CN111705029A - 一种基于嗜盐菌高效生产3-羟基丙酸(3hp)及其衍生物的方法 - Google Patents

一种基于嗜盐菌高效生产3-羟基丙酸(3hp)及其衍生物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明通过转录组学方法首次解析了盐单胞菌的3‑羟基丙酸(3HP)降解途径，发现了3‑羟基丙酸降解基因dddA和dddC，并获得了不能降解3HP的重组盐单胞菌TDΔdddA。在此基础上，进一步利用来源于盐单胞菌内源的负责3HP生产的代谢的醇脱氢酶基因AdhP和醛脱氢酶基因AldDTD，通过合成生物学手段调控该代谢途径的表达水平，筛选得到3HP高产重组盐单胞菌，产量和生产力分别为0.93g/g1,3‑丙二醇(PDO)和2.4g/L/h，这是迄今为止报道的最高3HP产量和生产力。

Description

一种基于嗜盐菌高效生产3-羟基丙酸(3HP)及其衍生物的 方法
技术领域
本发明涉及微生物代谢工程和发酵工程领域。更具体地说，本发明通过在嗜盐菌里构建3-羟基丙酸(3HP)及其衍生物的合成途径，解析并删除3-羟基丙酸降解途径，增强目标产物的代谢流，调节细胞的氧化还原平衡，从而实现利用抗染菌嗜盐菌生产3-羟基丙酸及其衍生物(聚合物)的目的。
背景技术
3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3HP)是一种重要的平台化合物，位列美国能源部列举的12种最具价值的平台化合物之一(Wang,Y.,et al.,Biosynthesis ofplatform chemical 3-hydroxypropionic acid(3HP)directly from CO2 incyanobacterium Synechocystis sp.PCC 6803.Metabolic engineering,2016.34:p.60-70.)。3-羟基丙酸(3HP)是一种用于合成C3基化学品的平台化学品，包括丙烯酸、丙二酸、丙烯酰胺、丙烯腈(ACN)和聚-3-羟基丙酸(P3HP)基聚合物。聚3-羟基丙酸(P3HP)是PHA家族中具有高强度机械性能的材料之一，P3HP是由3-羟基丙酸一种单体构成的均聚物，没有支链，属于短链PHA，其优秀的性能主要表现为较高的杨氏模量和断裂延伸率，聚3-羟基丙酸的杨氏模量最低可达到300MPa，断裂延伸率可达到600％，拉伸强度也在27MPa左右，既不像聚3-羟基丁酸(PHB)那么脆，又不像中长链PHA那样柔软，聚3-羟基丙酸的机械性能已完全可以和目前的石油基材料相比，而且聚3-羟基丙酸具有生物相容性和生物可降解性，大大拓宽了其应用价值。
化学法合成3HP的效率不高，并且污染环境，添加的结构类似物前体价格昂贵，不适用于工业化生产。生物合成主要通过在微生物中异源表达代谢途径的方式，与化学合成相比，生物合成的优势在于：1)特异性高；2)对底物纯度要求低；3)更加环境友好，不需高温高压(Della Pina,C.,E.Falletta,and M.Rossi,A green approach to chemicalbuilding blocks.The case of 3-hydroxypropanoic acid.Green chemistry,2011.13(7):p.1624-1632.)。所以在微生物中利用廉价碳源高效生产3HP是本发明要解决的主要科学问题。
目前据报道已经构建了从葡萄糖、甘油或CO2等生物可再生资源中生产3HP的合成途径。但是由于需要操纵和调节多个基因，导致基于丙二酰辅酶A或β-丙氨酸的3HP合成途径的复杂性以及3HP生物合成效率较低。3HP的生物合成集中在以甘油为原料上。由甘油生产3HP要经过两步：1)甘油脱水酶DhaB将甘油转化为3-羟基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde,3HPA)，此过程以辅酶B12为辅因子；2)醛基脱氢酶AldH消耗1分子NAD+，将3HPA催化为3HP(Yazdani,S.S.and R.Gonzalez,Anaerobic fermentation ofglycerol:a path to economic viability for the biofuels industry.Currentopinion in biotechnology,2007.18(3):p.213-219.)。
传统的微生物底盘，如大肠杆菌或谷氨酸棒状杆菌，报道的最高3HP浓度约为70g/L。肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)可以合成GDHt的辅助因子维生素B12，其3HP产量最高为82g/L。然而，因为肺炎克雷伯菌是一种机会致病菌，所以其不适用于大规模生产。而且在3HP的生产过程中：在有氧条件下，GDHt的活性受到抑制，维生素B12的合成减少；而在厌氧条件下，细胞生长不良，NAD+(ALDH的必需辅因子)难以再生(Ashok,S.et al.Effect ofpuuC overexpression and nitrate addition on glycerol metabolism and anaerobic3-hydroxypropionic acid production in recombinant Klebsiella pneumoniaeΔglpKΔdhaT.Metabolic Engineering 2013,15,10-24.)。维生素B12合成和NAD+再生之间的权衡控制着3HP的产生，核心是培养基中溶解氧的平衡。使用1,3-丙二醇(PDO)作为底物可能是一种解决方案，因为PDO可在1,3-丙二醇氧化还原酶(PDOR)和ALDH39的催化下转化为3HP(Zhao,L.,Lin,J.,Wang,H.,Xie,J.&Wei,D.Development of a two-step process forproduction of 3-hydroxypropionic acid from glycerol using Klebsiellapneumoniae and Gluconobacter oxydans.Bioprocess Biosystems Engineering.2015,38,2487-2495)。在没有维生素B12的有氧条件下，这两种NAD+依赖酶PDOR和ALDH功能良好。
大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、假单胞菌、酿酒酵母等多种微生物已作为宿主进行3HP的生产，其中大肠杆菌因其具有丰富的基因组和生理信息以及完善的遗传操作工具而成为研究最为广泛使用的微生物。3HP在高浓度下具有细胞毒性，会导致细胞活力降低同时限制发酵后期3HP产量的继续增加(Chun,A.Y.,et al.,Elucidation of toxicity of organicacids inhibiting growth of Escherichia coli W.Biotechnology and bioprocessengineering,2014.19(5):p.858-865.)。有机酸的毒性效应是一种多因子的复杂现象，对细胞的抑制作用一般分为三种:1)破坏细胞质pH稳态；2)阴离子在胞质和/或细胞内高浓度积累；3)由于在发酵过程中添加中和剂而导致的渗透压增加。在细胞质中，有机酸分解，释放H+，降低细胞内pH值，pH值降低或质子浓度升高会干扰细胞膜电位和ATP的产生(Olson,E.R.,Influence of pH on bacterial gene expression.Molecular microbiology,1993.8(1):p.5-14.)，而且一些必需酶在高质子浓度下也容易变性。而在高盐高碱环境下最适生长的嗜盐微生物可以抵抗3HP生产过程中的抑制作用，是3HP高浓度生产底盘菌的一种理想选择。极端嗜盐古菌通过在细胞内积累与胞外NaCl浓度相同的KCl来维持渗透压。而大部分嗜盐细菌是通过在细胞内积累一类低分子量的“亲和性溶质”来维持细胞渗透压，比如氨基酸、氨基酸衍生物、糖类或者其他多元醇，这些物质一般不会影响细胞代谢。因此，嗜盐菌目前广泛应用于生产亲和性溶质、耐高盐的酶制剂、生物表面活性剂等(Quillaguamán,J.,et al.,Synthesis and production of polyhydroxyalkanoates by halophiles:current potential and future prospects.Applied Microbiology andBiotechnology,2010.85(6):p.1687-1696.)。
发明内容
针对现有生产3-羟基丙酸及其衍生物的技术不足，本发明的发明人经过反复的研究和实验验证，发明了一种重组嗜盐菌以及使用该嗜盐菌生产3-羟基丙酸及其衍生物的方法。具体地，本发明首次鉴定和删除了嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD01的3HP降解途径，筛选和优化了内源生物合成酶，工程化表达了3HP合成途径，平衡了氧化还原状态，进行了补料分批生产3HP，在开放和不灭菌条件下，制备超高产3HP及其共聚物聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基丙酸)(P3HB3HP)的嗜盐工程菌。
本发明的一个目的是通过构建高产3-羟基丙酸3HP及其衍生物的重组型嗜盐菌，实现无灭菌、开放和连续发酵生产上述产品。
因此，本发明提供以下各项：
1.重组嗜盐菌(Halobacteriaceae)，其包含生产3-羟基丙酸(3HP)或其衍生物的代谢路径，其中所述3-羟基丙酸的衍生物为聚3-羟基丙酸酯(P3HP)或3-羟基丙酸与选自以下的单体的共聚物：3-羟基丁酸(3HB)、4-羟基丁酸(4HB)、3-羟基戊酸(3HV)、或其组合，优选为聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基丙酸)(P3HB3HP)。
2.根据以上1所述的重组嗜盐菌，其中3-羟基丙酸的降解途径被敲除，优选其中所述重组嗜盐菌缺失了3-羟基丙酸降解基因，更优选所述3-羟基丙酸降解基因为嗜盐菌的编码胆碱脱氢酶的基因dddA、编码甲基丙二酸半醛脱氢酶的基因dddC或其组合，最优选所述基因dddA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述基因dddC的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据以上1或2所述的重组嗜盐菌，其中所述代谢路径是通过在野生型嗜盐菌中表达(过表达)负责该代谢途径的(外源)基因或(外源)基因的组合和/或减弱或阻断或敲除所述代谢路径的支路和/或分解代谢路径的(内源)基因或(内源)基因的组合(使其为该基因缺陷型)来构建的，优选的基因的减弱或阻断可以通过表达(过表达)所述基因的抑制剂基因或直接删除来实现的。
4.根据以上1-3所述的重组嗜盐菌，其特征还在于以下中的一个或多个：
(1)所述重组嗜盐菌通过过表达内源或外源3-羟基丙酸合成基因来生产3-羟基丙酸，优选所述3-羟基丙酸合成基因为编码1,3-丙二醇脱氢酶的基因dhaT(SEQ ID NO:3)、编码醛脱氢酶的基因aldD(SEQ ID NO:4)、aldDTD编码醛脱氢酶的基因aldDTD(SEQ ID NO:5)、编码醇脱氢酶的基因adhP(SEQ ID NO:6)或它们的任何组合，更优选为dhaT基因和aldD基因的组合或aldDTD基因和adhP基因的组合，最优选为嗜盐菌的aldDTD基因和adhP基因的组合；
(2)3-羟基丙酸合成基因处于外源引入的强启动子和强RBS序列控制下，以提高其转录和翻译水平，优选所述强启动子选自Porin启动子(SEQ ID NO:7)，所述强RBS序列如SEQ ID NO:8所示；和
(3)所述重组嗜盐菌还通过过表达3-羟基丙酸衍生物合成基因来生产3-羟基丙酸共聚物，优选所述3-羟基丙酸共聚物合成基因为PHA聚合酶基因PhaC与辅酶A连接酶结构域Pcs’基因、乙酰辅酶A合成酶AcoE基因、丙酰辅酶A合成酶PrpE基因和/或醛脱氢酶基因PduP的组合，更优选所述3-羟基丙酸共聚物合成基因为来源于R.eutropha的PhaC1基因(SEQ IDNO:8)与来源于Chloroflexu aurantiacus的辅酶A连接酶结构域Pcs’基因(SEQ ID NO:9)、来源于Ralstonia eutropha的乙酰辅酶A合成酶AcoE基因(SEQ ID NO:10)、来源于E.coli的丙酰辅酶A合成酶PrpE基因(SEQ ID NO:11)或来源于Salmonella typhimurium的醛脱氢酶基因PduP(SEQ ID NO:12)的组合。
5.根据以上1-4中任一项所述的重组嗜盐菌，其中所述嗜盐菌为嗜盐单胞菌属(Halomonas sp.)，最优选为Halomonas bluephagenesis TD01(菌种保藏编号CGMCCNo.4353)。
6.一种制备3-羟基丙酸或其衍生物的方法，所述3-羟基丙酸的衍生物为聚3-羟基丙酸酯(P3HP)或3-羟基丙酸与选自以下的单体的共聚物：3-羟基丁酸(3HB)、4-羟基丁酸(4HB)、3-羟基戊酸(3HV)、或其组合，优选为聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基丙酸)(P3HB3HP)，所述方法包括使用根据以上1-5中任一项所述的重组嗜盐菌来生产3-羟基丙酸或其衍生物。
7.根据以上6所述的方法，其中所述方法可以在开放无灭菌和/或批次或连续发酵的条件下进行，优选其中将葡萄糖和1,3-丙二醇(PDO)作为混合碳源。
8.根据以上6或7所述的方法，其中所述方法包括在发酵过程中加入乙酸来调节细胞内的氧化还原平衡，和/或通过增加缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)的量来提高培养基的缓冲能力，由此增加3-羟基丙酸或其衍生物的产量。
9.一种制备根据以上1-5中任一项所述的重组嗜盐菌的方法，所述方法包括构建具有以上4中所述特征中一个或多个[(优选特征(1)+(2)的组合，特征(1)+(2)+(3)的组合]的重组嗜盐菌。
10.根据以上9所述的方法，其中所述表达(过表达)是通过将所表达的基因在一个或多个质粒上表达或者被整合到所述嗜盐菌的基因组中表达来实现的，和/或所述基因缺陷型是通过从所述嗜盐菌中敲除所述基因来实现的，优选利用CRISPR/cas9介导的基因敲除方法进行基因的敲除。
发明详述
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是一类具有生物可降解性的生物基塑料，其中聚3-羟基丙酸酯(P3HP)具在PHA里机械性能最好，其单体3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid，3HP)也是一种重要的平台化合物，位列美国能源部列举的12种最具价值的平台化合物之一。但是目前还没天然微生物可以合成P3HP的报道，其生物合成较多的是在大肠杆菌等通用底盘菌株中构建异源表达的代谢通路，但是大肠杆菌在工业生产过程中有易染菌的缺点。而本发明利用的盐单胞菌(特别是Halomonas bluephagenesisTD)可以进行连续开放发酵，发酵全程不用灭菌处理，并且不易染菌等特点，结合工业微生物发酵的常温、常压、可持续资源，可以大幅度提高工业生物技术的竞争性。
本发明通过转录组测序比较添加与不添加3-羟基丙酸做碳源的培养条件下的基因表达差异，结合功能验证，解析了盐单胞菌的3HP降解途径，并获得了不能降解3HP的重组盐单胞菌TDΔdddA。通过蛋白序列比对以及添加1,3-丙二醇PDO后的转录组变化分析，本发明找到了来源于盐单胞菌内源的从PDO到3HP生产的代谢基因醇脱氢酶AdhP和醛脱氢酶AldDTD，并通过合成生物学手段调控该代谢途径的表达水平，筛选得到较高3HP产量的重组盐单胞菌。将不同表达强度的adhP和aldDTD在基因组上过表达，并通过调节细胞内的氧化还原状态，获得了与质粒表达系统的3HP产量相当的基因组表达重组盐单胞菌TD27，TD27能够产生11.7g/L的3HP。在7L发酵罐中重组盐单胞菌TD27的3HP产量达154g/L。然后引入不同来源的辅酶A连接酶或合成酶，成功在盐单胞菌中实现P(3HB-co-40mol％3HP)的生产。得到的重组盐单胞菌可作为3HP及其共聚物低成本生产的平台菌株，对工业生产3HP及其共聚物具有重要意义。
1.发明内容之一，利用嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD01作为3-羟基丙酸及其衍生物生产的底盘细胞。Halomonas bluephagenesis TD01是申请人2012年10月10日公告授权的中国专利CN 102120973B中要求保护的盐单胞菌，其菌种保藏编号为CGMCCNo.4353。
2.发明内容之二，解析嗜盐菌3-羟基丙酸降解途径，盐单胞菌中3-羟基丙酸降解途径解析可以通过但不限于下面方法：
(1)将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)KT2440的1,3-丙二醇脱氢酶编码基因dhaT和醛脱氢酶编码基因aldD构建在可以进行接合转化的载体，并转化到嗜盐菌中，以PDO作为唯一碳源进行摇瓶发酵实验，大肠杆菌可以产生1.5g/L的3HP，而盐单胞菌仅生产0.2g/L的3HP。但是检测培养基中的1,3-丙二醇残余量发现，转入DhaT和AldD的盐单胞菌1,3-丙二醇的残余量显著降低。
(2)以3-羟基丙酸作为唯一碳源培养盐单胞菌，结果发现，盐单胞菌可以完全降解5g/L的3-羟基丙酸，用于细胞生长和胞内PHB的积累。这也就说明盐单胞菌3HP较低的产量是因为其生产的3HP同时可以被当作碳源用于生长。
(3)为了找到3HP的降解途径，本发明进行了添加与不添加3-羟基丙酸做碳源的培养条件下转录组测序分析，qRT-PCR验证差异表达倍数，寻找可能的3-羟基丙酸降解酶，转录差异最大的是甲基丙二酸半醛脱氢酶(CoA acylating)，但是该酶的表达基因在盐单胞菌基因组上有四个拷贝，其中三个表现为上调表达；排在第二位的为胆碱脱氢酶，该酶的表达基因在盐单胞菌基因组上只有一个拷贝，根据蛋白序列比对，其与Halomonas sp.HTNK1的DddA相似度为81.77％，所以本发明将盐单胞菌的胆碱脱氢酶改称为DddA，其编码基因对应为dddA。与dddA同一个操纵子的上游的dddC编码甲基丙二酸半醛脱氢酶，转录组表达差异倍数与dddA相当，负责将3HP降解的产物进一步降解为乙酰辅酶A用于细胞生长。
(4)利用CRISPR/cas9介导的基因敲除方法进行dddA基因的敲除，鉴于盐单胞菌只能进行接合转化，所以需要将gRNA和含有敲除基因上下游同源臂的片段(用于同源重组)构建到可进行结合转移的质粒载体上。第一次敲除选择dddA基因上下游各1kb同源片段用于同源重组，在构建过程中始终得不到正确的克隆，经分析发现，dddA下游含有一个由68个氨基酸组成的冷激蛋白(cold-shock protein)，当选择1kb同源臂长度时，整个蛋白被完整过表达，导致构建过程中的细胞毒性。改变同源臂的长度为500bp，避免冷激蛋白过表达，成功构建了dddA敲除质粒，最终得到dddA敲除的盐单胞菌TDΔdddA(图2)。dddA敲除后盐单胞菌的3HP产量从0.2g/L提高到2.7g/L。优选所述3-羟基丙酸降解基因为dddA(GME_RS01260)编码胆碱脱氢酶(RefSeq.Accession:WP_009721523.1)、dddC(GME_RS01255)编码甲基丙二酸半醛脱氢酶(RefSeq.Accession:WP_009721522.1)。
3.发明内容之三，鉴定嗜盐菌内源高效的醇脱氢酶和醛脱氢酶，盐单胞菌中PDO转化为3HP的内源合成途径解析可以通过但不限于下面步骤的方法：
(1)以假单胞菌的醇脱氢酶DhaT和醛脱氢酶AldD进行蛋白序列比对分析，其中用DhaT的氨基酸序列在盐单胞菌中未找到序列相似性蛋白，盐单胞菌的基因组注释有四个醇脱氢酶，而AldD在盐单胞菌中具有一个相似度在80％的蛋白(醇脱氢酶，AldDTD，WP_009721344.1)，蛋白功能注释是醛脱氢酶，是AldD的同工酶。
(2)转录组分析表明，当加入PDO后，AldDTD的转录水平显著增加。另外本发明发现AldDTD表达基因下游存在一个醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，AdhP，WP_039868491.1)表达基因，其转录水平在加入PDO后也显著增加。将以上基因与AldDTD在嗜盐菌中过表达，获得盐单胞菌内源醇脱氢酶和醛脱氢酶过表达的重组盐单胞菌，经过48小时发酵，重组盐单胞菌产生3g/L 3HP。
(3)通过调谐启动子和RBS强度，调节醛脱氢酶AldD和醇脱氢酶AdhP的表达强度，从而提高3HP产量。优化表达后3HP的产量显著提升，由3.2g/L提升到7.2g/L。
优选所述3-羟基丙酸合成基因为dhaT编码1,3-丙二醇脱氢酶(RefSeq.Accession:AAN68411.1)、aldD编码醛脱氢酶(RefSeq.Accession:AAN66172.1)、aldDTD编码醛脱氢酶(RefSeq.Accession:WP_009721344.1)和adhP编码醇脱氢酶(RefSeq.Accession:WP_039868491.1)，更优选为嗜盐菌的aldDTD基因和adhP基因。
4.发明内容之四，发展高产3-羟基丙酸的重组嗜盐菌构建方法，但不限于上述嗜盐菌为底盘，发酵生产3-羟基丙酸。高产3-羟基丙酸的嗜盐菌构建可以通过但不限于下面方法：
(1)将3HP的代谢通路中外源表达的基因通过CRISPR/Cas9的方法整合到盐单胞菌TD的基因组中，以获得3HP的稳定生产菌株。构建了含有1000bp同源臂(H1/H2)、插入基因片段以及靶向基因组插入位置的gRNA序列的质粒gRNA-ald+adh-insertion(图4)，将其与表达Cas9蛋白的质粒共同转化到TDΔdddA，用基因组上同源臂以外的Primer1和Primer2筛选阳性克隆，目的基因成功插入基因组的实验组扩增产物理论长度是5.6Kb，野生型阴性对照扩增产物理论长度是1.8Kb。目的基因成功插入基因组的实验组命名为TD22，TD26和TD27。TD22为基因组插入来源于假单胞菌的醛脱氢酶AldD和醇脱氢酶DhaT表达基因；TD26为基因组插入来源于盐单胞菌的醛脱氢酶AldDTD和醇脱氢酶AdhP表达基因；TD27为基因组插入来源于盐单胞菌的醛脱氢酶AldDTD和醇脱氢酶AdhP表达基因，其中AldDTD具有较强的翻译识别序列(RBS)。
(2)本发明通过添加乙酸平衡胞内的NADH/NAD+比例，在20g/L葡萄糖和20g/L PDO为碳源的基础上，设置了0，3，6，9g/L的乙酸添加浓度梯度，初始pH调至8.5，由于3HP生产过程中细胞内的氧化还原状态的不平衡，导致培养基pH降低，但添加乙酸的实验组在发酵过程中pH值相对稳定，各组培养24小时后用5M NaOH调节pH到8.5。实验结果显示6g/L添加量能显著增加3HP的产量以及细胞干重和PHB百分含量。在添加6g/L乙酸的条件下，不仅3HP的产量提高了30％，细胞干重从3.7g/L提高到7.9g/L，提高超过200％，PHB百分含量从5.6％提高到45.6％，提高超过8倍。
(3)本发明提高了磷酸盐缓冲对(磷酸氢二钾/磷酸二氢钾)的量，加入15g/L的磷酸氢二钾和5g/L的磷酸二氢钾。用60MM改良培养基为基底，在20g/L葡萄糖和20g/L PDO为碳源的基础上，添加6g/L的乙酸，初始pH调至8.5，并且48小时发酵中途不调节pH，比较改良后的培养条件对质粒表达系统和基因组表达系统3HP生产的影响，实验结果显示质粒表达系统TDΔdddA p59的3HP产量达到11g/L，而基因组表达系统TD27的3HP产量更高，达到11.7g/L，而且基因组表达系统TD27的PHB百分含量显著高于质粒表达。另外，本发明还检测了两种系统在这种培养条件下的PDO转化为3HP的转化率，通过检测PDO剩余量得出PDO的消耗量，与相应的3HP产物作比较，PDO到3HP的转化率均接近90％
5.发明内容之五，以高产3-羟基丙酸的重组嗜盐菌Halomonas bluephagenesisTD27为底盘菌生产3-羟基丙酸衍生物。生产3-羟基丙酸衍生物的嗜盐菌构建可以通过但不限于下面步骤的方法(涉及的主要反应通路/代谢途径参见图1)：
PDO首先在醇脱氢酶AdhP和醛脱氢酶AldDTD的作用下被转化为3HP，然后3HP在辅酶A连接酶Pcs、乙酰辅酶A合成酶AcoE或者丙酰辅酶A合成酶PrpE的作用下形成3-羟基丙酰辅酶A(3HP-CoA)，最后通过PhaC1的催化聚合生成P3HP。另外，PDO经醇脱氢酶AdhP的催化产生3-羟基丙醛，3-羟基丙醛在醛脱氢酶PduP的催化下形成3-羟基丙酰辅酶A(3HP-CoA)，通过PhaC1的催化聚合生成P3HP。本发明选择来源于Chloroflexu aurantiacus的辅酶A连接酶结构域Pcs’，来源于Ralstonia eutropha的乙酰辅酶A合成酶AcoE，来源于E.coli的丙酰辅酶A合成酶PrpE和来源于Salomonella typhimurium的醛脱氢酶PduP分别进行3HP聚合物的生产能力测试，将辅酶A连接酶/合成酶以及醛脱氢酶分别与来源于R.eutropha的PhaC1共同表达。实现了P(3HB-co-3HP)的生产，四种不同来源的酶的表达产生不同比例的P3HP，其中P3HP比例最高的是来源于C.aurantiacus的辅酶A连接酶结构域Pcs’，P3HP摩尔比超过40％
6.发明内容之六，提供基于上述嗜盐菌3-羟基丙酸及其衍生物的发酵方法。
培养基：
基础培养基：60g/L NaCl，30g/L葡萄糖，0.5g/L尿素，0.2g/L MgSO4，组分II：2.7g/L Na2HPO4·12H2O和3.3g/L KH2PO4，组分III&IV：10ml/L微量元素溶液I和1ml/L微量元素溶液II。其中，微量元素溶液I的组成为：5g/L柠檬酸铁铵，2g/L CaCl2，用1M HCl配制。微量元素溶液II的组成为：100mg/L ZnSO4·7H2O，30mg/L MnCl2·4H2O，300mg/L H3BO3，200mg/L CoCl2·6H2O，10mg/L CuSO4·5H2O，20mg/L NiCl2·6H2O，30mg/L NaMoO4·2H2O，用1M HCl配制。上述试剂购自国药集团化学试剂公司。补料培养基根据需求配制。
发酵罐培养方法：
(1)种子摇瓶培养：
取单克隆于20毫升于60LB中培养，在37℃，200rpm培养12-16小时。将5-10vol％一级种子液接种于100ml 60LB中，在500ml摇瓶中培养，需要时加上抗生素，37℃，200rpm培养48h。
(2)发酵罐培养：
使用7升生物反应器(Biolo III/USA)，培养体系是3L，培养8～12小时的种子液按照10％接种量接种到发酵罐中，具体的发酵罐培养条件如下：
用5M NaOH维持发酵液的pH值在8.5。通过以1vvm(空气体积/培养体积/分钟)的流速注入空气使溶解氧(DO)保持在空气饱和的30％左右。搅拌与溶氧同时进行达到最大转速800rpm。具体培养条件：底料尿素2g/L，氯化钠40g/L，酵母粉10g/L，组份II，组份III&IV，30g/L葡萄糖。37℃培养8小时后开始以25ml/h的流速流加补料，补料分三段进行，第一次补料：终浓度4g/L尿素溶解在400ml 800g/L葡萄糖溶液中。第二次补料：终浓度1g/L尿素溶解在350ml 800g/L葡萄糖溶液中。在发酵的32h，36h，40h分别一次性添加终浓度60g/L PDO和6g/L的乙酸。48h时总计耗糖850ml，52h总计耗糖950ml。
附图说明
图1. 1,3-丙二醇生产3HP及其共聚物的代谢途径(其中：DhaT或AdhP：醇脱氢酶；AldD或AldDTD：醛脱氢酶；PCS/AcoE/PrpE/PduP：辅酶A连接酶或转移酶；PhaC：PHA聚合酶；CoA：辅酶A；1,3-丙二醇(1,3-propanediol)，3-羟基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde)，3-羟基丙酸(3-hydroxypropionic acid)，3-羟基丙酰辅酶A(3HP-CoA)，聚3-羟基丙酸酯(P3HP))。
图2.嗜盐菌3HP降解途径删除。
图3.a.3HP降解途径敲除后以3HP为唯一碳源验证实验；b.3HP发酵液的液相色谱峰图(其中黑色代表标准品，红色是重组嗜盐菌发酵液上清)。
图4.aldDTD和adhP基因组整合示意图及其鉴定结果。
图5. 7L发酵罐发酵产量。
图6.P3HB3HP共聚物的H1NMR鉴定结果
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的详细说明，便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中的培养基配方：
60LB培养基：60g/L氯化钠,5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L胰蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)。余量为水，高压蒸汽灭菌。在实际培养过程中，可向上述培养基中加入一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，常用抗生素包括：壮观霉素母液(100mg/ml)；氯霉素母液(25mg/ml)。
若需获得固体培养基，则在上述液体培养基的基础上添加1.5％琼脂，灭菌后冷却至60℃，按需求添加适量抗生素，混匀后倒平板。
实施例中的接合转化方法：
1)将构建的质粒通过电击转化到大肠杆菌S17-1中，涂相应抗性平板，挑取单克隆到LB培养基中震荡培养过夜；
2)按1％的接种量转接到装有20ml LB培养基的100ml小摇瓶里，盐单胞菌按1％的接种量转接到装有20ml 60LB培养基的100ml小摇瓶里，培养至OD600＝0.6～0.8；
3)将大肠杆菌S17-1和盐单胞菌LS21分别取1.5ml培养液1500g离心2分钟，倒掉上清；
4)为了保证大肠杆菌和盐单胞菌混合在一起还都能正常生长，分别用50μl无抗20LB培养基重悬，然后按1：1体积比混匀，滴加到20LB的无抗固体平板上培养6小时后，涂相应抗生素的40LB固体培养基上。待长出单克隆进行菌落PCR鉴定。
实施例中Gibson assembly质粒构建具体步骤如下：
1)根据Gibson重组的原理，首先设计具有20-40bp同源臂的引物，可以使用NEBuilder设计，也可以利用Snapgene在连接片段的接口处直接读取含有同源臂的引物序列，每对引物的退火温度不能差超过5℃。
2)进行常规的PCR反应，同时载体可以选择酶切或者PCR扩增，然后按照胶回收试剂盒的说明书进行切胶回收，获得带有同源臂的片段。
3)用Nanodrop测定回收片段的浓度，按照公式pmols＝(weight in ng)x 1,000/(base pairs x 650daltons)计算每个片段的浓度，按照等摩尔数混合各片段，保证每个片段在0.04pmols左右，反应体系10μl，注意要用移液器充分混匀，不能使用漩涡震荡和离心，操作在冰上进行。
4)用PCR仪50℃反应1小时后，电击转化或者化学转化合适的感受态中，因为重组反应效率很高，所以对于电击转化，重组产物先稀释3倍(缓慢吹吸混匀)，取1μl转化感受态细胞；对于化学转化，重组产物先稀释4倍(缓慢吹吸混匀)，取2μl转化感受态细胞。
实施例中荧光定量PCR测定基因转录水平的方法
用Primer Premier 5软件在目的基因内部设计引物，选取三组打分最高的引物合成(HPLC级)，扩增片段长度控制在150-300bp。引物合成后稀释到10μM，并在普通基因扩增仪上测试引物质量，从中选取特异性最好的一组用于荧光定量PCR。定时制备菌液冻在-80℃作为RNA样品，严格按照细菌RNA提取试剂盒的操作说明书在RNAase free的环境中提取盐单胞菌TD菌株的总RNA，并测定其浓度。按照Genstar公司的反转录试剂盒的操作说明书进行反转录，所用总RNA模板不超过300ng，并使用试剂盒配套的随机引物进行反转录PCR，所得产物稀释10倍用于接下来的荧光定量PCR检测分析。反转录完成后，使用Genstar公司的2x RealStar Green Power mixture(with ROXII)试剂盒配制反应体系，反应过程按照说明书进行。选用盐单胞菌的16S rRNA作为内参基因，将得到的Ct值利用2-ΔΔCt的方法对目的基因的相对转录水平进行计算，并对其进行显著性分析。
实施例中3-羟基丙酸(3HP)检测方法：
本发明使用高压液相色谱仪是日本岛津(SHIMADZU)公司LC-20A系列，取发酵结束后菌液13000g离心10分钟，取上清用0.45μm水相滤膜过滤到液相色谱上样瓶中，同时为了制作3HP浓度的标准曲线，需要配制包含3HP理论产量的最大浓度和最小浓度范围内的0g/L、0.625g/L、1.25g/L、2.5g/L、5g/L五个梯度浓度，与待测样品一起用AS3000型自动进样器上样，并用亲和离子柱检测3HP的浓度。色谱条件：Bio-Rad
Figure BDA0002570620500000101
HPX-87H(7.8×300mm2)柱，柱温40℃；5mM H2SO4溶液作为流动相，流速0.50ml/min；进样量30μl。同样的方法检测乙酸，PDO和葡萄糖等的剩余量，从而计算碳源转化率。
实施例中细胞干重计算方法：
准备好干净的离心管并称量管重，然后将培养48小时后的菌液各取30ml离心(10000g，离心10分钟)，去上清，各用20ml去离子水清洗一遍菌体，振荡器重悬后10000g离心10分钟，去上清，用保鲜膜封口(注意用牙签扎几个透气孔)后放置-80℃冰箱至少1小时后，放冰干机至少8小时除去水分，以每升发酵后体系中的细胞干重计量，细胞干重的单位为g/L。细胞干重(DCM)＝(进行冷冻干燥后的离心管的重量-原空离心管的重量)÷0.03；进行冷冻干燥后的离心管的重量和原空离心管的重量，单位均为g；0.03代表0.03L。
实施例中3-羟基丙酸共聚物的检测方法：
1)样品处理：首先配置酯化液，取485ml无水甲醇，加15ml浓硫酸和1g苯甲酸充分溶解。然后取40～60mg干燥的菌体，于酯化管中精确计量重量后，分别加入2ml酯化液和2ml三氯甲烷，同时用同样方法处理20mg左右标准PHA样品。充分旋紧酯化管的盖子，100℃恒温酯化4小时。酯化结束后关闭仪器冷却至室温，小心打开瓶塞，各加入1mL水，振荡1分钟充分混匀，静置1小时分层。待水相和三氯甲烷相彻底分离后，用注射器取下层(三氯甲烷相)溶液至气象色谱样品瓶中进行GC分析。
2)GC分析：本文工作中涉及到的PHA含量分析使用日本岛津公司的GC-2014气相色谱仪，配备AOC-20S自动进样器，所使用的色谱柱为HP-5毛细管柱，火焰离子化检测器，高纯氮气为载气，空气为助燃气，氢气为燃气，使用过程中用丙酮作为取样器的清洗剂。本文工作中涉及的主要是对于短链的PHA的GC分析，具体的程序的设置为：80℃，停留1.5分钟；30℃/min的速率升温到140℃，停留0分钟；40℃/min的速率升温到240℃，停留2分钟。整个程序耗时8分钟，氢气流量为50mL/min，空气为400mL/min。进样口的温度是240℃，检测器的温度是250℃。
实施例中核磁共振氢谱(NMR)方法：
采用日本JEOL公司的JNMECA600对中间体和产物进行核磁共振氢谱测定：用氘代氯仿、氘代THF或氘代DMSO作为溶剂，以0.03％v/v四甲基硅烷(TMS)内标进行校准。
实施例1解析嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD01的3-羟基丙酸降解途径
目的是解析3-羟基丙酸的降解途径，并构建可以生产3-羟基丙酸的重组型嗜盐菌。为解决上述技术问题，采用的方法是：
1.将来源于恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonas putida KT2440)的1,3-丙二醇脱氢酶编码基因dhaT(SEQ ID NO:3)和醛脱氢酶编码基因aldD(SEQ ID NO:4)与野生型PPorin启动子(SEQ ID NO:7)，通过Gibson assembly连接获得dhaT和aldD的表达质粒p30(空载体为pKS，其是用卡那霉素和壮观霉素抗性基因替换pSEVA321(Silva-Rocha,R.et al.，TheStandard European Vector Architecture(SEVA):a coherent platform for theanalysis and deployment of complex prokaryotic phenotypes.Nucleic AcidsRes.2013,41,D666-D675)质粒的氯霉素抗性基因，通过Gibson assembly连接获得的对照质粒)。
2.本发明的3-羟基丙酸降解途径删除的重组菌Halomonas bluephagenesis TDΔdddA主要通过下述方法构建得到：
(1)以3-羟基丙酸作为唯一碳源培养盐单胞菌，检测盐单胞菌TD01是否能够利用3-羟基丙酸作为唯一碳源生长，结果发现，盐单胞菌可以完全降解5g/L的3-羟基丙酸，用于细胞生长和胞内PHB的积累。这也就说明盐单胞菌3HP较低的产量是因为其生产的3HP同时可以被当作碳源用于生长。
(2)添加与不添加3-羟基丙酸做碳源的培养条件下转录组测序分析，培养12h后，从摇瓶实验中取样。然后，将样品在4000g和4℃下离心10分钟，在液氮中快速冷冻。RNA是由
Figure BDA0002570620500000111
试剂(美国Invitrogen)提取，利用Illumina TruseqTM RNA样品制备试剂盒(美国Illumina)构建RNA文库，使用Illumina Hiseq平台进行测序。用edgeR分析表达差异。RNA的提取、测序和分析由公司(联川生物)完成。其中log2(FC)：是两个组进行比较得到的差异倍数取log2值。也就是说，如果实验组与对照组相比上调了2倍，那么log2(FC)就是1；如果下调了2倍，那么log2(FC)就是-1。差异倍数筛选条件是至少2倍的表达差异，即log2(FC)的绝对值大于1。pvalue：两组样品间表达差异的显著程度，一般筛选条件为小于0.05。qvalue：两组样品间表达差异修正的pvalue，也就是P值的校正值(FDR)，统计学意义更大，一般筛选条件为小于0.05。通过比较添加与不添加3-羟基丙酸做碳源的培养条件下的基因表达差异，本发明按照差异基因FDR<＝0.05并且|log2(FC)|>＝1的条件进行筛选，得到表达上调或者下调的基因共803个。利用log2(FC)和qvalue进行综合筛选，同时关注表达量高低提高后期验证率。
(3)qRT-PCR验证差异表达倍数，寻找可能的3-羟基丙酸降解酶。转录差异最大的是methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase(CoA acylating)，但是该酶的表达基因在盐单胞菌基因组上有四个拷贝，其中三个表现为上调表达；排在第二位的为cholinedehydrogenase，该酶的表达基因在盐单胞菌基因组上只有一个拷贝，根据蛋白序列比对，其与Halomonas sp.HTNK1的DddA相似度为81.77％，所以本发明将盐单胞菌的cholinedehydrogenase改称为DddA，其编码基因对应为dddA。另外发现，与dddA同一个操纵子的上游的dddC编码甲基丙二酸半醛脱氢酶，转录组表达差异倍数与dddA相当，负责将3HP降解的产物进一步降解为乙酰辅酶A用于细胞生长。
(4)利用CRISPR/cas9介导的基因敲除方法进行dddA基因的敲除。首先构建敲除用gRNA质粒，以pQ31(Qin,Q.,Ling,C.,Zhao,Y.Q.,Yang,T.,Yin,J.,Guo,Y.Y.,and Chen,G.Q.(2018)CRISPR/Cas9 editing genome of extremophile Halomonas spp.,Metab.Eng.47,219-229.)为模板，将两个同源片段和pQ31的骨架片段分别进行PCR扩增(引物序列参见表6，以下同)，用Gibson assmbly的办法构建出pdddA-donor质粒，基于测序验证正确的pdddA-donor质粒为模板，在Halomonas bluephagenesis TD内源dddA基因序列上选取20bp的gRNA序列(AGTGCTAGACGATTTCGCCG)，用引物梯度退火和质粒环P的形式将其在构建到pdddA-donor上，得到pdddA-donor-gRNA质粒，经测序验证得到正确克隆。
4)将上述pdddA-donor-gRNA质粒接合转化到带有pQ08质粒(Qin,Q.,Ling,C.,Zhao,Y.Q.,Yang,T.,Yin,J.,Guo,Y.Y.,and Chen,G.Q.(2018)CRISPR/Cas9 editinggenome of extremophile Halomonas spp.,Metab.Eng.47,219-229.)的TD菌株中，涂布于带相应抗性的60LB平板，筛选出敲除成功的阳性克隆。利用无抗60LB液体培养基传代6次丢弃Cas9质粒，得到敲除后的菌株。经过PCR和测序验证获得内源dddA基因全长敲除的盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD，命名为Halomonas bluephagenesis TDΔdddA。
通过类似方法，获得了敲除了内源dddA和dddC双基因全长敲除的盐单胞菌Halomonas bluephagenesis TD，命名为Halomonas bluephagenesis TDΔdddAC。
3HP降解途径敲除后，以3HP为唯一碳源进行摇瓶培养，验证上述敲除株Halomonasbluephagenesis TDΔdddAC是否还能降解3HP，结果如图3a，敲除株不能降解3HP用于生长。
3.应用3-羟基丙酸降解基因敲除的重组盐单胞菌生产3-羟基丙酸
(1)将p30质粒转化到Halomonas bluephagenesis TDΔdddA中，挑取单克隆在含有氯霉素的60LB中过夜培养，按照5％体积比转接到基础培养基，以30g/L葡萄糖和10g/LPDO为混合碳源，30g/L葡萄糖用于细胞生长和PHB的生产，10g/L PDO用于3HP的生产，因发酵产生的3HP会导致培养基酸化影响细胞生长，所以在摇瓶发酵24小时后用5M NaOH调节培养基的pH值到8.5。
(2)培养结束后，进行细胞干重测定、PHA含量以及单体含量的测定。3HP发酵液的液相色谱峰图如图3b(其中黑色代表标准品，红色是重组嗜盐菌发酵液上清)，3HP的出峰时间为15.6min。结果见表1，TD pKS：野生型盐单胞菌TD转入只含有抗性基因的空载体对照质粒pKS，TD p30：野生型盐单胞菌TD转入含有aldD和dhaT基因的质粒p30，TDΔdddA pKS：敲除了dddA基因的盐单胞菌转入只含有抗性基因的空载体对照质粒pKS，TDΔdddA p30：敲除了dddA基因的盐单胞菌转入含有aldD和dhaT基因的质粒p30，TDΔdddAC p30：敲除了dddA和dddC双基因的盐单胞菌转入含有aldD和dhaT基因的质粒p30。TDΔdddA p30实验组产生2.7g/L的3HP，但与对照组相比，TDΔdddA p30实验组的细胞干重和PHB含量显著降低，这说明细胞的生长受到严重抑制，以后的实验中检测3HP产量的同时进行细胞干重和PHB含量的分析，用于表征细胞的生长状态。
表1敲除降解基因后以PDO为碳源生产3-羟基丙酸的摇瓶实验结果
Figure BDA0002570620500000121
Figure BDA0002570620500000131
实施例2鉴定嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD01内源高效的醇脱氢酶和醛脱氢酶
目的是解析3-羟基丙酸的内源合成途径，为解决上述技术问题，采用的方法是：
1.鉴定嗜盐菌内源高效的醇脱氢酶和醛脱氢酶，包括在PRe启动子(SEQ ID NO:13)过表达的来源于Halomonas bluephagenesis TD的1,3-丙二醇脱氢酶编码基因adhP(SEQID NO:6)和醛脱氢酶编码基因aldDTD(SEQ ID NO:5)；PPorin启动子(SEQ ID NO:7)过表达的来源于Halomonas bluephagenesis TD的1,3-丙二醇脱氢酶编码基因adhP(SEQ ID NO:6)和醛脱氢酶编码基因aldDTD(SEQ ID NO:5)；
2.本发明的3-羟基丙酸内源合成途径过表达的重组菌Halomonasbluephagenesis TDΔdddA(AldDTD+AdhP)主要通过下述方法构建得到：
(1)过表达aldDTD和adhP的质粒构建，以Halomonas bluephagenesis TD为模板扩增内源dddA基因序列，替换p30质粒上的来源于P.putida KT2440的dhaT和aldD，获得p58质粒，然后通过接合转化到Halomonas bluephagenesis TDΔdddA中。p30为对照，经过48小时发酵，TDΔdddA p58产生3g/L 3HP，与对照组相当，这就证明了盐单胞菌内源的醛脱氢酶AldDTD和醇脱氢酶AdhP具有将1,3-丙二醇转化为3HP的功能。
(2)通过调谐启动子和RBS强度，调节醛脱氢酶AldD和醇脱氢酶AdhP的表达强度，构建了具有较强AldDTD翻译水平(Strong RBS)(cctgtagaaataattttgtttaactttaataaggagatatacc)(SEQ ID NO:8)的p59质粒，将表达aldDTD和adhP基因的启动子换成具有较强强度的野生型Porin启动子获得p60质粒，将p59和p60分别转化到TDΔdddA，分别获得重组盐单胞菌TDΔdddA p59和TDΔdddA p60。
3.基于重组嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TDΔdddA(p58)(即TDΔdddAp58)、Halomonas bluephagenesis TDΔdddA(p59)(即TDΔdddA p59)和Halomonasbluephagenesis TDΔdddA(p60)(即TDΔdddA p60)生产3-羟基丙酸。
(1)挑取单克隆在含有氯霉素的60LB中过夜培养，按照5％体积比转接到基础培养基，添加30g/L葡萄糖和10g/L PDO为混合碳源，添加3g/L乙酸，发酵48小时。发酵24小时后用5M NaOH调节培养基的pH值到8.5。
(2)培养结束后，进行细胞干重测定、PHA含量以及单体含量的测定。结果见表2，其中TDΔdddA：敲除了dddA基因的盐单胞菌；TDΔdddA p30：TDΔdddA转入假单胞菌的aldD和dhaT表达质粒p30，作为对照；TDΔdddA p58：TDΔdddA转入盐单胞菌内源AldDTD和AdhP表达质粒p58。TDΔdddA p59和TDΔdddA p60：TDΔdddA分别转入优化了表达量的盐单胞菌内源AldDTD和AdhP表达质粒p59和p60。30g/L葡萄糖和10g/L PDO为混合碳源，发酵48小时，优化表达后3HP的产量显著提升，由3.2g/L提升到7.2g/L。
表2盐单胞菌内源的醇脱氢酶和醛脱氢酶表达量优化对3HP产量的影响
Figure BDA0002570620500000141
实施例3高产3-羟基丙酸的重组嗜盐菌构建
目的是构建高效生产3-羟基丙酸的重组型嗜盐菌。为解决上述技术问题，采用的方法是：
1.构建高效生产3-羟基丙酸的重组型嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD27，包括PRe启动子过表达的来源于Halomonas bluephagenesis TD的1,3-丙二醇脱氢酶编码基因adhP(SEQ ID NO:6)和醛脱氢酶编码基因aldDTD(SEQ ID NO:5)；PRe启动子过表达的来源于Pseudomonas putida KT2440的1,3-丙二醇脱氢酶编码基因dhaT(SEQ ID NO:3)和醛脱氢酶编码基因aldD(SEQ ID NO:4)。
2.本发明的3-羟基丙酸高效合成重组菌Halomonas bluephagenesis TD27主要通过下述方法构建得到：
(1)将3HP的代谢通路中外源表达的基因通过CRISPR/Cas9的方法整合到盐单胞菌TD的基因组中，以获得3HP的稳定生产菌株。构建含有1000bp同源臂(H1/H2)、插入基因片段以及靶向基因组插入位置的gRNA序列(ttcacctagctagatgagac)的质粒gRNA-ald+adh-insertion(图4)，经测序验证得到正确克隆。
(2)将gRNA-ald+adh-insertion质粒接合转化到带有pQ08质粒的Halomonasbluephagenesis TDΔdddA菌株中，涂布于带相应抗性的60LB平板，用基因组上同源臂以外的Primer1和Primer2筛选筛选出敲除成功的阳性克隆，目的基因成功插入基因组的实验组扩增产物理论长度是5.6Kb，野生型阴性对照扩增产物理论长度是1.8Kb。利用无抗60LB液体培养基传代6次丢弃Cas9质粒，得到敲除后的菌株。经过PCR和测序验证获得Halomonasbluephagenesis TD22为基因组插入来源于假单胞菌的醛脱氢酶AldD和醇脱氢酶DhaT表达基因；Halomonas bluephagenesis TD26为基因组插入来源于盐单胞菌的醛脱氢酶AldDTD和醇脱氢酶AdhP表达基因；Halomonas bluephagenesis TD27为基因组插入来源于盐单胞菌的醛脱氢酶AldDTD和醇脱氢酶AdhP表达基因，其中AldDTD具有较强的翻译识别序列(RBS)。
3.基于重组嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD22、Halomonasbluephagenesis TD26和Halomonas bluephagenesis TD27生产3-羟基丙酸
(1)挑取单克隆在60LB中过夜培养，按照5％体积比转接到基础培养基，添加30g/L葡萄糖和10g/L PDO为混合碳源，添加3g/L乙酸，发酵48小时。发酵24小时后用5M NaOH调节培养基的pH值到8.5。
(2)培养结束后，进行细胞干重测定、PHA含量以及单体含量的测定。结果见表3，以质粒表达系统TDΔdddA p59为对照组，基因组插入来源于盐单胞菌的醛脱氢酶AldDTD和醇脱氢酶AdhP表达基因的TD27具有与对照组相当的3HP产量以及细胞干重和PHB百分含量。
表3.aldDTD和adhP基因组整合重组盐单胞菌的生长以及3HP生产能力测试
Figure BDA0002570620500000151
4.通过添加乙酸平衡胞内的NADH/NAD+比例，在20g/L葡萄糖和20g/L PDO为碳源的基础上，设置了0，3，6，9g/L的乙酸添加浓度梯度，初始pH调至8.5，各组培养24小时后用5M NaOH调节pH到8.5。实验结果如表4，6g/L添加量能显著增加3HP的产量以及细胞干重和PHB百分含量。在添加6g/L乙酸的条件下，不仅3HP的产量提高了30％，细胞干重从3.7g/L提高到7.9g/L，提高超过200％，PHB百分含量从5.6％提高到45.6％，提高超过8倍。
表4.不同浓度乙酸对3HP产量以及细胞干重和PHB百分含量的影响
Figure BDA0002570620500000152
5.在基础培养基的基础上提高磷酸盐缓冲对的量，改为15g/L的磷酸氢二钾和5g/L的磷酸二氢钾，构成60MMG改良培养基。用60MM改良培养基为基底，在20g/L葡萄糖和20g/LPDO为碳源的基础上，添加6g/L的乙酸，初始pH调至8.5，并且48小时发酵中途不调节pH，实验结果如表5，质粒表达系统TDΔdddA p59的3HP产量达到11g/L，而基因组表达系统TD27的3HP产量更高，达到11.7g/L，而且基因组表达系统TD27的PHB百分含量显著高于质粒表达。另外，本发明还检测了两种系统在这种培养条件下的PDO转化为3HP的转化率，通过检测PDO剩余量得出PDO的消耗量，与相应的3HP产物作比较，PDO到3HP的转化率均接近90％。
表5. 60MM改良培养基对3HP生产的影响
Figure BDA0002570620500000153
3.基于重组嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD27生产3-羟基丙酸的发酵罐实验方法如下：培养基配方同前述发明内容之六。
发酵过程中每4小时取一次样品用于产物分析和检测，发酵64小时的结果如图5，当PDO和葡萄糖在发酵的第8小时连续加入时，细胞生长受到抑制。仅获得60 g/L 3HP和小于30g/L的DCM。当在补料分批发酵期间的24、28和32小时添加60g/L的PDO以分离细胞生长和3HP合成，重组嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD27产生154g/L 3HP，产量和生产力分别为0.93g/g PDO和2.4g/L/h，这是迄今为止报道的最高3HP产量和生产力。
实施例4以高产3-羟基丙酸的重组嗜盐菌Halomonas bluephagenesis TD27为底盘菌生产3-羟基丙酸衍生物
目的是构建生产3-羟基丙酸共聚物的重组型嗜盐菌。为解决上述技术问题，采用的方法是：
1.构建高效生产3-羟基丙酸衍生物P3HB3HP的重组型嗜盐菌，包括PPorin启动子过表达的来源于Ralstonia entropha的PHA合成酶编码基因phaC(SEQ ID NO:8)和来源于C.aurantiacus的辅酶A连接酶结构域Pcs’(SEQ ID NO:9)或来源于R.eutropha的乙酰辅酶A合成酶AcoE(SEQ ID NO:10)或来源于E.coli的丙酰辅酶A合成酶PrpE(SEQ ID NO:11)或来源于S.typhimurium的醛脱氢酶PduP(SEQ ID NO:12)。
2.本发明的高效生产3-羟基丙酸衍生物P3HB3HP的重组型嗜盐菌主要通过下述方法构建得到：
(1)将来源于C.aurantiacus的辅酶A连接酶结构域Pcs’，来源于R.eutropha的乙酰辅酶A合成酶AcoE，来源于E.coli的丙酰辅酶A合成酶PrpE或来源于S.typhimurium的醛脱氢酶PduP分别与来源于R.eutropha的PhaC1共同过表达，通过Gibson assembly方法分别构建获得p129，p130，p131和p132质粒。用上述质粒转化重组嗜盐菌Halomonasbluephagenesis TD27，分别获得重组菌TD27 p129、TD27 p130、TD27 p131和TD27 p132。
(2)加入不同浓度梯度碳源，本发明发现当加入6g/L PDO时，3HP的产量只有5g/L，当PDO浓度提高到12g/L时TD27 p129就能生产超过40％摩尔比的P3HP。将P3HP不同摩尔比的P(3HB-co-3HP)共聚物进行NMR分析，结果证明共聚物中的确存在P3HP，并且其摩尔比与气相色谱分析结果一致(图6)。
3.基于高效生产3-羟基丙酸衍生物P3HB3HP的重组型嗜盐菌生产P3HB3HP的发酵方法如下：
培养基中的葡萄糖浓度变为20g/L，PDO浓度变为10g/L，乙酸浓度调整为6g/L。
培养基组配方和检测方法同前述发明内容之六。
表6.本发明涉及的基因序列和引物序列
Figure BDA0002570620500000161
Figure BDA0002570620500000171
Figure BDA0002570620500000181
Figure BDA0002570620500000191
Figure BDA0002570620500000201
Figure BDA0002570620500000211
Figure BDA0002570620500000221
Figure BDA0002570620500000231
本发明涉及的各个质粒构建用到的引物序列
Figure BDA0002570620500000232
Figure BDA0002570620500000241
本领域技术人员应该理解，尽管参照上述实施例对本发明进行了具体的描述，但是本发明并不限于这些具体的实施例。基于本发明所教导的方法和技术方案，在不背离本发明的精神的前提下，本领域技术人员能够进行适当的修改或改进，由此所得的等价实施方案都在本发明的范围内。
Figure IDA0002620954960000011
Figure IDA0002620954960000021
Figure IDA0002620954960000031
Figure IDA0002620954960000041
Figure IDA0002620954960000051
Figure IDA0002620954960000061
Figure IDA0002620954960000071
Figure IDA0002620954960000081
Figure IDA0002620954960000091
Figure IDA0002620954960000101
Figure IDA0002620954960000111
Figure IDA0002620954960000121
Figure IDA0002620954960000131
Figure IDA0002620954960000141

Claims (10)

1.重组嗜盐菌(Halobacteriaceae)，其包含生产3-羟基丙酸(3HP)或其衍生物的代谢路径，其中所述3-羟基丙酸的衍生物为聚3-羟基丙酸酯(P3HP)或3-羟基丙酸与选自以下的单体的共聚物：3-羟基丁酸(3HB)、4-羟基丁酸(4HB)、3-羟基戊酸(3HV)、或其组合，优选为聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基丙酸)(P3HB3HP)。
2.根据权利要求1所述的重组嗜盐菌，其中3-羟基丙酸的降解途径被敲除，优选其中所述重组嗜盐菌缺失了3-羟基丙酸降解基因，更优选所述3-羟基丙酸降解基因为嗜盐菌的编码胆碱脱氢酶的基因dddA、编码甲基丙二酸半醛脱氢酶的基因dddC或其组合，最优选所述基因dddA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述基因dddC的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组嗜盐菌，其中所述代谢路径是通过在野生型嗜盐菌中表达(过表达)负责该代谢途径的(外源)基因或(外源)基因的组合和/或减弱或阻断或敲除所述代谢路径的支路和/或分解代谢路径的(内源)基因或(内源)基因的组合(使其为该基因缺陷型)来构建的，优选的基因的减弱或阻断可以通过表达(过表达)所述基因的抑制剂基因或直接删除来实现的。
4.根据权利要求1-3所述的重组嗜盐菌，其特征还在于以下中的一个或多个：
(1)所述重组嗜盐菌通过过表达内源或外源3-羟基丙酸合成基因来生产3-羟基丙酸，优选所述3-羟基丙酸合成基因为编码1,3-丙二醇脱氢酶的基因dhaT(SEQ ID NO:3)、编码醛脱氢酶的基因aldD(SEQ ID NO:4)、aldDTD编码醛脱氢酶的基因aldDTD(SEQ ID NO:5)、编码醇脱氢酶的基因adhP(SEQ ID NO:6)或它们的任何组合，更优选为dhaT基因和aldD基因的组合或aldDTD基因和adhP基因的组合，最优选为嗜盐菌的aldDTD基因和adhP基因的组合；
(2)3-羟基丙酸合成基因处于外源引入的强启动子和强RBS序列控制下，以提高其转录和翻译水平，优选所述强启动子选自Porin启动子(SEQ ID NO:7)，所述强RBS序列如SEQ IDNO:8所示；和
(3)所述重组嗜盐菌还通过过表达3-羟基丙酸衍生物合成基因来生产3-羟基丙酸共聚物，优选所述3-羟基丙酸共聚物合成基因为PHA聚合酶基因PhaC与辅酶A连接酶结构域Pcs’基因、乙酰辅酶A合成酶AcoE基因、丙酰辅酶A合成酶PrpE基因和/或醛脱氢酶基因PduP的组合，更优选所述3-羟基丙酸共聚物合成基因为来源于R.eutropha的PhaC1基因(SEQ ID NO:8)与来源于Chloroflexu aurantiacus的辅酶A连接酶结构域Pcs’基因(SEQ ID NO:9)、来源于Ralstonia eutropha的乙酰辅酶A合成酶AcoE基因(SEQ ID NO:10)、来源于E.coli的丙酰辅酶A合成酶PrpE基因(SEQ ID NO:11)或来源于Salmonella typhimurium的醛脱氢酶基因PduP(SEQ ID NO:12)的组合。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的重组嗜盐菌，其中所述嗜盐菌为嗜盐单胞菌属(Halomonas sp.)，最优选为Halomonas bluephagenesis TD01(菌种保藏编号CGMCCNo.4353)。
6.一种制备3-羟基丙酸或其衍生物的方法，所述3-羟基丙酸的衍生物为聚3-羟基丙酸酯(P3HP)或3-羟基丙酸与选自以下的单体的共聚物：3-羟基丁酸(3HB)、4-羟基丁酸(4HB)、3-羟基戊酸(3HV)、或其组合，优选为聚(3-羟基丁酸-co-3-羟基丙酸)(P3HB3HP)，所述方法包括使用根据权利要求1-5中任一项所述的重组嗜盐菌来生产3-羟基丙酸或其衍生物。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述方法可以在开放无灭菌和/或批次或连续发酵的条件下进行，优选其中将葡萄糖和1,3-丙二醇(PDO)作为混合碳源。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述方法包括在发酵过程中加入乙酸来调节细胞内的氧化还原平衡，和/或通过增加缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)的量来提高培养基的缓冲能力，由此增加3-羟基丙酸或其衍生物的产量。
9.一种制备根据权利要求1-5中任一项所述的重组嗜盐菌的方法，所述方法包括构建具有权利要求4中所述特征中一个或多个[(优选特征(1)+(2)的组合，特征(1)+(2)+(3)的组合]的重组嗜盐菌。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述表达(过表达)是通过将所表达的基因在一个或多个质粒上表达或者被整合到所述嗜盐菌的基因组中表达来实现的，和/或所述基因缺陷型是通过从所述嗜盐菌中敲除所述基因来实现的，优选利用CRISPR/cas9介导的基因敲除方法进行基因的敲除。
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