CN115125275A - 一种利用盐单胞菌生产pha的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用盐单胞菌生产PHA的方法。利用微生物连续发酵得到PHA的方法，容易被杂菌污染，难以保证纯种培养。针对上述问题，本发明提供一种利用盐单胞菌生产PHA的方法，发酵所用微生物为嗜盐单胞菌，这种菌能适应高盐浓度的培养基，正是这种高盐环境避免了培养基被空气中的杂菌污染，确保了嗜盐单胞菌的纯种培养。另外，本发明这种三段式微生物连续发酵技术可使嗜盐单胞菌体的增殖过程主要发生在发酵罐1中，菌体增殖向PHA合成转变的过程主要发生在发酵罐2中，PHA快速合成积累的过程主要发生在发酵罐3中，整个发酵过程可持续进行三个月，延长了单次发酵的时间，产能得到大大提高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，尤其涉及一种利用盐单胞菌生产PHA的方法。
背景技术
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由很多细菌合成的一种胞内聚酯，它具有类似于合成塑料的物化特性及合成塑料所不具备的生物可降解性、生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性等许多优秀性能。聚羟基脂肪酸酯在可生物降解的包装材料、组织工程材料、缓释材料、电学材料以及医疗材料方面有广阔的应用前景，但只有降低PHA的生产成本后才可能大规模应用。
连续发酵又称开放型发酵，在培养中，控制输出与输入的恒速率，维持发酵液原来的体积。优点是：可以提高产物的产率和设备利用率，使菌体处于一个稳定的生长环境，缩短了产物的合成时间，同时便于自动控制。缺点就是较长时间的连续培养，容易被杂菌污染，难以保证纯种培养，菌种发生变异的可能性较大。
发明内容
现有技术中存在的问题是：利用微生物连续发酵得到PHA的方法，容易被杂菌污染，难以保证纯种培养。针对上述问题，本发明提供一种利用盐单胞菌生产PHA的方法，包括以下步骤：
(1)将三份等体积的菌液分别置于发酵罐1、发酵罐2、发酵罐3中，三个发酵罐之间依次有管道连接并通过蠕动泵驱动菌液流动；
(2)当发酵罐1中的葡萄糖浓度低于10g/L时，开始向发酵罐1中补加料一，同时将发酵罐1中的菌液以及料二加入到发酵罐2中；与此同时，将发酵罐2中的菌液以及料三加入到发酵罐3中，同时收集发酵罐3中泵出的菌液；全程监控发酵罐1中的OD600值，当发酵罐1中菌液的OD600值低于50时，停止发酵；
整个发酵过程是个连续的过程，发酵罐1、2、3中的菌液体积均不发生变化，一直保持动态平衡(具体是通过调节发酵罐1、2、3之间蠕动泵的功率来控制每个发酵罐中菌液泵出的流量大小，使得每个发酵罐内的菌液体积不发生变化)；
发酵罐1、2、3中的搅拌速度均为750-800rpm；
发酵罐1、2、3中菌液的温度均为36.5℃；
发酵罐1、2、3中菌液的pH＝8.5±0.1。
优选地，所述发酵罐1、2、3大小尺寸完全相同。
优选地，所述菌液由营养液和盐单胞菌培养液按照体积比10:1组成，所述营养液由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖60g/L
玉米浆干粉12g/L
尿素2g/L
氯化钠40-60g/L
硫酸镁0.2g/L
柠檬酸铁铵0.05g/L
无水氯化钙0.015g/L
七水硫酸锌0.1mg/L
四水硫酸锰0.03mg/L
硼酸0.3mg/L
五水硫酸铜0.01mg/L
钼酸钠0.03mg/L；
所述盐单胞菌培养液按照以下步骤制备：
(1)制备LB60液体培养基
将适量的酵母浸粉、胰蛋白胨、氯化钠溶解在水中得到培养液，并采用浓度为3M的氢氧化钠水溶液调节培养液的pH＝8.0±0.3，所述酵母浸粉在水中的浓度为5g/L，所述胰蛋白胨在水中的浓度为10g/L，所述氯化钠在水中的浓度为60g/L；
(2)制备LB60固体培养基
将适量的酵母浸粉、胰蛋白胨、氯化钠搅拌混合均匀，采用浓度为3M的氢氧化钠水溶液调节培养液的pH＝8.0±0.3，并加入适量琼脂粉，搅拌均匀后于121℃下高温高压灭菌20min得到LB60固体培养基，所述酵母浸粉在水中的浓度为5g/L，所述胰蛋白胨在水中的浓度为10g/L，所述琼脂粉在水中的浓度为16g/L，所述氯化钠在水中的浓度为60g/L；
(3)制备种子液
步骤a，取保存于-80℃的盐单胞菌甘油管，划线接种至LB60固体培养基上，36.5℃下培养24h；
步骤b，从步骤a的LB60固体培养基上挑取盐单胞菌重新划线接种至LB60固体培养基上，36.5℃下培养24h；
步骤c，从上一步骤b的LB60固体培养基上挑取盐单胞菌接种至盛有30mL LB60液体培养基的250mL三角瓶中，36.5℃下、220rpm/min震荡培养10h，即得到种子液；
(4)取3mL步骤(3)得到的种子液，按照1％接种体积比接种至300mL LB60液体培养基中，36.5℃下、220rpm/min震荡培养10-12h，即获得盐单胞菌培养液。
优选地，所述料一由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖80-120g/L
玉米浆干粉12g/L
尿素2-7g/L
氯化钠40-50g/L
硫酸镁0.2g/L
柠檬酸铁铵0.05g/L
无水氯化钙0.015g/L
七水硫酸锌0.1mg/L
四水硫酸锰0.03mg/L
硼酸0.3mg/L
五水硫酸铜0.01mg/L
钼酸钠0.03mg/L。
优选地，所述料二由葡萄糖基液与微量元素母液按照体积比10:1组成，所述葡萄糖基液由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖500-520g/L
尿素7.55g/L；
氯化钠40-60g/L
所述微量元素母液由微量元素与水组成，所述微量元素在水中的浓度如下：
氯化钼0.218g/L
氯化铁9.7g/L
氯化钙7.8g/L
五水合硫酸铜0.156g/L。
优选地，所述料三是浓度为800g/L的葡萄糖水溶液。
优选地，所述盐单胞菌包括但不限于嗜盐单胞菌H.bluephagenesis、H.campeniesis、H.alkaliphila、H.smymensis、H.levan、H.bluephagenesis TD-MmP1、Halomonas lutescens MDF-9。
有益效果
(1)本发明这种三段式微生物连续发酵获得PHA的方法，采用的微生物为嗜盐单胞菌，这种菌能适应高盐浓度的培养基，正是这种高盐环境避免了发酵罐中的培养基被空气中的杂菌污染，确保了嗜盐单胞菌的纯种培养；
(2)本发明这种三段式微生物连续发酵获得PHA的方法，可使得嗜盐单胞菌体的增殖过程主要发生在发酵罐1中，菌体增殖向PHA合成转变的过程主要发生在发酵罐2中，PHA快速合成积累的过程主要发生在发酵罐3中，整个发酵过程可持续进行三个月，延长了单次发酵的时间，产能得到大大提高；
(3)本发明这种三段式微生物连续发酵获得PHA的方法，相较于分批发酵，可以解除底物抑制，并能控制适当的菌体浓度，底物转化率较高；
(4)本发明这种三段式微生物连续发酵获得PHA的方法，相较于半连续培养，不需要间歇的放掉部分培养液，使得养分被充分利用，碳源转化率高；
(5)本发明这种三段式微生物连续发酵获得PHA的方法，相较于连续发酵，不易被杂菌污染，菌种不易老化，产能较高。
附图说明
图1：发酵装置示意图。
具体实施方式
本发明以下实施例中所用的水均为过滤水，水的电导率＜50us/cm。
本发明以下实施例中所用的嗜盐单胞菌为Halomonas lutescens MDF-9。
本发明以下实施例中所用的盐单胞菌培养液按照以下步骤制备：
(1)制备LB60液体培养基
将适量的酵母浸粉、胰蛋白胨、氯化钠溶解在水中得到培养液，并采用浓度为3M的氢氧化钠水溶液调节培养液的pH＝8.0±0.3，所述酵母浸粉在水中的浓度为5g/L，所述胰蛋白胨在水中的浓度为10g/L，所述氯化钠在水中的浓度为60g/L；
(2)制备LB60固体培养基
将适量的酵母浸粉、胰蛋白胨、氯化钠搅拌混合均匀，采用浓度为3M的氢氧化钠水溶液调节培养液的pH＝8.0±0.3，并加入适量琼脂粉，搅拌均匀后于121℃下高温高压灭菌20min得到LB60固体培养基，所述酵母浸粉在水中的浓度为5g/L，所述胰蛋白胨在水中的浓度为10g/L，所述琼脂粉在水中的浓度为16g/L，所述氯化钠在水中的浓度为60g/L；
(3)制备种子液
步骤a，取保存于-80℃的盐单胞菌甘油管，划线接种至LB60固体培养基上，36.5℃下培养24h；
步骤b，从步骤a的LB60固体培养基上挑取盐单胞菌重新划线接种至LB60固体培养基上，36.5℃下培养24h；
步骤c，从上一步骤b的LB60固体培养基上挑取盐单胞菌接种至盛有30mL LB60液体培养基的250mL三角瓶中，36.5℃下、220rpm/min震荡培养10h，即得到种子液；
(4)取3mL步骤(3)得到的种子液，按照1％接种体积比接种至300mL LB60液体培养基中，36.5℃下、220rpm/min震荡培养10-12h，即获得盐单胞菌培养液。
本发明以下实施例中发酵罐1、2、3中的搅拌速度均为800rpm；
本发明以下实施例中发酵罐1、2、3中菌液的温度均为36.5℃；
本发明以下实施例中发酵罐1、2、3中菌液的pH＝8.5±0.1，pH调节剂为3M的氢氧化钠水溶液。
本发明以下实施例中由菌液分离得到PHA干粉的方法如下：
将收集到的菌液在10000rpm/min下离心15min，弃上清液，纯水稀释后，震荡均质，再在10000rpm/min下离心15min，弃上清液，重复上述步骤3-4次，将收集到的湿PHA粉置于干燥机中，70℃下烘干，即得到PHA干粉。
实施例1
利用盐单胞菌生产PHA的方法，步骤如下：
(1)将三份3L的菌液分别置于体积均为5L的发酵罐1、发酵罐2、发酵罐3中，三个发酵罐之间依次有管道连接并通过蠕动泵驱动菌液流动，整个发酵装置示意图如图1所示；
(2)当发酵罐1中的葡萄糖浓度低于10g/L时，开始向发酵罐1中补加料一，同时将发酵罐1中的菌液以及料二加入到发酵罐2中；与此同时，将发酵罐2中的菌液以及料三加入到发酵罐3中，同时收集发酵罐3中泵出的菌液；整个发酵过程是个连续的过程，发酵罐1、2、3中的菌液体积均不发生变化，一直保持动态平衡(具体是通过控制发酵罐1、2、3之间蠕动泵的功率来调节每个发酵罐中菌液泵出的流量大小，使得每个发酵罐内的菌液体积不发生变化)；全程监控发酵罐1中的OD600值，当发酵罐1中菌液的OD600值低于50时，停止发酵。
实施例1中的菌液由营养液和盐单胞菌培养液按照体积比10:1组成，所述营养液由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖60g/L
玉米浆干粉12g/L
尿素2g/L
氯化钠50g/L
硫酸镁0.2g/L
柠檬酸铁铵0.05g/L
无水氯化钙0.015g/L
七水硫酸锌0.1mg/L
四水硫酸锰0.03mg/L
硼酸0.3mg/L
五水硫酸铜0.01mg/L
钼酸钠0.03mg/L；
所用的料一由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖80g/L
玉米浆干粉12g/L
尿素6.8g/L
氯化钠50g/L
硫酸镁0.2g/L
柠檬酸铁铵0.05g/L
无水氯化钙0.015g/L
七水硫酸锌0.1mg/L
四水硫酸锰0.03mg/L
硼酸0.3mg/L
五水硫酸铜0.01mg/L
钼酸钠0.03mg/L。
所用的料二由葡萄糖基液与微量元素母液按照体积比10:1组成，所述葡萄糖基液由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖500g/L
尿素7.55g/L；
氯化钠50g/L
所述微量元素母液由微量元素与水组成，所述微量元素在水中的浓度如下：
氯化钼0.218g/L
氯化铁9.7g/L
氯化钙7.8g/L
五水合硫酸铜0.156g/L。
所用的料三是浓度为800g/L的葡萄糖水溶液。
发酵过程中，以250ml/h的流量添加补料一，40ml/h的流量添加补料二，30ml/h的流量添加补料三，发酵罐3每小时泵出菌液约330ml。
整个发酵过程持续进行了90天，共消耗135.17kg葡萄糖，发酵罐3共泵出696.96L菌液，收获59.24kg PHA干粉，碳源转化率为43.83％。
实施例2
利用盐单胞菌生产PHA的方法，步骤如下：
(1)将三份3L的菌液分别置于体积均为5L的发酵罐1、发酵罐2、发酵罐3中，三个发酵罐之间依次有管道连接并通过蠕动泵驱动菌液流动；
(2)当发酵罐1中的葡萄糖浓度低于10g/L时，开始向发酵罐1中补加料一，同时将发酵罐1中的菌液以及料二加入到发酵罐2中；与此同时，将发酵罐2中的菌液以及料三加入到发酵罐3中，同时收集发酵罐3中泵出的菌液；整个发酵过程是个连续的过程，发酵罐1、2、3中的菌液体积均不发生变化，一直保持动态平衡；全程监控发酵罐1中的OD600值，当发酵罐1中菌液的OD600值低于50时，停止发酵。
实施例2中的菌液由营养液和盐单胞菌培养液按照体积比10:1组成，所述营养液由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖60g/L
玉米浆干粉12g/L
尿素2g/L
氯化钠40g/L
硫酸镁0.2g/L
柠檬酸铁铵0.05g/L
无水氯化钙0.015g/L
七水硫酸锌0.1mg/L
四水硫酸锰0.03mg/L
硼酸0.3mg/L
五水硫酸铜0.01mg/L
钼酸钠0.03mg/L；
所用的料一由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖100g/L
玉米浆干粉12g/L
尿素2g/L
氯化钠40g/L
硫酸镁0.2g/L
柠檬酸铁铵0.05g/L
无水氯化钙0.015g/L
七水硫酸锌0.1mg/L
四水硫酸锰0.03mg/L
硼酸0.3mg/L
五水硫酸铜0.01mg/L
钼酸钠0.03mg/L。
所用的料二由葡萄糖基液与微量元素母液按照体积比10:1组成，所述葡萄糖基液由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖510g/L
尿素0.89g/L；
氯化钠40g/L
所述微量元素母液由微量元素与水组成，所述微量元素在水中的浓度如下：
氯化钼0.218g/L
氯化铁9.7g/L
氯化钙7.8g/L
五水合硫酸铜0.156g/L。
所用的料三是浓度为800g/L的葡萄糖水溶液。
发酵过程中，以250ml/h的流量添加补料一，40ml/h的流量添加补料二，30ml/h的流量添加补料三，发酵罐3每小时泵出菌液约330ml。
整个发酵过程持续进行了90天，共消耗146.57kg葡萄糖，发酵罐3共泵出696.01L菌液，收获60.08kg PHA干粉，碳源转化率为40.99％。
实施例3
利用盐单胞菌生产PHA的方法，步骤如下：
(1)将三份3L的菌液分别置于体积均为5L的发酵罐1、发酵罐2、发酵罐3中，三个发酵罐之间依次有管道连接并通过蠕动泵驱动菌液流动；
(2)当发酵罐1中的葡萄糖浓度低于10g/L时，开始向发酵罐1中补加料一，同时将发酵罐1中的菌液以及料二加入到发酵罐2中；与此同时，将发酵罐2中的菌液以及料三加入到发酵罐3中，同时收集发酵罐3中泵出的菌液；整个发酵过程是个连续的过程，发酵罐1、2、3中的菌液体积均不发生变化，一直保持动态平衡；全程监控发酵罐1中的OD600值，当发酵罐1中菌液的OD600值低于50时，停止发酵。
实施例3中的菌液由营养液和盐单胞菌培养液按照体积比10:1组成，所述营养液由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖60g/L
玉米浆干粉12g/L
尿素2g/L
氯化钠60g/L
硫酸镁0.2g/L
柠檬酸铁铵0.05g/L
无水氯化钙0.015g/L
七水硫酸锌0.1mg/L
四水硫酸锰0.03mg/L
硼酸0.3mg/L
五水硫酸铜0.01mg/L
钼酸钠0.03mg/L；
所用的料一由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖120g/L
玉米浆干粉12g/L
尿素2g/L
氯化钠40g/L
硫酸镁0.2g/L
柠檬酸铁铵0.05g/L
无水氯化钙0.015g/L
七水硫酸锌0.1mg/L
四水硫酸锰0.03mg/L
硼酸0.3mg/L
五水硫酸铜0.01mg/L
钼酸钠0.03mg/L。
所用的料二由葡萄糖基液与微量元素母液按照体积比10:1组成，所述葡萄糖基液由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖520g/L
尿素14.2g/L；
氯化钠60g/L
所述微量元素母液由微量元素与水组成，所述微量元素在水中的浓度如下：
氯化钼0.218g/L
氯化铁9.7g/L
氯化钙7.8g/L
五水合硫酸铜0.156g/L。
所用的料三是浓度为800g/L的葡萄糖水溶液。
发酵过程中，以250ml/h的流量添加补料一，40ml/h的流量添加补料二、30ml/h的流量添加补料三，发酵罐3每小时泵出菌液约330ml。
整个发酵过程持续进行了90天，共消耗157.98kg葡萄糖，发酵罐3共泵出696.53L菌液，收获61.29kg PHA干粉，碳源转化率为38.80％。
对比例1同实施例1，不同之处在于，对比例1所用三个发酵罐直径不同，发酵罐1与发酵罐2、发酵罐3的直径比为1:2:2。发酵过程中，对比例1以250ml/h的流量添加补料一，以40ml/h的流量添加补料二，以30ml/h的流量添加补料三，发酵罐3每小时泵出菌液约330ml。
整个发酵过程只持续了7天，发酵系统就发生崩溃，共消耗10.51kg葡萄糖，发酵罐3共收集到39.60L菌液，收获2.06kg PHA干粉，碳源转化率为19.61％。
对比例2
批次发酵的工艺步骤如下：
(1)将3L菌液置于5L发酵罐中，所述菌液与实施例1中的菌液完全相同，发酵罐中的搅拌速度为800rpm，发酵罐中菌液的温度为36.5℃；
(2)当菌液中的含糖量降至10g/L后，间歇式地加入310ml补料A，当补料A使用完后，间歇式地加入250ml补料B，当补料B使用完后，间歇式地加入375mL补料C，三种补料添加过程中始终保持发酵液的糖浓度范围为5-15g/L；
(3)加完补料C后，继续培养至菌液的残糖量降至1g/L时，收集菌液，从菌液中提取PHA，单批次发酵完成。
所述补料A由水、葡萄糖和尿素组成，所述葡萄糖在水中的浓度为800g/L，所述尿素在水中的浓度为44.35g/L。
所述补料B由水、葡萄糖和硫酸铵组成，所述葡萄糖在水中的浓度为800g/L，所述硫酸铵在水中的浓度为5g/L。
所述补料C由水、葡萄糖组成，所述葡萄糖在水中的浓度为800g/L。
三个5L发酵罐按照以上述单批次发酵的步骤同时进行，每个发酵罐反复进行90天，在此期间，不断收集三个发酵罐在90天内残糖量降至1g/L时的菌液，经计算，三个发酵罐在90天内各重复进行了30次发酵过程，三个发酵罐在90天内共收集到270L菌液，共提取到17.28kg PHA干粉，共消耗83.70kg葡萄糖，碳源转化率为20.65％。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种利用盐单胞菌生产PHA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将三份等体积的菌液分别置于发酵罐1、发酵罐2、发酵罐3中，三个发酵罐之间依次有管道连接并通过蠕动泵驱动菌液流动；
(2)当发酵罐1中的葡萄糖浓度低于10g/L时，开始向发酵罐1中补加料一，同时将发酵罐1中的菌液以及料二加入到发酵罐2中；与此同时，将发酵罐2中的菌液以及料三加入到发酵罐3中，同时收集发酵罐3中泵出的菌液；全程监控发酵罐1中的OD600值，当发酵罐1中菌液的OD600值低于50时，停止发酵；
整个发酵过程是个连续的过程，发酵罐1、2、3中的菌液体积均不发生变化，一直保持动态平衡；
发酵罐1、2、3中的搅拌速度均为750-800rpm；
发酵罐1、2、3中菌液的温度均为36.5℃；
发酵罐1、2、3中菌液的pH＝8.5±0.1。
2.根据权利要求1所述的一种利用盐单胞菌生产PHA的方法，其特征在于，所述发酵罐1、2、3大小尺寸完全相同。
3.根据权利要求1所述的一种利用盐单胞菌生产PHA的方法，其特征在于，所述菌液由营养液和盐单胞菌培养液按照体积比10:1组成，所述营养液由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖60g/L
玉米浆干粉12g/L
尿素2g/L
氯化钠40-60g/L
硫酸镁0.2g/L
柠檬酸铁铵0.05g/L
无水氯化钙0.015g/L
七水硫酸锌0.1mg/L
四水硫酸锰0.03mg/L
硼酸0.3mg/L
五水硫酸铜0.01mg/L
钼酸钠0.03mg/L；
所述盐单胞菌培养液按照以下步骤制备：
(1)制备LB60液体培养基
将适量的酵母浸粉、胰蛋白胨、氯化钠溶解在水中得到培养液，并采用浓度为3M的氢氧化钠水溶液调节培养液的pH＝8.0±0.3，所述酵母浸粉在水中的浓度为5g/L，所述胰蛋白胨在水中的浓度为10g/L，所述氯化钠在水中的浓度为60g/L；
(2)制备LB60固体培养基
将适量的酵母浸粉、胰蛋白胨、氯化钠搅拌混合均匀，采用浓度为3M的氢氧化钠水溶液调节培养液的pH＝8.0±0.3，并加入适量琼脂粉，搅拌均匀后于121℃下高温高压灭菌20min得到LB60固体培养基，所述酵母浸粉在水中的浓度为5g/L，所述胰蛋白胨在水中的浓度为10g/L，所述琼脂粉在水中的浓度为16g/L，所述氯化钠在水中的浓度为60g/L；
(3)制备种子液
步骤a，取保存于-80℃的盐单胞菌甘油管，划线接种至LB60固体培养基上，36.5℃下培养24h；
步骤b，从步骤a的LB60固体培养基上挑取盐单胞菌重新划线接种至LB60固体培养基上，36.5℃下培养24h；
步骤c，从上一步骤b的LB60固体培养基上挑取盐单胞菌接种至盛有30mL LB60液体培养基的250mL三角瓶中，36.5℃下、220rpm/min震荡培养10h，即得到种子液；
(4)取3mL步骤(3)得到的种子液，按照1％接种体积比接种至300mL LB60液体培养基中，36.5℃下、220rpm/min震荡培养10-12h，即获得盐单胞菌培养液。
4.根据权利要求1所述的一种利用盐单胞菌生产PHA的方法，其特征在于，所述料一由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
5.根据权利要求1所述的一种利用盐单胞菌生产PHA的方法，其特征在于，所述料二由葡萄糖基液与微量元素母液按照体积比10:1组成，所述葡萄糖基液由营养物质与水组成，所述营养物质在水中的浓度如下：
葡萄糖500-520g/L
尿素7.55g/L；
氯化钠40-60g/L
所述微量元素母液由微量元素与水组成，所述微量元素在水中的浓度如下：
氯化钼0.218g/L
氯化铁9.7g/L
氯化钙7.8g/L
五水合硫酸铜0.156g/L。
6.根据权利要求1所述的一种利用盐单胞菌生产PHA的方法，其特征在于，所述料三是浓度为800g/L的葡萄糖水溶液。
7.根据权利要求1所述的一种利用盐单胞菌生产PHA的方法，其特征在于，所述盐单胞菌包括嗜盐单胞菌H.bluephagenesis、H.campeniesis、H.alkaliphila、H.smymensis、H.levan、H.bluephagenesis TD-MmP1、Halomonas lutescens MDF-9中的至少一种。
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