CN105316356A - 微藻多基因共表达载体及多基因共表达微藻 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微藻多基因共表达载体，所述表达载体的开放阅读框，采用Ubi启动子、Nos启动子或Hsp70A启动子；目的基因之间以2A肽序列连接并构建在所述表达载体的一个开放阅读框中。
Description
技术领域
本发明涉及微藻的基因工程领域，尤其是涉及采用小球藻内源性启动子和2A肽来构建高效表达载体，能够在一个表达框中融合多个基因，转化微藻后实现在微藻中共表达多个基因产物。
背景技术
微藻基因工程研究在莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)[1-2]中取得了重要的进展，在三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)[3]、杜氏盐藻(Dunaliellasalina)[4]以及小球藻(Chlorella)[5-6]等微藻上也有了不同程度的研究。目前，普遍用于转化的质粒中表达抗性基因和目的基因启动子是独立的，分别位于不同的表达框里。通过抗性筛选获得的转化藻不能保证目的基因及其表达框架能够同时整合进基因组，也不能保证其表达，因此给进一步的鉴定和筛选带来了较大的困难和工作量。此外，对于表达2个及以上目的基因时，通常需在质粒中同时插入多个表达框，使得质粒骨架变大，对整合效率和目的基因的表达造成了很大的影响。
利用微藻作为新型生物反应器生产高附加值重组蛋白(蛋白疫苗、治疗性抗体、工业酶等)的研究已经进行了多年，与其它表达系统相比，微藻具有以下几点优势：1)成本低，以1g未纯化的蛋白计算，其成本不到用哺乳动物细胞生产的万分之一[7]；2)不会受到病毒和朊病毒的影响，这两者对人体有害，通常由哺乳动物细胞培养引起；3)与细菌和酵母相比，可以进行复杂的蛋白折叠和修饰，如Mamedov等[8]用质谱分析法对莱茵衣藻糖蛋白的N端聚糖模式进行了研究，发现其与哺乳动物细胞相似；4)多数种类的微藻是安全的，即生产的蛋白具有生物相容性，可以不进行纯化。
莱茵衣藻(C.reinhardtii)是真核微藻的模式藻，可以进行自养生长也可以以乙酸钠为碳源进行混养[9]生长，遗传和代谢背景清楚，三种基因组(核、叶绿体和线粒体)都可实现外源基因转化，目前被认为是最有潜力的重组蛋白生产平台[10]。但其面临着一个较大的障碍，即其无论在光自养还是混养培养时的生长速率都较低，培养技术不成熟。
相比较而言，转基因小球藻具有更加明显的优势。小球藻含有丰富的蛋白质、脂类、叶绿素、多糖、维生素、微量元素以及一些生物活性代谢产物，营养成分全面而均衡，因而在保健品、饲料、食品、医药等方面具有巨大的应用价值。与转基因植物相比，小球藻的产量易于控制，与其它微藻如C.reinhardtii相比，小球藻的繁殖速度要快得多，钱峰慧[12]在异养培养蛋白核小球藻时发现该藻可耐受高浓度的葡萄糖，在5L和50L生物反应器中培养90h左右，细胞密度分别可达132.18g/L和149.43g/L。小球藻分离纯化表达产物相对简单，适于规模化生产，且产业化的培养技术已经成熟，小球藻作为食品、营养品等已经被人们广泛认可。这些优点是其它表达系统和微藻所不具备的，作为新一代的生物反应器，有巨大的应用潜力。
蛋白核小球藻与一般的实验室研究用微藻不同，它可高产蛋白质、叶黄素和小球藻生长因子，已于2012年被我国批准为新资源食品。使用独特的异养-稀释-光诱导串联培养平台技术[13](Sequentialheterotrophy-dilution-photoinductioncultivation,SHDP)可以实现其高密度高品质的培养，并已经成功实现了蛋白核小球藻粉的工业化生产，异养培养的平均生长速率达3g/L/d，不低于现有任何其它外源基因表达系统；此外，在合适的户外培养条件下该藻株可快速固定CO2并积累高达40％的油脂[14]，目前已经用作微藻固碳和微藻能源的工业模式藻株进行产业化开发。基于SHDP技术和高产油蛋白核小球藻良种，可实现集“高附加值微藻产品、微藻能源和生物固碳”的一体化开发，有望加快微藻能源和微藻固碳的产业化进程。蛋白核小球藻表达系统的研究和开发在微藻能源、微藻固碳、废水处理、生物医药、酶制剂、饲料(饵料)添加剂等工业生物技术领域具有极其重要的应用价值，但迄今未见有关该藻遗传改造方面的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用于微藻的多基因共表达的载体，尤其是采用了小球藻内源性的启动子和具有自我剪切功能的2A肽。
本发明提供了一种微藻多基因共表达载体，所述表达载体的开放阅读框，采用Ubi启动子(Ubiquitin启动子)、AR启动子、Nos启动子或Hsp70A(热激动蛋白70A启动子)启动子；目的基因之间以2A肽序列连接并构建在所述表达载体的一个开放阅读框中。上述的启动子可为内源性的或来源自高等植物。所述的表达载体具有其他载体的通用的复制原点基因和抗性基因，或者无通用的抗性基因，其抗性基因构建入开放阅读框中,与目的基因一同表达。
其中，优选地，所述Hsp70A启动子和AR启动子与目的基因之间构建有Kozak序列GCCACC。
其中，优选地，所述的开放阅读框，采用Hsp70A启动子；Hsp70A为蛋白核小球藻内源性启动子，其序列如SEQIDNO:1所示。
优选地，所述的2A肽选自但不限于F2A(肽Footandmouthdiseasevirus2A)、T2A肽(Thoseaasignavirus)、P2A肽(Porcineteschovirus-12A)和E2A肽(Equinerhinitis2A)。
进一步优选地，所述的F2A肽基因序列如SEQIDNO:2所示；所述的T2A肽基因序列如SEQIDNO:3所示；所述的P2A肽基因序列如SEQIDNO:4所示；所述的E2A肽基因序列如SEQIDNO:5所示。
上述表达载体选自pGreen0000、pGreen0029、pBIN19、pBI121、pBI221、pBluescriptSK/KS的重组构建载体。
其中，优选地，所述的表达载体的开放阅读框的终止子为Nos终止子
本发明另一方面涉及构多基因共表达微藻，含有上述的构建有抗性基因和目的基因的多基因共表达载体。
其中，所述的微藻藻种选自蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)和小球藻(Chlorellazofingiensis)。
其中，优选地，所述的抗性基因选自但不限于ble基因(博来霉素抗性基因)、nptII基因(遗传霉素抗性基因)和hpt基因(潮霉素抗性基因)。
进一步优选地，在构建上述多基因共表达微藻，选用电穿孔法、基因枪法和玻璃珠法，优选地，选用电穿孔法。
本发明提供的载体利用具有自身剪切功能的2A肽，可以实现一个开放阅读框中表达多个目的基因的效果，与其他共表达的策略相比具有更具明显的优势。
附图说明
图1为现有载体的开放表达框的结构示意图；
图2为本发明所述载体的开放表达框的结构示意图；
图3为本发明中涉及的pGreenII0000-NosT重组质粒的构建流程图；
图4为本发明涉及的pGreenII0000-NptII-P2A-EGFP-NosT重组质粒的构建流程图；
图5为本发明涉及的pGreenII0000-Ubi(AR、Hsp)-NptII-P2A-EGFP-Nos重组质粒的构建流程图；
图6为不同类型启动子的载体转化的小球藻的培养效果图；其中，00ARNPE为pGreenII0000-AR-NptII-P2A-EGFP-Nos重组载体，00UbiNPE为pGreenII0000-Ubi-NptII-P2A-EGFP-Nos重组载体，00HspNPE为pGreenII0000-Hsp-NptII-P2A-EGFP-Nos重组载体，00NNPE为pGreenII0000-Nos-NptII-P2A-EGFP-Nos重组载体
图7为不同类型启动子的载体转化的小球藻的荧光显微镜观察图。其中,DIC为微干涉相差显微结果，TxRed为红色荧光显微结果；FITC为绿色荧光显微结果；TxRed-FITC为红色荧光和绿色荧光共同显微结果。Y代表野生型,HSP7代表编号为7的Hsp70A启动子转化株，Hsp10代表编号为10的Hsp70A启动子转化株,Ubi2代表编号为2的Ubi启动子转化株，AR4代表编号为4的AR启动子转化株。
具体实施方式
参照说明书附图，对本发明的具体实施例作出进一步详细说明，但不限于以下实施例所述的技术方案。
实施例1
pEASY-F2A、P2A、T2A重组质粒的构建
根据F2A、P2A、T2A三种2A肽的氨基酸序列及蛋白核小球藻内源密码子偏好性[8]设计其核苷酸序列，分别设计2段有重复约20bp的上下游引物，分别为F2A1、F2A2、P2A1、P2A2、T2A1、T2A2，用融合PCR法合成完整的序列，回收纯化后连接到pEASY-Blunt克隆载体，用M13引物做PCR鉴定单菌落，提取质粒后测序验证。所用引物如下：
表12A肽融合时所用引物
实施例2
pGreenII0000-NosT重组质粒的构建
参照图3所示，用分别含NotI和SacI酶切位点的Nos终止子上下游引物NosT-F/R和高保真酶Pfu聚合酶从pGreenII0029质粒中克隆出Nos终止子片段。用SpeI和NotI双酶切pGreenII0000质粒和Nos终止子片段，分离纯化Nos终止子片段和线性化的pGreenII0000质粒，然后用T4DNA连接酶过夜连接，得到pGreenII0000-NosT重组质粒，转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞，用00F和00R引物做PCR鉴定单菌落，并提取质粒测序验证。所用引物如下：
表2构建pGreenII0000-NosT重组质粒时所用引物
实施例3
pGreenII0000-NptII-P2A-EGFP-NosT重组质粒的构建
参照图4所示，首先分别用NptIIBamF和NptIIP2AR引物克隆出NptII基因片段(新霉素磷酸转移酶)、P2ANptIIF和P2AEGFPR引物克隆出P2A片段、EGFPP2AF和EGFPNotR引物克隆出EGFP片段，其中NptIIP2AR和P2ANptIIF引物为反向互补序列，含有18bp的NptII基因末端序列和18bp的P2A基因前端序列，P2AEGFPR和EGFPP2AF引物为反向互补序列，含有18bp的P2A基因末端序列和19bp的EGFP基因前端序列以及SpeI酶切位点序列。回收纯化3个基因片段后用重组PCR法将3个片段连接起来，得到NptII-P2A-EGFP序列，再用NptIIBamF和EGFPNotR引物扩增此序列，回收纯化后连接pEASY-Blunt克隆载体，用M13引物做PCR鉴定单菌落，提取质粒后测序验证。
分别用BamHI和NotI双酶切pGreenII0000-NosT重组质粒和pEASY-NptII-P2A-EGFP重组质粒，分离纯化NptII-P2A-EGFP基因片段和线性化的pGreenII0000-NosT质粒，然后用T4DNA连接酶过夜连接，得到pGreenII0000-NptII-P2A-EGFP-NosT(简称00NPE)重组质粒，转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞，用00F和00R引物做PCR鉴定单菌落，并提取质粒测序验证。上述使用的引物如下：
表3构建pGreenII0000-NptII-P2A-EGFP-NosT重组质粒时所用引物
实施例4：
参照图5所示，pGreenII0000-Ubi(AR、Hsp)-NptII-P2A-EGFP-Nos重组质粒的构建
1)pGreenII0000-Ubi-NptII-P2A-EGFP-Nos(简称00UbiNPE)重组质粒的构建
分别用HindIII和BamHI双酶切pGreenII0029-Ubi-EGFP-Nos重组质粒和pGreenII0000-NptII-P2A-EGFP-Nos重组质粒，分离纯化Ubiquitin启动子基因片段和线性化的pGreenII0000-NptII-P2A-EGFP-Nos重组质粒，然后用T4DNA连接酶过夜连接，得到pGreenII0000-Ubi-NptII-P2A-EGFP-Nos重组质粒，转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞，用00F和UbiR引物做PCR鉴定单菌落，并提取质粒测序验证。
2)pGreenII0000-AR-NptII-P2A-EGFP-Nos(简称00ARNPE)重组质粒的构建
用含HindIII位点的上游引物ARhinF和含BamHI位点的下游引物ARbamR从pMS188质粒中克隆出AR启动子基因片段，其中下游引物ARbamR中添加有助于翻译起始的Kozak序列“GCCACC”。之后操作与00UbiNPE质粒构建相同，用00F和ARbamR引物做PCR鉴定单菌落，并提取质粒测序验证。
3)pGreenII0000-Hsp-NptII-P2A-EGFP-Nos(简称00HspNPE)重组质粒的构建
用含HindIII位点的上游引物HsphinF和含BamHI位点的下游引物HspbamR从蛋白核小球藻基因组DNA中克隆出Hsp70A启动子基因片段，其中下游引物HspbamR中添加有助于翻译起始的Kozak序列“GCCACC”。回收纯化后连接到pEASY-Blunt克隆载体，测序验证后提取质粒，之后操作与00UbiNPE质粒构建相同，用00F(表2)和HspbamR引物做PCR鉴定单菌落，并提取质粒测序验证。
上述实验所用的引物如下，
表4，构建pGreenII0000-Ubi(AR、Hsp)-NptII-P2A-EGFP-Nos重组质粒时所用引物
实施例5
pGreenII0000-NosP-NptII-F2A(P2A、T2A)-EGFP-Nos重组质粒的构建
上述质粒的启动子均为与NptII基因同属于一个表达框下的Nos启动子，Nos-NptII基因片段直接用PCR法从pGreenII0029质粒上克隆获得。分别用含BamHI位点的NosPbF引物和NptIIF2AR(NptIIP2AR、NptIIT2AR)引物克隆出Nos-NptII基因片段、用F2ANptIIF和F2AEGFPR引物克隆出F2A片段、用P2ANptIIF和P2AEGFPR引物克隆出P2A片段、用T2ANptIIF和T2AEGFPR引物克隆出T2A片段，再分别用融合PCR法获得NosP-NptII-F2A(P2A、T2A)基因片段。连接pEASY-Blunt克隆载体，测序验证后提取质粒。
分别用BamHI和SpeI双酶切pEASY-NosP-NptII-F2A(P2A、T2A)质粒和pGreenII0000-Ubi-NptII-P2A-EGFP-Nos重组质粒，分离纯化Nos-NptII-F2A(P2A、T2A)基因片段和线性化的pGreenII0000-EGFP-Nos片段，然后用T4DNA连接酶过夜连接，得到pGreenII0000-Nos-NptII-F2A(P2A、T2A)-EGFP-Nos重组质粒，转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞，用00F和EGFPcxR引物做PCR鉴定单菌落，并提取质粒测序验证。
上述载体构建所用的引物如下，
表5构建pGreenII0000-NosP-NptII-F2A(P2A、T2A)-EGFP-Nos重组质粒所用引物
实施例6：
蛋白核小球藻的电击转化
1)在Endo培养基中接种10％的蛋白核小球藻，30℃、150rpm弱光条件下混养。
2)取1mL处于对数生长期的藻液，4℃下8,000rpm离心3min收集藻细胞，小心吸出上清液，加入1mL的高渗液，用枪头轻轻吹打至混匀，冰浴40min。
3)4℃下8,000rpm离心3min收集藻细胞，小心吸出上清液，加入1mL电击液用枪头轻轻吹打至混匀，用血球板计数法统计细胞密度。
4)用电击液调节细胞密度至5×107个/mL，加入上述质粒(载体00UbiNPE、重组质粒00ARNPE、重组质粒00HspNPE和pGreenII0000-NosP-NptII-F2A(P2A、T2A)-EGFP-Nos重组质粒)、辅助质粒pSoup及鲑鱼精DNA。混匀后取100μL加入2mm电击杯，静置冰浴5min。
5)调节电击参数进行电击，完成后，冰上静置10min，加入200μL含1g/mL葡萄糖的BBM培养基，30℃静置1h。
8)用移液器小心吸出转移至离心管中，4℃下12,000rpm离心2min收集藻细胞。加入150μL含1g/mL葡萄糖的BBM培养基，于无菌的96孔板中恢复培养24h。
9)全部取出，涂布在含G418的SE固体培养基(含1.5％琼脂)上，先30℃避光过夜，后在2klx、16h/8h光暗周期培养，约一周后可见有单藻落长出
转化效率如图6和图7所示；其中，参照图6和图7所示，在3个培养皿中，采用Hsp70A启动子的重组载体(00HspNPE)转化效率最好，采用Ubi启动子的重组载体(00UbiNPE)的转化效率次之。转化效率统计如下表6所示，其中，如下所述的转化效率每个电转化的细胞所产生的转化子数目。
表6启动子Ubi、Hsp70A和Nos的转化效率
| 3,300V/cm** | |
| Ubi | 7.13×10-6 |
| Hsp70A | 9.45×10-6 |
| Nos | 4.39×10-6 |
| no plasmid* | 0 |
*空质粒作为阴性对照。
**转化参数。
本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。
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Claims (11)
1.微藻多基因共表达载体，其特征在于，所述表达载体的开放阅读框，采用Ubi启动子、Nos启动子或Hsp70A启动子；目的基因之间以2A肽序列连接并构建在所述表达载体的一个开放阅读框中。
2.如权利要求1所述的微藻多基因共表达载体，其特征在于，所述的开放阅读框，采用Hsp70A启动子。
3.如权利要求1所述的微藻多基因共表达载体，其特征在于，所述Hsp70A启动子与目的基因之间构建有Kozak序列GCCACC。
4.如权利要求1-3任一项所述的微藻多基因共表达载体，其特征在于，所述的Hsp70A启动子基因来源于蛋白核小球藻，其序列如SEQIDNO:1所示。
5.如权利要求1所述的微藻多基因共表达载体，其特征在于，所述的2A肽选自F2A肽、T2A肽、P2A肽和E2A肽。
6.如权利要求5所述的微藻多基因共表达载体，其特征在于，所述的F2A肽基因序列如SEQIDNO:2所示；所述的T2A肽基因序列如SEQIDNO:3所示；所述的P2A肽基因序列如SEQIDNO:4所示；所述的E2A肽基因序列如SEQIDNO:5所示。
7.如权利要求1所述的微藻多基因共表达载体，其特征在于，所述的表达载体的开放阅读框的终止子为Nos终止子。
8.如权利要求1-7所述的微藻多基因共表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pGreen0000、pGreen0029、pBIN19、pBI121、pBI221或pBluescriptSK/KS的重组构建载体。
9.多基因共表达微藻，其特征在于，含有权利要求1～8任一项所述的构建有抗性基因和目的基因的多基因共表达载体。
10.如权利要求9所述的多基因共表达微藻，其特征是，所述的微藻藻种选自蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、普通小球藻(Chlorellavulgaris)、椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)、小球藻(Chlorellazofingiensis)、小球藻(Chlorellasorokiniana)或小球藻(Chlorellaprotothecoides)。
11.如权利要求9所述的构建多基因共表达微藻的方法，其特征是，所述的抗性基因选自ble基因、nptII基因和hpt基因。
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| CN103173492A (zh) * | 2013-03-12 | 2013-06-26 | 中国人民解放军白求恩国际和平医院 | 携带外源基因的复制型hbv载体、其转染后产生的重组hbv，和相应的制备方法与应用 |
-
2015
- 2015-10-14 CN CN201510662234.7A patent/CN105316356B/zh not_active Expired - Fee Related
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