CN104404049B

CN104404049B - 一种蝇防御素突变体及其制备方法和用途

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Publication number: CN104404049B
Application number: CN201410712363.8A
Authority: CN
Inventors: 李钢; 邹辉琴; 高静雷; 温静
Original assignee: Rota Bioengineering Co Ltd
Current assignee: Rota Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2014-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2017-03-15
Anticipated expiration: 2034-11-28
Also published as: CN104404049A

Abstract

本发明公开了一种如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，还公开了包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌，以及SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码的蝇防御素突变体。本发明通过基因工程的方式制备得到了蝇防御素突变体，其抑菌活性好，耐热活性佳，具备抗胰蛋白酶的活性，具有良好的市场应用前景。

Description

一种蝇防御素突变体及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种蝇防御素突变体及其制备方法和用途。

背景技术

抗菌肽(Antibacterial Peptides，ABPs)，又称抗微生物肽(AntimicrobialPeptides,AMPs)，广义上是指广泛存在于生物体内具有抵御外界微生物侵害，清除体内突变细胞的一类小分子多肽，是生物先天免疫防御系统的一个重要组成部分，在黏膜免疫系统中起重要作用，称之为“第一道防御体系”或“第一道免疫体系”。抗菌肽广泛存在于细菌、植物、无脊椎动物及脊椎动物体内，不仅具有广谱抗细菌能力，而且对真菌、病毒及癌细胞也有一定杀抑作用。此外，还具有稳定、水溶性好、抗菌机理独特、无耐药性、对高等动物正常细胞无害等特点，从而显示了其在医学和农业上潜在的研究和应用价值。

蝇防御素是来自于家蝇的抗菌肽，其杀菌机制是分子中的二硫键与细菌细胞膜的磷脂有很强的亲和作用，即大量分子与膜结合在一起，形成寡聚糖体，并在细菌细胞膜上围成一个离子通道，使细胞内大量K+外流和ATP合成受阻，导致细胞呼吸停止、菌体死亡。研究也发现，防御素附着在细菌表面后，除了本身对细菌的损伤外，还可以使细菌被吞噬细胞吞噬消化，起到调理素的作用。

直接从家蝇中分离提取的蝇防御素难以满足市场需求，采用基因工程的方式制备重组蝇防御素可以降低成本，但是采用蝇防御素的基因直接在大肠杆菌中表达获得的重组蝇防御素抗菌活性不高，耐热活性差，不具备抗胰蛋白酶的活性，实际应用价值低。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种蝇防御素的突变体。

本发明提供了一种如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

还提供了一种重组载体，它包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。优选地，所述的重组载体是重组pGEX-4-1质粒。

还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。优选地，所述的重组菌为重组大肠杆菌。

本发明蝇防御素突变体，它由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码。它的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供了一种制备前述蝇防御素突变体的方法，包含如下步骤：

(1)取前述的重组菌，接种于含有50ug/mL氨苄青霉素的液体肉汤培养基中，37℃、220rpm震荡培养12h，然后用含有50ug/mL的氨苄青霉素的液体肉汤培养基重悬至OD₆₀₀为0.1，于37℃培养至OD₆₀₀为0.8，加入IPTG至终浓度为1mM，诱导表达3小时，离心，得菌体；

(2)取菌体，用GST融合蛋白纯化试剂盒分离纯化，得到结合了GST融合蛋白的树脂后，加入等体积的浓度为50U/ml的凝血酶溶液，混匀，室温震荡10小时，离心，得上清，去除凝血酶，即得。

所述液体肉汤培养基每升包含如下成分：蛋白胨10g、酵母浸出物5g、NaCl 10g，其余为水。

本发明还提供了前述蝇防御素突变体在制备饲料添加剂或抗菌药物中的用途。

本发明还提供了一种抗菌药物，它是以前述蝇防御素突变体为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。

本发明通过基因工程的方式制备得到了纯品蝇防御素突变体，其抑菌活性好，耐热活性佳，具备抗胰蛋白酶的活性，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1 SDS—PAGE分析。1泳道为纯化LUC-ori融合蛋白；2泳道为纯化的LUC-n融合蛋白；9泳道为LUC-n菌悬液总蛋白；8泳道为细胞溶解后上清蛋白；7泳道为溶菌酶，DNA酶，RNA酶酶解后上清；6泳道为酶解后沉淀总蛋白；4，5泳道为上柱前清液，3为第一次洗柱清液。

图2 SDS—PAGE分析。泳道1为LUC-ori融合蛋白酶切结果；泳道2，3为LUC-n融合蛋白酶切结果，2为5单位凝血酶，3为2.5单位凝血酶；4泳道为LUC-n融合蛋白未酶切结果，箭头所示为蝇防御素蛋白。

图3 SDS—PAGE分析。1泳道：突变LUC-n蛋白超滤离心后的离心液；2泳道：LUC-n蛋白经透析袋浓缩后的清液；3泳道：未突变LUC-ori蛋白超滤离心后的离心液；4泳道：LUC-ori蛋白透析袋浓缩后的清液。

图4抑菌实验结果。1号样品：LUC-n融合蛋白酶切液；2号样品：LUC-ori融合蛋白酶切液；3号样品：GST蛋白对照；4号样品：凝血酶对照。

图5热处理后的抑菌结果。蓝色点为LUC-n热处理结果，红点为LUC-ori热处理结果。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

实施例1 本发明重组蛋白的制备

1、重组表达

(1)蝇防御素多肽基因的克隆

基因序列分析

将野生蝇防御素命名为LUC-ori，从NCBI数据库中调取已知蝇防御素序列，对其进行Blastp分析，得出氨基酸序列。

对蝇抗菌肽基因进行改造，将甘氨酸突变称丝氨酸，命名为LUC-n。

核苷酸比对：

LUC-ori(SEQ ID NO：1):

gctacttgcg atttattgag tggtactggt gttaaacatt cagcttgtgc tgcccactgc

ttgttgagag gaaatcgtgg cggttattgt aatggtagag ctatttgcgt gtgtcgtaat

LUC-n(SEQ ID NO：2):

gctacttgcg atttattgag tggtactggt gttaaacatt cagcttgtgc tgcccactgc

ttgttgagag gaaatcgtgg cagttattgt aatggtagag ctatttgcgt gtgtcgtaat

合成前述LUC-ori和LUC-n。

氨基酸序列比对：

LUC-ori(SEQ ID NO：3)：

ATCDLLSGTG VKHSACAAHC LLRGNRGGYCNGRAICVCRN

LUC-n(SEQ ID NO：4)：

ATCDLLSGTG VKHSACAAHC LLRGNRGSYC NGRAICVCRN

(2)重组菌的构建和筛选

重组表达载体的构建：全基因LUC-n和LUC-ori分别通过EcoRI/NotI位点克隆到大肠杆菌表达载体pGEX-4-1上,得到重组载体pGEX-LUC-n。

LUC-n和LUC-ori基因在Invitrogen公司进行合成，同时在基因两端添加EcoRI/NotI位点，并将基因通过TA克隆至pMD18-T载体(购自TaKaRa公司)中，使用Qiagen公司的质粒提取试剂盒，分别提取含有LUC-n和LUC-ori基因的pMD18-T载体质粒以及pGEX4-1载体质粒，使用EcoRI/NotI双酶切，使用胶回收试剂盒(购自TaKaRa公司)分别回收基因片段以及pGEX载体，使用DNA连接试剂盒(购自TaKaRa公司)进行16℃下连接30分钟，采用大肠杆菌热激法转化方法，将连接液转化至DH5α并涂布于含有50ug/mL的氨苄青霉素肉汤培养基平板上。次日使用基因引物5’GAATTCGCTACTTGCGATTTATTGA，以及3’引物GCGGCCGCTTAATTACGACACACGC对阳性克隆进行PCR筛选，PCR条件95℃预变性5min，95℃30sec，55℃1min，72℃1min，30个循环，72℃10min，得到的阳性克隆送至Invitrogen公司测序，挑出分别含有pGEX-LUC-ori重组质粒和pGEX-LUC-n重组质粒的阳性克隆。

(3)重组表达

挑取阳性单克隆于含有50ug/mL的氨苄青霉素的液体肉汤培养基中，37℃、220rpm震荡培养12h，次日用新鲜培养基稀释培养液至OD₆₀₀为0.1，继续于37℃培养至OD₆₀₀：0.8，然后加入终浓度为1mM的IPTG，诱导3小时。诱导结束后，取样进行SDS-PAGE电泳验证。

液体肉汤培养基配方：蛋白胨10g、酵母浸出物5g、NaCl 10g，加水至1L，pH7.0,115℃灭菌20min。

(4)分离纯化：

a、取菌体，采用Thermo公司《Pierce GST spin purification kit》(即GST融合蛋白纯化试剂盒)，按照试剂盒的操作说明分离纯化，得到结合了GST融合蛋白的树脂；

b、将结合了GST融合蛋白的树脂与凝血酶混合反应，即按每毫升树脂加入1ml凝血酶溶液，凝血酶溶液是含有浓度为50U/ml凝血酶的PBS溶液，颠倒数次，室温下震荡10小时，4℃以500g离心5min，将上清转移到新管中。

c、使用通用电气医疗集团Vivaspin样品浓缩离心管离心洗涤，选择分子量截流范围为10kD的离心管，将酶解上清液中4kD大小的防御素与36kD大小的凝血酶分离，去除离心液，即得纯品蛋白，然后在1kD的透析膜中浓缩，保存。

2、测定

(1)SDS-PAGE

取前述分离纯化过程中的样品和分离纯化得到的样品，用SDS-PAGE电泳分析蛋白条带。

(2)抑菌试验：取酶切液160μL加入牛津杯中16-18小时后取出观察，具体参见蝇防御素活性测定方法。

1.原理

本法基于防御素杀菌抑菌能力，利用在特定条件下一定浓度的防御素在含有微生物的培养基内扩散并形成固定大小的抑菌区域的原理进行测定，同时通过微生物检定法二剂量法计算防御素相当于标准抗菌物质的效价单位。

2.参考文献及标准

《中华人民共和国兽药典》2010版——抗生素微生物鉴定法

QB 2394-2007食品添加剂乳酸链球菌素

3.试剂

3.1 底层琼脂1.5g琼脂，加水至100mL，115℃，灭菌20min。

3.2 上层琼脂：蛋白胨1.0g，酵母浸粉0.5g，NaCl 1.0g，加水至100mL，琼脂糖1.5g，pH7.0，115℃，灭菌20min。

3.3 LB固体培养基：蛋白胨1.0g，酵母浸粉0.5g，NaCl 1.0g，加水至100mL，琼脂1.5g，pH7.0，115℃，灭菌20min。

3.4 LB液体培养基：蛋白胨1.0g，酵母浸粉0.5g，NaCl 1.0g，加水至100mL，115℃，pH7.0，灭菌20min。

3.5 磷酸缓冲液：K₂HPO₄2.0g，KH₂PO₄8.0g，加蒸馏水定容至1000mL，过滤，115℃，30min，备用。

4.分析步骤

4.1 指示菌的活化

按照试剂3.4的配方，配置30mL的培养液，取出一支指示菌，吸取1mL无菌水加入其中并充分混匀，最后转接1mL指示菌菌悬液于培养液中，放入摇床，200rpm，37℃，培养18h。取出培养好的指示菌菌悬液，600nm下用无菌蒸馏水调零，测定其OD值，如果OD值介于1.5—2.0，菌悬液的加入量为40微升每10mL上层培养基，如果OD值在2.0—2.5之间，菌悬液加入量为35微升每10mL上层培养基。

4.2 标准品液的制备

4.2.1 硫酸粘杆菌素标准液

准确称取硫酸粘杆菌素标准品(中国兽医药品监察所，含量22156U/mg)0.0360g，用试剂3.5磷酸缓冲液定容至10mL，2000rpm，离心10min后再稀释10倍后作为高剂量浓度，并将其稀释1倍，使之配成高低剂量两个浓度梯度溶液。

4.2.2 防御素供试品

准确称取防御素3.8000g，并溶于6.2mL的磷酸缓冲液当中，混匀，2000rpm，离心10min，留上清液作为高剂量浓度，并将其稀释1倍，使之配成高低剂量两个浓度梯度溶液。

4.3 平板的制备

用无菌20mL移液管移取15mL的平板试剂3.1底层琼脂于平板上，将平板放置于水平的操作台上至冷却，备用。

加热融化试剂3.2上层琼脂，呆冷却置50℃时(刚好不烫手的温度)，按步骤4.1指定量加入大肠杆菌悬液，摇匀后置于50℃恒温水浴锅中，用无菌10mL移液管每次精确移取10mL试剂3.2上层琼脂注入含底层琼脂的平板上，迅速轻放于于水平操作台上至冷却，保证琼脂胶凝后效价测定培养基平面的平整度。

4.4 上样

用直尺将平板划分为均匀的四份，在每个制备好的平板中以等距离安置牛津杯4个。样品和标准品的高低剂量分别以对角形式加入，加入量为160微升。上样完成后，放入培养箱，用事先烘干(烘箱120℃，2h)的陶瓦盖代替平板上盖盖好平板，37℃，培养6h。实验重复5组。

4.5 测量及结果计算

将平板取出，倒出牛津杯，将平板放置在一个黑色背景的平台上，用游标卡尺测量各抑菌圈的大小，取其平均值，按公式1计算效价，或使用二剂量法生物效价测定软件计算。

式中：

CSH——样品溶液的效价，单位为U/mg；

CBH——标准溶液的效价，单位为U/mg；

XSH——高剂量样品溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米(mm)；

XSL——低剂量样品溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米(mm)；

XBH——高剂量标准溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米(mm)；

XBL——低剂量标准溶液所致的抑菌圈直径，单位为毫米(mm)；

k——高剂量倍数与低剂量倍数的比值。

产品含量按公式2计算：

产品含量＝CSH/0.38……………………………………………………….(2)

0.38——产品浓度，单位为g/mL

若样品估计值不在测定值的90％-110％范围内，需要重新估计样品效价，重测。

(3)耐热性检测：

将纯品LUC-n与纯品LUC-ori稀释到100μg/mL，分别在50，60,70,80，90下保温处理10min,快速冷却至室温,按前述(2)抑菌试验测定抑菌活性。

(4)耐胃蛋白酶和胰蛋白酶水解检测：

将纯品LUC-n与纯品LUC-ori酶切液稀释到100μg/mL，分别用胃蛋白酶和胰蛋白酶酶解0、15、30、45、60min(胃蛋白酶酶解条件:pH值为2.0,酶解温度为37℃；胰蛋白酶酶解条件：pH值为7.2,酶解温度为37℃)，酶解结束后用沸水浴灭酶5min,再快速冷却至室温,按前述(2)抑菌试验测定抑菌活性。

3、测定结果

(1)表达的电泳检测结果

如图1所示，本发明制备得到了纯品LUC-ori-GST融合蛋白和纯品LUC-n-GST融合蛋白。

如图2所示，箭头所示为蝇防御素蛋白，分子量约4kD，大小符合预期。

如图3所示，通过进一步的分离纯化，得到了纯品LUC-ori和纯品LUC-n，通过紫外分光光度计检测，LUC-n和LUC-ori浓缩后蛋白浓度分别到达325μg/mL和217μg/mL。

实验结果说明，本发明制备得到的蝇防御素突变体的纯品蛋白LUC-n。

(2)抑菌活性

如图4所示，1号，2号样品分为LUC-n和LUC-ori浓缩后的样品，将LUC-n与LUC-ori浓缩液稀释至终均为100μg/mL；3号样品：GST蛋白对照；4号样品：凝血酶对照。

结果发现：

1、1号的抑菌圈稳定，说明本发明蝇防御素突变体LUC-n较为稳定，而2号的抑菌圈变形，说明野生型蝇防御素的稳定性较差。

2、抗菌肽抑菌活性单位按照在10⁶cfu/mL大肠杆菌培养基中，37℃，pH5.0时，每形成1mm²抑菌区域所需要的肽量为一个单位，通过测量LUC-n抑菌圈直径为18mm，则抑菌活性＝3.14*9²＝254U，蛋白的比活力为＝254/160/100*10⁶＝15875U/mg(160为牛津杯中上样体积，100为上样的抗菌肽的浓度)。

同理计算出LUC-ori抑菌活性＝3.14*7.2²＝162U，比活力为10173.6U/mg。

对比可以看出，本发明蝇防御素突变体LUC-n的抗菌比活为15875U/mg，是野生型蝇防御素的1.56倍，抗菌活性明显提高。

(3)耐热性检测结果

表1 野生型蝇防御素LUC-ori的检测结果

温度(℃)	50	60	70	80	90	100
							圈大小(mm)	18	18	17.1	14.5	12.7	13.3
活性	254.34	254.34	229.54	165.05	126.61	138.86
							相对活性	100	100	90.2	64.9	49.8	54.6

表2 蝇防御素突变体LUC-n的检测结果

温度(℃)	50	60	70	80	90	100
							圈大小(mm)	18	18.1	18	17.9	17.8	17.5
活性	254.34	257.17	254.34	251.52	248.72	240.41
							相对活性	100	101.1	100	98.9	97.8	94.5

如图5和表1～表2所示，随着温度升高，野生型蝇防御素LUC-ori的抑菌活性显著下降，在100℃时的抑菌活性仅仅为50℃时抑菌活性的54.6％；而本发明蝇防御素突变体LUC-n的抑菌活性无明显变化，在100℃时的抑菌活性是50℃时抑菌活性的94.6％。

实验结果表明，与野生型蝇防御素LUC-ori相比，本发明蝇防御素突变体LUC-n耐热性显著增加。

(4)耐胃蛋白酶和胰蛋白酶水解检测结果

结果如表3～4所示：

表3 LUC-ori胰蛋白酶处理结果

标号	0	1	2	3	4
						酶解时间(min)	0	15	30	45	60
圈大小(mm)	13.10	12.73	12.12	12.02	12.09
						活性	134.7	127.2	115.3	113.4	114.7

表4 LUC-n胰蛋白酶处理结果

标号	0	1	2	3	4
						酶解时间(min)	0	15	30	45	60
圈大小(mm)	13.31	13.61	13.35	13.35	13.52
						活性	139.0	145.4	139.9	139.9	143.4

如表3～表4所示，随着酶解时间延长，野生型蝇防御素LUC-ori的抑菌活性显著下降，说明其不具备抗胰蛋白酶的活性；而本发明蝇防御素突变体的抑菌活性则随着酶解时间延长无明显变化，说明其具有抗胰蛋白酶的活性。

实验结果表明，野生型蝇防御素LUC-ori不具有抗胰蛋白酶的活性，而本发明经过突变获得的蝇防御素突变体LUC-n则具有抗胰蛋白酶消化的能力。

本发明通过基因工程的方式，制备得到了纯品蝇防御素突变体，其抑菌活性好，耐热活性佳，具备抗胰蛋白酶的活性，性能明显优于野生型蝇防御素，具有良好的市场应用前景。

Claims

1.一种如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

2.一种重组载体，其特征在于：包含SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述的重组载体是重组pGEX-4-1质粒。

4.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或者3所述的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述的重组菌为重组大肠杆菌。

6.一种蝇防御素突变体，其特征在于：它由SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列编码；它的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

7.一种制备权利要求6所述蝇防御素突变体的方法，其特征在于：包含如下步骤：

（1）取权利要求4或5所述的重组菌，接种于含有50ug/mL氨苄青霉素的液体肉汤培养基中，37℃、220rpm震荡培养12h，用含有50ug/mL的氨苄青霉素的液体肉汤培养基重悬至OD₆₀₀为0.1，于37℃培养至OD₆₀₀为0.8，然后加入IPTG至终浓度为1mM，诱导表达3小时，离心，得菌体；

（2）取菌体，用GST融合蛋白纯化试剂盒分离纯化，得到结合了GST融合蛋白的树脂后，加入等体积的浓度为50U/ml的凝血酶溶液，混匀，室温震荡10小时，离心，得上清，去除凝血酶，即得。

8.权利要求6所述蝇防御素突变体在制备饲料添加剂或抗菌药物中的用途。

9.一种抗菌药物，其特征在于：它是以权利要求6所述蝇防御素突变体为活性成分，加上药学上可接受的辅料制备而成的制剂。