CN107841469A

CN107841469A - 一种表达猪小肠抗菌肽pf1基因的重组乳酸克鲁维酵母及构建方法

Info

Publication number: CN107841469A
Application number: CN201710467627.1A
Authority: CN
Inventors: 曹远东; 潘烘; 周志; 周华娇; 张燕; 焦贺勋
Original assignee: Jiangxi Drable Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Jiangxi Drable Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2017-06-20
Publication date: 2018-03-27

Abstract

本发明公开了一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母的构建方法，包括以下步骤：首先按乳酸克鲁维酵母密码子优化合成的猪小肠抗菌肽PF1基因；将猪小肠抗菌肽PF1基因与乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2同时双酶切反应、琼脂糖凝胶电泳回收，并进行4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109，提重组质粒PF1‑pKLAC2；使用限制性内切酶SacII线性化处理重组质粒；再将线性化重组质粒转化乳酸克鲁维酵母GG799,得到重组乳酸克鲁维酵母PF1‑pKLAC2‑GG799。本发明使用乳酸克鲁维酵母对猪小肠抗菌肽PF1进行表达，同时表达产物分泌胞外，降低了后续的分离纯化成本。

Description

一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母及构建方法

技术领域

本发明涉及一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母及构建方法。

背景技术

抗菌肽是一种小分子短肽，具有广谱抗菌性，一般由小于 60 个氨基酸残基组成，由于分子量小，因此可以在水中溶解，高温下不易分解，抗菌肽是在诱导条件下，动物免疫系统产生的一类防御性肽类物质，是免疫防御系统的重要组成部分。

PF1最早是科研人员从猪小肠中发现的，是 Cathelicidin 抗菌肽家庭中富含精氨酸和脯氨酸的线状抗菌肽，分子量约为 9KDa，主要含 42 个脯氨酸残基和 15个苯丙氨酸残基，是一种高抗菌活性，相对稳定的抗菌肽。

发明内容

本发明其目的就在于提供一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母及构建方法，使用乳酸克鲁维酵母对猪小肠抗菌肽 PF1进行表达，同时表达产物分泌胞外，降低了后续的分离纯化成本。

为实现上述目的而采取的技术方案是，

一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母，所述重组乳酸克鲁维酵母为PF1-pKLAC2-GG799。

一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母的构建方法，包括如下步骤：

（1）按乳酸克鲁维酵母密码子优化合成猪小肠抗菌肽PF1基因；

（2）将猪小肠抗菌肽PF1基因与乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2同时双酶切反应、琼脂糖凝胶电泳回收，并进行4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109，提重组质粒PF1-pKLAC2；

（3）使用限制性内切酶SacII线性化处理重组质粒；

（4）线性化重组质粒转化乳酸克鲁维酵母 GG799,构建重组乳酸克鲁维酵母PF1-pKLAC2-GG799。

有益效果

与现有技术相比本发明具有以下优点。

本发明的优点是使用乳酸克鲁维酵母对猪小肠抗菌肽PF1进行表达，同时表达产物分泌胞外，降低了后续的分离纯化成本，因此具有更广阔的应用前景。

附图说明

以下结合附图对本发明作进一步详述。

图1为猪小肠抗菌肽 PF1 基因与 pKLAC2 质粒连接的阳性转化子 PCR 鉴定电泳图（引物 PF1-F 和 PF1-R，产物约 267bp）；

图2为乳酸克鲁维酵母 GG799 表达 PF1 的 SDS-PAGE 图（蛋白大小在 9KD 左右）；

图3为 pKLAC2 质粒图谱；

图4为 pKLAC2 质粒的多克隆位点图谱。

具体实施方式

所述基因的乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2。

所述质粒的乳酸克鲁维酵母为GG799。

一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母的构建方法，如图1-4所示，包括如下步骤：

（3）使用限制性内切酶SacII线性化处理重组质粒；

实施例 1

PF1基因的获得

抗菌肽PF1的氨基酸序列为：

AFPPPNVPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPPFPPPIFPGPWFPPPPPFRPPPFGPPRFP

按乳酸克鲁维酵母密码子偏好性优化，两端分别添加酶切位点 NcoI 和EcoRI及酶切位点保护性碱基，并在上游添加 6 个组氨酸的核苷酸序列，优化好的序列为：

CATGCCATGGCATCATCATCATCATCATGCTTTCCCACCACCAAACGTTCCAGGTCCAAGATTTCCACCACCAAATTTTCCAGGTCCAAGATTCCCACCACCTAACTTCCCAGGTCCAAGATTCCCTCCACCAAACTTCCCAGGTCCTAGATTCCCACCTCCAAACTTCCCTGGTCCACCATTTCCACCACCTATTTTTCCAGGTCCTTGGTTTCCACCACCACCACCTTTCAGACCACCACCATTTGGTCCACCAAGATTCCCAGAATTCGC

合成序列后放-20℃备用。

实施例 2

重组质粒 PF1- pKLAC2 的构建

合成的包含NcoI和EcoRI酶切位点的基因和 pKLAC2 质粒分别进行NcoI和EcoRI的双酶切反应，琼脂糖凝胶回收酶切产物，T4 连接酶进行4℃过夜连接反应，连接产物转化大肠杆菌 JM109 大肠杆菌感受态细胞，转化子经菌落 PCR 鉴定后测序，PCR 鉴定引物为：

PF1-F：CCATGGCATCATCATCATCATCAT；

PF1-R：GAATTCTGGGAATCTTGGTGGACC

实施例 3

重组乳酸克鲁维酵母 PF1- pKLAC2-GG799 的构建

使用 SacII 对重组质粒 PF1- pKLAC2 进行酶切线性化，酶切反应体系为：SacII 2uL，PF1-pKLAC2 重组质粒34uL，10× H buffer 4 uL，共 40 uL，于 37℃温箱反应3h，酶切完成后，回收线性化质粒，转化乳酸克鲁维酵母 GG799 感受态细胞，乳酸克鲁维酵母GG799 感受态细胞过程及转化步骤如下：

1.1、于 YPD 平板上划线分离乳酸克鲁维酵母 GG799，30℃培养 48-64h；

1.2、挑取乳酸克鲁维酵母 GG799 单菌落接种于 50 mL YPD 液体培养基，250rpm ，30℃过夜培养种子液；

1.3、取 50uL 过夜培养的种子液，接种于 100 mL YPD 液体培养基，250rpm，30℃培养至 OD600=0.8-1.0；

1.4 、4℃ 4000rpm 离心 5min，收集菌体，用预冷的无菌水 25 mL 缓慢重悬；

1.5 、4℃ 4000rpm 离心 5min，收集菌体，加 1mL 100mM 的氯化锂，转入1.5mL EP管中，12000rpm 离心 30sec；

1.6、用 400ul 100mM 氯化锂缓慢重悬菌体，50uL/管分装；

1.7、取一管新鲜制备的感受态细胞，依次加入 50% PEG3350 240uL、1M 氯化锂 36ul、2mg/mL 单链鲑鱼精 DNA 25uL、10ug/50uL 线性化质粒，剧烈涡旋；

1.8、30℃培养 30min，再于 42℃培养 20min；

1.9、4℃ 4000rpm 收集菌体，用 1mL YPD 液体培养基缓慢重悬菌体，30℃，120rpm培养4h；

1.10 、4℃ 4000rpm 收集菌体，用 1mL 无菌水缓慢重悬，涂布于添加5mM乙酰胺的YCB 平板，30℃静置3-5天。

使用酵母基因组提取试剂盒提取疑似阳性转化子的基因组，以该基因组为模板进行 PCR 扩增鉴定，从而筛选出阳性转化子。

实施例 4

重组抗菌肽 PF1 的表达

于YPD平板上划线分离重组乳酸克鲁维酵母PF1- pKLAC2-GG799，30℃培养48-64h，挑取乳酸克鲁维酵母GG799单菌落接种于10 mL YPD 液体培养基，250rpm ，30℃过夜培养种子液，取 5mL 过夜培养的种子液，接种于 500 mL YPG 液体培养基（1%酵母提取物；2%蛋白胨；2%半乳糖），250rpm，30℃培养 48h，5000rpm

离心10min，所得上清液进行蛋白纯化和 SDS-PAGE。

实施例 5

重组抗菌肽 PF1 的纯化

1、饱和硫酸铵沉淀培养基上清中的 PF1

培养完成的菌液最大转速离心 30min，弃菌体沉淀，将等体积的饱和硫酸铵溶液（4.1mol/L，25℃）边搅拌边慢慢加入，加完放磁力搅拌器上 4℃搅拌过夜，使蛋白充分沉淀。10000rpm 4 ℃离心 30min ，弃上清保留沉淀，将沉淀溶于少量（10-20mL）PBS-0.2g/L叠氮钠中，使沉淀溶解，再使用透析袋 4℃透析 48h，每隔 6 小时更

换透析缓冲液，以彻底去除硫酸铵。

2、重组抗菌肽 PF1 蛋白镍柱纯化

相关试剂如下：

母液 1：29.22g 氯化钠，2.42gTris-Base，ddH₂O定溶至1L，调节pH=8.0。

母液2：6.06gTris-Base，ddH₂O定溶至 1L，调节 pH=8.0

Binding buffer：0.1702g 咪唑，溶于 500 mL 母液 1。

Elution buffer：17.02g 咪唑，溶于 500 mL 母液 1。

Washing buffer: 2.3828g 咪唑，溶于 500 mL 母液 2。

先用 Binding buffer 平衡镍离子亲和层析柱，然后将待纯化的样品上样于镍柱，结合 30min 左右，收集留出液 Flow Through，用 Washing buffer 洗 3 个柱体积，收集 Wash throngh，最后用 Elution buffer 洗脱蛋白，收集 Eluent.将 Binding buffer，Wash throngh，Eluent。将镍柱收集的蛋白用 Milipore 压力超滤浓缩装置通过 30kDa 超滤膜截留浓缩至10mL左右，将样品通过 Gel filtration buffer 平衡过的 Superdex200分子筛进行分离。

实施例 6

重组抗菌肽 PF1 的 Tricine-SDS-PAGE

1、相关试剂的配制

1.1、 AB-3 浓缩胶：9.6g丙烯酰胺，0.3g甲叉双丙烯酰胺，溶于20ml水；AB-6分离胶：9.3g 丙烯酰胺，0.6g甲叉双丙烯酰胺，溶于20ml水；凝胶缓冲液：2.422g Tris，0.02gSDS，溶于 20ml 水，pH=8.45。

1.2、15%分离胶（Separating gel）

成分体积（mL）

ddH₂O 7.5

AB-6 5

凝胶缓冲液 1

甘油 1.5

10%过硫酸铵 0.05

TEMED 0.005

总体积 15

1.3、10%浓缩胶（Spacer gel）

成分体积（mL）

ddH₂O 1.1

AB-3 0.6

凝胶缓冲液 1

甘油 0.3

10%过硫酸铵 0.015

TEMED 0.0015

总体积 3

1.4、4%浓缩胶（Stacking gel）

成分体积（mL）

ddH₂O 4

AB-3 0.5

凝胶缓冲液 1.5

10%过硫酸铵 0.045

TEMED 0.0045

总体积 6

1.5、考马斯亮蓝染色液：称取 1.0g 考马斯亮蓝 R-250，加入 50ml 冰醋酸、25ml无水乙醇和 425mlddH2O，搅拌溶解后过滤；

1.6、考马斯亮蓝脱色液：50ml 冰醋酸、25ml 无水乙醇，用 ddH2O 定容至 500ml；

2、纯化抗菌肽 PF1 的 Tricine-SDS-PAGE

将纯化的重组抗菌肽 PF1 中添加 SDS-PAGE loading buffer，沸水浴 15min，以蛋白质标准分子量为参考，在 Tricine-SDS-PAGE 蛋白胶上电泳，由15% Separating gel，10%Spacer gel，4% Stacking gel灌制三层的 Tricine-SDS-PAGE蛋白胶，插入 1mm 胶梳，室温下凝固。制备完成后拔下胶梳，立即将胶板固定于电泳装置上，电泳槽内加入电泳缓冲液，排尽凝胶底部玻璃板间的气泡，每孔加样 20μL,接通电源，进入分离胶之前 30V,之后100 V,在跑至分离胶底部之前调至200V，电泳完成后取下凝胶，考马斯亮蓝染色液中染色过夜，过夜染色完成后，使用考马斯亮蓝脱色液进行脱色，每 30 分钟换脱色液，直到看到清晰的条带为止，结果如图 2 所示。

Claims

1.一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母，其特征在于，所述重组乳酸克鲁维酵母为PF1-pKLAC2-GG799。

2.根据权利要求1所述的一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母，其特征在于，包含权利要求 1 所述基因的乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2。

3.根据权利要求1所述的一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母，其特征在于，包含权利要求 2 所述质粒的乳酸克鲁维酵母为GG799。

4.根据权利要求1所述的一种表达猪小肠抗菌肽PF1基因的重组乳酸克鲁维酵母的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

按乳酸克鲁维酵母密码子优化合成猪小肠抗菌肽PF1基因；

将猪小肠抗菌肽PF1基因与乳酸克鲁维酵母质粒pKLAC2同时双酶切反应、琼脂糖凝胶电泳回收，并进行4℃过夜连接，将连接产物转化大肠杆菌JM109，提重组质粒PF1-pKLAC2；

使用限制性内切酶SacII线性化处理重组质粒；

线性化重组质粒转化乳酸克鲁维酵母 GG799,构建重组乳酸克鲁维酵母PF1-pKLAC2-GG799。