CN101280290B - 一株产较高热稳定性重组β-葡聚糖酶的基因工程菌及其构建 - Google Patents

一株产较高热稳定性重组β-葡聚糖酶的基因工程菌及其构建 Download PDF

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一株产较高热稳定性重组β-葡聚糖酶的基因工程菌及其构建，属于基因工程技术领域。本发明采用易错PCR技术扩增高产β-葡聚糖酶的淀粉液化芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SYB-001(ZL.200510038488.8)专利菌株β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的开放阅读框序列，向其中随机引入突变，将改造后的基因插入到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中，转化Escherichia coli BL21(DE3)，构建重组子文库，经筛选，最终得到一株可以产较高热稳定性重组酶的突变株大肠埃希氏菌(E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bglt 1)CGMCC No.2741。经酶学性质分析，CGMCC No.2741最适温度为55℃，在50-55℃下较稳定，各比出发菌SYB-001提高5℃。

Description

一株产较高热稳定性重组β-葡聚糖酶的基因工程菌及其构建
技术领域
一株产较高热稳定性重组β-葡聚糖酶的基因工程菌及其构建，本发明涉及淀粉液化芽胞杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的定向进化，属于基因工程技术领域。
技术背景
β-葡聚糖是构成禾本科植物细胞壁的一种非淀粉性多糖，在大麦、黑麦、高梁、大米和小麦的胚乳细胞壁中含量尤其高。β-葡聚糖可以很大的分子量溶解于水中，其浓度越大，溶液的粘度也就越大，这在以大麦为主要原料的啤酒工业中会造成过滤速度和原料利用率降低，成品啤酒的非生物稳定性下降，在畜牧业中用麦类饲料喂养禽畜的时候会造成消化液粘度增大，养分的吸收效率降低，甚至会造成某些消化道疾病。通过添加可降解β-葡聚糖的β-1，3-1，4-葡聚糖酶，便可以有效消除这个不良因子。
自然界高产β-葡聚糖酶的微生物主要来自芽胞杆菌属，但其酶属于中温酶，耐热性一般较差，这限制了其在酿酒和饲料工业中的应用，需要对其进行改造提高其耐温性。近些年兴起的易错PCR技术为定向改造β-葡聚糖酶提高其耐温性提供了新的途径，国内外目前尚无对淀粉液化芽胞杆菌β-葡聚糖酶基因定向进化的报道。
发明内容：
本发明的目的：构建一株可表达耐温性相比原菌株好的β-1，3-1，4-葡聚糖酶的重组大肠杆菌，并提出构建的方法。
本发明的技术方案：通过易错PCR技术，定向改造高产β-葡聚糖酶的芽胞杆菌菌株(Bacillus amyloliquefaciens)SYB-001的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因，将其整合到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中，转化Escherichia coli BL21(DE3)得到重组子，构建重组子文库，经筛选，最终得到一株可以产较高热稳定性重组酶的突变株。
淀粉液化芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)SYB-001巳在ZL.200510038488.8公开，公开日2005年10月19日。
一株产较高热稳定性重组β-葡聚糖酶的基因工程菌，其分类命名为大肠埃希氏菌(E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bglt 1)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编码为CGMCC No.2741。
CGMCC No.2741基因工程菌的构建，从淀粉液化芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens SYB-001提取染色体DNA作模板，进行易错PCR扩增，引物：
PAG 1-F：5’-ACATCGGATCCATGAAACGAGTGTTGCTAATTCTTG-3’
PAG 1-R：5’-GTAGTCATCTCGAGTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG-3’
易错PCR体系：0.5mL PCR管中按顺序加入以下试剂：10×PCR缓冲液5μL；100MgCl2 2μL；1.0mol/L MnCl2 2μL；2.5mmol/L dATP和dGTP各0.1μL；2.5mmol/L dTTP和dCTP各0.4μL；25μmol/L上下游引物各1μL；模板DNA 2μL；Taq酶0.6μL；加双蒸水至总体系50μL；
易错PCR扩增条件：94℃预变性3min；94变性50s、56℃退火45s、72℃延伸1min，30个循环；
将其用BamH I和Xho I酶切后连接到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中，得到重组载体pET28a(+)-bgl，用CaCl2法转化E.coli BL21(DE3)得到重组大肠埃希氏菌(E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bglt 1)CGMCC No.2471。
β-葡聚糖酶活力测定方法：精确吸取待测稀释酶液0.5mL，及pH6.5磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液1.0mL，置于40℃水浴预热5min，加入经预热的1.0％β-葡聚糖溶液0.5mL，立即开始计时，于40℃水浴精确反应10min，立即加入3.0mL DNS液终止反应，然后置于沸水浴中7min，取出迅速冷却后加入10mL去离子水，摇匀后，测定550nm下的反应液的吸光值。同时进行空白对照测定，其步骤为吸取待测稀释酶液0.5mL，加入1.0mL pH 5.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，然后先加入3.0mL DNS液使酶失活，40℃水浴预热，再加入同样经预热的1.0％β-葡聚糖溶液0.5mL，40℃水浴10min，然后置于沸水浴中7min，以后步骤同于样品测定。
本发明的有益效果：本发明采用易错PCR技术扩增高产β-葡聚糖酶的淀粉液化芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefafaciens)SYB-001(ZL.200510038488.8)专利菌株β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因的开放阅读框序列，向其中随机引入突变，将改造后的基因插入到大肠杆菌表达载体pET28a(+)中，转化Escherichia coli BL21(DE3)，构建重组子文库，经筛选，最终得到一株可以产较高热稳定性重组酶的大肠埃希氏菌(E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bglt 1)CGMCC No.2741。结果显示，经筛选获得的CGMCC No.2741在LB培养基中用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达，经酶学性质分析，CGMCC No.2741最适温度为55℃，在50-55℃下较稳定，各比出发菌SYB-001提高5℃。
生物材料样品保藏
一株高产β-葡聚糖酶的重组大肠杆菌，该菌株为大肠埃希氏菌，命名为E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bglt 1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2471，保藏日期为2008年4月29日。
具体实施方式
以下实施例更为详细地解释了本发明的技术关键点，为更好地理解本发明提供了依据。
实施例1
1)从淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens SYB-001提取染色体DNA作模板，进行易错PCR扩增，引物：
正向引物：
PAG1-F：5’-ACATCGGATCCATGAAACGAGTGTTGCTAATTCTTG-3’
反向引物：
PAG 1-R：5’-GTAGTCATCTCGAGTTATTTTTTTGTATAGCGCACCCAG-3’
0.5mL PCR管中按顺序加入以下试剂：10×PCR缓冲液5μL；100mol/LMgCl2 2μL；1.0mol/L MnCl2 2μL；2.5mmol/L dATP和dGTP各0.1μL；2.5mmol/L dTTP和dCTP各0.4μL；25μmol/L上下游引物各1μL；模板DNA 2μL；Taq酶0.6μL；加双蒸水至总体系50μL。按下列程序进行易错PCR扩增：94℃预变性3min；94℃变性50s、56℃退火45s、72℃延伸1min，30个循环。
2)PCR产物经1％琼脂糖电泳分离，回收700bp左右的片段，用BamH I和Xho I酶切，连接表达载体pET28a(+)，转化E.coli BL21(DE3)，涂布抗性平板，构建重组子文库。
3)对获得的重组子进行筛选，选出表达的重组酶耐温性较好的菌株
结果显示，经筛选获得一株产耐温性较好的重组β-1，3-1，4-葡聚糖酶的菌株，在LB培养基中用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达，对获得的重组酶的酶学性质研究表明其最适温度为55℃，在50-55℃下较稳定，比原出发菌各提高5℃。

Claims (1)

1.一株产较高热稳定性重组β-葡聚糖酶的基因工程菌，其分类命名为大肠埃希氏菌E.coli BL21(DE3)-pET28a(+)-bglt1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编码为CGMCC No.2741。
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Zhang Xiu-yan等.Enhancement of the thermostability of β-1,3-1,4-glucanase by directed evlution.Journal of Zhejiang University SCIENCE A7 11.2006,7(11),1948-1955.
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李永仙等.耐高温β-葡聚糖酶在啤酒糖化中的应用研究.酿酒29 2.2002,29(2),81-83.
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Assignee: Jiangsu Boli Biological Products Co., Ltd.

Assignor: Jiangnan University

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Denomination of invention: Genetic engineering bacteria for producing high-thermal stability recombinant beta-glucanase and construction thereof

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License type: Exclusive License

Open date: 20081008

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