨酸生物合成途径中原生“+1”途径部分(或大肠杆菌中的原生LeuABCD部分)的基因修饰作用以通过多个生化反应进行C7-C11 2-酮酸转化。基因修饰的“+1”途径可采用至少一种野生型或其基因修饰的酶；然而，在本发明的情形下，基因修饰的“+1”途径采用如本文先前所描述的基因修饰的异丙基苹果酸异构酶，例如，LeuCD′。例如，基因修饰的“+1”途径可包含LeuABCD途径的野生型(称为LeuA、LeuB、LeuC和/或LeuD)和/或基因修饰的(称为LeuA′、LeuB′、LeuC′和/或LeuD′)酶。
在实施例中，参考图1，LeuABCD途径的天然和/或基因修饰的酶将2-酮丁酸、2-酮异戊酸或2-甲基-2-酮戊酸转化为所需的C7-C11 2-酮酸。例如，可先将2-酮丁酸转化为2-酮戊酸，然后转化为2-酮己酸，然后转化为2-酮庚酸或2-酮-十一酸，即所需的C7-C11 2-酮酸，如通过“+1”途径发生链-延长。作为另一实例，可先将2-酮异戊酸转化为2-酮异己酸，然后转化为2-酮异庚酸。实现“+1”途径中的链伸长的酶(野生型或基因修饰的)可包含具有异丙基苹果酸合成酶活性的异丙基苹果酸合成酶(例如，LeuA和/或LeuA′)、具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的异丙基苹果酸脱氢酶(例如，LeuB和/或LeuB′)和/或具有异丙基苹果酸异构酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸异构酶(例如，LeuCD′)。在一些实施例中，仅一种酶是基因修饰的，例如，基因修饰的异丙基苹果酸异构酶。例如，链伸长酶可仅包含基因修饰的LeuCD′，而其余酶是野生型的。酶的选择使得以2-酮丁酸或2-酮异戊酸开始的C7-C11 2-酮酸的所需产生得以实现。
关于非天然亮氨酸生物合成途径的修饰的进一步公开描述于共同待审的国际公开号WO/2015/089127中，其通过引用整体并入本文。在一些实施例中，如国际公开案第WO/2015/089127中所描述使用LeuA′、LeuB′和/或LeuCD′(如本文中先前所描述)。在一些实施例中，组合使用野生型Leu A、基因修饰的LeuA′、野生型LeuB、基因修饰的LeuB和基因修饰的LeuCD′。特别关于LeuA，可对LeuA(GenBank登录号NC_000913.3基因ID：947465)进行基因修饰以产生具有高于平均的催化效率(kcat/Km)的异丙基苹果酸合成酶变异体(即LeuA′)以捕获用于催化的目的2-酮酸。
一旦形成伸长的C7-C11 2-酮酸，所述伸长的C7-C11 2-酮酸可以原样使用，或转化为C6-C10醛。对于转化为C6-C10醛，采用野生型或基因修饰的硫氨素依赖性脱羧酶，产生具有比被转化的C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛。C6-C10醛具有广泛的适用性，例如，作为产生C6-C10醇、C6-C10羧酸、C5-C9烷烃及其组合的起始底物或中间物，如本文随后更详细地描述。
在实施例中，微生物体选自大肠杆菌、短乳杆菌、恶臭假单胞菌、梭菌属种(Clostridium species)，例如扬氏梭菌或自产醇梭菌(Clostridium autoethanogenum)、芽孢杆菌属(Bacillus species)，例如枯草杆菌，酵母菌种(Saccharomyces species)，例如酿酒酵母和/或棒状杆菌种(Corynebacterium species)，例如谷氨酸棒状杆菌。在一些实施例中，微生物体选自大肠杆菌、短乳杆菌、恶臭假单胞菌、扬氏梭菌、自产醇梭菌、枯草杆菌、酿酒酵母或谷氨酸棒状杆菌。在一些实施例中，微生物体是大肠杆菌。在实施例中，本文所描述的微生物体可用于酶促产物例如C6-C10醛和/或由此制备的C6-C10产物之一的大规模或商业规模的发酵生产。
在实施例中，可通过重组技术来进行基因修饰的微生物体的制备，例如，将编码选择的基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的基因插入合适的载体，且将载体插入合适的宿主细胞，例如目标微生物体。通常，本文公开的实施例表明重组工程以改变给定密码子中的一个或多个核酸碱基，以改变由此编码的氨基酸。此类重组技术可用于产生基因修饰的酶和/或微生物体，以用于在体外测定。相反，在一些实施例中，微生物体的基因组可被改变以用于大规模生产菌株。这些制备方法可通过本领域普通技术人员已知的任何合适的方法进行。
借助于实例，可使用合适的数据库，例如GenBank，来获得目标野生型酶的遗传密码，且可识别其合适的密码子。密码子识别可用作本领域普通技术人员已知的蛋白质工程方法的基础。如本文先前所描述，可通过核酸的定点诱变来实现目标酶中特别涵盖的氨基酸取代，以获得所得基因。然后可将所得基因克隆到载体中，例如复制质粒载体，且可将该载体转化到宿主微生物体中。载体应能够表达目标酶，在一些情况下，目标酶对天然或非天然底物具有高于野生型的催化效率。然后可以从宿主微生物体中分离出目标酶，且可在纯化或不纯化的情况下用于产生含酶溶液。在一些情况下，含酶溶液对天然或非天然底物表现出高于野生型的催化效率。
在一些实施例中，有可能识别具有在所需途径中有用的野生型酶的微生物体，并将该微生物用作宿主微生物体或将其基因组的合适的酶编码部分转移到不同宿主微生物体基因组中。在一些实施例中，宿主微生物体是被识别为可用于大规模发酵生产的生物体。借助于实例，如本文先前所描述，可选择产生合适的野生型硫氨素依赖性脱羧酶(即DC)和/或野生型醇脱氢酶(即ADH)的微生物体，且微生物体可用作宿主微生物体或作为转化微生物体来制备基因修饰的微生物体。
已详细描述包含基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物的微生物体的实施例。现在，将描述用基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物制备C7-C11 2-酮酸的方法的实施例。
III.用基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物制备C7-C11 2-酮酸的方法
在实施例中公开了制备C7-C11 2-酮酸的方法。在一些实施例中，制备C7-C112-酮酸的方法包含提供具有一系列酶的C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种，所述酶包含基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物，例如基因修饰的LeuCD′酶复合物。在一些实施例中，制备C7-C11 2-酮酸的方法包含提供起始底物和一系列作用于底物或其产物的酶。在一些实施例中，所述系列酶最终将底物转化为所需的C7-C11 2-酮酸。
在一些实施例中，制备C7-C11 2-酮酸的方法包含：(I)提供C4-C10 2-酮酸底物中的至少一种，其具有(A)至少一种具有异丙基苹果酸合成酶活性的异丙基苹果酸合成酶，(B)至少一种具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的异丙基苹果酸脱氢酶，和(C)至少一种具有异丙基苹果酸异构酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物，例如至少一种基因修饰的LeuCD′酶复合物，在C4-C102-酮酸底物之至少一种转化为C7-C11 2-酮酸的条件下。在一些实施例中，所述方法可进一步包含野生型LeuCD酶复合物。在一些实施例中，至少一种C4-C102-酮酸底物转化为C7-C11 2-酮酸通过一种或多种生化反应发生。如本文先前所描述，生化反应可以独立地发生在基因修饰的微生物体内部或外部。在一些实施例中，C4-C10 2-酮酸底物包含2-酮丁酸。在一些实施例中，C4-C10 2-酮酸底物包含2-酮异戊酸。在一些实施例中，C4-C102-酮酸底物包含2-甲基-2-酮戊酸。
在一些实施例中，参考图2，制备C7-C11 2-酮酸、C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸或C5-C9烷烃的方法包含将所选择的含碳底物转化为丙酮酸，且然后通过一种或多种酶的作用将丙酮酸转化为2-酮丁酸或2-酮异戊酸。更确切地说，在实施例中，提供含碳底物有和/或与一种或多种酶接触，使得含碳底物转化为2-酮丁酸、2-酮异戊酸或2-甲基-2-酮戊酸。如本文中先前所描述，2-酮丁酸、2-酮异戊酸或2-甲基-2-酮戊酸然后可通过“+1”途径中的各种酶的作用(或在LeuABCD途径中，如参照大肠杆菌微生物体所命名)通过链伸长转化为C7-C11 2-酮酸。
参考图1，“+1”途径的迭代部分(或大肠杆菌中的LeuABCD途径的迭代部分)为非天然亮氨酸途径的一部分。在实施例中，能够实现链伸长的酶在本文中被识别为：异丙基苹果酸合成酶，例如，野生型2-异丙基苹果酸合成酶(例如LeuA；GenBank：登录号NC 000913.3基因ID：947465)，和/或具有异丙基苹果酸合成酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合成酶(例如LeuA′，例如，如Marcheschi等人《用于碳链伸长的合成递归“+1”途径(A syntheticrecursive“+1”pathway for carbon chain elongation)》《ASC化学生物学(ACS chemicalbiology)》2012，7，689-697中所描述，其通过引用整体并入；异丙基苹果酸脱氢酶，例如野生型异丙基苹果酸脱氢酶(例如LeuB(GenBank：登录号NC000913.3基因ID：944798)和/或具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸脱氢酶(例如LeuB′，例如，如Sanghani等人在国际公开案第WO/2015/089127A1号中所描述，其通过引用整体并入；和/或基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物，例如本文先前所述的基因修饰的LeuCD′复合物。如本领域普通技术人员已知，可在LeuABCD途径(如图1所示)中的任何点处添加合适的底物，包含中间物和终产物代谢物。
在实施例中，具有异丙基苹果酸合成酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合成酶可如本文先前所描述，和/或如Marcheschi等人《用于碳链伸长的合成递归“+1”途径(Asynthetic recursive“+1”pathway for carbon chain elongation)》《ASC化学生物学(ACS chemical biology)》2012，7，689-697中所描述，其通过引用整体并入。在一些实施例中，具有异丙基苹果酸合成酶活性的基因修饰的异丙基苹果酸合成酶包含在以下位点之一或多处具有氨基酸取代的LeuA′变异体：Phe-47、Leu-73、His-97、Phe-99、Ser-139、Asn-167、Pro-169、Asn-197和/或Gly-462。Phe-47、Leu-73、His-97、Phe-99、Ser-139、Asn-167、Pro-169、Asn-197和/或Gly-462中的一个或多个；这些位点可被选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和/或缬氨酸的氨基酸取代。这类氨基酸取代可如本文先前所描述进行，例如，通过定点诱变。确切地说，可进行已知的异丙基苹果酸合成酶基因的定点诱变，例如大肠杆菌的LeuA(GenBank：登录号NC_000913.3基因ID：947465)来实现各种氨基酸取代。
在一些实施例中，基因修饰的LeuA′包含以下特别涵盖的取代：丙氨酸取代His-97、甘氨酸取代Ser-139、甘氨酸取代Asn-167、丙氨酸取代Pro-169和天冬氨酸取代Gly-462。据信具有这类特别涵盖的取代的基因修饰的LeuA′(即变异体)在捕获用于催化的目的2-酮酸方面比野生型LeuA更有效(更高的kcat/Km)。因此，不受理论的束缚，据信使用具有这类特别涵盖的取代的基因修饰的LeuA′变异体可提高相关的“+1”途径的总体效率。
在实施例中，具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的经基因修饰的苹果酸异丙基苹果酸脱氢酶如Sanghani等人在国际公开案第WO/2015/089127A1号中所描述，其全部内容通过引用并入。在一些实施例中，具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的基因修饰的苹果酸异丙基苹果酸脱氢酶包括在以下一个或多个位点具有取代的LeuB′变异体：Leu-96和/或Val-198。Leu-96和/或Val-198中的一个或多个可以被选自甘氨酸，丙氨酸和/或缬氨酸的氨基酸取代。这类氨基酸取代可如本文先前所描述进行，例如，通过定点诱变。确切地说，可进行已知的异丙基苹果酸脱氢酶基因定点诱变，例如大肠杆菌的LeuB(GenBank：登录号NC_000913.3基因ID：944798)来实现各种氨基酸取代。在一些实施例中，基因修饰的LeuB′包含以下特别涵盖的取代：甘氨酸或丙氨酸取代Leu-96和/或甘氨酸或丙氨酸取代Val-198。具有这类特别涵盖的取代的基因修饰的LeuB′变异体在将3-HM转化为相应的C7-C11 2-酮酸中被认为比野生型LeuB更有效(更高的kcat/Km)。因此，不受理论的束缚，据信使用具有这种特别涵盖的取代的基因修饰的LeuB′变异体可提高相关的“+1”途径的总体效率。
在2-酮丁酸、2-酮异戊酸或2-甲基-2-酮戊酸的链伸长后，C7-C11 2-酮酸可通过至少一种酶，例如硫氨素依赖性脱羧酶(例如，具有脱羧酶活性的野生型和/或基因修饰的硫氨素依赖性脱羧酶)的作用转化为C6-C10醛。确切地说，2-酮丁酸、2-酮异戊酸或2-甲基-2-酮戊酸可提供有具有脱羧酶活性的野生型和/或基因修饰的硫氨素依赖性脱羧酶和/或与其接触。在实施例中，野生型和/或基因修饰的硫氨素依赖的脱羧酶通过将C7-C11 2-酮酸转化为比所转化的C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛来起作用。在实施例中，硫氨素依赖性脱羧酶具有硫氨素依赖性脱羧酶活性。关于具有硫氨素依赖性脱羧酶活性的硫氨素依赖性脱羧酶的修饰和选择的进一步公开内容包含在共同待审的国际公开号第WO2015/089127号中，其通过引用整体并入本文。
C6-C10醛可用于多种工业应用和/或用作生产不同化学品的中间物和/或起始物质。例如，C6-C10醛可提供有醇脱氢酶(例如，野生型(登录号NC_001145.3，基因ID：855368)和/或基因修饰的醇脱氢酶)和/或与其接触，其将C6-C10醛转化为相应的C6-C10醇产物。在实施例中，醇脱氢酶具有醇脱氢酶活性。或者，C6-C10醛可提供有醛脱氢酶(例如，野生型和/或基因修饰的醛脱氢酶(登录号NM_000689.4))和/或与其接触，其将C6-C10醛转化为相应的C6-C10羧酸产物。在实施例中，醛脱氢酶具有醛脱氢酶活性。最后，C6-C10醛可与脂肪醛脱羰酶(例如，野生型和/或基因修饰的脂肪醛脱羰酶(登录号NM_100101.3))接触，其将C6-C10醛转化为相应的Cn-1烷烃产物。在实施例中，脂肪醛脱羰酶具有脂肪醛脱羰酶活性。在一些实施例中，本文先前描述的C5-C10醇、羧酸或烷烃产物，例如C6-C10醇、C6-C10羧酸和/或C5-C9烷烃以高特异性产生。例如，C5-C10醇、羧酸和/或烷烃产物可以总产物的约25重量％、约40重量％、约50重量％或约70重量％或更高的量产生。
在一些实施例中，制备C7-C11 2-酮酸的方法还包含用额外的酶和生化反应将C7-C11 2-酮酸转化为所需的C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸或C5-C9烷烃。这些方法可在非天然存在的，即基因工程细胞的所述实施例中的一个中以生物合成方式进行。例如，在说明性的非限制性实施例中，这些方法可在非天然存在的微生物体中进行。在其它说明性的非限制性实施例中，产生C7-C11 2-酮酸、C6-C10醛、C6-C10醇、C6-C10羧酸和/或C5-C9烷烃可通过在体外方法进行，例如从不包含微生物体的起始点开始。
在一些实施例中，制备C7-C11 2-酮酸的方法还包含：(II)在C7-C11 2-酮酸被转化为比被转化的C7-C11 2-酮酸少一个碳原子的C6-C10醛的条件下，向C7-C112-酮酸提供具有硫氨素依赖性脱羧酶活性的硫氨素依赖性脱羧酶(例如，具有硫氨素依赖性脱羧酶活性的野生型和/或基因修饰的硫氨素依赖性脱羧酶)。
在进一步的实施例中，制备C7-C11 2-酮酸的方法还包含：(III)在将C6-C10醛转化为相应的C6-C10醇的条件下，向C6-C10醛提供具有醇脱氢酶活性的醇脱氢酶(例如，具有醇脱氢酶活性的野生型和/或基因修饰的醇脱氢酶)。在一些实施例中，制备C7-C11 2-酮酸的方法还包含：(III)在将C6-C10醛转化为相应的C6-C10羧酸的条件下，向C6-C10醛提供具有醛脱氢酶活性的醛脱氢酶(例如，具有醛脱氢酶活性的野生型和/或基因修饰的醛脱氢酶)。在一些实施例中，制备C7-C11 2-酮酸的方法还包含：(III)在将C6-C10醛转化为相应的Cn-1烷烃的条件下，向C6-C10醛提供具有脂肪醛脱羰酶活性的脂肪醛脱羰酶(例如，具有脂肪醛脱羰酶活性的野生型和/或基因修饰的脂肪醛脱羰酶)。
制备C7-C11 2-酮酸的方法可在体内或在体外进行。取决于环境，在体内方法和在体外方法均可用于商业规模的生产。在一些实施例中，在体外方法可用于实验室和/或研究目的，例如进行酶促测定。在在体内和在体外方法中，都可以利用本文先前所描述的合适的微生物体。
已经详细描述了用基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物制备C7-C11 2-酮酸的方法的实施例。
实例
实例1：制备对2-己基苹果酸(2-HM)具有增加的活性的基因修饰的LeuCD′酶复合物.
在通过LeuABCD途径的递归活性进行2-酮壬酸生物合成期间，形成不同长度的2-烷基苹果酸作为LeuCD的底物。为了有效地生物合成2-酮壬酸，期望LeuCD有效捕获2-乙基苹果酸(中间物II，n＝1；图1)、2-丙基苹果酸(2-IPM；中间物II，n＝2；图1)、2-丁基苹果酸(中间物II，n＝3；图1)、2-戊基苹果酸(中间物II，n＝4；图1)和2-己基苹果酸(2-HM；中间物II，n＝5；图1)用于催化。野生型LeuCD在捕获较长的非天然2-烷基苹果酸底物方面效率较低。为了提高野生型LeuCD捕获2-己基苹果酸用于催化的效率，如下文所描述，使用蛋白质工程化技术修饰野生型LeuCD酶复合物的活性位点。
大肠杆菌异丙基苹果酸异构酶(LeuCD)是由称为LeuC的50kDa亚单位和称为LeuD的22.4kDa亚单位购成的异二聚体。两个亚单位在一起形成在二聚体界面处具有活性位点的功能酶。(通过同源建模构建的)LeuCD的结构模型识别排列在大肠杆菌LeuCD的2-异丙基苹果酸结合位点处的残基，且将猪乌头酸酶(蛋白质数据库(PDB)代码1ACO)和空肠弯曲杆菌的异丙基苹果酸异构酶小单位(PDB ID代码3Q3W)的晶体结构模型作为模板(图3)。最初，使用分子建模程序MOE(加拿大蒙特利尔Chemical Computing Group公司)，且分别使用猪乌头酸酶(PDB代码1ACO)和空肠弯曲杆菌的小亚单位(PDB ID代码3Q3W)作为模板，分开构建LeuC和LeuD亚单位的模型。通过将两个亚单位模型覆盖在乌头酸酶的两个结构域上来产生功能复合物。将存在于猪乌头酸酶晶体结构模型的活性位点中的4Fe-4S簇和反式乌头酸酶用作模板以构建在活性位点内结合的LeuCD与底物2-异丙基苹果酸和2-己基苹果酸的动力学胜任型模型。发现LeuC和Leu-31中的残基Val-35和Leu-411以及LeuD中的His-88接近底物的异丙基和己基，并且选择用于修饰(图2)。将这些残基中的每一个修饰成具有较小疏水侧链的氨基酸残基，以为较大的烷基让出空间。如表1中所示，设计了15种变异体用于评估。
表1.通过共表达各种LeuC和LeuD亚单位产生的LeuCD变异体以及LeuCD变异体的活性。
Figure BDA0002401009730000281
*通过对野生型氨基酸序列的修饰来识别LeuC和LeuD亚单位。这些特定基因修饰的符号以及本说明书中公开的基因修饰的类似符号遵循工业标准，其中氨基酸修饰被定义为起始单字母氨基酸代码，其后是氨基酸位置，其后是新的氨基酸单字母代码。L＝亮氨酸；A＝丙氨酸；G＝甘氨酸；V＝缬氨酸；S＝丝氨酸；和I＝异亮氨酸。
将工程化LeuCD变异体中的每一个表达、分离，然后在不进一步纯化的情况下评估对2-异丙基苹果酸(即2-IPM)、2-丁基苹果酸(即2-BM)和2-己基苹果酸(即2-HM)的活性，如下所述。2-IPM是LeuCD的天然底物，且在亮氨酸的生物合成期间在微生物体中形成。2-BM和2-HM是LeuCD的非天然底物，其将在C7-C11 2-酮酸，例如2-酮壬酸生物合成期间在细胞内形成。
使用下述酶测定法分两步进行LeuCD′变异体的评估。最初测试变异体对单一高浓度2-IPM、2-BM和2-HM的活性。测定涉及将LeuCD反应与LeuB反应偶联。因此，在测定期间，2-IPM最初通过LeuCD被异构化为3-异丙基苹果酸(3-IPM)，然后其通过测定混合物中存在的LeuB酶立即转化为4-甲基-2-酮戊酸。同样，在涉及2-BM或2-HM作为底物的测定中，在测定中形成的终产物分别是2-酮庚酸或2-酮壬酸。LeuCD变异体的活性根据偶联测定中产生的相应2-酮酸的量计算。LeuCD′变异体在将全部或部分2-烷基苹果酸底物(如2-HM)转化为相应的C7-C11 2-酮酸方面具有比野生型酶更高的活性，这是合意的，因为他们提高了整体效率并避免图1的相关“+1”LeuABCD途径的瓶颈。在初步评估之后，对选定数量的LeuCD变异体进行更详细的动力学分析，以确定最大速率(即kcat)、米氏常数(Michaelis-Mentenconstant)(即KM)和酶对一些底物的催化效率(即kcat/KM)。
实例2：LeuCD变异体在大肠杆菌中的表达.
为了评估表1中列出的野生型LeuCD和工程化LeuCD′变异体的底物的特异性，将每种复合物的基因分开表达到大肠杆菌细胞中。从大肠杆菌基因组网站EcoGene(http://ecogene.org)下载LeuC(EcoGene登录号EG11576(序列表，SEQ ID 1)和LeuD(EcoGene登录号EG11575)的基因序列。包含六个组氨酸的13个额外氨基酸的密码子融合在LeuC基因序列的Met-1密码子的上游。这种修饰允许在N-末端表达具有13个额外氨基酸的His-标记的LeuC。出于克隆的目的，向所得修饰基因中添加额外的碱基以分别在5′和3′端引入NcoI和SacI限制性位点。化学合成整个DNA序列，并由SGI公司在NcoI和SacI位点处将其克隆到大肠杆菌表达载体pRSFDuet-1(购自EMD Biosciences)中。向下载的LeuD基因序列中加入额外的碱基以分别在5′和3′端引入NdeI和XhoI限制性位点。同样地化学合成所得修饰基因并由SGI公司在NdeI和XhoI限制性位点处克隆到大肠杆菌表达载体pETDuet-1载体中。同样地，化学合成另外的LeuC和LeuD变异体的基因并分别克隆到pRSFDuet和pETDuet载体中。
通过用单独的LeuC和LeuD亚单位表达载体共转染它们，在大肠杆菌BL21(DE3)(购自EMD Biosciences)细胞中产生全功能异丙基苹果酸异构酶(即LeuCD)。通过共转染大肠杆菌细胞中LeuC和LeuD变异体载体的不同组合产生不同的LeuCD变异体。表1显示了用于在大肠杆菌中产生相应的LeuCD变异体的LeuC和LeuD载体组合。应注意，本文包含的序列表中没有一个显示使用的组氨酸标记，在这种情况下，其是Gly-Ser-Ser-His-His-His-His-His-His-Ser-Ser。
使用标准程序用LeuC和LeuD表达载体共转染大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上选择携带表达载体的细胞。通过将单个转化体菌落转移到50mL含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养基中并在37℃下以220rpm振荡温育过夜来开始发酵剂培养。第二天，将7mL发酵剂培养物接种到800mL极品肉汤(Terrific Broth，TB)中，并将培养物在37℃温育直至其OD600nm达到0.5。加入终浓度为1mM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖-吡喃糖苷(IPTG)以诱导LeuCD复合物或其变异体的表达，并将培养物转移至15℃温箱中，持续16小时。在16小时结束时，将培养物以8000转/分钟(rpm)的速度离心以使细胞造粒。将细胞团块分成四个等分试样并储存在-80℃直至破碎以分离LeuCD复合物。
将LeuCD复合物在厌氧室(从COY Lab Products(美国，密歇根州)获得)中从细胞团块中分离，保持在98％氮气和2％氢气下。将大肠杆菌团块悬浮于含有0.2mM硫酸亚铁铵、10mM DTT、30mM KCl、5mM MgCl2和蛋白酶抑制剂混合物(从美国SIGMA-ALDRICH获得)的50mM HEPES缓冲液(pH8.0)中。向细胞中添加2.5gm 0.1mm玻璃珠，并在Geno研磨机上以1750转破碎细胞3分钟。通过离心沉淀细胞碎片和玻璃珠，并将上清液与等体积的50％甘油混合并在-20℃下厌氧储存。
使用来自产生LeuCD变异体的细胞的全细胞裂解物进行每种LeuCD变异体的功能评估。为了比较每种LeuCD复合物的催化效率，使用装配有荧光检测器的Labchip GX II(马萨诸塞州，沃尔瑟姆Perkin Elmer公司)上的微流体毛细管电泳确定全细胞裂解物中LeuC和LeuD变异体的量。使用制造商提供的试剂和方案制备细胞裂解物用于毛细管电泳。简而言之，将4μL细胞提取物的等分试样与14μL变性缓冲液混合。将混合物在100℃加热5分钟并使其冷却至室温。冷却后，向混合物中加入70μL无菌水，并使用PerkinElmer提供的方案进行分析。LabChip GX II软件分析并报告了每个样品中检测到的LeuC和LeuD的大小、相对浓度和纯度。将来自含有空载体的细胞的细胞提取物作为阴性对照，用于识别提取物中的LeuC和LeuD蛋白。将由Pierce Biotechnology(伊利诺伊州，罗克福德)提供的分析级牛血清白蛋白(BSA)标准溶液(2mg/mL)用作定量的标准。在所有含有LeuCD复合物的提取物中，LeuC亚单位是限制性亚单位。每种LeuCD提取物的活性相对于提取物中存在的LeuC的量标准化。
实例3：确定野生型和工程化LeuCD′变异体的底物特异性.
开发了高通量LeuCD酶测定法，用于针对对2-异丙基苹果酸(即2-IPM)、2-丁基苹果酸(2-BM)和2-己基苹果酸(即2-HM)的活性，筛选和动力学评估实例1和2中制备的LeuCD′变异体。偶联测定涉及将LeuCD反应与LeuB反应偶联。因此，在测定期间，2-IPM最初通过LeuCD被异构化为3-异丙基苹果酸(3-IPM)，然后其通过测定混合物中存在的LeuB酶立即转化为4-甲基-2-酮戊酸。同样，在涉及2-BM或2-HM作为底物的测定中，在测定中形成的终产物分别是2-酮庚酸或2-酮壬酸。LeuCD变异体的活性根据偶联测定中产生的相应2-酮酸的量计算。
用于筛选每种变异体活性的HTP LeuCD偶联测定涉及将表达LeuCD变异体的细胞的全细胞裂解物与2.6mM 2-异丙基苹果酸(即2-IPM)、2-丁基苹果酸(即2-BM)或2-己基苹果酸(即2-HM)在混合物中温育，所述混合物含有以下：20μg野生型LeuB、16μg LeuB的L96G/V198A变异体、5mM NAD+、10mM DTT、20μg牛血清白蛋白、30mM KCl、5mM MgCl2和50mM HEPESpH 8。总测定体积是100μL，并在室温下在COY室中以厌氧方式进行1小时。添加等体积的含20％甲酸和10％甲醇的混合物终止反应。使用与AB Sciex 5500QTrap质谱仪偶联的Agilent 1290Infinity uHPLC对偶联测定中形成的2-酮酸进行定量。在反相条件下，在Waters Acquity HSS T3 1.8μM 3.0 x 150mm反相柱上分离2-酮酸后，通过在负模式下操作的单四极选择离子监测方法在质谱仪中进行检测和定量。定量基于来自定制合成的分析级标准参考物质的每种2-酮酸的外部校准曲线，除了4-甲基-2氧代戊酸，其可从Sigma-Aldrich商购获得。
用全细胞裂解物中LeuC亚单位的量标准化活性。2-IPM是LeuCD的原生底物，对其的活性表明，工程化酶能够在2-酮丁酸伸长至2-KN期间催化“+1”途径的早期循环。2-BM和2-HM是LeuCD的非原生底物。对2-HM活性高于野生型LeuCD的LeuCD变异体能够通过在2-KN形成期间使“+1”途径的后续循环更有效来改善辛醇产率。HTP测定涉及将LeuCD活性与“+1”LeuABCD途径中的下一个酶，异丙基苹果酸脱氢酶(即LeuB)的活性偶联。因此，通过LeuCD分别由2-IPM、2-BM或2-HM产生的3-异丙基苹果酸(即3-IPM)、3-丁基苹果酸或3-己基苹果酸(即3-HM)被LeuB氧化脱羧为2-酮异己酸、2-酮庚酸和2-酮壬酸(即2-KN)。然后，使用LC/MS对所有三种2-酮酸进行定量。
如表1中所示，野生型LeuCD(变异体3)对2-IPM和2-BM具有高活性，而对2-HM的活性非常小。表1还强调了13种LeuCD变异体在将2-己基苹果酸异构化为3-己基苹果酸时具有比野生型LeuCD高2至340倍的活性。LeuC亚单位内的残基Val-35和LeuD内的Leu-31对于改善对2-HM的活性具有重大影响。例如，变异体1(即V35A-LeuC+wt LeuD)和6(即wt LeuC+L31G-LeuD)对2-HM的活性比野生型LeuCD(即变异体3)分别高出63和341倍。虽然LeuC和LeuD中的V35A和L31G取代分别增加了对2-HM的活性，但他们显著降低了对2-IPM的活性。总之，数据表明，变异体1和6在2-酮丁酸伸长期间在“+1”途径早期循环中的效果明显低于野生型酶，但在2-酮丁酸伸长为2-酮壬酸的后期阶段期间的效率将高出60到350倍。表达野生型LeuCD和变异体1或6将改善2-酮丁酸到C7-C11 2-酮酸以及最终C6-C10醇的伸长。
实例4：确定对2-己基苹果酸(2-HM)显示高特异性的LeuCD变异体的催化效率
在初始评估之后，对野生型LeuCD和选定数量的变异体进行更详细的动力学分析以确定最大速率(即kcat)、米氏常数(即KM)，以及酶对2-IPM、2-BM和2-HM的催化效率(即kcat/KM)。使用上述HTP酶测定法进行动力学测定，稍作修改。在动力学参数测定期间，2-IPM、2-BM和2-HM浓度分别为0-0.625mM、0-5mM和0-1.6mM。测定进行30分钟，并调节野生型或LeuCD变异体提取物的量以将底物消耗限制在20％以下。对于最大速率(kcat)计算，酶反应中存在的LeuCD复合物的量基于使用在Labchip GX II(马萨诸塞州，沃尔瑟姆PerkinElmer公司)上的微流体毛细管电泳测定的LeuC的量来确定。通过使用Graphpad Prizm软件将测定中的活性拟合至米氏方程来计算动力学参数。
表2.LeuCD复合物的动力学参数。
Figure BDA0002401009730000331
如表2中所强调的，野生型LeuCD复合物(变异体3)在催化其天然底物2-IPM方面是高效的。野生型酶不太优选其非天然底物2-BM和2-HM，如其较低的kcat/KM值所证实。2-HM是最不优选的底物。变异体1、5、6、9、59和61显示出与野生型酶相比，对2-HM的催化效率提高5至480倍。动力学数据还表明，变异体5在催化2-BM异构化方面比2-HM更有效(kcat/KM)，而变异体6、9和61在催化2-HM方面比2-BM更有效。变异体1和59在催化2-BM和2-HM的异构化方面显示出非常相似的效率。
实例5：使用野生型LeuCD和其变异体以及′+1途径′酶在大肠杆菌的工程菌株中在体内产生C4-C8醇
菌株构建
在工程化大肠杆菌(E.coli)MG1655菌株中评估LeuCD变异体对醇产生的影响。修改MG1655菌株以改进线性醇产生，使得能够从Plac启动子表达基因并赋予克隆稳定性。线性醇产生的改进涉及敲低ilvBN和ilvIH基因，以及上调大肠杆菌MG1655中的ilvA基因。敲除ilvBN和IlvIH基因消除了支链醇的产生，而上调ilvA基因增加了2-酮丁酸的产生。通过用强组成型启动子BBa_J23119和合成核糖体结合位点BBa_B0034替换其原生启动子和核糖体结合位点来实现ilvA的上调。强组成型启动子和合成核糖体结合位点均获自标准生物组件登记处(Registry of Standard Biological Parts)(http://parts.igem.org)，由国际基因工程机器大赛(International Genetically Engineered Machine Competition，iGEM)策划的生物零件数据库。如Datsenko和Wanner(PNAS97(12)：6640-6645)所描述，通过λ(red)介导的重组进行ilvBN和ilvIH基因的敲除以及ilvA基因的原生启动子和核糖体结合位点的替换。为了能够从Plac启动子表达基因，使用λDE3溶原化试剂盒(EMD MilliporeCat#69734)将DE3溶原菌整合到MG1655中。为了确保克隆稳定性，通过λRed介导的同源重组使recA失活。用于醇产生研究的所得菌株的基因型是MG1655(DE3)ΔrecAΔilvBNΔilvIHilvAup。
载体构建
在评估LeuCD变异体在工程化MG1655大肠杆菌菌株中对C4-C8醇产生的影响期间，共表达以下七种酶：i)野生型大肠杆菌异丙基苹果酸合成酶(LeuA；GenBank：登录号NC000913.3基因ID：947465)、ii)LeuA*(Marcheschi等人《化学生物学(ACS Chem.Biol.)》2012，7，689-697描述的大肠杆菌IPMS的H97A/S139G/N167G/P169A/G462D变异体)、iii)野生型大肠杆菌异丙基苹果酸异构酶(LeuCD；GenBank：登录号NC 000913.3基因ID：94576和基因ID：945642)、iv)表3中描述的异丙基苹果酸异构酶变异体、v)大肠杆菌异丙基苹果酸脱氢酶(LeuB；GenBank：登录号NC 000913.3基因ID：944798)、vi)来自乳酸乳球菌(Lactocossus lactis)的酮异戊酸脱羧酶(KIVD*)的F381L/V461A变异体(Zhang等人PNAS.2008，105，20653-20658所描述)以及vii)酿酒酵母(S.cerevisiae)乙醇脱氢酶(ADH6；GenBank：登录号NC_001145.3基因ID：855368)。使用Marcheschi等人描述的两种表达载体pZE_LeuABCD-KA6和pZAlac_ilvAleuA(《化学生物学(ACS Chem.Biol.)》2012，7，689-697)在大肠杆菌中表达所有酶。pZE_LeuABCD-KA6从Liao博士的小组获得，不经任何进一步修饰即可使用。pZE_LeuABCD-KA6在工程化的MG1655菌株中表达LeuA*(Marcheschi等人《化学生物学(ACS Chem.Biol.)》2012，7，689-697描述的大肠杆菌IPMS的H97A/S139G/N167G/P169A/G462D变异体)、LeuB、LeuC、LeuD和KiVD*(来自乳酸乳球菌的酮异戊酸脱羧酶的F381L/V461A变异体，如Zhang等人PNAS.2008，105，20653-20658所描述)。具有Ilva和野生型LeuA基因拷贝的载体pZAlac_ilvAleuA被修饰以表达本文所描述的LeuCD变异体基因。构建包含表3中所示的LeuC和LeuD变异体基因的十一种载体，用于评估工程化MG1655菌株中对醇组成的影响。图7显示典型的修饰载体pOC-CL-0###，其与pZE_LeuABCD-KA6一起用于醇产生研究。如图7所示且在表3中列出，每个pOC-CL-0###载体具有表达给定LeuCD变异体的LeuC*和LeuD*基因，野生型大肠杆菌异丙基苹果酸异构酶和ilvA基因蛋白。两种载体中的所有基因都在pLacO1启动子下且使用异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导。
使用New England Bioscience的Gibson组装技术将LeuC和LeuD变异体的基因分两步克隆到pZAlac_ilvAleuA载体中。第一步涉及在pZAlac_ilvAleuA载体的ZraI位点插入LeuD变异体基因作为盒(如图8A所示)。LeuD变异体基因盒作为Gblock(通过IntegratedDNA Technologies)产生，且在LeuD变异体基因的5′侧具有placO1启动子、核糖体结合位点(rbs)和独特的NheI位点(图8A)。将终止子序列和独特的限制性位点置于LeuD变异体基因的3′端(图8A)。载体构建的第二步涉及使用Gibson组装技术引入LeuC变异体基因作为PCR产生的盒(图8B)。由pOC-CL-0###载体识别的最终所得载体中基因的排列如图2所示。对于醇产生，用含有完整途径的pZE_LeuABCD-KA6载体(图6)和表3中列出的pOC-CL-0###载体中的一个转化工程化大肠杆菌MG1655菌株(MG1655(DE3)ΔrecA ΔilvBN ΔilvIH ilvAup)。
表3.构建含有LeuC和LeuD变异体基因的载体，用于评估在工程化MG1655菌株中对醇组成的影响。
变异体 LeuC LeuD pOC-CL-0###
1 V35A Wt LeuD pOC-CL-0122
2 V35G Wt LeuD pOC-CL-0123
3 Wt LeuC Wt LeuD pOC-CL-0124
6 Wt LeuC L31G pOC-CL-0112
9 V35A L31G pOC-CL-0113
10 V35G L31V pOC-CL-0127
38 V35A/L411G L31A pOC-CL-0129
39 V35A/L411G L31G pOC-CL-0114
59 Wt LeuC L31V/H88A pOC-CL-0115
61 Wt LeuC L31G/H88A pOC-CL-0128
115 V35G/L411V L31A/H88S pOC-CL-0130
工程化MG1655细胞中的醇产生
在含有100ug/mL氨苄青霉素和25ug/mL卡那霉素的LB琼脂平板上选择用pZE_LeuABCD-KA6和表3中列出的pOC-CL-0###载体中的一个转化MG1655菌株。使用来自双重抗生素LB琼脂平板的单个菌落启动在含有100ug/mL氨苄青霉素和25ug/mL卡那霉素的LB培养基中的50mL发酵剂培养物，并在37℃下在设定为200rpm的温箱振荡器中温育过夜。温育12至16小时后，将含有5mL具有100ug/mL氨苄青霉素和25ug/ml卡那霉素的无菌修饰的2XM9培养基(表4中所示的组成)的血清瓶用50μL发酵剂培养物进行接种。
表4.用于表明由重组工程化以含有′+1途径′的大肠杆菌以及LeuCD变异体产生醇的培养基组成。
Figure BDA0002401009730000361
将培养物在37℃下以200rpm的速度振荡温育，并在3小时后使用0.1mM IPTG诱导以表达所有基因。诱导后将培养温度降至30℃。诱导后44小时，将其转移至4℃，持续20-30分钟来收集培养物。然后去掉血清瓶的盖子，且将1mL发酵液快速倒入含有1mL饱和氯化钠溶液和2mL分析级甲苯的15mL锥形管中。将发酵液-氯化钠-甲苯混合物涡旋30秒，并使用国际公开案第WO/2016/094604 A1号中描述的GC/FID方法，对甲苯提取物进行醇分析，其通过引用整体并入本文。
表5显示了10种LeuCD变异体对表达它们以及上述其他基因的菌株中的醇组成的影响。与仅表达野生型LeuCD的菌株相比，几种表达LeuCD变异体的细胞产生更高量的庚醇和/或辛醇。这表明本文报道的LeuCD变异体使用本文描述的非天然途径克服了产生＞C7醇的障碍。对数据的ANOVA分析显示LeuCD变异体6和59增加了庚醇效价(图9A)，而变异体6、9、10、38、39和61增加了辛醇效价(图9B，下图)，其显著高于野生型酶所产生的那些。表达LeuCD变异体6、9或39的细胞产生的辛醇量比WT LeuCD酶高6倍(图9B，下图)。
表5.含有′+1途径′酶以及WT和变异体LeuCD酶的大肠杆菌的血清瓶发酵的平均醇效价。
变异体# 1-丁醇 1-戊醇 1-己醇 1-庚醇 1-辛醇 总醇
WT 238.5±12.0 139.1±4.8 69.2±1.1 83.9±1.2 2.3±0.2 533.1±18.9
1 242.4±8.1 145.0±7.2 72.4±4.4 87.0±5.4 2.4±0.2 549.2±25.3
2 242.1±8.5 144.9±3.4 72.9±1.2 87.5±2.0 2.4±0.3 549.8±14.1
115 248.6±12.0 144.0±8.6 71.9±3.6 82.8±4.3 2.6±0.1 550.0±28.6
61 252.7±9.8 146.1±6.5 73.5±3.7 85.9±6.5 3.9±0.5 562.2±26.8
10 257.9±7.6 125.6±1.2 58.8±0.7 80.3±1.3 4.1±0.6 526.7±9.8
38 275.0±17.2 142.7±5.1 74.7±1.6 79.8±3.8 5.6±0.7 577.8±27.9
59 302.2±9.4 159.2±5.0 66.8±2.5 95.5±3.9 6.8±0.4 630.6±17.3
6 289.4±6.0 160.3±6.0 72.4±3.7 93.9±4.7 14.2±0.4 630.2±19.6
9 310.2±12.6 158.8±7.9 65.5±4.9 84.8±8.7 15.0±0.8 634.4±34.3
39 292.6±16.2 145.9±10.2 63.0±7.1 76.0±9.2 18.2±1.2 595.7±42.9
*ADH6和kivD也包含在所有菌株构筑体中。所有效价均以最少一式三份试验的毫克每升±标准偏差显示。诱导后44小时测量效价。
实例6：结果和讨论
为了提高“+1”途径产生2-酮壬酸的效率，异丙基苹果酸异构酶理想地有效地催化所有中间物2-烷基苹果酸异构化成其相应的3-烷基苹果酸。用于评估LeuCD变异体的三种底物表示这些中间物2-烷基苹果酸。更确切地说，2-异丙基苹果酸(即2-IPM)表示预期在“+1”迭代途径的早期循环期间形成的较短的2-烷基苹果酸底物；2-丁基苹果酸(即2-BM)和2-己基苹果酸(即2-HM)分别是在形成2-酮壬酸路径的迭代途径中形成的中等至最大的2-烷基苹果酸。对于在体外合成2-酮壬酸的“+1”迭代途径的最佳效率，LeuCD复合物组合需要有效地催化每个中间物2-烷基苹果酸转化为其相应的3-烷基苹果酸。从表2中可以看出，野生型LeuCD复合物的效率随着烷基链的大小增加而降低，其中2-HM是不良底物。在这些条件下，向反应混合物中加入变异体6将提高生产2-酮壬酸的途径的效率。
对于“+1”迭代途径的最佳效率，为了在体内制备2-酮壬酸，LeuCD复合物组合需要使其催化每个中间物2-烷基苹果酸转化的效率与细胞内其他酶的效率以及细胞内其他竞争性代谢途径匹配。在这种情况下，任何表1(或表5)列出的变异体可更适合，即使他们异构化2-HM的效率可能不是最高。
最初，针对对单个高浓度3-IPM、2-BM和3-HM的活性筛选LeuCD′变异体，然后确定所选择的几个的催化效率(表1和表2)。不希望受任何理论的束缚，表2中所示的结果可解释为表示用具有较小疏水侧链的氨基酸替换LeuC的Val-35和/或Leu-411，例如缬氨酸、丙氨酸取代Val-35和/或缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代Leu-411，和/或用具有较小疏水侧链的氨基酸替换LeuD的Leu-31和/或His-88，例如缬氨酸、丙氨酸或甘氨酸取代Leu-31和/或丝氨酸或丙氨酸取代His-88，在一些情况下可同时降低对3-IPM的酶活性，并增加对3-HM的酶活性。如表1中所示，这些变异体的各种组合对3-HM表现出比野生型酶更高的活性。这个分析表明，野生型LeuCD在捕获其原生底物(即2-IPM)用于催化方面非常有效，但随着“+1”途径迭代用于将2-酮丁酸伸长至C7-C11 2-酮酸(例如在这种情况下，2-酮壬酸)，其作为催化剂的活性逐渐降低。变异体1(V35A-LeuC+wt LeuD)、5(wt-LeuC+L31A LeuD)、6(wt-LeuC+L31G-LeuD)、9(V35A-LeuC+L31G-LeuD)、10(V35A-LeuC+L31V)、18(L411V-LeuC+L31G-LeuD)、31(V35A/L411V-LeuC+L31V-LeuD)、32(V35A/L411V-LeuC+L31A-LeuD)、39(W35A/L411G-LeuC+L31G-LeuD)、59(wt-LeuC+L31V/H88A-LeuD)、61(wt-LeuC+L31G/H88A-LeuD)、64(wt-LeuC+L31G/H88S-LeuD)和115(V35G/L411V-LeuC+L31A/H88S-LeuD)对2-HM的活性比野生型LeuCD(变异体3)高2至341倍。虽然LeuC和LeuD中的这些不同取代增加了对2-HM的活性，但他们减少或消除了对2-IPM的活性。总之，数据表明，这些在2-酮丁酸伸长期间在“+1”途径的早期循环中的效率明显低于野生型酶，但在2-酮丁酸伸长至C8-C11 2-酮酸的后期阶段期间的效率将提高2至341倍。表达野生型LeuCD和变异体1、5、6、9、10、18、31、32、39、59、61、64或115将克服2-酮丁酸伸长至C7-C11 2-酮酸以及最终C6-C10醇期间LeuCD相关的瓶颈。
数据显示，基因修饰的LeuCD′酶通常以比野生型酶更高的催化效率操作，以如所示催化2-己基苹果酸形成3-己基苹果酸，随后形成2-酮壬酸。还可以推断，其将更有效地催化2-戊基苹果酸以形成3-戊基苹果酸，随后形成2-酮辛酸。最后，其还可能以更高的催化效率进行这些转化的组合。表5中所示，与仅表达野生型LeuCD的菌株相比，几种表达LeuCD变异体的细胞产生更高量的庚醇和/或辛醇。这表明本文报道的LeuCD变异体使用本文使用的非天然途径克服了产生＞C7醇的障碍。LeuCD变异体6和59增加了庚醇效价，而变异体6、9、10、38、39、59和61与野生型酶产生的那些相比增加了辛醇效价。表达LeuCD变异体6、9或39的细胞产生的辛醇量比WT LeuCD酶高>6倍。
实例7：制备表达具有N端(His)6标签的LeuC或具有C端(His)6标签的LeuC的基因修饰的LeuCD酶复合物
制备表达具有N端(His)6标签的LeuC或具有C端(His)6标签的LeuC的基因修饰的LeuCD酶复合物。确切地说，从大肠杆菌基因组网站EcoGene(http://ecogene.org)下载LeuC(EcoGene登录号EG11576和LeuD(EcoGene登录号EG11575)的基因序列。包含六个组氨酸的13个额外氨基酸的密码子融合在LeuC基因序列的Met-1密码子的上游。这种修饰允许在N端表达具有13个额外氨基酸的(His)6标记的LeuC。在表6中提供具有在N端的13个额外的氨基酸的His标记的LeuC的所得479个氨基酸序列。表6中加下划线的13个氨基酸是添加到包含(His)6标签的N端的13个氨基酸。出于克隆的目的，向所得修饰基因中添加额外的碱基以分别在5′和3′端引入NcoI和SacI限制性位点。化学合成整个DNA序列，并通过SGI Inc.在NcoI和SacI位点克隆到大肠杆菌表达载体pRSFDuet-1(购自EMD Biosciences)。LeuD也经过化学合成(不带任何标签)并克隆到pETDuet-1载体。通过用单独的LeuC和LeuD亚单位表达载体(即PRSFDuet-1载体和pETDuet-1载体)共转染它们，在大肠杆菌BL21(DE3)(购自EMD Biosciences)细胞中产生全功能异丙基苹果酸异构酶(即LeuCD)。
表6.N端His标记的LeuC(即，N-His LeuC插入物479aa)和C端His标记的LeuC(即，C-His LeuC插入物476aa)的氨基酸序列。
Figure BDA0002401009730000401
还将包含六个组氨酸的10个额外氨基酸的密码子分开融合在LeuC基因序列的Lys-466密码子的下游。这种修饰允许在C端表达具有10个额外氨基酸的(His)6标记的LeuC。在表6中提供在C端上具有10个额外氨基酸的(His)6标记的LeuC的所得476个氨基酸序列。在表6中加下划线的10个氨基酸是添加到包含(His)6标签的C端的10个氨基酸。出于克隆的目的，向所得修饰基因中添加额外的碱基以分别在5′和3′端引入NcoI和SacI限制性位点。化学合成整个DNA序列，并通过SGI Inc.在NcoI和SacI位点克隆到大肠杆菌表达载体pRSFDuet-1(购自EMD Biosciences)。LeuD也经过化学合成(不带任何标签)并克隆到pETDuet-1载体。通过用单独的LeuC和LeuD亚单位表达载体(即PRSFDuet-1载体和pETDuet-1载体)共转染它们，在大肠杆菌BL21(DE3)(购自EMD Biosciences)细胞中产生全功能异丙基苹果酸异构酶(即LeuCD)。
使用标准技术用N-His LeuC、C-His LeuC和/或LeuD表达载体共转染大肠杆菌BL21(DE3)细胞。在含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上选择携带表达载体的细胞。通过将单个转化体菌落转移到50mL含有100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素的LB培养基中并在37℃下以220rpm振荡温育过夜来开始发酵剂培养。第二天，将7mL发酵剂培养物接种到800mL极品肉汤(TB)中，并将培养物在37℃温育直至其OD600nm达到0.5。添加终浓度为1mM的异丙基β-D-1-硫代半乳糖-吡喃糖苷(即IPTG)以诱导LeuCD复合物或其变异体的表达，并将培养物转移至15℃温箱中，持续16小时(h)。在16小时结束时，将培养物以8000转/分钟(rpm)的速度离心以使细胞造粒。将细胞团块分成四个等分试样并储存在-80℃直至破碎以分离LeuCD复合物。
将LeuCD复合物在厌氧室(从COY Lab Products(美国，密歇根州)获得)中从细胞团块中分离，保持在98％氮气和2％氢气下。将所制备的大肠杆菌沉淀悬浮于含有0.2mM硫酸亚铁铵、10mM DTT、30mM KCl、5mM MgCl2和蛋白酶抑制剂混合物(从美国SIGMA-ALDRICH获得)的50mM HEPES缓冲液(pH8.0)中。向细胞中添加2.5gm 0.1mm玻璃珠，并在Geno研磨机上以1750转破碎细胞3分钟。通过离心沉淀细胞碎片和玻璃珠，并将上清液与等体积的50％甘油混合并在-20℃下厌氧储存。
实例8：评估表达具有N端(His)6标签的LeuC或具有C端(His)6标签的LeuC的基因修饰的LeuCD酶复合物的底物特异性
实例3中所描述的高通量(即HTP)LeuCD酶测定用于评估基因修饰的LeuCD酶复合物的底物特异性，所述复合物含有具有N端(His)6标签或C端(His)6标签的LeuC，如实例7中所制备。如实例3中所描述评估基因修饰的LeuCD酶复合物针对2-IPM和2-HM的活性。如实例3中所描述，测定涉及将LeuCD反应与LeuB反应偶联。因此，在测定期间，2-IPM最初通过LeuCD被异构化为3-异丙基苹果酸(3-IPM)，然后其通过测定混合物中存在的LeuB酶立即转化为2-酮异己酸。同样，在涉及2-BM作为底物的测定中，在测定中形成的终产物是2-酮壬酸。LeuCD变异体的活性根据偶联测定中产生的相应2-酮酸的量计算。
简而言之，测定涉及用2mM 2-IPM或2-HM在混合物中温育温育来自表达实例7的修饰的LeuCD酶复合物的细胞的全细胞裂解物，所述混合物含有：20μg野生型LeuB、16μg LeuB的L96G/V198A变异体、5mM NAD+、10mM DTT、20μg牛血清白蛋白、30mM KCl、5mM MgCl2和50mMHEPES pH 8。总测定体积是100μL，并在室温下在COY室中以厌氧方式进行1小时。添加等体积的含20％甲酸和10％甲醇的混合物终止反应。使用与AB Sciex 5500QTrap质谱仪偶联的Agilent 1290Infinity uHPLC对偶联测定中形成的2-酮酸进行定量。在反相条件下，在Waters Acquity HSS T31.8μM 3.0x 150mm反相柱上分离2-酮酸后，通过在负模式下操作的单四极选择离子监测方法在质谱仪中进行检测和定量。定量基于来自定制合成的分析级标准参考物质的每种2-酮酸的外部校准曲线，除了4-甲基-2-氧代戊酸，其可从Sigma-Aldrich商购获得。
比较每种基因修饰的LeuCD酶复合物对2-IPM和2-HM的活性。2-IPM是LeuCD的原生底物，对其的活性表明，工程化酶能够在2-酮丁酸伸长至2-酮壬酸(即2-KN)期间催化“+1”途径的早期循环。2-HM是LeuCD的非原生底物。对2-HM活性高于野生型LeuCD的LeuCD变异体能够通过在2-KN形成期间使“+1”途径的后续循环更有效来提高2-KN产率。HTP测定涉及将LeuCD活性与“+1”LeuABCD途径中的下一个酶，异丙基苹果酸脱氢酶(即LeuB)的活性偶联。因此，通过LeuCD分别由2-IPM或2-HM产生的3-异丙基苹果酸(即3-IPM)或3-己基苹果酸(即3-HM)被LeuB氧化脱羧为2-酮异己酸和2-酮壬酸(即2-KN)。然后，使用LC/MS定量所有2-酮酸。
如图10A-10B所示，表达具有N端(His)6标签的LeuC(即，N-His LeuC；表6)的基因修饰的LeuCD酶复合物显示出与2-HM(图10B)相比对2-IPM(图10A)的活性高100倍。有趣的是，尽管表达具有C端(His)6标签的LeuC(即，C-His LeuC；表6)的基因修饰的LeuCD酶复合物对2-IPM(图10A)几乎没有可检测的活性，但是C-His LeuC表现出对2-HM(图10B)显著更高的活性。不受理论的束缚，据信LeuC的C端上的额外氨基酸序列加宽了LeuCD的活性位点，使得LeuCD不再能接受2-IPM作为底物。相反，C-His LeuC优选2-HM较大的化合物作为它的底物。因此，据信在LeuC的C端上添加这种氨基酸序列将改善在“+1”途径中2-酮丁酸向C7-C11 2-酮酸，并最终向C6-C10醇的伸长。
保藏信息
先前公开的含有LeuCD变异体38(V35A/L411G-LeuC+L31A-LeuD)的大肠杆菌、含有LeuCD变异体39(W35A/L411G-LeuC+L31G-LeuD)的大肠杆菌、含有LeuCD变异体10(V35A-LeuC+L31V-LeuD)的大肠杆菌、含有LeuCD变异体6(wt-LeuC+L31G-LeuD)的大肠杆菌、含有LeuCD变异体59(wt-LeuC+L31V/H88A-LeuD)的大肠杆菌、含有LeuCD变异体9(V35A-LeuC+L31G-LeuD)的大肠杆菌和含有LeuCD变异体61(wt-LeuC+L31G/H88A-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株已由弗吉尼亚州20110，马纳萨斯，大学大道美国典型培养物保藏中心(theAmerican Type Culture Collection，ATCC)，10801根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约条款保藏。保藏日期为2016年9月2日，代表陶氏全球技术公司(DowGlobal Technologies)。自本申请的提交日期之前，每个菌株的25个小瓶的保藏物取自发明人保持的相同保藏物。这些保藏物旨在满足37C.F.R.§1.801-1.809的所有要求。保藏物将在保藏库保存30年，或在最后一次请求后保存5年，或保存长达专利有效期(以较长者为准)，并在此期间根据需要予以更换。含有LeuCD变异体38((V35A/L411G-LeuC+L31A-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月2日保藏在ATCC(ATCC专利保藏号：PTA-123472)。含有LeuCD变异体39(W35A/L411G-LeuC+L31G-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月2日保藏在ATCC(ATCC专利保藏号：PTA-123473)。含有LeuCD变异体10(V35A-LeuC+L31V-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月6日保藏在ATCC(ATCC专利保藏号：PTA-123474)。含有LeuCD变异体6(wt-LeuC+L31G-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月6日保藏在ATCC(ATCC专利保藏号：PTA-123475)。含有LeuCD变异体59(wt-LeuC+L31V/H88A-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月6日保藏在ATCC(ATCC专利保藏号：PTA-123477)。含有LeuCD变异体9(V35A-LeuC+L31G-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月6日保藏在ATCC(ATCC专利保藏号：PTA-123478)。含有LeuCD变异体61(wt-LeuC+L31G/H88A-LeuD)的大肠杆菌的微生物菌株于2016年9月6日保藏在ATCC(ATCC专利保藏号：PTA-123479)。
序列表
<110> 陶氏环球技术有限责任公司（DOW GLOBAL TECHNOLOGIES LLC）
<120>基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物及用其制备伸长的2-酮酸和C5-C10化合物的方法
<130> QS-P200197P
<150> 62/565,271
<151> 2017-09-17
<160> 40
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 466
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 1
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Val Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Leu Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys
465
<210> 2
<211> 201
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<400> 2
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Leu Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu His Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 3
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (35)..(35)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35A)
<400> 3
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Ala Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Leu Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys
465
<210> 4
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (35)..(35)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35G)
<400> 4
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Gly Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Leu Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys
465
<210> 5
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (411)..(411)
<223> 合成的-修饰的LeuC (L411A)
<400> 5
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Val Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Ala Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys
465
<210> 6
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (411)..(411)
<223> 合成的-修饰的LeuC (L411G)
<400> 6
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Val Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Gly Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys
465
<210> 7
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (411)..(411)
<223> 合成的-修饰的LeuC (L411V)
<400> 7
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Val Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Val Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys
465
<210> 8
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (35)..(35)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35A L411A)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (411)..(411)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35A L411A)
<400> 8
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Ala Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Ala Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys
465
<210> 9
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (35)..(35)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35A L411G)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (411)..(411)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35A L411G)
<400> 9
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Ala Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Gly Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys
465
<210> 10
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (35)..(35)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35A L411V)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (411)..(411)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35A L411V)
<400> 10
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Ala Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Val Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys
465
<210> 11
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (35)..(35)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35G L411A)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (411)..(411)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35G L411A)
<400> 11
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Gly Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Ala Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys
465
<210> 12
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (35)..(35)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35G L411G)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (411)..(411)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35G L411G)
<400> 12
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Gly Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Gly Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys
465
<210> 13
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (35)..(35)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35G L411V)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (411)..(411)
<223> 合成的-修饰的LeuC (V35G L411V)
<400> 13
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Gly Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Val Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys
465
<210> 14
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (H88A)
<400> 14
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Leu Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ala Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 15
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (H88G)
<400> 15
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Leu Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Gly Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 16
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (H88V)
<400> 16
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Leu Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Val Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 17
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (H88S)
<400> 17
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Leu Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ser Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 18
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31A)
<400> 18
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ala Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu His Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 19
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31A H88A)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31A H88A)
<400> 19
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ala Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ala Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 20
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31A H88G)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31A H88G)
<400> 20
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ala Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Gly Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 21
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31A H88V)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31A H88V)
<400> 21
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ala Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Val Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 22
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31A H88S)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31A H88S)
<400> 22
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ala Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ser Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 23
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31G)
<400> 23
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Gly Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu His Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 24
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31G H88A)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31G H88A)
<400> 24
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Gly Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ala Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 25
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31G H88G)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31G H88G)
<400> 25
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Gly Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Gly Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 26
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31G H88V)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31G H88V)
<400> 26
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Gly Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Val Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 27
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD( L31G H88S)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD( L31G H88S)
<400> 27
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Gly Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ser Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 28
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31V)
<400> 28
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Val Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu His Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 29
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31V H88A)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31V H88A)
<400> 29
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Val Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ala Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 30
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31V H88G)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31V H88G)
<400> 30
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Val Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Gly Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 31
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31V H88V)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31V H88V)
<400> 31
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Val Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Val Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 32
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31V H88S)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31V H88S)
<400> 32
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Val Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ser Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 33
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31S)
<400> 33
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ser Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu His Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 34
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31S H88A)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31S H88A)
<400> 34
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ser Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ala Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 35
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31S H88G)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31S H88G)
<400> 35
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ser Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Gly Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 36
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31S H88V)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31S H88V)
<400> 36
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ser Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Val Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 37
<211> 201
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (31)..(31)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31S H88S)
<220>
<221> MUTAGEN
<222> (88)..(88)
<223> 合成的-修饰的LeuD (L31S H88S)
<400> 37
Met Ala Glu Lys Phe Ile Lys His Thr Gly Leu Val Val Pro Leu Asp
1 5 10 15
Ala Ala Asn Val Asp Thr Asp Ala Ile Ile Pro Lys Gln Phe Ser Gln
20 25 30
Lys Val Thr Arg Thr Gly Phe Gly Ala His Leu Phe Asn Asp Trp Arg
35 40 45
Phe Leu Asp Glu Lys Gly Gln Gln Pro Asn Pro Asp Phe Val Leu Asn
50 55 60
Phe Pro Gln Tyr Gln Gly Ala Ser Ile Leu Leu Ala Arg Glu Asn Phe
65 70 75 80
Gly Cys Gly Ser Ser Arg Glu Ser Ala Pro Trp Ala Leu Thr Asp Tyr
85 90 95
Gly Phe Lys Val Val Ile Ala Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Tyr Gly
100 105 110
Asn Ser Phe Asn Asn Gln Leu Leu Pro Val Lys Leu Ser Asp Ala Glu
115 120 125
Val Asp Glu Leu Phe Ala Leu Val Lys Ala Asn Pro Gly Ile His Phe
130 135 140
Asp Val Asp Leu Glu Ala Gln Glu Val Lys Ala Gly Glu Lys Thr Tyr
145 150 155 160
Arg Phe Thr Ile Asp Ala Phe Arg Arg His Cys Met Met Asn Gly Leu
165 170 175
Asp Ser Ile Gly Leu Thr Leu Gln His Asp Asp Ala Ile Ala Ala Tyr
180 185 190
Glu Ala Lys Gln Pro Ala Phe Met Asn
195 200
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(10)
<223> 合成的-可变长度C端肽
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(2)
<223> 命名为"Xaa"的氨基酸可是任何天然存在的氨基酸。位置1-2处命名为"Xaa"的氨基酸的任一个或全部可存在或不存在。
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(10)
<223> 命名为"Xaa"的氨基酸可是任何天然存在的氨基酸。位置9-10处命名为"Xaa"的氨基酸的任一个或全部可存在或不存在。
<400> 38
Xaa Xaa His His His His His His Xaa Xaa
1 5 10
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(10)
<223> 合成的-非可变C端肽
<400> 39
Ser Ser His His His His His His Ser Ser
1 5 10
<210> 40
<211> 476
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(476)
<223> 合成的-具有C端肽的LeuC'亚单位
<400> 40
Met Ala Lys Thr Leu Tyr Glu Lys Leu Phe Asp Ala His Val Val Tyr
1 5 10 15
Glu Ala Glu Asn Glu Thr Pro Leu Leu Tyr Ile Asp Arg His Leu Val
20 25 30
His Glu Val Thr Ser Pro Gln Ala Phe Asp Gly Leu Arg Ala His Gly
35 40 45
Arg Pro Val Arg Gln Pro Gly Lys Thr Phe Ala Thr Met Asp His Asn
50 55 60
Val Ser Thr Gln Thr Lys Asp Ile Asn Ala Cys Gly Glu Met Ala Arg
65 70 75 80
Ile Gln Met Gln Glu Leu Ile Lys Asn Cys Lys Glu Phe Gly Val Glu
85 90 95
Leu Tyr Asp Leu Asn His Pro Tyr Gln Gly Ile Val His Val Met Gly
100 105 110
Pro Glu Gln Gly Val Thr Leu Pro Gly Met Thr Ile Val Cys Gly Asp
115 120 125
Ser His Thr Ala Thr His Gly Ala Phe Gly Ala Leu Ala Phe Gly Ile
130 135 140
Gly Thr Ser Glu Val Glu His Val Leu Ala Thr Gln Thr Leu Lys Gln
145 150 155 160
Gly Arg Ala Lys Thr Met Lys Ile Glu Val Gln Gly Lys Ala Ala Pro
165 170 175
Gly Ile Thr Ala Lys Asp Ile Val Leu Ala Ile Ile Gly Lys Thr Gly
180 185 190
Ser Ala Gly Gly Thr Gly His Val Val Glu Phe Cys Gly Glu Ala Ile
195 200 205
Arg Asp Leu Ser Met Glu Gly Arg Met Thr Leu Cys Asn Met Ala Ile
210 215 220
Glu Met Gly Ala Lys Ala Gly Leu Val Ala Pro Asp Glu Thr Thr Phe
225 230 235 240
Asn Tyr Val Lys Gly Arg Leu His Ala Pro Lys Gly Lys Asp Phe Asp
245 250 255
Asp Ala Val Ala Tyr Trp Lys Thr Leu Gln Thr Asp Glu Gly Ala Thr
260 265 270
Phe Asp Thr Val Val Thr Leu Gln Ala Glu Glu Ile Ser Pro Gln Val
275 280 285
Thr Trp Gly Thr Asn Pro Gly Gln Val Ile Ser Val Asn Asp Asn Ile
290 295 300
Pro Asp Pro Ala Ser Phe Ala Asp Pro Val Glu Arg Ala Ser Ala Glu
305 310 315 320
Lys Ala Leu Ala Tyr Met Gly Leu Lys Pro Gly Ile Pro Leu Thr Glu
325 330 335
Val Ala Ile Asp Lys Val Phe Ile Gly Ser Cys Thr Asn Ser Arg Ile
340 345 350
Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ala Glu Ile Ala Lys Gly Arg Lys Val Ala
355 360 365
Pro Gly Val Gln Ala Leu Val Val Pro Gly Ser Gly Pro Val Lys Ala
370 375 380
Gln Ala Glu Ala Glu Gly Leu Asp Lys Ile Phe Ile Glu Ala Gly Phe
385 390 395 400
Glu Trp Arg Leu Pro Gly Cys Ser Met Cys Leu Ala Met Asn Asn Asp
405 410 415
Arg Leu Asn Pro Gly Glu Arg Cys Ala Ser Thr Ser Asn Arg Asn Phe
420 425 430
Glu Gly Arg Gln Gly Arg Gly Gly Arg Thr His Leu Val Ser Pro Ala
435 440 445
Met Ala Ala Ala Ala Ala Val Thr Gly His Phe Ala Asp Ile Arg Asn
450 455 460
Ile Lys Ser Ser His His His His His His Ser Ser
465 470 475

Claims (15)

1.一种基因修饰的LeuCD′酶复合物，其包括：
(a)基因修饰的LeuC′亚单位，其包括：
(1)与具有C端的SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和
(2)与(a)(1)的所述氨基酸序列的C端偶联的C端氨基酸或肽，其中所述C端氨基酸选自任何天然存在的氨基酸，且其中所述C端肽包括氨基酸序列：(Xaa)1(Xaa)2(Xaa)3(Xaa)4(Xaa)5(Xaa)6(Xaa)7(Xaa)8(Xaa)9(Xaa)10(SEQ ID NO：39)，其中：
(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9和(Xaa)10各自独立地选自任何天然存在的氨基酸，或不存在，条件是(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的至少两个存在于所述C端肽中；和
(b)LeuD亚单位，其包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列，其中所述基因修饰的LeuCD′酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性。
2.根据权利要求1所述的基因修饰的LeuCD′酶复合物，其中所述基因修饰的LeuCD′亚单位包括所述C端肽，且存在其中(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的至少六个。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的基因修饰的LeuCD′酶复合物，其中所述基因修饰的LeuC′亚单位包括所述C端肽，且其中存在于所述C端肽中的(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的每个独立地选自Ser、Thr、His、Lys和Arg。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的基因修饰的LeuCD′酶复合物，其中：
所述基因修饰的LeuC′亚单位包括所述C端肽；
(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)9和(Xaa)10各自独立地选自Ser和Thr；并且
(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7和(Xaa)8各自独立地选自His、Lys和Arg。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的基因修饰的LeuCD′酶复合物，其中所述基因修饰的LeuC′亚单位包括所述C端肽(SEQ ID NO：40)。
6.一种包括至少一种基因修饰的LeuCD′酶复合物的微生物体，所述复合物包括：
(a)基因修饰的LeuC′亚单位，其包括：
(1)与具有C端的SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和
(2)与(a)(1)的所述氨基酸序列的C端偶联的C端氨基酸或肽，其中所述C端氨基酸选自任何天然存在的氨基酸，且其中所述C端肽包括氨基酸序列：(Xaa)1(Xaa)2(Xaa)3(Xaa)4(Xaa)5(Xaa)6(Xaa)7(Xaa)8(Xaa)9(Xaa)10(SEQ ID NO：39)，其中：
(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9和(Xaa)10各自独立地选自任何天然存在的氨基酸，或不存在，条件是(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的至少两个存在于所述C端肽中；和
(b)包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列的LeuD亚单位，其中所述至少一种基因修饰的LeuCD′酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性。
7.根据权利要求6所述的微生物体，其中所述基因修饰的LeuC′亚单位包括所述C端肽，且其中存在(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的至少六个。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的微生物体，其中所述基因修饰的LeuC′亚单位包括所述C端肽，且其中存在于所述C端肽中的(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的每个独立地选自Ser、Thr、His、Lys和Arg。
9.根据权利要求6到8中任一项所述的微生物体，其中：
所述基因修饰的LeuC′亚单位包括所述C端肽；
(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)9和(Xaa)10各自独立地选自Ser和Thr；并且
(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7和(Xaa)8各自独立地选自His、Lys和Arg。
10.根据权利要求6到9中任一项所述的微生物体，其中所述基因修饰的LeuC′亚单位包括所述C端肽(SEQ ID NO：40)。
11.一种制备C7-C112-酮酸的方法，所述方法包括：(I)提供C4-C102-酮酸底物中的至少一种，其具有：
(A)至少一种具有异丙基苹果酸合成酶活性的异丙基苹果酸合成酶；
(B)至少一种具有异丙基苹果酸脱氢酶活性的异丙基苹果酸脱氢酶；和
(C)至少一种基因修饰的LeuCD′酶复合物，其包括：
(1)基因修饰的LeuC′亚单位，其包括：
(i)与具有C端的SEQ ID NO：1具有至少80％同源性的氨基酸序列；和
(ii)与(I)(C)(1)(i)的氨基酸序列的C端偶联的C端氨基酸或肽，其中所述C端氨基酸选自任何天然存在的氨基酸，且其中所述C端肽包括氨基酸序列：(Xaa)1(Xaa)2(Xaa)3(Xaa)4(Xaa)5(Xaa)6(Xaa)7(Xaa)8(Xaa)9(Xaa)10(SEQ ID NO：39)，其中：
(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9和(Xaa)10各自独立地选自任何天然存在的氨基酸，或不存在，条件是(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的至少两个存在于所述C端肽中；和
(2)包括与SEQ ID NO：2具有至少80％同源性的氨基酸序列的LeuD亚单位；
在所述C4-C102-酮酸底物中的至少一种转化为所述C7-C112-酮酸的条件下，其中：
所述至少一种基因修饰的LeuCD′酶复合物具有异丙基苹果酸异构酶活性，并且
所述C4-C102-酮酸底物的至少一种转化为所述C7-C112-酮酸通过一种或多种生化反应发生。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述基因修饰的LeuC′亚单位包括所述C端肽，且其中存在(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的至少六个。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，所述基因修饰的LeuC′亚单位包括所述C端肽，其中存在于所述C端肽中的(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7、(Xaa)8、(Xaa)9或(Xaa)10中的每个独立地选自Ser、Thr、His、Lys和Arg。
14.根据权利要求11到13中任一项所述的方法，其中：
所述基因修饰的LeuC′亚单位包括所述C端肽；
(Xaa)1、(Xaa)2、(Xaa)9和(Xaa)10各自独立地选自Ser和Thr；并且
(Xaa)3、(Xaa)4、(Xaa)5、(Xaa)6、(Xaa)7和(Xaa)8各自独立地选自His、Lys和Arg。
15.根据权利要求11到14中任一项所述的方法，其中所述基因修饰的LeuC′亚单位包括所述C端肽(SEQ ID NO：40)。
CN201880057654.4A 2017-09-29 2018-09-25 基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物及用其制备伸长的2-酮酸和c5-c10化合物的方法 Pending CN111201321A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762565271P 2017-09-29 2017-09-29
US62/565271 2017-09-29
PCT/US2018/052579 WO2019067412A1 (en) 2017-09-29 2018-09-25 GENETICALLY MODIFIED ISOPROPYLMALATE ISOMERASE ENZYME COMPLEXES AND METHODS FOR PREPARING ELONGATE 2-CÉTOACIDES AND C5-C10 COMPOUNDS THEREWITH

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111201321A true CN111201321A (zh) 2020-05-26

Family

ID=63915106

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880057654.4A Pending CN111201321A (zh) 2017-09-29 2018-09-25 基因修饰的异丙基苹果酸异构酶酶复合物及用其制备伸长的2-酮酸和c5-c10化合物的方法

Country Status (6)

Country Link
US (2) US11230705B2 (zh)
EP (1) EP3688175B1 (zh)
CN (1) CN111201321A (zh)
BR (1) BR112020005080A2 (zh)
CA (1) CA3076748A1 (zh)
WO (1) WO2019067412A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111233986B (zh) * 2020-02-28 2020-11-06 盐城师范学院 一种表达链球菌溶血素成熟蛋白的工程菌及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101939433A (zh) * 2007-07-23 2011-01-05 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 酵母中生产乙酰-CoA的酶
CN105793431A (zh) * 2013-12-12 2016-07-20 陶氏环球技术有限责任公司 通过微生物代谢途径的遗传修饰制备延长的2-酮酸和由此生成的c6-c10化合物的方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2010003501A (es) 2007-10-04 2010-06-09 Bio Architecture Lab Inc Produccion de biocombustible.
JP5578767B2 (ja) 2008-01-28 2014-08-27 克己 飯田 蒸発装置
WO2010045629A2 (en) 2008-10-18 2010-04-22 The Regents Of The University Of California Production of c5-c8 alcohols using evolved enzymes and metabolically engineered microorganisms
IT1398927B1 (it) * 2009-06-25 2013-03-28 Consorzio Interuniversitario Per Lo Sviluppo Dei Sistemi A Grande Interfase Csgi Espressione batterica di un gene artificiale per la produzione di crm197 e derivati.
EP2464736A4 (en) 2009-08-12 2013-07-31 Gevo Inc PATIENT LOCALIZATION OF CYTOSOLIC ISOBUTANOL FOR THE MANUFACTURE OF ISOBUTANOL
US8372610B2 (en) 2010-09-15 2013-02-12 Ls9, Inc. Production of odd chain fatty acid derivatives in recombinant microbial cells
WO2012135731A2 (en) 2011-04-01 2012-10-04 The Regents Of The University Of California Alcohol production from recombinant microorganisms
US20150259710A1 (en) 2011-07-28 2015-09-17 Gevo, Inc. Decarboxylase proteins with high keto-isovalerate decarboxylase activity
US20140377857A1 (en) 2012-02-15 2014-12-25 The Regents Of The University Of California Integrated electro-bioreactor
BR112017012416A2 (pt) 2014-12-10 2018-07-31 Dow Global Technologies Llc fenilpiruvato descarboxilase geneticamente modificada, processos para preparar e usos da mesma
AU2016276973B2 (en) 2015-06-10 2022-09-01 Synlogic Operating Company, Inc. Bacteria engineered to treat disorders involving the catabolism of a branched chain amino acid

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101939433A (zh) * 2007-07-23 2011-01-05 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 酵母中生产乙酰-CoA的酶
CN105793431A (zh) * 2013-12-12 2016-07-20 陶氏环球技术有限责任公司 通过微生物代谢途径的遗传修饰制备延长的2-酮酸和由此生成的c6-c10化合物的方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP3688175A1 (en) 2020-08-05
US11230705B2 (en) 2022-01-25
WO2019067412A1 (en) 2019-04-04
US11898181B2 (en) 2024-02-13
EP3688175B1 (en) 2024-03-13
CA3076748A1 (en) 2019-04-04
US20200291378A1 (en) 2020-09-17
BR112020005080A2 (pt) 2020-09-15
US20220098567A1 (en) 2022-03-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2009265373B2 (en) Production of alkenes by enzymatic decarboxylation of 3-hydroxyalkanoic acids
AU2017260270B2 (en) 3-methylcrotonic acid decarboxylase (MDC) variants
JP2016528904A (ja) アシルアミノ酸を製造するための方法
CN107231807B (zh) 基因修饰苯丙酮酸脱羧酶、其制备方法和用途
JP2017534268A (ja) 有用産物の生産のための改変微生物および方法
US11898181B2 (en) Genetically modified isopropylmalate isomerase enzyme complexes and processes to prepare elongated 2-ketoacids and C5-C10 compounds therewith
CN115335514A (zh) 罗汉果甙的生物合成
CN112368378A (zh) 3-甲基巴豆酸脱羧酶(mdc)变体
US11236310B2 (en) Process to prepare elongated 2-ketoacids and C-5-C10 compounds therefrom via genetic modifications to microbial metabolic pathways
KR20230163393A (ko) 3-메틸크로톤산 데카복실라제(mdc) 변이체

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination