CN102373189A

CN102373189A - 与脂肪酸合成相关的蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN102373189A
Application number: CN2011103508981A
Authority: CN
Inventors: 林祥志; 程汝滨; 李科; 林汝榕; 马瑞娟; 荣辉; 王昭凯; 马涌; 杨善军; 陈水波
Original assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Current assignee: Third Institute of Oceanography SOA
Priority date: 2011-11-08
Filing date: 2011-11-08
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2031-11-08
Also published as: CN102373189B

Abstract

本发明公开了与脂肪酸合成相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的与脂肪酸合成相关的蛋白，是如下1)或2)的蛋白质：1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与脂肪酸合成相关的由1)衍生的蛋白质。将本发明所提供的与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因MCAT转入裂壶藻体内后，转基因藻株的脂肪酸含量较野生型藻株提高了38％以上，说明MCAT基因在裂壶藻的脂肪酸合成过程中发挥了重要的功能，并且该基因的导入并不影响其原本的脂肪酸组成。该基因将在产油微生物及油料作用的基因工程改造中发挥重要作用。

Description

与脂肪酸合成相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中与脂肪酸合成相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

裂壶藻是一种海洋微藻，与硅藻、褐藻等微藻同属Stramenopiles门。裂壶藻的脂肪酸组成简单，DHA含量高，分离纯化简单，是获取天然高浓度DHA的良好资源。

在脂肪酸合成过程中，乙酰辅酶A经乙酰辅酶A羧化酶催化转变为丙二酰辅酶A后，生物体内的一系列脂肪酸合成酶就以丙二酰辅酶A为底物，继续进行脂肪酸的合成。丙二酰辅酶A在丙二酰辅酶A：酰基载体蛋白转酰基酶(MCAT)的催化作用下，将丙二酰辅酶A上的丙二酸基团转移到完全酰基载体蛋白(ACP)末尾的硫醇上，形成丙二酰-ACP蛋白复合物(Malonyl ACP)，作为第一步的反应底物参与脂肪酸的合成与延伸。MCAT蛋白在脂肪酸的体内合成过程中发挥了重要的功能，研究结果表明，在生物体内MACT蛋白对于脂肪酸合成是必须的。在裂壶藻体内，不饱和脂肪酸DHA的合成是通过一种全新的PKS合成途径调控的，该途径不需要多种脱氢酶和碳链延长酶的参与，而是由一个类似聚酮合成酶(PKS)的基因簇控制的，MCAT基因在裂壶藻的PKS合成途径中发挥了重要的功能，为该途径的合成提供必须的前提物质。此外，MCAT还涉及到生物体内聚酮类化合物的生物合成，MCAT与酰基载体蛋白(ACP)、聚酮合酶和链长因子异质二聚体一起，组成了II型聚酮的多聚乙酰合酶。MACT蛋白被认为是连接生物体内脂肪酸合成与聚酮合成之间的关键蛋白。因此，裂壶藻MACT蛋白基因的克隆与功能研究，将有助于进一步的阐明裂壶藻体内的DHA合成途径的机制，并且对产油微生物及油料作用的基因工程改造具有重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供与脂肪酸合成相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与脂肪酸合成相关的蛋白，名称为MCAT，来源于裂壶藻(Schizochytrium sp.)TIO1101，是如下1)或2)的蛋白质：

1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

2)将序列表中序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与脂肪酸合成相关的由1)衍生的蛋白质。

上述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因(命名为MCAT基因)也属于本发明的保护范围。

所述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因：

1)其核苷酸序列是序列表中的序列1；

2)在严格条件下与1)的基因杂交且编码所述蛋白的基因；

3)与1)或2)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中序列1由1176个碱基组成，其开放阅读框为序列表中序列1自5’端第1位至第1176位碱基，编码具有序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列2由391个氨基酸残基组成。

扩增所述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围；

所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列6所示，另一条引物序列如序列表中序列7所示。

含有所述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述表达盒是由启动子TEF1、权利要求2或3所述编码基因和终止子CYC1依次连接而成；

所述启动子TEF1的核苷酸序列如序列表中序列3所示；

所述终止子CYC1的核苷酸序列如序列表中序列4所示。

所述重组表达载体为在双元载体pCAMBIA2301的多克隆位点间插入所述表达盒得到的重组表达载体。

所述重组表达载体为在酵母表达载体pYES2.0的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体。

所述重组菌为将所述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因导入宿主菌得到的重组菌；所述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入宿主菌中；所述宿主菌为裂壶藻(Schizochytrium sp.)TIO1101CGMCC No.4603。

裂壶藻(Schizochytrium sp.)TIO1101CGMCC No.4603已在中国专利公报中公布，公布日为2011年09月28日，公布号为CN 102188541A。

所述重组菌为将所述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因导入宿主菌得到的重组菌；所述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入宿主菌中；所述宿主菌为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)尿嘧啶营养缺陷型菌株INVSc1。

所述与脂肪酸合成相关的蛋白、所述与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因、所述表达盒、所述重组表达载体、所述转基因细胞系或所述重组菌在合成脂肪酸中的应用也属于本发明的保护范围。

将本发明所提供的与脂肪酸合成相关蛋白的编码基因MCAT转入裂壶藻体内后，转基因藻株的脂肪酸含量较野生型藻株提高了38％以上，说明MCAT基因在裂壶藻的脂肪酸合成过程中发挥了重要的功能，并且该基因的导入并不影响其原本的脂肪酸组成。该基因将在产油微生物及油料作用的基因工程改造中发挥重要作用。

附图说明

图1为裂壶藻MCAT基因在大肠杆菌体内诱导表达及纯化结果。

图2为裂壶藻MCAT基因对酿酒酵母生物量的影响结果。

图3为裂壶藻MCAT基因对酿酒酵母脂肪酸组成及含量的影响结果。

图4为重组质粒pCAMBIA2301-MCAT的结构示意图。

图5为裂壶藻基因工程藻株中MCAT基因的mRNA表达水平检测结果。

图6为裂壶藻MCAT基因对裂壶藻生物量的影响结果。

图7为裂壶藻MCAT基因对裂壶藻脂肪酸含量的影响结果。

图8为裂壶藻MCAT基因对裂壶藻脂肪酸组成的影响结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、裂壶藻MCAT编码基因的克隆及其功能验证

一、裂壶藻MCAT编码基因的克隆

根据裂壶藻的EST文库中MCAT基因的部分序列信息，利用已经建立的裂壶藻EST文库，通过序列比对分析获得了丙二酰辅酶A酰基载体蛋白转酰基酶(Malonyl-CoA：acyl carrier protein transacylase，MCAT)的部分序列，在MCAT基因的两侧设计反向引物Reverse-MCAT-F/Reverse-MCAT-R，引物序列如下：

Reverse-MCAT-F：5’-AAGTAAATGTGACGATGCTGAAGC-3’，

Reverse-MCAT-R：5’-ATGGAATGGTGCAGAAACTCTTAG-3’。

提取裂壶藻(Schizochytrium sp.)TIO1101CGMCC No.4603(该裂壶藻已在中国专利公报中公布，公布日为2011年09月28日，公布号为CN 102188541A)的基因组，以常规的8种限制性内切酶(EcoRI，HindIII，EcoRV，PstI，BglII，XhoI，KpnI，BamHI)对裂壶藻基因组进行酶切后，利用T4DNA连接酶对酶切基因组进行环化处理，以环化后的裂壶藻基因组为模板，利用Reverse-MCAT-F/Reverse-MCAT-R引物进行反向PCR扩增，具体的PCR扩增程序如下：94℃预变性5min，然后经30个循环(94℃30s、60℃1min、72℃5min)，72℃10min。

裂壶藻(Schizochytrium sp.)TIO1101CGMCC No.4603，以下简称裂壶藻S.TIO1101。

结果表明：以HindIII的酶切环化产物为模板的PCR产物条带单一，且大小大于2000bp，故利用HindIII的酶切环化产物为模板扩增获得的PCR产物进行测序，获得裂壶藻MCAT基因的侧翼未知序列，结合MCAT的部分已知序列，获得MCAT基因的全基因组序列。

将MCAT基因的基因组序列利用软件Genescan软件进行预测，以去除其中可能的内含子序列，结果表明MCAT基因的基因组序列中，不存在内含子，获得了MCAT的理论编码基因序列。

根据MCAT的理论编码基因序列，设计引物MCAT-F/MCAT-R扩增MCAT基因的全长序列，引物序列如下：

MCAT-F：ATGCGGACGTCGATTCTTG，

MCAT-R：TTACATTATATCTGAAAAA。

提取裂壶藻S.TIO1101的总RNA后，以随机引物进行反转录，获得裂壶藻S.TIO1101的cDNA。以裂壶藻S.TIO1101的cDNA为模板，利用引物MCAT-F/MCAT-R扩增MCAT基因序列，具体的PCR反应条件如下：94℃预变性5min，然后经30个循环(94℃30s、58℃1min、72℃2min)，72℃10min。将PCR产物连接至pMD18-T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司，产品目录号为：D101A)中，获得载体pMD-MCAT，测序后获得了具有完整编码区的裂壶藻MCAT的基因序列，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，其序列信息与理论预测结果完全一致。

裂壶藻MCAT基因的cDNA序列全长为1176bp，其开放阅读框为序列表中序列1自5’端第1位至第1176位碱基，编码具有序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列2由391个氨基酸残基组成。

二、裂壶藻MCAT基因功能验证

1、裂壶藻MCAT基因的体外表达

以质粒pMD-MCAT为模板，利用引物BamHI-MCAT-F/EcoRI-MCAT-R引物，扩增获得两侧带有BamHI/EcoRI酶切位点的裂壶藻MCAT基因的全长序列。将PCR扩增产物利用BamHI/EcoRI进行双酶切，回收目的片段；同时用BamHI/EcoRI对表达载体pGEX-6P-1(购自通用电气医疗集团，GE Healthcare Life Sciences，产品目录号为28-9546-48)进行双酶切，回收载体中较大的片段，将回收的目的片段与载体大片段进行连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5a(购自Invitrogen，产品目录号为18263-012)中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pGEX-6P-1的BamHI和EcoRI酶切位点间插入了序列表中序列1所示的裂壶藻MCAT基因片段，证明质粒构建正确，将重组载体命名为pGEX-MCAT。

其中引物序列如下：

BamHI-MCAT-F：CGGGATCCATGCGGACGTCGATTCTTG(序列表中序列6)，

EcoRI-MCAT-R：GGAATTCTTACATTATATCTGAAAAA(序列表中序列7)。

将重组载体pGEX-MACT转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自Invitrogen，产品目录号为C6000-03)中，挑取菌落接种至含有氨苄青霉素的LB培养基(100ug/ml)中，置37℃摇床过夜培养。过夜菌按1％接种量接种于新鲜的含有氨苄青霉素的LB培养基中，在37℃，200rpm的情况下，培养至OD为0.6-0.8，加入终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，于不同的时间(0小时、3小时、6小时)取样，离心收集菌体，进行电泳检测蛋白表达情况。

结果：检测结果见图1(图1中，泳道M为Marker；泳道1为诱导0小时；泳道2为诱导3小时；泳道3为诱导6小时；泳道4为经GST纯化后的目的蛋白)，从图中可见，在加入IPTG诱导3小时后，即可检测到明显的电泳条带(70Kda)。增加诱导时间(诱导6小时)后，电泳检测目标蛋白的含量无显著增加。此结果表明，克隆获得的裂壶藻MCAT基因能够在大肠杆菌体内成功的获得表达。

将诱导3小时后的菌体离心收集后，利用Lysis buffer重悬菌体后，于-80℃冰箱中静止1小时，对细胞壁进行预处理。其中Lvsis buffer的组成为：Tris 6.057g/L，EDTA-2Na·2H₂O 1.86g/L，NaCl 5.84g/L，DTT 0.77g/L，PMSF 0.17g/L，Triton X-10010ml/L；pH 8.0。

将菌体取出后，在冰浴中超声破碎至澄清，将裂解的菌液用12000rpm，4℃离心15min，收集上清。利用预冷的平衡缓冲液PBS平衡GST纯化柱10个柱体积后，将上述超声破碎后的上清液加入GST纯化柱，利用PBS缓冲液充分洗涤后，再用洗脱缓冲液洗脱约10-15个柱体积，收集洗脱液进行电泳检测。

其中PBS缓冲液的组成如下：

NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄1.44g/L，KH₂PO₄0.24g/L；pH 7.4；

洗脱缓冲液的组成如下：

Tris 6.057g/L，还原型谷胱甘肽3.08g/L；pH 8.0；

电泳结果检测如图1所示，从图中可见，通过GST纯化柱获得了纯度较高的重组蛋白，通过电泳检测其大小约为70Kda，与理论预测分子量一致，进一步说明成功克隆获得了裂壶藻的MCAT基因。

2、裂壶藻MCAT基因在酵母中的功能研究

为了进一步的验证裂壶藻MCAT基因的功能，将上述获得的引入BamHI/EcoRI酶切位点的裂壶藻MCAT基因的全长序列用BamHI/EcoRI酶切位点进行双酶切，回收目的片段；同时用BamHI/EcoRI对酵母表达载体pYES2.0(购自Invitrogen公司，产品目录号为V82520)进行双酶切，回收载体大片段，将回收的目的片段与载体大片段连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5a(购自Invitrogen公司，产品目录号为18263-012)中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在酵母表达载体pYES2.0的BamHI和EcoRI酶切位点间插入了序列表中序列1所示的裂壶藻MCAT基因片段，证明质粒构建正确，将重组载体命名为pYES-MACT。

将该质粒转入酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)尿嘧啶营养缺陷型菌株INVSc1(购自Invitrogen公司，产品目录号为C810-00)，通过尿嘧啶缺陷型选择性培养基筛选阳性克隆子pYES-MCAT，同时以转入质粒pYES2.0的酿酒酵母尿嘧啶营养缺陷型菌株INVSc1作为阴性对照(Control)。

在尿嘧啶缺陷型选择性培养基(购自北京泛基诺科技有限公司，商品名称为Sc-Ura培养基)中，加入棉籽糖作为碳源，以利于外源基因裂壶藻MCAT在酵母细胞中的诱导表达，将过夜培养的酵母菌按照2％的接种量接种于200ml培养基中，28℃诱导3天后，收集菌体，计算干重以及细胞中的脂肪酸组成和含量。利用GC-MS分析脂肪酸组成，根据内标法计算其脂肪酸的含量。

脂肪酸含量测定过程如下：

准确称取待测样品0.1g于50mL比色管中，加入10mL 0.5M KOH-甲醇溶液振摇，使之甲脂化，然后加入10mLV(苯)％V(正己烷)＝1∶1混合溶液萃取，超声振荡40min，加入10mL去离子水，摇匀，静置分层，取上清液于3000rpm下离心5min，移取上清液待测。

GC-MS分析采用安捷伦气相色谱仪(689N0，America)，配有FID氢火焰检测器，HP-IN-NOWxa polyethylene glyeol极性柱(30.0mX0.32mnX0.50um)。柱温采用四列段升温程序：150℃保持1min，150升温至200℃(15℃/min)，200℃升温至250℃(3C℃/min)，250℃保持5min。检测器温度280℃。上样模式：不分流。载气：氮气，20mL/min恒流。

采用毛细管气相色谱内标法测定样品中脂肪酸的含量，以十七烷酸(C17:0)甲酯作为内标物，利用峰面积积分方法对脂肪酸的含量进行定量分析。

结果：裂壶藻MCAT基因对酿酒酵母生物量的影响结果如图2所示；裂壶藻MCAT基因对酿酒酵母脂肪酸组成及含量的影响结果如图3所示，图3中A为裂壶藻MCAT基因对酿酒酵母脂肪酸组成的影响结果，图3中B为裂壶藻MCAT基因对酿酒酵母脂肪酸含量的影响结果。从图中可见，转入裂壶藻MCAT基因的酿酒酵母细胞(pYES-MCAT)中，其生物量为1.18g/L，阴性对照(Control)的生物量为1.04g/L，结果表明，裂壶藻MCAT基因在酿酒酵母细胞INVSc1中表达后能够明显提高其生物量(13％)；利用GC-MS分析脂肪酸组成，表明裂壶藻MCAT基因过表达后不影响酵母细胞的脂肪酸组成。根据内标法计算其脂肪酸含量，转入裂壶藻MCAT基因的酿酒酵母细胞(pYES-MCAT)中，其脂肪酸含量为1.3％，阴性对照(Control)的脂肪酸含量仅为0.85％；利用相对脂肪酸含量的计算方法，以阴性对照(Control)的脂肪酸含量为1，转入裂壶藻MCAT基因的酿酒酵母细胞(pYES-MCAT)的脂肪酸含量为1.53。，结果表明，裂壶藻MCAT基因过表达后，酵母体内的脂肪酸含量提高了50％以上。上述结果表明，裂壶藻MCAT基因能够明显提高酵母细胞的生物量和脂肪酸含量，但是不改变其原来的脂肪酸组成。

实施例2、裂壶藻MCAT基因在提高裂壶藻脂肪酸含量中的应用

一、表达载体的构建

1、丙二酰辅酶A酰基载体蛋白转酰基酶编码基因(MCAT)的克隆

以实施例1构建得到的质粒pMD-MCAT为模板，用EcoRI-MCAT-F和PstI-MCAT-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

EcoRI-MCAT-F：5′-GGAATTCATGCGGACGTCGATTCTTG-3′；

PstI-MCAT-R：5′-AACTGCAGTTACATTATATCTGAAAAA-3′。

PCR反应条件：94℃预变性5min，然后经30个循环(94℃30s、58℃30s、72℃2min)，72℃10min。用限制性内切酶EcoRI和PstI双酶切PCR扩增产物，回收1200bp的酶切产物。同时，用限制性内切酶EcoRI和PstI双酶切克隆载体pBluescript II SK+(购自Stratagene公司，产品目录号为212205)，回收载体骨架(约3000bp)。将上述酶切产物及载体骨架连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5a(购自Invitrogen，产品目录号为18263-012)中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pBluescript II SK+的EcoRI和PstI酶切位点间插入了序列表中序列1第1位-1176位所示的裂壶藻MCAT基因片段，证明质粒构建正确，将重组载体命名为pBS-MCAT。

2、MCAT基因表达模块的构建

(1)以质粒pGAPZαA(购自Invitrogen公司，产品目录号为V205-20)为模板，用TEF-F和TEF-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即组成型启动子TEF1，如序列表的序列3所示。

TEF-F：5′-CCCAAGCTTCCCACACACCATAGCTTC-3′；

TEF-R：5′-GGAATTCGGTTTAGTTCCTCACCTT-3′。

PCR反应条件：95℃预变性5min，然后经30个循环(94℃30s、56℃30s、72℃1min)，72℃10min。

(2)用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

(3)用限制性内切酶HindIII和EcoRI双酶切重组质粒pBS-MCAT，回收载体骨架(约3800bp)。

(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，得到重组质粒pBS-TEF1-MCAT。

(5)以质粒pGAPZαA为模板，用CYC1-F和CYC1-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，即终止子CYC1，如序列表的序列4所示。

CYC1-F：5′-AACTGCAGCACGTCCGACGGCGGCC-3′；

CYC1-R：5′-CGGGATCCAGCTTGCAAATTAAAGCCT-3′。

(6)用限制性内切酶PstI和BamHI双酶切PCR扩增产物，回收酶切产物。

(7)用限制性内切酶PstI和BamHI双酶切重组质粒pBS-TEF1-MCAT，回收载体骨架(约4700bp)。

(8)将步骤(6)的酶切产物和步骤(7)的载体骨架连接，得到重组质粒pBS-TEF1-MCAT-CYC1。

3、重组质粒pCAMBIA2301-MCAT的构建

(1)用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切重组质粒pBS-TEF1-MCAT-CYCl，回收5000bp的酶切产物(MCAT基因的表达模块TEF1-MCAT-CYC1)。

(2)用限制性内切酶HindIII和BamHI双酶切双元载体pCAMBIA2301(购自CAMBIA，Canberra，Australia.)，回收载体骨架(约11600bp)。

(3)将步骤(1)的酶切产物和步骤(2)的载体骨架连接，将连接产物转入大肠杆菌DH5a(购自Invitrogen公司，产品目录号为18263-012)中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pCAMBIA2301的HindIII和BamHI酶切位点间插入了序列表中序列5所示的基因片段(即MCAT基因的表达模块TEF1-MCAT-CYC1)，其中，第1位到479位为组成型启动子TEF1序列，第486位到1661位为MCAT基因序列，第1668位到1985位为终止子CYC1序列，证明质粒构建正确，将重组载体命名为pCAMBIA2301-MCAT。重组质粒pCAMBIA2301-MCAT的结构示意图见图4。

二、农杆菌LBA4404介导裂壶藻的基因转化

1、农杆菌感受态细胞的制备

1)将农杆菌LBA4404(购自Invitrogen，产品目录号为18313-015)在含利福平40ug/ml，链霉素100ug/ml的YEB固体培养基上划线，28℃培养48h；

2)挑取菌落到含利福平40ug/ml，链霉素100ug/ml的YEB液体培养基中28℃培养至OD600为0.5。

3)冰上预冷菌体30min，在4200rpm，4℃离心10min收集菌体。

4)利用1mM的pH 7.0的HEPS洗涤菌体三次，再用10％的甘油洗涤一次后，利用10％的甘油重悬菌体，分装后保存与-80℃。

2、农杆菌转化

将200ng的质粒pCAMBIA2301-MCAT与40ul的农杆菌感受态细胞混合后按以下条件进行电转化：U 1.8kV；R 200Ω；C 25uF。电击完成后，加入900ul预冷的YEB培养基，28℃培养2-3h后，取200ul涂布在含有利福平和链霉素的YEB平板上，28℃倒置培养48h。

3、农杆菌介导的裂壶藻转化

1)裂壶藻原生质体的制备

将裂壶藻S.TIO1101接种于YPD培养基中，28℃摇床中培养过夜。次日按照1％(体积比)的接种量转接入50ml新鲜的液体YPD培养基中28℃培养至对数生长期。以4000rpm的转速4℃离心5min收集藻细胞，利用预冷的无菌水洗涤藻细胞一次后加入10ml酶处理液，28℃摇床中消化5-6小时，显微镜观察裂壶藻形成原生质体的状态，当90％以上裂壶藻细胞转化为原生质体时即可停止消化。

所述酶处理液组成如下：由溶质和溶剂组成；所述溶剂为20mM磷酸盐缓冲液(pH5.8)；所述溶质及其浓度如下：2％(质量百分比)纤维素酶，2％(质量百分比)蜗牛酶和0.7M KCl。

2)农杆菌细胞LBA4404的准备

挑取含有pCAMBIA2301-MCAT质粒的重组农杆菌至液体YEB培养基中，28℃震荡培养至对数生长期，离心收集菌体，利用诱导培养基IM重悬稀释调整农杆菌的浓度为OD600＝0.6-0.8，并加入终浓度为250umol/L的乙酰丁香酮，28℃预诱导4-5小时。

3)裂壶藻的转化

离心收集制备好的的原生质体，用诱导培养基IM重悬后，加入得到的重组农杆菌菌液中，28℃震荡侵染14小时。离心获得藻细胞与菌体混合培养物，涂布于固体YPD筛选培养基中，28℃培养2-3天。挑取固体YPD筛选培养基中的转化子克隆，得到转基因藻株M5和M11。设未转化的裂壶藻S.TIO1101为野生型对照藻株。

同时，用上述方法将空白双元载体DCAMBIA2301转入裂壶藻S.TIO1101中，得到转空载体对照裂壶藻株A1。

4、转基因藻株的鉴定

转基因藻株中MCAT基因的表达水平检测

为了检测转基因藻株中裂壶藻MCAT基因的表达水平，分别提取野生型藻株和转基因藻株M5和M11的总RNA，利用随机引物进行反转录后获得其cDNA，利用半定量引物Q-MCAT-F/Q-MCAT-R进行PCR扩增，检测MCAT基因在mRNA表达水平的变化情况，其中利用18S rRNA基因作为上样对照。

引物Q-MCAT-F/Q-MCAT-R的序列如下：

Q-MCAT-F：5’-GACGTCGATTCTTGCTAGTC-3’，

Q-MCAT-R：5’-GACTAGCAAGAATCGACGTC-3’。

结果如图5所示，从图中可见，转基因藻株的MCAT基因的表达水平较野生型裂壶藻显著提高，M5与M11的MCAT基因的表达水平分别提高了50％和60％，说明MCAT基因已经成功的转入裂壶藻体内，并提高了其在裂壶藻中的表达水平。

5、转基因藻株中生物量及脂肪酸含量的检测

将转基因藻株M5和M11在海水YPD中培养3天，离心收集藻体后进行冷冻干燥，计算其生物量，取1g干藻粉利用Bligh-Dyer方法提取脂肪酸，计算其脂肪酸含量，并利用GC-MS分析转基因藻株的脂肪酸组成，分析条件与实施例1中相同，其中野生型裂壶藻作为对照。

结果：裂壶藻MCAT基因对裂壶藻生物量的影响结果如图6所示；裂壶藻MCAT基因对裂壶藻油脂含量的影响结果如图7所示。从图6中可见，将裂壶藻MCAT基因转入裂壶藻体内后，转基因藻株M5的生物量为14.38g/L，转基因藻株M11的生物量为14.56g/L，野生型裂壶藻的生物量为13.45g/L；转基因藻株M3和M11较野生型裂壶藻略微提高，分别提高了6.8％和8.2％。从图7中可见，转基因藻株M5的油脂含量为59.2％，转基因藻株M11的油脂含量为61.1％，野生型裂壶藻的油脂含量为42.6％；与野生型裂壶藻相比，转基因藻株M5与M11的油脂含量显著提高，分别比野生型裂壶藻的油脂含量提高了38％和43％，并且GC-MS分析结果表明转基因裂壶藻的脂肪酸组成与野生型裂壶藻类似(图8)，其中DHA的含量在43％左右。转空载体对照裂壶藻株A1的生物量和油脂含量均与野生型裂壶藻无显著差异。上述结果表明，裂壶藻中的MCAT基因在裂壶藻的脂肪酸合成过程中发挥了重要的功能，并且该基因的导入并不影响其原本的脂肪酸组成。