CN102121025B - 一种多拷贝整合表达载体及其制备方法与在表达牛乳铁蛋白中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达载体及其制备方法与应用，特别涉及一种多拷贝整合表达载体及其制备方法与在表达牛乳铁蛋白中的应用，属于基因工程技术领域。一种多拷贝整合表达载体，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述的多拷贝整合表达载体以YIPlac204质粒为骨架，PGK为启动子，G418抗性为筛选标记，rDNA为整合位点，是适用于工业化生产使用的酵母多拷贝整合型表达载体。

Description

一种多拷贝整合表达载体及其制备方法与在表达牛乳铁蛋白中的应用

技术领域

本发明涉及一种表达载体及其制备方法与应用，特别涉及一种多拷贝整合表达载体及其制备方法与在表达牛乳铁蛋白中的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

乳铁蛋白(Lactoferrin，简写为LF)是一种铁结合性糖蛋白，其分子量为80KDa。1939年由Sorensen从牛乳中分离出来，由于LF与铁结合后会形成红色的复合物，故一开始被称为红蛋白。1960，Groves用色谱法得到该蛋白的纯化产物后确定其属于转运蛋白家族，能够结合铁离子，故将其命名为乳铁蛋白。

乳铁蛋白主要存在于乳液尤其是初乳中，是新生动物重要的免疫和营养调节物质。国内外大量研究结果显示，乳铁蛋白能促进铁吸收，降低缺铁性贫血发生率；乳铁蛋白具有明显的抗菌作用，通过和细菌争夺铁，抑制或杀死多种细菌(双歧杆菌等需铁量极少的几种有益菌除外)；有利于肠道中有益菌的生长，维持菌群平衡，防止腹泻；还可阻断胃肠炎病毒等多种病毒和宿主细胞的结合；可提高机体过氧化物酶含量和吞噬细胞活性，提高免疫力。乳铁蛋白经胃蛋白酶水解成小肽后，抗菌活性是乳铁蛋白本身的400倍。因此，乳铁蛋白是安全、高效、具有多种生理功能和良好前景的养殖用抗生素替代品。将乳铁蛋白作为饲料添加剂喂养动物尤其是新生动物，能降低缺铁性贫血发生率，增加肠道中有益菌的数量，并提高它们的抗病能力，减少新生动物疾病发生率，提高存活率。

由于乳铁蛋白具有很多生理功能作用，于是自1960年以来人们就试着采用各种方法来制备乳铁蛋白，例如采用色谱法、超滤法、盐析法以及酸沉淀法等从人或牛乳中分离纯化LF(参见：姬德衡.《乳中的生物活性成分》[J].中国乳品工业.1996，3(24)：29-31)。LF的分离方法主要有两大类：色谱法和超滤法。色谱法又可分为吸附、离子交换、亲合色谱法以及固定化单系抗体法，超滤法是生产食用乳铁蛋白最能实现工业化的方法之一。目前，随着分离精制技术不断完善，已在工业规模上成功从干酪乳清和脱脂乳中制备纯度高达95％以上的LF。

但是，色谱法价格昂贵，技术要求高，不适用于工业化生产；而超滤法简便并且费用低，但是得到的LF纯度低，膜需要经常清洗。这些从牛乳中分离纯化得到乳铁蛋白的方法都要受牛乳的质量、数量、价格等影响，使得LF分离提纯成本不易下降，限制了其作为饲料添加剂的应用范围。如能利用转基因生物得到廉价的重组乳铁蛋白，将会使它得到更广泛的应用，满足畜禽和水产养殖业的需要。

目前，人乳铁蛋白已成功在大肠杆菌、毕赤酵母、小鼠、奶牛、马铃薯和大米中成功表达，并且Patrick等成功利用转基因奶牛实现大批量生产人乳铁蛋白。lactoferricin已成功在毕赤酵母和大肠杆菌中表达，但是很少有人在酵母系统中表达牛乳铁蛋白，只有Dong，Z Y等人在毕赤酵母中表达青藏高原牦牛的乳铁蛋白，并且经甲醇诱导表达，发酵产物需要进行纯化后才能使用，不利于降低成本。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种多拷贝整合表达载体及其制备方法与在表达牛乳铁蛋白中的应用。

一种多拷贝整合表达载体，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述多拷贝整合表达载体的构建方法，步骤如下：

(1)以YIPlac204为模板，经PCR扩增得到460bp大小的Bgl片段，引物序列如下：

引物b1：5’GACGTCAGATCTATTCTTGCCACGACTCATCTCC  3’，

引物b2：5’GAATTCAGATCTGATTCCGATGCTGACTTGCTG  3’；

PCR反应条件为：94℃2min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，循环重复34次，72℃10min；

(2)将步骤(1)制得的Bgl片段经Aat II和EcoR I酶切后与经Aat II和EcoR I酶切载体YIPlac204后得到的大片段用DNA连接酶连接，得到表达载体的骨架，将其命名为pYB-1；

(3)以质粒pMA91为模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR进行PCR扩增得到1836bp的PGK启动子和终止子片段(序列如SEQ ID NO.2所示)，反应条件为98℃10sec，61℃15sec，72℃120sec，循环重复34次，72℃10min，引物序列如下：

pgk1：CGCGGATCCAAGCTTTCTAACTGATCTATC；

pgk2：CGCGGATCCCTTTAACGAACGCAGAATTTTGGAG；

(4)将步骤(3)制得的经BamH I酶切后的PGK启动子和终止子片段与经Bgl II单酶切的pYB-1用DNA连接酶连接，转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板，利用HindⅢ进行酶切验证，选取出现2230bp和1960bp两条带的转化子，命名为pYB-2；

(5)以酿酒酵母ABXL-1D染色体为模板，进行PCR扩增，得到大小为1134bp的rDNA1片段1216bp的rDNA2片段；引物序列如下：

rDNA1F：CTGCAGTTTCCTCTGGCTTCACCCTATT，

rDNA1R：CTGCAGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCT；

rDNA2F：GACGTCACCTAAAACGACCGTACTTGCAT，

rDNA2R：GACGTCGAAACTCACCAGGTCCAGACACA；

PCR反应条件为：95℃5min，94℃30sec，61℃30sec，72℃100sec，循环重复34次，72℃10min；

(6)将步骤(4)制得的pYB-2和步骤(5)制得的rDNA2分别用Aat II酶切，然后纯化，DNA连接酶连接后，转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板，利用Hind III和Hpa I进行酶切验证，选取酶切后产生大小为2156bp、1856bp和960bp三条带的转化子，将其命名为pYB-3；

(7)将步骤(6)制得的pYB-3和步骤(5)制得的rDNAl分别用Pst I酶切，然后纯化，DNA连接酶连接后，转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板，利用Hpa I进行酶切验证，选取酶切后产生大小为4089bp和2450bp两条带的转化子，将其命名为pYB-4；

(8)以YIPlac204为模板，PCR得到大小为256bp的Not片段，PCR引物序列为：

notF：CGCGGATCCGCGGCCGCATTCTTGCCACGACTCATCTCC，

notR：CGCGGATCCGCGGCCGCGATTCCGATGCTGACTTGCTG；

PCR条件为：95℃2min，94℃30sec，61℃30sec，72℃30sec，循环重复34次，72℃10min；

(9)将步骤(8)制得的Not片段用BamH I酶切，并与经Bgl II酶切的有步骤(7)制得的pYB-4，纯化后，用DNA连接酶连接，然后转化E.coli TOP10菌株，涂布LB0100μg/mL氨苄青霉素)平板，利用Not I进行酶切验证，选取酶切后产生大小为256bp条带的转化子，将其命名为pYB-5；

(10)以质粒pUG6为模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR进行PCR扩增得到1456bp的KanMX基因，PCR引物序列为：

kanF：GGATCCTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGC，

kanR：GGATCCATTAAGGGTTCTCGAGAGCTCG；

PCR反应条件为98℃10sec，68℃15sec，72℃120sec，循环重复34次，72℃10min；

(11)将步骤(10)制得的KanMX基因用BamH I酶切后与用Bgl II单酶切的pYB-5片段用DNA连接酶连接，然后转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板，利用Pst I进行酶切验证，选取酶切后产生大小为276bp、1200bp和6720bp三条条带的转化子，即为构建完毕的多拷贝整合表达载体。

上述多拷贝整合表达载体在表达牛乳铁蛋白中的应用。

上述应用，步骤如下：

(1)将牛乳铁蛋白基因和多拷贝整合表达载体分别用Not I酶切，然后用DNA连接酶连接后，转化E.coliTOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板，利用Not I进行酶切验证，经分析测序，选取反向插入牛乳铁蛋白基因的转化子命名为pYIPLF；

(2)将步骤(1)制得的pYIPLF用Hpa I酶切，回收大片段后，加入到80μL酵母电转化感受态细胞，将混合物电击后，经G418的YEPD平板的筛选，获得表达牛乳铁蛋白的酵母细胞；

(3)培养步骤(2)制得的表达牛乳铁蛋白的酵母细胞，经干燥，制得牛乳铁蛋白饲料添加剂。

上述步骤(2)中电转化的电击时间为3.5～4.0ms。

上述步骤(3)中的培养条件：在无选择压力的YEPD培养基中28～30℃培养2～3天。

上述步骤(2)中的酵母为具有絮凝性的野生型酿酒酵母ABXL-1D，菌种购自美国ATCC公司。

酿酒酵母对人类无毒，被食品和药物管理局(FDA)确认为无害表达系统，表达产物可直接作为饲料添加剂应用，并且酿酒酵母的细胞壁成分β-1，3葡聚糖也是一种免疫增强剂。故本发明利用强絮凝型酿酒酵母组成型表达牛乳铁蛋白，在工业生产中不需要分离工艺，复杂的蛋白纯化工艺，利用成本较低的发酵培养基即可进行发酵生产，发酵完毕后收集酵母，即可直接制成酵母干粉制剂作为饲料添加剂应用。

为了降低重组乳铁蛋白的生产成本，简化生产工艺，本研究选择具有絮凝性的野生型酿酒酵母ABXL-1D整合表达乳铁蛋白，但是目前商品化的酿酒酵母整合表达载体大都利用营养缺陷型标记作为筛选标记和整合位点，需要营养缺陷型酿酒酵母作为宿主，并且整合后得到的拷贝数较低。有研究表明，酿酒酵母的rDNA基因也可作为整合位点，并且可使重组蛋白基因的拷贝数提高到50或50以上。本发明构建含有rDNA作为整合位点，G418抗性为筛选标记，酵母强组成型表达启动子PGK为启动子的新型酿酒酵母多拷贝整合表达载体。另外，由于牛乳铁蛋白在所有哺乳动物来源的乳铁蛋白中抗菌活性最高，是人乳铁蛋白抗菌活性的20倍，故将牛乳铁蛋白基因同载体连接后，转化Saccharomyces cerevisiae ABXL-1D，检测S.cerevisiae ABXL-1D表达重组牛乳铁蛋白情况。

有益效果：

1、本发明所述的多拷贝整合表达载体以YIPlac204质粒为骨架，PGK为启动子，G418抗性为筛选标记，rDNA为整合位点，是适用于工业化生产使用的酵母多拷贝整合型表达载体。

2、本发明采用强絮凝性的野生型酿酒酵母作为重组蛋白的宿主菌，并成功表达重组乳铁蛋白。强絮凝性的酿酒酵母菌在工业化生产时，能使分散在培养液中的酵母细胞相互聚集发生凝集，形成絮凝颗粒并沉降，从而有利于酵母细胞同培养液的有效分离，可大大简化生产工艺，降低成本。

3、本发明采用组成型强启动子PGK高效启动重组蛋白的表达，提高了重组的表达率和减去工业化生产时补料控制工艺，简化了操作。

4、本发明首次利用野生型酿酒酵母成功表达牛乳铁蛋白，并且利用生物安全性较高的多拷贝整合表达载体提高牛乳铁蛋白在酿酒酵母基因组中的拷贝数从而提高乳铁蛋白在酿酒酵母中的表达效率，重组牛乳铁蛋白不需纯化就可直接作为饲料添加剂应用。利用该重组牛乳铁蛋白酿酒酵母工程菌进行牛乳铁蛋白的发酵生产，降低牛乳铁蛋白的生产成本，从而为推广牛乳铁蛋白作为饲料添加剂成为饲用抗生素替代品打下良好基础。

附图说明

图1bLF mRNA序列同根据bLF氨基酸序列设计的bLF序列的比对图；

图2多拷贝整合表达载体的构建图；

图3乳铁蛋白基因插入表达载体；

其中：1泳道：pYIPLF质粒，2泳道：pYIPLF Not I酶切结果，3泳道：KB ladder Marker。

图4酿酒酵母转化子菌液PCR验证；

其中：1泳道：S.cerevisiae ABXL-1D菌液PCR结果，2泳道：S.cerevisiae ABXL-1D重组转化子菌液PCR结果，3泳道DL2000Marker。

图5重组转化子SDS-PAGE检测蛋白表达情况；

其中：1泳道：Bio-Rad蛋白Marker，2泳道：重组bLF酿酒酵母转化子，3泳道：S.cerevisiaeABXL-1D，4泳道：重组bLF酿酒酵母转化子；图中虚线箭头所指为重组bLF条带。

图6重组转化子Western Blot结果；

其中：1泳道：Bio-Rad蛋白Marker；2泳道：重组bLF酿酒酵母转化子；3泳道：S.cerevisiae ABXL-1D；图中虚线箭头所指为重组bLF条带。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明的内容做进一步的说明，但本发明所保护范围不限于此；

实施例1

乳铁蛋白基因的获得：

由核酸翻译至蛋白质的过程中，不同物种存在着不同的密码子偏爱性。而酿酒酵母和哺乳动物的密码子偏爱性存在较大差异，为了使乳铁蛋白基因能在酿酒酵母中得到比较高效的表达，因此根掘酿酒酵母密码子偏爱性，将从NCBI上查到的牛乳铁蛋白氨基酸序列转换成适合在酿酒酵母中表达的核酸序列，同时还要考虑整个核酸序列的GC含量等问题，避免翻译过程提前终止。设计好的核酸序列同牛乳铁蛋白mRNA进行序列比对，比对结果显示两条核酸序列只有78.9％相似性(图1)，说明酵母菌和哺乳动物牛的密码子偏好性存在较大差异。

将设计好的核酸序列(bLF)两端引入Not I酶切位点后，交山金思特尘物科技有限公司进行人工合成。该公司将合成好的片段插入pUC57中，并进行测序，测序结果反馈序列合成无误。

实施例2

多拷贝整合表达载体的构建(图2)

(I)载体骨架pYB-1的构建：

(i)Bgl片段的扩增：以YIPlac204为模板，引物b1和b2为引物，利用PCR技术扩增Bgl片段并在其两端分别引入Aat II，EcoR I和Bgl II酶切位点。引物序列如下：下划线部分为Bgl II的识别位点，阴影部分为Aat II的识别位点，框架中的序列为EcoR I的识别位点。

引物 b1：5’GACGTCAGATCTATTCTTGCCACGACTCATCTCC  3’：(SEQ ID N0.2)

引物b2：5’

AGATCTGATTCCGATGCTGACTTGCTG  3’：(SEQ ID N0.3)

PCR反应条件为94℃ 2 min，94℃30 sec，60℃30 sec，72℃ 30 sec，循环重复34次，72℃ l0min。PCR得到280 bp大小的DNA片段，将该片段纯化回收后同pGM-T载体连接，转化E.coli TOPl0菌株，涂布含IPTG和x-gal的LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板上，进行蓝白斑筛选挑取白色菌落，摇菌过夜后进行菌液PCR(以菌液为模板，T7和SP6通用引物为引物)得到约460 bp大小片段，即280 hp的Bgl片段再加上载体上T7和SP6引物结合位点间约180 bp的距离。这与预期相符，说明Bgl片段已经同T载体连接成功。

(ii)Bgl片段和YIPlac204的连接：将Bgl片段用Aat II和EcoR I从T载体上酶切下来，切胶回收。载体YIPlac204上有Aat II和EcoR I的酶切位点，将该载体用AatⅡ和EcoR I双酶切后，回收大片段，并将其同酶切过的Bgl片段连接，连接液转化E.coliTOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取若干转化子进行小量质粒制备后，用Bgl II酶切进行验证，得到大小约为2.2 kb的大片段和256 hp的小片段。同预期相符，说明Bgl片段成功同YIPlac204的片段连接成为表达载体的骨架，将其命名为pYB-1。

(II)启动子终止子元件的插入

1.8 kb PGK启动子和终止子片段(PGKp+t)以质粒pMA91为模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR进行PCR扩增得到，反应条件为98 oC 10 sec，61 oC 15 sec，72 oC 120sec，循环重复34次，72 oC 10 min，引物均引入BamH I酶切位点(下划线)，

pgk1：CGCGGATCCAAGCTTTCTAACTGATCTATC(SEQ ID NO.4)和

pgk2：CGCGGATCCCTTTAACGAACGCAGAATTTTGGAG(SEQ ID N0.5)，反应产物大小约为1836bp。

将PCR产物回收后进行末端加A尾反应，然后再同pGM-T连接，连接液转化E.coli TOP10菌株，涂布含IPTG和X-gal的LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板上，进行蓝白斑筛选挑取若干白色菌落，小量制备质粒后用EcoR I进行酶切验证，得到约3051bp的T载体片段和约1836bp的PGKp+t片段，同预期相符说明该片段已插入T载体中。将筛选出的转化子送去测序，测序结果经过序列比对分析，表明PGKp+t片段序列同pMA91质粒上的PGKp+t相同。

利用BamH I和Bgl II为同尾酶的特点，将用BamH I从T载体酶切下来，切胶回收得到的PGKp+t片段同用Bgl II单酶切pYB-1，切胶回收得到的片段连接，连接液转化E.coliTOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取若干转化子进行小量质粒制备后，利用Hind III进行酶切验证。若PGKp+t片段正向插入pYB-1的Bgl II位点，则经Hind III酶切后将得到一条电泳条带，而反向插入则会出现两条带，大小分别约为2230bp和1960bp。选取反向插入的转化子将其命名为pYB-2。

(III)整合位点rDNA单元的插入

酵母基因组中高度重复的rDNA单元，是构建高拷贝整合表达载体同源重组区的首选序列。每个rDNA单元长达9.1kb左右，由5S、5.8S、25S和18S rRNA的转录区及一些非转录区组成。有研究表明，用于介导整合的rDNA区域，不应包含其RNA polymerase I的起始转录区，同时整合于rDNA区域的外源片断大小接近rDNA单元长度时，其在有丝分裂中稳定性最高。根据这一要求，对S.cerevisiae rDNA序列进行分析，确定所需2.2kb片断，其在rDNA单元中的相对位置。该片段含有质粒用于线性转化的Hpa I单酶切位点。

为了减少能赋予细菌氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶编码基因的扩散，增加重组蛋白工程菌作为饲料添加剂的生物安全性，将选择出的rDNA片段从Hpa I处分成两段进行PCR并克隆入pYB-2中，这样就可以在转化酵母时，利用Hpa I线性化载体从而去除β-内酰胺酶编码基因Ampr。

根据这两段rDNA序列设计引物

rDNA1F：CTGCAGTTTCCTCTGGC TTCACCCTATT  (SEQ ID NO.6)，

rDNA1R：CTGCAGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCT  (SEQ ID NO.7)，

rDNA2F：GACGTCACCTAAAACGACCGTACTTGCAT(SEQ ID NO.8)，

rDNA2R：GACGTC GAAACTCACCAGGTCCAGACACA  (SEQ ID NO.9)，

引物均引进酶切位点(Aat II下划线，Pst I阴影)。以酿酒酵母ABXL-1D染色体为模板，上述引物为上下游引物进行PCR扩增rDNA1和rDNA2片段。PCR反应条件为：95℃5min，94℃30sec，61℃30sec，72℃100sec，循环重复34次，72℃10min。PCR反应产物rDNA1和rDNA2的大小分别约为1134bp和1216bp。将rDNA2和pYB-2用Aat II酶切，切胶纯化回收片段后连接，连接液转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取若干转化子进行小量质粒制备后，利用Hind Ⅲ和Hpa I进行酶切验证，酶切后产生三条带，大小分别约为2156bp，1856bp和960bp的转化子为rDNA2片段反向插入pYB-2的转化子，将其命名为pYB-3。

将pYB-3和rDNA1用Pst I酶切，切胶纯化回收片段后连接，连接液转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/ml氨苄青霉素)平板。挑取若干转化子进行小量质粒制备后，利用Hpa I进行酶切验证，酶切后产生两条带，大小分别约为4089bp和2450bp的转化子为rDNA1片段反向插入pYB-3的转化子，将其命名为pYB-4。

(IV)pYB-5的构建

由于G418抗性基因中含有Bgl II位点，因此，PGKp+t片段中的克隆位点Bgl II则不可用，需要另换克隆位点。经过序列分析后，得知载体和bLF上不存在Not I位点，并且Not I在基因组中出现频率低，故将PGKp+t片段的Bgl II位点置换成Not I位点。用于置换酶切位点的Not片段通过PCR得到，该PCR以YIPlac204为模板，两端引入BamH I(下划线)和Not I位点(阴影)的

notF：CGCGGATCCGCGGCCGCATTCTTGCCACGACTCATCTCC  (SEQ ID NO.10)和

notR：CGCGGATCCGCGGCCGCGATTCCGATGCTGACTTGCTG(SEQ ID NO.11)

为引物，条件为：95℃2min，94℃30sec，61℃30sec，72℃30sec，循环重复34次，72℃10min，PCR反应得到大小约为256bp的Not片段。将Not片段用BamHI酶切，pYB-4用Bgl II酶切，纯化回收后连接，连接液转化E.coll TOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取若干转化子进行小量质粒制备后，利用Not I进行酶切验证。挑选释放出约256bp的Not片段的转化子，将其命名为pYB-5。

(v)G418抗性基因的插入

以质粒pUG6为模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR进行PCR扩增得到约1.4Kb的KanMX基因，PCR反应条件为98℃10sec，58℃15sec，72℃120sec，循环重复34次，72℃10min，引物均引入BamH I酶切位点(下划线)，引物序列为：

kanF：GGATCCTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGC  (SEQ ID NO.12)和

kanR：GGATCCATTAAGGGTTCTCGAGAGCTCG  (SEQ ID NO.13)，反应产物大小约为1456bp。

将PCR产物回收后进行末端加A尾反应，然后再同pGM-T连接，连接液转化E.coliTOP10菌株，涂布含IPTG和X-gal的LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板上，进行蓝白斑筛选挑取若干白色菌落，小量制备质粒后用EcoR I进行酶切验证，得到约3051bp的T载体片段和约1472bp的KanMX片段，同预期相符说明该片段已插入T载体中。将筛选出的转化子送去测序，测序结果经过序列比对分析，表明KanMX片段序列同pUG6质粒上的KanMX序列相同。

将KanMX用BamHI从T载体酶切下来，切胶回收后同用Bgl II单酶切pYB-1，切胶回收得到的片段连接，连接液转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取若干转化子进行小量质粒制备后，利用Pst I进行酶切验证。若KanMX正向插入pYB-1的BamH I位点，则经Pst I酶切后将得到三条电泳条带，大小分别为276bp，1200bp和6720bp。选取正向插入的转化子将其命名为pYB-6(pYIP-6)。pYIP-6即为构建完毕的多拷贝整合表达载体。其序列如SEQ ID NO.1所示。

实施例3

多拷贝整合表达载体在表达牛乳铁蛋白中的应用，步骤如下：

(I)将bLF和载体pYIP-6用Not I酶切，切胶回收得到的片段进行连接，连接液转化E.coli TOP10菌株，涂布LB(100μg/mL氨苄青霉素)平板。挑取若干转化子进行小量质粒制备后，利用Not I进行酶切验证(图3)。酶切后，得到大小约为7940bp的载体片段和释放出来大小约为2142bp的bLF片段。将插入bLF的几个转化子送去测序，分析测序结果将反向插入bLF的转化子命名为pYIPLF。

(II)pYIPLF转化酿酒酵母ABXL-1D和含高拷贝bLF转化子的筛选：提取pYIPLF质粒，用Hpa I酶切，切胶回收大片段。将回收得到的大片段加入到80μL酿酒酵母ABXL-1D电转化感受态细胞，将混合物加入0.1cm电击杯中，选取酵母电击参数进行电击，电击时间为3.8ms。电击完后，涂布含200μg/mL G418的YEPD平板，30℃倒置培养2天。挑取平板上转化子接种于500μg/mL G418的YEPD平板，30℃倒置培养2天后，将该平板上的转化子转接至1mg/mL G418的YEPD平板，30℃倒置培养2天后，以同样的程序在2mg/mL和4mg/mL G418的YEPD平板上筛选转化子。抗G418的浓度越高，说明G418在酿酒酵母染色体中的拷贝数就越高，则bLF在酿酒酵母染色体的拷贝数就越高。在4mg/mL G418YEPD平板上菌落较大的转化子为含高拷贝数bLF的酿酒酵母转化子。

(III)重组乳铁蛋白酿酒酵母工程菌的菌液PCR检验：将挑选出来的转化子和空白菌利用冻-煮-冻的方法制备模板，利用根据bLF设计的引物lf1和lf2为引物进行PCR验证。反应条件为：94℃2min，94℃30sec，58℃30sec，72℃30sec，循环重复34次，72℃10min。取10μL PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。转化子PCR得到的片段大约为224bp，符合lf1和lf2之间的距离，而没有经载体转化的空白菌PCR没有得到条带(图4)，说明经筛选得到的转化子基因组中含有bLF，pYIPLF已经整合到S.cerevisiaeABXL-1D基因组中。

(IV)Western Blotting检测重组乳铁蛋白酿酒酵母工程菌表达量：接种转化子于50mL YEPD液体培养基中，30℃200rpm振荡培养48h后，取1mL菌液离心后，用1mL PBS洗涤两次后，用200μL PBS溶解沉淀后，加2×上样缓冲液混匀后，沸水浴10min。取20μL处理液上样SDS-PAGE(图5)。由图5可知，转化子表达一种不在空白菌中表达的蛋白，大小约为78kD，同乳铁蛋白分子量相符，说明乳铁蛋白可能在酿酒酵母转化子中成功表达。为了进一步验证该蛋白是否为乳铁蛋白，我们利用抗牛乳铁蛋白的鼠源一抗和山羊抗鼠的二抗(带碱性磷酸酶)进行Western Blot(图6)。

由图6可知，在75kD的上方转化子中有一条约为78kD的条带，而空白菌中则没有。由此，可以认定牛乳铁蛋白在酿酒酵母中成功得到表达，但是表达量相对较少，这可能与乳铁蛋白分子量相对较大，在S.cerevisiae胞内表达该蛋白有关。

Claims (7)

1.一种多拷贝整合表达载体，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的多拷贝整合表达载体的构建方法，步骤如下：

(1)以YIPlac204为模板，经PCR扩增得到460bp大小的Bgl片段，引物序列如下：

引物b1：5′GACGTCAGATCTATTCTTGCCACGACTCATCTCC  3′，

引物b2：5′GAATTCAGATCTGATTCCGATGCTGACTTGCTG  3′；

PCR反应条件为：94℃2min，94℃30sec，60℃30sec，72℃30sec，循环重复34次，72℃10min；

(2)将步骤(1)制得的Bgl片段经Aat II和EcoR I酶切后与经Aat II和EcoR I酶切载体YIPlac204后得到的大片段用DNA连接酶连接，得到表达载体的骨架，将其命名为pYB-1；

(3)以质粒pMA91为模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR进行PCR扩增得到1836bp的PGK启动子和终止子片段，反应条件为98℃10sec，61℃15sec，72℃120sec，循环重复34次，72℃10min，引物序列如下：

pgk1：CGCGGATCCAAGCTTTCTAACTGATCTATC；

pgk2：CGCGGATCCCTTTAACGAACGCAGAATTTTGGAG；

(4)将步骤(3)制得的PGK启动子和终止子片段经BamH I酶切后与经Bgl II单酶切的pYB-1用DNA连接酶连接，转化E.coli TOP10菌株，涂布LB平板，利用Hind III进行酶切验证，选取出现2230bp和1960bp两条带的转化子，命名为pYB-2；

(5)以酿酒酵母ABXL-1D染色体为模板，进行PCR扩增，得到大小为1134bp的rDNA1片段和大小为1216bp的rDNA2片段；引物序列如下：

rDNA1F：CTGCAGTTTCCTCTGGCTTCACCCTATT，

rDNA1R：CTGCAGCCTGTTTGAGCGTCATTTCCTTCT；

rDNA2F：GACGTCACCTAAAACGACCGTACTTGCAT，

rDNA2R：GACGTCGAAACTCACCAGGTCCAGACACA；

PCR反应条件为：95℃5min，94℃30sec，61℃30sec，72℃100sec，循环重复34次，72℃10min；

(6)将步骤(4)制得的pYB-2和步骤(5)制得的rDNA2分别用Aat II酶切，然后纯化，DNA连接酶连接后，转化E.coli TOP10菌株，涂布LB平板，利用Hind III和Hpa I进行酶切验证，选取酶切后产生大小为2156bp、1856bp和960bp三条带的转化子，将其命名为pYB-3；

(7)将步骤(6)制得的pYB-3和步骤(5)制得的rDNA1分别用Pst I酶切，然后纯化，DNA连接酶连接后，转化E.coli TOP10菌株，涂布LB平板，利用Hpa I进行酶切验证，选取酶切后产生大小为4089bp和2450bp两条带的转化子，将其命名为pYB-4；

(8)以YIPlac204为模板，PCR得到大小为256bp的Not片段，PCR引物序列为：

notF：CGCGGATCCGCGGCCGCATTCTTGCCACGACTCATCTCC，

notR：CGCGGATCCGCGGCCGCGATTCCGATGCTGACTTGCTG；

PCR条件为：95℃2min，94℃30sec，61℃30sec，72℃30sec，循环重复34次，72℃10min； 

(9)将步骤(8)制得的Not片段用BamH I酶切，并与经Bgl II酶切的由步骤(7)制得的pYB-4，纯化后，用DNA连接酶连接，然后转化E.coli TOP10菌株，涂布LB平板，利用Not I进行酶切验证，选取酶切后产生大小为256bp条带的转化子，将其命名为pYB-5；

(10)以质粒pUG6为模板，利用高保真PCR聚合酶primeSTAR进行PCR扩增得到1456bp的KanMX基因，PCR引物序列为：

kanF：GGATCCTAGGTCTAGAGATCTGTTTAGCTTGC，

kanR：GGATCCATTAAGGGTTCTCGAGAGCTCG；

PCR反应条件为98℃10sec，58℃15sec，72℃120sec，循环重复34次，72℃10min；

(11)将步骤(10)制得的KanMX基因用BamH I酶切后与用Bgl II单酶切的pYB-5片段用DNA连接酶连接，然后转化E.coli TOP10菌株，涂布LB平板，利用Pst I进行酶切验证，选取酶切后产生大小为276bp、1200bp和6720bp三条条带的转化子，即为构建完毕的多拷贝整合表达载体。

3.权利要求1所述的多拷贝整合表达载体在表达牛乳铁蛋白中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤如下：

(1)将牛乳铁蛋白基因和多拷贝整合表达载体分别用Not I酶切，然后用DNA连接酶连接后，转化E.coli TOP10菌株，涂布LB平板，利用Not I进行酶切验证，经分析测序，选取反向插入牛乳铁蛋白基因的转化子命名为pYIPLF；

(2)将步骤(1)制得的pYIPLF用Hpa I酶切，回收大片段后，加入到80μL酵母电转化感受态细胞，将混合物电击后，经含有G418的YEPD平板筛选，获得表达牛乳铁蛋白的酵母细胞；

(3)培养步骤(2)制得的表达牛乳铁蛋白的酵母细胞，经干燥，制得牛乳铁蛋白饲料添加剂。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(2)中电转化的电击时间为3.5～4.0ms。

6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，上述步骤(2)中的酵母为具有絮凝性的野生型酿酒酵母ABXL-1D，菌种购自美国ATCC公司。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，上述步骤(3)中的培养条件：在无选择压力的YEPD培养基中28～30℃培养2～3天。 

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