CN101372694B - 耐高温木聚糖酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种耐高温木聚糖酶分泌表达载体以及通过乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)高效表达耐高温木聚糖酶的方法。采用本发明所述的方法，使得表达的木聚糖酶大部分分泌到细胞外，从而降低了分离纯化成本，而且大大提高了表达效率；其中在摇瓶培养的条件下，以半乳糖诱导培养时，胞外分泌酶量可达70mg/L，以RBB-木聚糖为底物时，酶活可高达6100U/L。

Description

耐高温木聚糖酶基因在乳酸克鲁维酵母中的表达

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及来自真细菌耐高温木聚糖酶基因在乳酸克鲁维酵母中的分泌表达。

背景技术

木聚糖酶主要由腐生真菌和细菌产生，它能降解植物细胞壁中的木聚糖成分，并被证实在农业和工业的多个领域都具有重要的应用价值。木聚糖具有异源性，因而完全降解木聚糖需要多种酶的共同作用，其中β-1，4-D-木聚糖酶是其中一种关键酶，它能打断主链上D-木糖残基之间的β-1，4糖苷键，从而把多糖的骨架降解成短链的木寡糖。因此β-1，4-D-木聚糖酶在食品，饲料和造纸工业中有着非常广泛的应用。其中，耐高温木聚糖酶XynB属于β-1，4-D-木聚糖酶中的一种，耐高温木聚糖酶XynB的编码基因是mxynB₍₆₄₎，其GenBank登录号为AY340789，该基因克隆自一种耐热真细菌-海栖热胞菌(Thermotogamaritima，MSB8)，该酶的最适反应温度为90℃，最适反应pH值为6.2，且在碱性条件下稳定，因此在工业上，特别是在纸浆漂白工艺上具有巨大的应用价值(参见Winterhalter C，Liebl W.Twoextremely thermostable xylanases of the hyperthermophilic bacteriumThermotoga maritima MSB8.Applied and Environmental Microbiology，1995，61(5)：1810～1815)。

目前，已有在大肠杆菌中表达来源于海栖热袍菌(Thermotogamaritima)MSB8木聚糖酶基因mxynB的报道，虽然目的基因表达量高，但产物主要集中在细胞内，使得后续的分离纯化成本增高。本发明构建了木聚糖酶的乳酸克鲁维酵母表达载体，使得表达产物大部分分泌至胞外，有效解决了上述问题。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种可在乳酸克鲁维酵母中表达木聚糖酶基因的表达载体。

本发明的另一个目的是提供一种培养条件简单，发酵时间短的表达耐高温木聚糖酶的方法。

(二)技术方案

本发明提供了一种耐高温木聚糖酶的表达载体pKLAC1-mxynB₍₆₄₎，它是将耐高温木聚糖酶基因mxynB₍₆₄₎插入到表达载体pKLAC1上构建得到的，其质粒图谱如附图2所示。

应当理解，考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的条件下，可以对pKLAC1-mxynB₍₆₄₎的核苷酸序列进行修改，同时可以对pKLAC1的非必需区段进行替换、添加和/或缺失一个或多个核苷酸，另外还可以对例如多克隆位点进行修改，然而这些修改并没有改变本发明的实质，均属于本发明的范围。

本发明还提供了一种耐高温木聚糖酶的表达方法，其包括以下步骤：

1)将上述表达载体导入乳酸克鲁维酵母中，筛选得到表达耐高温木聚糖酶的工程菌；

2)培养所述工程菌，并诱导耐高温木聚糖酶的表达。

所述培养条件为30℃，初始pH为7，250rpm，培养36-72小时后可诱导耐高温木聚糖酶的表达。所述诱导条件为每24小时补充一次诱导物半乳糖，  每次补充半乳糖至终浓度为2％。

其中，培养时所用的YPG培养基组成为(w/v)：酵母粉1％，蛋白胨2％，半乳糖2％。

采用本发明所述的方法，摇瓶培养48小时，细胞密度达OD₆₀₀为20，胞外分泌酶量可达70mg/L，以Remazol Brilliant R-D-Xylan[(简称：RBB-Xylan)，中文名称为：4-氧甲基-D-葡萄糖苷-D-木聚糖-Remazol-亮蓝R]为底物，酶活为6105U/L。

(三)有益效果

本发明将耐高温木聚糖酶基因mxynB₍₆₄₎插入到表达载体pKLAC1上构建得到pKLAC1-mxynB₍₆₄₎，将该表达质粒导入乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)中获得的工程菌能够高效表达耐高温木聚糖酶，表达的木聚糖酶大部分分泌到细胞外，降低了分离纯化成本，而且表达效率提高，在摇瓶培养的条件下，以半乳糖诱导培养时，胞外分泌酶量可达70mg/L，以RBB-Xylan为底物，酶活为6100U/L。本发明为该酶的工业化应用奠定了基础。

附图说明

图1目的基因DNA酶切回收电泳图，目的片段1.0kb(箭头所示)，其中M为DNA标准分子量(kb)，由上到下所对应的条带分别为：4.5，3.0，2.0，1.2，0.8，0.5 0.2；1为目的基因DNA酶切回收片段；

图2表达质粒pKLAC1-mxynB₍₆₄₎构建流程图；

图3表达质粒pKLAC1-mxynB₍₆₄₎的酶切电泳图，其中，M为DNA标准分子量(kb)，由上到下所对应的条带分别为：10，7.5，5，2.5，1，0.25；1表示质粒pKLAC1-mxynB₍₆₄₎；2表示质粒pKLAC1-mxynB₍₆₄₎经XhoI和KpnI酶切后的结果；

图4乳酸克鲁维酵母GG799-pKLAC1-mxynB₍₆₄₎摇瓶培养细胞密度及胞外酶活检测图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中涉及的百分含量均为质量百分含量，所涉及的酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。引物合成及测序由英骏(Invitrogen)生物公司完成。实施例1、乳酸克鲁维酵母表达质粒pKLAC1-mxynB₍₆₄₎的构建

1.1引物设计

根据GenBank中mxynB₍₆₄₎基因的序列(GenBank登录号为AY340789)以及乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC1多克隆位点的特征，设计合成了以下一对引物：

PX1：FW：5’-CCCctcgagAAAAGAATGAAAATATTACCTTC-3’

PX2：REV：5’-TTTggtaccTCATTTTCTTTCTTCTATCTTTTTCT-3’

PX1、PX2两端分别设计有XhoI和KpnI酶切位点(见上述序列中小写并有下划线的部分)

1.2耐高温木聚糖酶基因mxynB₍₆₄₎的PCR扩增

采用PX1、PX2引物，提取Thermotoga maritima，MSB8(海栖热袍菌)的基因组DNA作为模板，(Thermotoga maritima，MSB8基因组在GenBank的注册号：NC000853，MSB8菌株可在德国菌种保藏中心Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，简称DSMZ购买获得)，反应体系为：

模板DNA(10μg/μl)       1μl

10×Buffer               2μl

dNTP(2.5mmol/μl)        0.5μl

primer(PX1)(10pmol/μl)  0.8μl

primer(PX2)(10pmol/μl)  0.8μl

Taq酶                    0.1μl

ddH₂O                    14.8μl

总体积                   20μl

反应条件为：95℃ 5min；95℃ 30s，53℃ 1min，72℃ 1min，循环30次；72℃ 10min。

1.3从PCR反应产物中回收目的片段

从PCR产物中纯化回收目的基因片段采用切胶过柱的方法，PCR反应产物经过琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯的照射下切下目的基因DNA(目的基因长度为1.0kb(图1)，按照DNA回收试剂盒说明书(购自天根公司，产品编号为DP209-02)的方法进行回收。

1.4 TA克隆

将PCR回收产物连接到载体pMD18-T-Simple上(购自TaKaRa公司)，连接反应按照TaKaRa公司所提供的试剂盒(Code No.D104A)说明书操作。

1.5目的基因连接到乳酸克鲁维酵母表达载体pKLAC1(#E1000S，New England BioLabs Inc.生产，购自经科宏达公司)

用限制性内切酶XhoI和KpnI分别对pMD18-T-xynB₍₆₄₎和pKLAC1进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4连接酶将其连接，得到表达质粒pKLAC1-mxynB₍₆₄₎，构建流程图见附图2。

表达质粒pKLAC1-mxynB₍₆₄₎的检测结果见附图3，结果表明外源片段(1.0kb)和载体(9.0kb)大小均正确。将连接产物转化大肠杆菌DH5α(购自上海生工生物工程有限公司)。

实施例2耐高温木聚糖酶基因(mxynB₍₆₄₎)在乳酸克鲁维酵母GG799中的分泌表达

2.1乳酸克鲁维酵母GG799[购自New England BioLabs Inc.(NEB)]电转化感受态细胞的制备及其电击转化

(1)挑取新鲜的单菌落于5ml YPD液体培养基(酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％)中，于30℃，250rpm过夜培养。

(2)在室温下以体积比0.1％的接种量接种于100ml新鲜配制的YPD液体

培养基中，于30℃，250rpm培养至OD₆₀₀为0.4～0.5。

(3)在4℃下3000rpm离心5分钟，收集细胞；

(4)用250ml冰预冷的无菌水洗涤细胞一次；

(5)用50ml冰预冷的无菌电转化缓冲液EB(g/L)：蔗糖92.4，氯化镁2.03，10mmol/L pH7.5的MES缓冲液1L洗涤细胞一次；

(6)将细胞重悬于50ml冰预冷的无菌预处理缓冲液，于30℃静止培养30分钟；

(7)在4℃下3000rpm离心5分钟，收集细胞；

(8)用10ml冰预冷的无菌电转化缓冲液EB洗涤细胞一次；

(9)用200μl冰预冷的电转化缓冲液EB重悬细胞，以每管50μl分装于小管；

(10)向每管中加入2μl线性化的表达质粒pKLAC1-mxynB₍₆₄₎，混匀，冰上放置15分钟；

(11)将混合了DNA的感受态细胞转入0.2cm的电转杯；

(12)在BIO-RAD的Gene-Pulser电转仪上，在1000V，400Ω，25μF条件下电击细胞；

(13)马上加入1ml冰预冷的YPD液体培养基于经转化的细胞中，混匀后转入1.5ml离心管；

(14)用1ml无菌水洗涤细胞2次；

(15)将细胞用无菌水稀释1000倍，涂布含5mM乙酰胺的酵母基本碳源培养基YCB(1L)：1mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液30ml，YCB培养基粉末(NEB Inc.#B9017S)11.7g，琼脂20g，乙酰胺0.3g)琼脂平板，30℃培养3～5天观察结果。

2.2.乳酸克鲁维酵母高拷贝转化子及木聚糖酶高产菌株的筛选

2.2.1乳酸克鲁维酵母阳性转化子的筛选

转化后的细胞混合物被涂布于含有5mM乙酰胺的酵母基本碳源培养基YCB(培养基配方见2.1)。YCB培养基含有K.lactis生长所需要的营养物质和碳源，但是缺少氮源。只有当pKLAC1上的amds基因表达的乙酰胺酶将培养基中加入的乙酰胺降解为氨时，才能被细胞所利用，故重组子能够长成较大的菌落。根据此原理挑选较大的菌落作为阳性转化子，并做进一步鉴定。

2.2.2酵母菌落PCR法鉴定正确整合的转化子及多拷贝整合的转化子

在平板上选到阳性菌落，利用酵母菌落PCR的方法进一步验证得到正确整合且具有高拷贝得转化子。根据试剂盒(#E1000S NEB Inc.)提供的引物Pr1[5’d(TACCGACGTATATCAAGCCCA)3’]和Pr2[5’d(ATCACCTTGTC AGCGAAAGC)3’]，可以利用菌落PCR的方法鉴定转化子中的表达框是否正确整合到K.lactis基因组，如果有1.9kb的片段扩增出来则可证明表达框的正确整合。而用引物Pr2和Pr3[5’d(CAGTGATTACATGCATATTGT)3’]，扩增片段为2.3kb，则可以鉴定多拷贝整合的转化子。

模板的处理方法：

(1)用无菌的吸头挑取菌落少许，溶解到50μl的D2-Buffer(1L)：异硫氰酸胍472.64g，1mol/L pH8.0 Tris·HCl缓冲液50ml，β-巯基乙醇7ml，混匀；

(2)将混合液于100℃沸水浴5分钟；

(3)12000rpm，离心30秒，弃上清；

(4)用无菌水洗涤沉淀2次；

(5)将沉淀溶于20μl的ddH₂O，95℃作用5分钟；

(6)离心后得到上清液即为模板。

PCR反应体系：

模板          2μl

Pr1           2μl

Pr2           2μl

dNTP(2.5mM)   0.5μl

10×Buffer    2μl

Taq酶         0.2μl

ddH₂O         11.3μl

总体积        20μl

反应条件：95℃ 5分钟；95℃ 30秒，50℃ 30秒，72℃ 2分钟，循环30次；72℃ 10分钟。

分别挑取16个转化子进行摇瓶诱导培养，发现外源蛋白表达分泌量基本相同，选择其中胞外木聚糖酶活相对较高(570U/L)的一株进行后续的实验。

2.3.乳酸克鲁维酵母重组木聚糖酶的表达和检测

木聚糖酶XynB活性的测定采用RBB-木聚糖法：以1.15％的RBB-木聚糖为底物，在50mM pH6.5的MES(2-吗啉代乙磺酸一水合物)缓冲液中90℃保温10分钟。标准反应混合物的组成为：1.15％RBB-木聚糖50μl，200mM MES缓冲液25μl和合理稀释的酶液25μl。于90℃保温10分钟后，加入200μl无水乙醇终止反应，同时沉淀残留底物。静止放置至少15分钟，混合物以12000rpm离心5分钟，取上清液，在OD₅₉₅波长下读吸光值；空白对照的操作与上述一样，只是以25μl水代替酶液。

1个酶活单位(unit)的定义为：在上述反应条件下，每分钟导致ΔOD₅₉₅＝1.0所需要的酶量为一个酶活单位。

挑取新鲜的乳酸克鲁维酵母阳性转化子单菌落到5ml新鲜的YPD培养基活化后，以1/10的接种量接种于YPG培养基摇瓶诱导培养，于30℃，250rpm培养72小时，每24小时补充一次诱导物半乳糖，每次补充半乳糖至终浓度为2％。每隔一定的时间取样，测量其细胞密度(OD₆₀₀)和胞外的木聚糖酶的活性。

检测结果如附图4所示，从结果中我们可以看到在YPG培养基摇瓶培养的条件下34小时酶活达到最高，而细胞密度的增长在此时也开始放缓。在2×YPG培养基中摇瓶培养条件下(初始pH为7，培养温度为30℃)，细胞密度和胞外酶活都有明显的提高，培养48小时，细胞密度达OD₆₀₀为20，胞外分泌酶量可达70mg/L，以RBB-木聚糖为底物，酶活为6105U/L。

Claims (3)

1.一种表达耐高温木聚糖酶的工程菌，其是将质粒图谱如附图2所示的表达载体pKLAC1-mxynB₍₆₄₎通过电转化导入乳酸克鲁维酵母GG799中得到的，包括以下步骤：

（1）挑取新鲜的单菌落于5ml组成为酵母粉1％，蛋白胨2％，葡萄糖2％的YPD液体培养基中，于30℃，250rpm过夜培养；

（2）在室温下以体积比0.1％的接种量接种于100ml新鲜配制的YPD液体培养基中，于30℃，250rpm培养至OD₆₀₀为0.4～0.5；

（3）在4℃下3000rpm离心5分钟，收集细胞；

（4）用250ml冰预冷的无菌水洗涤细胞一次；

（5）用50ml冰预冷的无菌电转化缓冲液EB洗涤细胞一次；1L缓冲液EB中含蔗糖92.4g，氯化镁2.03g，10mmol/L pH7.5的MES缓冲液1L；

（6）将细胞重悬于50ml冰预冷的无菌预处理缓冲液，于30℃静止，培养30分钟；

（7）在4℃下3000rpm离心5分钟，收集细胞；

（8）用10ml冰预冷的无菌电转化缓冲液EB洗涤细胞一次；

（9）用200μl冰预冷的电转化缓冲液EB重悬细胞，以每管50μl分装于小管；

（10）向每管中加入2μl线性化的表达质粒pKLAC1-mxynB₍₆₄₎，混匀，冰上放置15分钟；

（11）将混合了DNA的感受态细胞转入0.2cm的电转杯；

（12）在Gene-Pulser电转仪上，在1000V，400Ω，25μF条件下电击细胞；

（13）马上加入1ml冰预冷的YPD液体培养基于经转化的细胞中，混匀后转入1.5ml离心管；

（14）用1ml无菌水洗涤细胞2次；

（15）将细胞用无菌水稀释1000倍，涂布含5mM乙酰胺的酵母基本碳源培养基YCB，30℃培养3~5天挑选较大的菌落作为阳性转化子；所述含5mM乙酰胺的酵母基本碳源培养基YCB其1L配方为：1mol/L pH7.0的磷酸盐缓冲液30ml,YCB培养基粉末11.7g,琼脂20g,乙酰胺0.3g；

所述表达载体pKLAC1-mxynB₍₆₄₎是通过以下步骤得到的：

1）采用PX1、PX2引物，提取海栖热袍菌（Thermotoga maritima），MSB8的基因组DNA作为模板，进行PCR扩增耐高温木聚糖酶基因mxynB₍₆₄₎；所述PX 1引物为：5’–CCCctcgagAAAAGAATGAAAATATTACCTTC-3’；所述PX2引物为5’–TTTggtaccTCATTTTCTTTCTTCTATCTTTTTCT-3’，小写部分分别为XhoI和KpnI酶切位点；

2）回收PCR产物，将其连接到载体pMD18-T-Simple上；

3）用限制性内切酶XhoI和KpnI分别对pMD18-T-xynB₍₆₄₎和pKLAC1进行双酶切，然后对目的片段进行回收，用T4连接酶将其连接，得到表达质粒pKLAC1-mxynB₍₆₄₎。

2.一种表达耐高温木聚糖酶的方法，其包括以下步骤：培养权利要求1所述工程菌，并诱导耐高温木聚糖酶的表达；培养时所用的YPG培养基组成为：酵母粉1%，蛋白胨2%，半乳糖2%;培养条件为30℃，初始pH为7，250rpm，培养36-72小时后诱导耐高温木聚糖酶的表达。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，诱导条件为每24小时补充一次诱导物半乳糖，每次补充半乳糖至终浓度为2%。

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