CN116396886A - 嗜盐单胞菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种嗜盐单胞菌及其应用。嗜盐单胞菌的保藏编号为GDMCC No:62635，已于2022年7月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。相对于传统技术，本申请的有益效果包括：保藏编号为GDMCC No:62635的嗜盐单胞菌，不仅能够高产PHA，而且能够在不添加微量元素的条件下高产PHA，特别是，能够形成PHA单一大颗粒。同时，该菌株还具有耐受性好，适用不同的碳源。
Description
技术领域
本发明涉及工业微生物技术领域，特别涉及一株嗜盐单胞菌及其应用。
背景技术
微生物发酵是生物合成产品的主要途径，由于传统工业生物技术存在灭菌成本高、高淡水消耗、不连续发酵易污染等缺点，导致其与化学工艺相比竞争力较低。随着科研人员的努力，筛选并改极端微生物作为底盘细胞，解决了传统工业生物技术的问题，发展出了“下一代工业生物技术（NGIB）”实现无需灭菌、节能节水、开放式的连续发酵。
对于下一代工业生物技术，研究比较成熟的便是嗜盐微生物，它是一种能够在高盐、高pH环境下能够正常生长的极端微生物。基于合成生物学的发展需求，对嗜盐微生物在基因改造、代谢调控及形态学方面进行了深入研究。
嗜盐单胞菌是NGIB最突出的底盘细胞，具有天然合成聚羟基脂肪酸酯（PHA）的优点。例如CN102120973A中记载的嗜盐单胞菌TD01。然而，高产量的PHA生产过程中，传统的嗜盐单胞菌对微量元素呈现比较明显的依赖性。
有鉴于此，特提出本申请。
发明内容
本申请实施例的目的之一包括提供一株嗜盐单胞菌，该菌株能够高产PHA且无需生产过程中无需添加微量元素，其中PHA呈现天然大颗粒状态。
在本申请的第一方面，提供一种保藏编号为GDMCC No:62635的嗜盐单胞菌，已于2022年7月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
在本申请的第二方面，提供一种聚羟基脂肪酸酯的制备方法，所述制备方法如下步骤：
培养第一方面所述的嗜盐单胞菌，从所得培养物中收集PHA。
在本申请的一些实施方式中，培养采用培养基
，所述培养基/>
包含氯化钠10g/L-120g/L、酵母粉1g/L-10g/L、胰蛋白胨1g/L -20g/L以及水，pH至7-11。
在本申请的一些实施方式中，培养采用培养基
，所述培养基/>
包含碳源以及所述的培养基/>
。
在本申请的一些实施方式中，所述碳源满足如下条件中一个或者多个：
（1）所述碳源选自挥发性脂肪酸盐、单糖、双糖、小分子多元醇或者其组合；和，
（2）所述碳源在所述培养基
中的用量为5g/L-50g/L。
在本申请的一些实施方式中，所述碳源满足如下条件中一个或者多个：
（1）所述挥发性脂肪酸盐选自乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠、己酸钠或者其组合；
（2）所述单糖选自葡萄糖、木糖或者其组合；
（3）所述双糖为蔗糖；和，
（4）所述小分子多元醇选自甘油、丁二醇、丙二醇、戊二醇、己二醇或者其组合。
在本申请的一些实施方式中，培养采用培养基
，所述培养基/>
包含所述的碳源、氯化钠10g/L-120g/L、酵母粉1g/L-20g/L、尿素0.5g/L -10g/L、天冬氨酸 0g/L-10g/L、无水硫酸镁0.05g/L-0.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L-5.5g/L、CaCl2·2H2O 0.02g/L-0.2g/L、Fe(III)-NH4-Citrate 0.04g/L -0.1g/L以及水，pH为7-11。
在本申请的一些实施方式中，所述培养基
包含葡萄糖10g/L-80g/L、乙酸钠0g/L-140g/L、氯化钠10g/L-120g/L、酵母粉1g/L-20g/L、尿素0.5g/L -10g/L、天冬氨酸 0g/L-10g/L、无水硫酸镁0.05g/L-0.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L-5.5g/L、CaCl2·2H2O 0.02g/L-0.2g/L、Fe(III)-NH4-Citrate 0.04g/L -0.1g/L以及水，pH为7-11。
在本申请的一些实施方式中，培养采用培养基
，所述培养基/>
包含所述的培养基/>
以及微量元素。
在本申请的一些实施方式中，所述培养基
包含葡萄糖10g/L-80 g/L、乙酸钠0g/L-140g/L、氯化钠10g/L-120g/L、酵母粉1g/L-20g/L、尿素0.5g/L -10g/L、天冬氨酸 0g/L-10g/L、无水硫酸镁0.05g/L-0.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L-5.5g/L、CaCl2·2H2O 0.02g/L-0.2g/L、Fe(III)-NH4-Citrate 0.04g/L -0.1g/L、ZnSO4·7H2O 9.8×10-5g/L-0.2 g/L、MnCl2·4H2O 2.94×10-5g/L-0.09g/L、H3BO32.94×10-4g/L-1g/L、CoCl2·6H2O 1.96×10- 4g/L-0.8 g/L、 CuSO4·5H2O 9.8×10-6g/L-0.08g/L、NiCl2·6H2O 1.96×10-5g/L-0.1g/L、NaMoO4·2H2O 2.95×10-5g/L-0.12 g/L以及水，pH为7-11。
在本申请的一些实施方式中，培养的温度为30℃-42℃，培养的转速为50rpm-300rpm，培养的时间为12h-72h。
相对于传统技术，本申请的有益效果包括：
本申请提供一株保藏编号为GDMCC No:62635的嗜盐单胞菌，即Halomonassp.LY01，该菌株不仅能够高产PHA，而且能够在不添加微量元素的条件下高产PHA，特别是，能够形成PHA单一大颗粒。同时，该菌株还具有耐受性好、适用不同的碳源的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为Halomonas sp.LY01扫描电镜图；
图2为Halomonas sp.LY01透射电镜图；
图3为Halomonas sp.LY01透射电镜图（10μm）；
图4为Halomonas sp.LY01透射电镜图（2μm）；
图5为Halomonas sp.LY01透射电镜图（1μm）；
图6为Halomonassp.LY01菌株与其他菌株序列对比的进化树。
本发明提供的Halomonassp.LY01，其分类命名为Halomonassp.，已于2022年7月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No.62635；该菌株于2022年7月19日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2022年7月19日检测为存活菌株。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间（也即数值范围），如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点（即最小值及最大值），以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1~10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，%(w/w)与wt%均表示重量百分比，%(v/v)指体积百分比，%(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本申请的第一方面
本申请提供一种保藏编号为GDMCC No:62635的嗜盐单胞菌，已于2022年7月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
本申请的第二方面
本申请提供一种聚羟基脂肪酸酯的制备方法，所述制备方法如下步骤：
培养第一方面所述的嗜盐单胞菌，从所得培养物中收集PHA。
在本申请的一些实施方式中，培养采用培养基
，所述培养基/>
包含氯化钠10g/L-120g/L、酵母粉1g/L-10g/L、胰蛋白胨1g/L -20g/L以及水，pH至7-11。
可选地，所述培养基
包含氯化钠55g/L-65g/L、酵母粉3g/L-7g/L、胰蛋白胨5g/L-15g/L以及水，pH至8-9。
在本申请的一些实施方式中，培养采用培养基
，所述培养基/>
包含碳源以及如上定义的培养基/>
。
在本申请的一些实施方式中，所述碳源满足如下条件中一个或者多个：
（1）所述碳源选自挥发性脂肪酸盐、单糖、双糖、小分子多元醇或者其组合；和，
（2）所述碳源在所述培养基
中的用量为5g/L-50g/L。
本申请中，所述碳源在所述培养基
中的用量（g/L）例如为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50。可选地，为25-35 g/L。
在本申请的一些实施方式中，所述碳源满足如下条件中一个或者多个：
（1）所述挥发性脂肪酸盐选自乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠、己酸钠或者其组合；
（2）所述单糖选自葡萄糖、木糖或者其组合；
（3）所述双糖为蔗糖；和，
（4）所述小分子多元醇选自甘油、丁二醇、丙二醇、戊二醇、己二醇或者其组合。
在本申请的一些实施方式中，培养采用培养基
，所述培养基/>
包含如上定义的碳源、氯化钠10g/L-120g/L、酵母粉1g/L-20g/L、尿素0.5g/L -10g/L、天冬氨酸 0g/L-10g/L、无水硫酸镁0.05g/L-0.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L-5.5g/L、CaCl2·2H2O 0.02g/L-0.2g/L、Fe(III)-NH4-Citrate 0.04g/L -0.1g/L以及水，pH为7-11。
本申请所述培养基
中各成分的浓度（g/L）可以为：氯化钠的浓度例如为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120；酵母粉的浓度例如为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；尿素的浓度例如为0.5g/L、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；天冬氨酸的浓度例如为：0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。无水硫酸镁的浓度例如为0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6；磷酸二氢钾的浓度例如为：1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5；CaCl2·2H2O的浓度例如为0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14、0.16、0.18、0.2；pH例如为7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11。
在本申请的一些实施方式中，所述培养基
包含葡萄糖10g/L-80g/L、乙酸钠0g/L-140g/L、氯化钠10g/L-120g/L、酵母粉1g/L-20g/L、尿素0.5g/L -10g/L、天冬氨酸 0g/L-10g/L、无水硫酸镁0.05g/L-0.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L-5.5g/L、CaCl2·2H2O 0.02g/L-0.2g/L、Fe(III)-NH4-Citrate 0.04g/L -0.1g/L以及水，pH为7-11。
可选地，所述培养基
中：葡萄糖的浓度（g/L）例如为10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80；乙酸钠的浓度（g/L）例如为0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140。
在本申请的一些实施方式中，培养采用培养基
，所述培养基/>
包含如上定义的培养基/>
以及微量元素。
在本申请的一些实施方式中，所述培养基
包含葡萄糖10g/L-80 g/L、乙酸钠0g/L-140g/L、氯化钠10g/L-120g/L、酵母粉1g/L-20g/L、尿素0.5g/L -10g/L、天冬氨酸 0g/L-10g/L、无水硫酸镁0.05g/L-0.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L-5.5g/L、CaCl2·2H2O 0.02g/L-0.2g/L、Fe(III)-NH4-Citrate 0.04g/L -0.1g/L、ZnSO4·7H2O 9.8×10-5g/L-0.2 g/L、MnCl2·4H2O 2.94×10-5g/L-0.09g/L、H3BO32.94×10-4g/L-1g/L、CoCl2·6H2O 1.96×10- 4g/L-0.8 g/L、 CuSO4·5H2O 9.8×10-6g/L-0.08g/L、NiCl2·6H2O 1.96×10-5g/L-0.1g/L、NaMoO4·2H2O 2.95×10-5g/L-0.12 g/L以及水，pH为7-11。
可选地，所述培养基
包含葡萄糖25g/L-35g/L、乙酸钠0g/L、氯化钠45g/L-55g/L、酵母粉1g/L-2g/L、尿素0.5g/L -0.7g/L、天冬氨酸 0g/L、无水硫酸镁0.3g/L-0.45g/L、磷酸二氢钾3g/L-4g/L、CaCl2·2H2O 0.02g/L-0.04g/L、Fe(III)-NH4-Citrate 0.04g/L -0.06g/L、ZnSO4·7H2O 9.8×10-5g/L-1.5×10-4g/L、MnCl2·4H2O 2.94×10-5g/L-3.1×10- 5g/L、H3BO32.94×10-4g/L-3.2×10-4g/L、CoCl2·6H2O 1.96×10-4g/L-2.5×10-4g/L、CuSO4·5H2O 9.8×10-6g/L- 1×10-5g/L、NiCl2·6H2O 1.96×10-5g/L-2.5×10-5g/L、NaMoO4·2H2O 2.95×10-5g/L-3×10-5g/L以及水，pH为7-11。
在本申请的一些实施方式中，培养的温度为30℃-42℃，培养的转速为50rpm-300rpm，培养的时间为12h-72h。
本申请中，培养的温度（℃）例如为30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42，培养的转速（rpm）例如为50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300，培养的时间（h）例如为12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
以下实施例中:
LB培养基包含水以及酵母粉5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化钠10 g/L，pH为8.5。在氯化钠浓度上调至60g/L的条件下记作“60 LB”。
实施例1、菌株的分离与纯化
（1）菌株的分离
称取1g来自新疆淤泥样，用无菌水稀释，涂布于含NaCl（60g/L）的LB平板上（60LB），37℃培养48h。
（2）菌株的纯化
随机挑取平板上的多个单克隆菌落，用新的60LB液体培养基稀释，涂布于新NaCl（60 g/L）的LB（60LB）平板上，37℃，静止培养48h；反复重复上述过程，直至平板上长出形状相近的单克隆，完成菌株的纯化，并将其命名为Halomonassp.LY01。
（3）菌株特征及类别鉴定
菌株形态：将分离纯化好的菌株采用60LB液体培养基在37℃条件下培养48小时（摇床转速为220 rpm），取少量培养好的菌液，使用扫描电镜确定菌的形态为短杆状或椭球形，如图1所示。
独特特征：该菌株利用碳源生长，可天然合成PHA单一大颗粒，PHA几乎充斥全细胞，高产，便于后续提取纯化，能够实现更低耗和简化的下游分离纯化工艺，详见图2、图3、图4、图5。
类别鉴定：利用革兰氏染色法对该菌株进行鉴别，确定该菌株为革兰氏阴性菌。
（4）菌株16srRNA基因测定
检测该菌株的16S rDNA序列，扩增16S rRNA序列。
其中，引物分别如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示：
16-F（SEQ ID No.1）：TTGCTACCCGCTGACGAGC，
1492-R（SEQ ID No.2）：CCGCCTTCGCCACTGGTATT。
随后送至广州华大生物公司测序分析，经测序，16S rRNA的序列如SEQ ID No.3所示：
CGGGGCGGCGGCTAACACATGCAGTCGAGCGGTAACAGGGGTAGCTTGCTACCCGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCATAGGAATCTGCCCGATAGTGGGGGATAACCTGGGGAAACCCAGGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGGGGGCTCCGGCTCCCGCTATTGGATGAGCCTATGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACATCGGGACTGAGACACGGCCCGAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGAGGAAGAACGCCTAGTGGTTAATACCCATTAGGAAAGACATCACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGCTTGATAAGCCGGTTGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAACGGCATCCGGAACTGTCAAGCTAGAGTGCAGGAGAGGAAGGTAGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCTTCTGGACTGACACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACCAGCCGTTGGGTGCCTAGCGCACTTTGTGGCGAAGTTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCTGCGAACTTGTGAGAGATCACTTGGTGCCTTCGGGAACGCAGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTATTTGCCAGCGGGTAATGCCGGGAACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGGGTTGCGAGCTCGCGAGAGTCAGCTAATCCCGAAAAGCCGGTCTCAGTCCGGATCGGAGTCTGCAACTCGACTCCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGACTGCACCAGAAGTGGTTAGCTTAACCTTCGGGAAAGCGATCACCACGGTGTGTAAGGG
（5）菌株序列对比
将测序得到的Halomonassp.LY01菌株的16S rRNA与Halomonassp. TD01、Halomonassp. X34、Halomonassp. TTW4、Halomonas campaniensisLS21、Halomonas alkaliphilaS5a、Halononassp. DSM2581等常见盐单胞菌来源的16s RNA用MEGA 6.0软件进行序列比对，并绘制进化树（图6）。
结果如图6所示，比对的进化树图反映了Halomonassp.LY01与Halomonassp. TD01序列相差较大，亲缘性较差；但是与Halomonassp. X34、Halomonassp. TTW4、Halomonas campaniensisLS21、Halomonas alkaliphilaS5a等亲缘性很近。
实施例2、比较Halomonas sp.LY01在不同碳源条件下的生长情况
碳源主要分类为：挥发性脂肪酸盐，如：乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠、己酸钠；葡萄糖等能量碳源，如：葡萄糖、木糖、甘油、蔗糖等。本实施例是将单一种类的碳源作为原料加入60LB。
（1）种子液制备
①菌种活化：于实验室-80℃冰箱取菌种，用枪头挑取菌液划线接种于平板固体培养基（酵母粉5 g/L；胰蛋白胨10 g/L；氯化钠60 g/L，pH为8.5）上，37℃培养24h。
②一级种子培养：挑取单菌落接种于12mL摇菌管（5mL 60LB培养基：酵母粉5 g/L；胰蛋白胨10g/L；氯化钠60 g/L；pH为8.5）中，将培养液置于摇床37℃、220rpm培养12h。
③二级种子培养：吸取一级菌液200μL(1％接种量，v/v)，接种于150ml锥形瓶（20ml 60LB培养基）中，将置于摇床37℃、220rpm培养12h。
（2）发酵培养基准备
发酵培养基（60LB）：酵母粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，氯化钠60 g/L，碳源10g/L ，pH为8.5；其中，根据碳源种类的不同设置9个实验组，分别对应的碳源种类为葡萄糖、乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠、己酸钠、木糖、蔗糖和甘油。
（3）发酵培养
将种子液按5%接种（2.5mL）于500mL锥形瓶（50 mL 60LB）内，置于摇床37℃、220rpm培养48h。
（4）细胞干重及PHA含量测定
细胞干重（CDW）:将30-35mL发酵后菌液置于50mL离心管中, 室温离心6分钟，转速为8000rpm，倒掉上清；加入适量去离子水恢复原体积，重悬，保证沉淀完全消失，同等条件下离心，倒掉上清液；封口膜封口离心管置于-80℃冰箱冻存2h；将离心管于真空冷冻干燥机内干燥12-16小时；称重，计算细胞干重（g/L）。
测定PHA含量：然后在40mg冻干细胞中加入2mL酯化液（包含甲醇、3% (v/v)浓硫酸(98%,w/w)和1g/L苯甲酸）及2mL氯仿，100℃下酯化约4h。PHB标品20-30mg采用同样处理为参照；随后使用GC-2014气相色谱仪(日本岛津)测定PHB含量。测试方法是：初始温度维持在80℃，1.5min；第一阶段,温度以30℃/min的速度增加到140℃；第二阶段，以40℃/min的速度增加到240℃，此过程耗时2min；总的分析时间是8min；注射温度为240℃和检测器温度为250℃。
（5）发酵结果
该菌株分别以不同类型碳源为唯一底物时的发酵结果如表1（在表中所有数据均是均值±方差）所示：
表1、不同类型碳源下的发酵数据表
结果表明：利用不同的碳源进行菌株培养时，发现当葡萄糖为唯一碳源进行培养时，菌株的长势状况最好，其OD600可以达到35，细胞干重最高可达到约8.96g/L，生产的PHA含量最高约为55%；以戊酸钠及己酸钠为碳源培养也具有潜力，OD600可以高达19，细胞干重可高达5g/L并且PHA最高含量接近50%。
实施例3、比较Halomonassp.LY01在不同生长条件的耐受情况
（1）种子液制备：同实施例2中的种子液制备步骤。
（2）发酵培养基准备：发酵培养基包含水以及酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠，碳源葡萄糖 30 g/L；
其中，氯化钠的浓度（g/L）设置4个水平：30，50，70，100。
（3）发酵培养：接种量及发酵条件同实施例2；温度设置为3个水平：30℃，33℃，37℃；pH（采用5M NaOH调节）设置为4个水平：7，8，9，10。
注：当进行温度测试实验时，培养体系为 60LB；当进行pH、氯化钠浓度实验时，培养体系为60LB和30 g/L葡萄糖，培养温度为30℃。
（4）细胞干重及PHA含量测定：细胞干重及PHA含量测定操作同实施例2。
（5）发酵结果：该菌株在不同生长条件（温度、pH、氯化钠浓度）下的发酵结果如表2（表中所有数据均是均值±方差）所示。
表2、不同生长条件下发酵数据表
结果表明：当该菌株在温度为30℃，OD600和细胞干重可达到最高值；当pH=10时，菌株的长势最好，其OD600、细胞干重和PHA含量可达到相对最高值；当氯化钠浓度为50g/L，菌株的生长发酵结果最好。
实施例4、比较Halomonassp.LY01在不同培养体系（60 LB和50 MM）下发酵情况
（1）种子液制备：同实施例2中的种子液制备。
（2）培养基准备
① 50MM培养体系
底料（g/L）： NaCl 56.7，yeast 1.14，以及水；
组分I（g/L）：MgSO420，CO(NH2)230，以及水；
组分II（g/L）KH2PO4175，以及水；
组分III（g/L）：将5 g/L Fe(III)-NH4-Citrate和2 g/L CaCl2·2H2O及浓盐酸（12mol/L） 41.7ml充分混合后定容1L；
组分IV（g/L）：含ZnSO4·7H2O 0.1，MnCl2·4H2O 0.03，H3BO30.3，CoCl2·6H2O 0.2，CuSO4·5H2O 0.01，NiCl2·6H2O 0.02和NaMoO4·2H2O 0.03；
组分III和组分IV：取100ml组分III，10ml组分IV且加入90mL去离子水混合，最后用5M的NaOH调pH值到4.5-5.5；
碳源（g/L）：葡萄糖 500，以及水。
② 60LB培养体系：制备同实施例2。
（3）发酵培养
① 50MM：将种子液按5%(v/v)接种于500ml锥形瓶（底料45mL；组分I 1mL；组分II1mL；组分III&IV 1mL；葡萄糖3 mL；5M的NaOH调pH值到8.5-9.5。
即各成分添加量为（g/L）：NaCl 50， yeast 1，MgSO40.39，CO(NH2)20.59，KH2PO43.43， Fe(III)-NH4-Citrate 0.049，CaCl2·2H2O 0.020，ZnSO4·7H2O 9.8×10-5，MnCl2·4H2O 2.94×10-5，H3BO32.94×10-4，CoCl2·6H2O 1.96×10-4，CuSO4·5H2O 9.8×10-6，NiCl2·6H2O 1.96×10-5和NaMoO4·2H2O 2.94×10-5，葡萄糖 29.41，置于摇床37℃、220rpm培养48h；
②60LB:接种量及发酵条件同实施例2。
（4）细胞干重及PHA含量的测定：细胞干重及PHA含量测定操作同实施例2。
(5)发酵结果：该菌株在不同培养基中的发酵结果如表3(表中所有数据均是均值±方差)所示。
表3、不同培养体系下Halomonassp.LY01发酵数据
结果表明：矿物质培养基MM培养基相较于60LB培养基更适合Halomonassp.LY01，当将该菌株培养在50MM培养基中，其OD600最高可达到约59，细胞干重可达到约8.4g/L，天然产生的PHA含量达到约50%。
实施例5、非微量元素依赖
（1）种子液制备：同实施例2中的种子液制备。
（2）培养基准备：采用实施例4 中50MM培养体系为对照；实验组3-4中将组分IV去除（即微量元素去除），其余组分加入量不变，记作“50MM（非微量元素依赖）”。
（3）发酵培养：接种量及发酵条件同实施例4。
（4）细胞干重及PHA含量的测定：细胞干重及PHA含量测定操作同实施例2。
（5）发酵结果：该菌株在不同培养基中的发酵结果于表4。
表4、非微量元素依赖发酵结果
对比50MM体系，当没有微量元素添加的条件下，嗜盐菌Halomonassp.LY01能够进行生长，并且会产生4.877 g/L的PHA 。
实施例6、Halomonassp.LY01高产不同单体类型PHA摇瓶发酵
按上述筛选出的条件，选择不同含量的碳源采用50MM培养基进行发酵，高产不同单体类型的PHA产品。
（1）种子液制备：同实施例2中的种子液制备。
（2）培养基的准备：采用50MM培养体系，同实施例4；50MM培养体系中添加碳源，根据碳源种类及其添加终浓度设置如下实验组：葡萄糖 30g/L、25g/L、甘油30 g/L、蔗糖30g/L、木糖30g/L、乙酸钠5g/L、丙酸钠5g/L、戊酸钠5g/L、己酸钠5g/L。
（3）发酵培养：接种量及发酵条件同实施例4 （注：需要改变不同组合碳源的加入量）。
（4）细胞干重及PHA含量测定：细胞干重及PHA含量测定操作同实施例2。
(5)发酵结果：不同温度及不同碳源比例下的发酵结果如表5(表中所有数据均是均值±方差)所示。
表5、不同碳源组合条件下的Halomonas sp.LY01发酵结果表
其中，
实验组4-1：碳源为葡萄糖，浓度为30 g/L；
实验组4-2：碳源为蔗糖，浓度为30 g/L；
实验组4-3：碳源为甘油，浓度为30 g/L；
实验组4-4：碳源为木糖，浓度为30g/L；
实验组4-5：碳源为葡萄糖和乙酸钠，浓度分别为25g/L和5g/L；
实验组4-6：碳源为葡萄糖和丙酸钠，浓度分别为25g/L和5g/L；
实验组4-7：碳源为葡萄糖和戊酸钠，浓度分别为25g/L和5g/L；
实验组4-8：碳源为葡萄糖和己酸钠，浓度分别为25g/L和5g/L。
结果表明：分别在50MM培养基中加入不同碳源组合，生产的PHA含量可高达70%；也会产生不同单体的PHA，如P3HB；P（3HB-co-3HP）；P（3HB-co-3HV）；P（3HB-co-3HHx）。其中，当加入30g/L葡萄糖时，细胞干重最大达到约9 g/L，PHB含量最高约为80%；另外，Halomonassp.LY01菌可直接利用甘油，并且也能天然合成约65% PHB。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。
Claims (11)
1.保藏编号为GDMCC No:62635的嗜盐单胞菌，已于2022年7月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。
2.一种聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下步骤：
培养权利要求1所述的嗜盐单胞菌，从所得培养物中收集PHA。
3.根据权利要求2所述的聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，培养采用培养基
，所述培养基/>
包含氯化钠10g/L-120g/L、酵母粉1g/L-10g/L、胰蛋白胨1g/L -20g/L以及水，pH至7-11。
4.根据权利要求2所述的聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，培养采用培养基
，所述培养基/>
包含碳源以及权利要求3中定义的培养基/>
。
5.根据权利要求4所述的聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，所述碳源满足如下条件中一个或者多个：
（1）所述碳源选自挥发性脂肪酸盐、单糖、双糖、小分子多元醇或者其组合；和，
（2）所述碳源在所述培养基
中的用量为5g/L-50g/L。
6.根据权利要求5所述的聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，所述碳源满足如下条件中一个或者多个：
（1）所述挥发性脂肪酸盐选自乙酸钠、丙酸钠、丁酸钠、戊酸钠、己酸钠或者其组合；
（2）所述单糖选自葡萄糖、木糖或者其组合；
（3）所述双糖为蔗糖；和，
（4）所述小分子多元醇选自甘油、丁二醇、丙二醇、戊二醇、己二醇或者其组合。
7.根据权利要求2所述的聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，培养采用培养基
，所述培养基/>
包含权利要求6中定义的碳源、氯化钠10g/L-120g/L、酵母粉1g/L-20g/L、尿素0.5g/L -10g/L、天冬氨酸 0g/L-10g/L、无水硫酸镁0.05g/L-0.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L-5.5g/L、CaCl2·2H2O 0.02g/L-0.2g/L 、Fe(III)-NH4-Citrate 0.04g/L -0.1g/L以及水，pH为7-11。
8.根据权利要求7所述的聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，所述培养基
包含葡萄糖10g/L-80g/L、乙酸钠0g/L-140g/L、氯化钠10g/L-120g/L、酵母粉1g/L-20g/L、尿素0.5g/L -10g/L、天冬氨酸 0g/L-10g/L、无水硫酸镁0.05g/L-0.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L-5.5g/L、CaCl2·2H2O 0.02g/L-0.2g/L、Fe(III)-NH4-Citrate 0.04g/L -0.1g/L以及水，pH为7-11。
9.根据权利要求2所述的聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，培养采用培养基
，所述培养基/>
包含权利要求7或者8中定义的培养基/>
以及微量元素。
10.根据权利要求9所述的聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，所述培养基
包含葡萄糖10g/L-80 g/L、乙酸钠0g/L-140g/L、氯化钠10g/L-120g/L、酵母粉1g/L-20g/L、尿素0.5g/L -10g/L、天冬氨酸 0g/L-10g/L、无水硫酸镁0.05g/L-0.6g/L、磷酸二氢钾1.5g/L-5.5g/L、CaCl2·2H2O 0.02g/L-0.2g/L、Fe(III)-NH4-Citrate 0.04g/L -0.1g/L、ZnSO4·7H2O 9.8×10-5g/L-0.2 g/L、MnCl2·4H2O 2.94×10-5g/L-0.09g/L、H3BO3 2.94×10-4g/L-1g/L、CoCl2·6H2O 1.96×10-4g/L-0.8 g/L、 CuSO4·5H2O 9.8×10-6g/L-0.08g/L、NiCl2·6H2O 1.96×10-5g/L-0.1g/L、NaMoO4·2H2O 2.95×10-5g/L-0.12 g/L以及水，pH为7-11。
11.根据权利要求2至10任一项所述的聚羟基脂肪酸酯的制备方法，其特征在于，培养的温度为30℃-42℃，培养的转速为50rpm-300rpm，培养的时间为12h-72h。
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