CN104782909A - 一种饲料用抗菌肽脱霉剂及其制备方法和动物饲料添加剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种饲料用抗菌肽脱霉剂及其制备方法和动物饲料添加剂，其中，饲料用抗菌肽脱霉剂包括酵母细胞壁和抗菌肽。本发明的脱霉剂的酵母细胞壁成分主要是葡萄糖甘露聚糖的化学结构与同样属于有机类的霉菌毒素的亲和性非常优良，能够形成较好的亲和吸附，相比无机的吸附剂，具有更好的吸附亲和能力；并且联合抗菌肽使用，在吸附的同时用抗菌肽进行增强杀菌，提升脱霉剂的效果，并且抗菌肽在家畜使用后对已经产生的免疫抑制有修复作用；整体上本发明的脱霉剂可同时具有杀霉、脱霉、吸附及修补多重功效。本发明进一步还提出包含有上述饲料用抗菌肽脱霉剂的动物饲料添加剂。

Description

一种饲料用抗菌肽脱霉剂及其制备方法和动物饲料添加剂

技术领域

本发明属于动物饲料添加剂技术领域，具体涉及一种饲料用抗菌肽脱霉剂及其制备方法和动物饲料添加剂。

背景技术

在畜牧业养殖中，长期存在的问题是饲料的存放中的微菌毒素污染；动物食用被污染的饲料后，造成养殖动物出现免疫抑制、下痢、母猪流产、仔猪假发情等问题。而面对这一问题，由于饲料的种植生产中与所生长的气候环境等相关，无法从源头保证隔绝微菌的污染；因此在这一情形下，多采用添加吸附剂这一物理吸附的方式来有效解决饲料污染的问题。其中，物理吸附的方式多采用“微菌毒素吸附剂”对饲料中的微菌毒素进行吸附去除，以降低微菌毒素在养殖中的上述毒害。

常用的“微菌毒素吸附剂”有水和硅酸铝、活性炭等等。这些吸附脱霉剂能在液相下与微菌毒素形成稳定的键合，进行吸附；但是上述的常用吸附剂，仅能对于部分的微菌毒素具有吸附效果，比如：无机吸附剂对黄曲毒素(AFL)的吸附效果佳，但是却对其他霉菌毒素(FUM、F2、DON、T2等)的吸附效果非常低。这些吸附剂使用中吸附片面的原因在于，一方面吸附效果优劣UI吸附材料的结构相关，譬如吸附空洞的大小、吸附结构本身的电荷分布方式、有效吸附面积等等，无法保证与所有的微菌毒素相匹配；另一方面不同的吸附结构与不同毒素具有不同的亲和性，而产生亲和性的差异影响因素有亲水性、疏水性、结构式与电荷分布等等，因此手吸附自身这些性质的限制，也不可能全面地吸附所有的霉菌毒素。

因此，现有的“微菌毒素吸附剂”在使用中对多种微菌毒素的吸附效果较为片面，不能满足大量去除微菌污染的需求，同时在使用中这些微菌毒素会使养殖的动物产生免疫抑制，而采用吸附剂在吸附之后也不能对动物食用污染饲料已经产生的免疫抑制有良好的缓解和修复的功能。

发明内容

本发明实施例的目的在于克服现有脱霉剂吸附效果片面且无法修复已经造成的免疫抑制问题的上述不足，提供一种。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种饲料用抗菌肽脱霉剂包括酵母细胞壁和抗菌肽。

本发明的脱霉剂的酵母细胞壁成分主要是葡萄糖甘露聚糖的化学结构与同样属于有机类的霉菌毒素的亲和性非常优良，能够形成较好的亲和吸附，相比无机的吸附剂，具有更好的吸附亲和能力；并且联合抗菌肽使用，在吸附的同时用抗菌肽进行增强杀菌，提升脱霉剂的效果，并且抗菌肽在家畜使用后对已经产生的免疫抑制有修复作用；整体上本发明的脱霉剂可同时具有杀霉、脱霉、吸附及修补多重功效。

基于上述目的，本发明进一步还提出上述饲料用抗菌肽脱霉剂的制备方法，包括如下步骤：

将含有目的抗菌肽的编码基因与质粒重组，获得重组表达载体；

将所述重组表达载体导入酵母细胞中，形成酵母工程菌；

将所述酵母工程菌进行发酵培养，获取发酵产物；

将所述发酵产物进行自溶破壁、分离、纯化处理。

本发明的制备方法，采用构建酵母工程菌进行发酵生产的方式进行，发酵培养的过程中工程菌大量表达抗菌肽，因此在最终的发酵培养产物中同时具备有酵母菌的细胞体和抗菌肽的表达产物；然后使产物中的酵母菌的细胞体自容破壁之后，然后进行分离纯化收集酵母细胞壁和抗菌肽，即可大量获得脱霉剂产品；相比现有需要从含量甚微的生物体内进行提取的方式，可以适用于大量生产并且方法上可以一次制备得到两种成分，工艺方法简单。

进一步本发明还提出包含有上述饲料用抗菌肽脱霉剂的动物饲料添加剂。

采用本发明的动物饲料添加剂中采用的脱霉剂为本发明的上述饲料用抗菌肽脱霉剂，其添加至饲料中之后，对饲料中微菌毒素的吸附亲和能力有提升，提升了脱霉的效果；并且还可同时具有杀霉及修补多重功效。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种饲料用抗菌肽脱霉剂，包括酵母细胞壁和抗菌肽；

其中的酵母细胞壁本身成分主要是葡萄糖甘露聚糖的化学结构与同样属于有机类的霉菌毒素的亲和性非常优良，能够形成较好的亲和吸附；相比无机的吸附剂，该种类型的细胞壁吸附剂针对霉菌毒素所共有的表面有机结构进行，相对能弥补无机吸附剂的片面缺点。同时，脱霉剂在酵母细胞壁吸附下混合抗菌肽，利用抗菌肽本身具有广谱抗菌活性的特点，结合单纯的酵母细胞壁相对吸附广，在吸附的同时用抗菌肽进行增强杀菌，提升脱霉剂的效果，并且抗菌肽在家畜使用后对已经产生的免疫抑制有修复作用；整体上本发明的脱霉剂可同时具有杀霉、脱霉、吸附及修补多重功效。

其中，在本发明的上述脱霉剂中，抗菌肽由于本身是生物内在免疫的效应分子，在生物体内含量甚微，从天然资源中提取成本高、得率低、工序繁琐，从生物体内直接提取大量抗菌肽的生产不满足本发明中大量饲料中添加的使用需求。因此，基于上述目的，本发明还提出一种能够满足上述饲料用抗菌肽脱霉剂大量制备的方法，包括如下步骤：

S10，将含有目的抗菌肽的编码基因与载体重组，构建表达目的抗菌肽的重组表达载体；

S20，将步骤S10所获得的重组表达载体导入酵母细胞中，形成酵母工程菌；

S30，将步骤S20所获得的酵母工程菌进行发酵培养，获取发酵产物；

S40，将步骤S30发酵培养所获得的含有酵母细胞菌体和工程菌表达产物的发酵产物进行自溶破壁、分离、纯化后即可获得同时含有酵母细胞菌体和目的抗菌肽的产物，即得到本发明的上述脱霉剂。

在上述整体制备的方法步骤的立意下，采用构建酵母工程菌进行发酵生产的方式进行，发酵培养的过程中工程菌大量表达抗菌肽，因此在最终的发酵培养产物中同时具备有酵母菌的细胞体和抗菌肽的表达产物；然后使产物中的酵母菌的细胞体自容破壁之后，然后进行分离纯化收集酵母细胞壁和抗菌肽，即可大量获得脱霉剂产品。

进一步在上述整体的方法立意下，本发明中进一步根据本身酵母细胞所能够进行非融合表达的特性，其中步骤S10中构建的工程菌中表达的目的基因为抗菌肽IsCT编码基因；本身IsCT是一种天然的α-螺旋抗菌肽，来源于马达加斯加黑爪蝎（Opisthacanthus madagascariensis），是抗菌肽中最短的多肽，仅由13个氨基酸残基（ILGKIWEGIKSLF）组成，没有半胱氨酸，对哺乳动物和细菌细胞都有活性。本发明中进行采用是基于这个原因设计的IsCT衍生物中的[L6, K11]-IsCT（ILGKILKGIKKLF）中与IsCT一样，对E. coli, P. aeruginosa，S. trphimurium，S. epidermidis，S. aureus有相同的抑菌活性，同时当[L6, K11]-IsCT浓度达到100μM时的溶血活性仅为20%，能够具备在饲料中添加使用的能力。

在上述情形下，本申请步骤S10中针对采用的抗菌肽IsCT的表达，重组表达载体的步骤可以包括如下：

S11，根据酵母密码子的偏好性，设计上述IsCT表达的编码基因，该基因为具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列的IsCT基因；

S12，采用质粒pYES2作为载体，并以pYES2α质粒的α信号肽为模板进行PCR扩增；

在该步骤中采用质粒pYES2作为载体，构建抗菌肽IsCT的重组表达载体；

其中在该步骤S12中，采用质粒pYES2，其目的在于在经过对酵母菌的非融合表达特点和本身IsCT的氨基酸结构，经过反复的多种验证和考量之后最终采用质粒pYES2进行；原因在于：首先，质粒pYES2本身具有酵母GAL1启动子，其能够在酿酒酵母中用半乳糖高水平的进行诱导，同时能被葡萄糖抑制；且质粒pYES的多克隆位点区域还具有CYC1终止子，能够有效终止mRNA的转录表达，采用该质粒在表达能力较强的同时还更加易于控制；其次，质粒pYES2本身的多克隆位点具有多种可用的酶切位点，便于重组操作；第三，质粒本身具有URA3基因和氨苄抗性基因，分别可以用于筛选带有ura3基因型的酵母宿主菌株转化子，和在大肠杆菌中进行载体筛选。在采用该质粒pYES2作为目的基因的表达载体之后，基于质粒pYES2的采用，针对其pYES2α质粒的α信号肽为模板设计引物，其中pYES2α质粒（932-1207碱基区段）的α信号肽的序列具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列；

以上述α信号肽为模板，分别设计的引物为具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.4碱基序列的下游引物。

其中，在上游引物中引入HindⅢ酶切位点，即上游引物的第1位至8位的碱基片段“CAAGCTTG”；并且在下游引物中引入“NotⅠ酶切位点”即下游引物中的第4位至15位的碱基片段“TTGCGGCCGCAA”；

同时在上述下游引物中直接将要表达的目的基因植入在引物序列内，即下游引物第41位至79位的碱基片段，直接通过引物自身在扩增的过程中，实现目的基因与质粒pYES2的衔接；同时下游引物中27至40位的碱基序列为引入的终止密码子，对目的基因准确的表达位点进行准确定位表达控制。

在该步骤中，以α信号肽的序列为模板进行扩增时，下游引物中直接引入了抗菌肽IsCT的编码基因，通过扩增直接可以获得含有IsCT基因和α信号肽的重组序列α-IsCT；当然扩增之的产物可以进行电泳、切胶回收，纯化重组序列α-IsCT备用。

S13，将步骤S12中的PCR成功扩增的重组序列α-IsCT和质粒pYES2分别用HindⅢ和NotⅠ进行双酶切后用DNA连接酶进行连接，形成重组质粒pYES2α-IsCT。

当然，在步骤S13之后，对步骤S13获得的用DNA连接酶处理后的连接产物中需要筛选重组成功的重组质粒，这一筛选的过程中可以采用将步骤S13中DNA连接酶处理的连接产物导入至大肠杆菌E.coli Top10中筛选重组成功的质粒。筛选的方法可以采用氨苄青霉素的培养基进行，因为本身采用的质粒pYES2自身具有氨苄抗性基因，转化成功之后的大肠杆菌可以在氨苄青霉素的培养基中生长。

步骤S20中进一步将步骤S10获得的重组质粒pYES2α-IsCT转化到酿酒酵母中，导入的方式采用电转化、化学转发等等均可以，之后筛选转化成功的酿酒酵母，作为工程菌备用。其中，转化成功与否，可以采用质粒pYES2所具有的URA3基因进行，原养型的酿酒酵母菌株在阴性培养基中无法正常生长，导入后具有转化进URA3基因的菌株能正常生长，通过质粒pYES2本身具有的URA3基因因此可以实现酵母工程菌的筛选。

之后步骤S30采用步骤S20成功构建的酵母工程菌进行大量的培养，培养的过程中注意控制生长条件，在适当的时候诱导抗菌肽IsCT进行表达；完成发酵之后步骤S40将发酵液进行处理，首先使其中的菌体自溶破壁、内含物释放，使酵母细胞菌体的细胞壁游离，然后进行分离纯化保留细胞壁和抗菌肽产物，最终得到的纯化物可以直接作为本发明的脱霉剂产品。

本发明采用酿酒酵母菌株构建的工程菌进行发酵生产，在脱霉剂发酵生产的过程中，整个重组表达所采用的宿主菌和表达载体及生产过程均无毒副作用；并且该酿酒酵母菌株对抗菌肽不敏感，可以耐受抗菌肽的杀菌活性，实现酵母细胞壁和抗菌肽产物的一步同时制备获得；并且该食品级的酿酒酵母作为表达宿主，结合质粒的α信号肽基因辅助，所表达抗菌肽的过程是非融合的分泌型表达，相比通常的融合表达能更进一步表达有利于多肽产品的分离纯化，节约成本；同时酿酒酵母表达载体不需要甲醇等有害物质诱导，也避免了添加抗生素等筛选剂，产物直接满足作为饲料添加剂的标准，同时能整体具有杀霉、脱霉、吸附及修补多重功效。

为使本发明上述制备的实施细节更加清楚完整、易于本领域技术人员的实施参考，以及使本发明脱霉剂产品的突出的进步性效果更加显著，以下通过实施例对上述过程的实施进行具体举例说明。

实施例1

在该实施例1中采用酿酒酵母INVSc1作为工程菌的宿主，按照如下步骤进行工程菌的构建和发酵培养：

S11，以pYES2α质粒的α信号肽基因片段为模板，采用具有具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.4碱基序列的下游引物进行PCR扩增，获取PCR扩增产物；

PCR扩增过程中可以采用100μL的标准体系进行。

S12，扩增之后将PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行分离和纯化，并将目的基因片段出的胶片条带切下来，回收溶解备用；回收的DNA条带为目的IsCT基因和α信号肽的重组序列α-IsCT；

S13，将步骤S12中电泳回收的重组序列α-IsCT与质粒pYES2用HindⅢ和NotⅠ进行双酶切后，再采用DNA连接酶进行连接处理，得到连接产物；

S14，将步骤S13得到的连接产物导入至感受态的大肠杆菌Top10中，其中感受态大肠杆菌的制备、以及导入的操作方式可以采用实验室常规的手段进行，在此不做限定；

并将经过导入处理的产物用含有氨苄青霉素培养基进行筛选，收集正常生长的菌体即为导入正确重组质粒pYES2α-IsCT的大肠杆菌E.coli Top10。

S20，将步骤S14中筛选重组成功的大肠杆菌，用质粒提取试剂盒提取重组质粒pYES2α-IsCT，然后将提取的重组质粒用电转化的方式导入至酿酒酵母INVSc1菌株中，然后采用5-FOA（5-氟乳清酸）的阴性培养基进行培养，正常原养型酵母细胞的乳清苷5-磷酸脱羧酶能将5-FOA转化为有毒物质（自杀性抑制物）无法正常生长培养；能正常生长的即为成功转化有重组质粒pYES2α-IsCT的酵母菌；

S30，然后发酵培养，在培养初期需要检测发酵液并测定IsCT能否抑制E. coli ATCC 8739和S. aureus ATCC 25923的生长；正常后继续培养；

同时，当OD的密度达到通常符合标准后，进行诱导，直接达到衰退期时收集发酵产物；

S40，将发酵产物经过自溶破壁、复合酶降解、分离、提纯、干燥、灭酶之后即可分别得到酵母细胞壁和抗菌肽IsCT。

在上述基础上，本申请进一步提出一种动物饲料添加剂，添加剂中包含有本发明的上述脱霉剂；包含有本发明上述脱霉剂的动物饲料添加剂，其添加至饲料中之后，对饲料中微菌毒素的吸附亲和能力有提升，提升了脱霉的效果；并且还可同时具有杀霉及修补多重功效。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

序列表

Claims (9)

1.一种饲料用抗菌肽脱霉剂，其特征在于，包括酵母细胞壁和抗菌肽。

2. 如权利要求1所述的饲料用抗菌肽脱霉剂，其特征在于，所述抗菌肽为IsCT抗菌肽。

3. 如权利要求1所述的饲料用抗菌肽脱霉剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将含有目的抗菌肽的编码基因与质粒重组，获得重组表达载体；

将所述重组表达载体导入酵母细胞中，形成酵母工程菌；

将所述酵母工程菌进行发酵培养，获取发酵产物；

将所述发酵产物进行自溶破壁、分离、纯化处理。

4. 如权利要求3所述的饲料用抗菌肽脱霉剂的制备方法，其特征在于，所述含有目的抗菌肽的编码基因为具有序列表SEQ.ID.No.1碱基序列的IsCT基因。

5. 如权利要求3或4所述的饲料用抗菌肽脱霉剂的制备方法，其特征在于，将所述含有目的抗菌肽的编码基因与质粒载体重组的步骤包括：

以具有序列表SEQ.ID.No.2碱基序列的α信号肽基因为模板进行PCR扩增；其中，PCR扩增过程中采用的引物为具有序列表SEQ.ID.No.3碱基序列的上游引物和具有序列表SEQ.ID.No.4碱基序列的下游引物；

将所述α信号肽基因的扩增产物与质粒pYES2进行重组，即得到所述重组表达载体。

6. 如权利要求5所述的饲料用抗菌肽脱霉剂的制备方法，其特征在于，将所述α信号肽基因的扩增产物与质粒pYES2进行重组之后还包括：

将所述α信号肽基因的扩增产物与质粒pYES2的重组产物，导入大肠杆菌中用含有氨苄青霉素培养基筛选重组表达载体。

7. 如权利要求5所述的饲料用抗菌肽脱霉剂的制备方法，其特征在于，所述酵母细胞为食用级酿酒酵母。

8. 如权利要求7所述的饲料用抗菌肽脱霉剂的制备方法，其特征在于，所述食用级酿酒酵母为酿酒酵母INVSc1。

9. 一种动物饲料添加剂，其特征在于，包含权利要求1或2所述的饲料用抗菌肽脱霉剂。