CN110878289B

CN110878289B - 一种脂肪酶及其应用

Info

Publication number: CN110878289B
Application number: CN201911368004.4A
Authority: CN
Inventors: 毛相朝; 高坤鹏; 孙建安; 王玉明; 薛长湖
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2019-12-26
Filing date: 2019-12-26
Publication date: 2020-10-30
Anticipated expiration: 2039-12-26
Also published as: CN110878289A

Abstract

本发明公开了属于功能酶筛选技术领域的一种脂肪酶及其应用。本发明的脂肪酶氨基酸序列为SEQ ID NO:1，本发明还提供重组宿主，用于重组表达上述的脂肪酶。本发明的脂肪酶用于催化鱼油水解反应获得富集DHA/EPA的甘油酯。本发明的脂肪酶具有一定的脂肪酸选择性和甘油骨架位置选择性，可催化鱼油甘油酯组分中饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的优先水解，从而使甘油骨架上的EPA/DHA含量升高，36h内即可使鱼油中EPA/DHA含量从17.5％提升至41.3％，达到原始含量的2.36倍。同时，该脂肪酶还表现出了位置选择性，可以得到56.66％EPA/DHA含量的sn‑2位甘油单酯，这种形式的DHA甘油酯最容易被人体吸收。

Description

一种脂肪酶及其应用

技术领域

本发明属于功能酶筛选技术领域，具体涉及一种脂肪酶的异源表达及其在富集EPA/DHA甘油酯中的应用。

背景技术

二十碳五烯酸(EPA，eicosapentaenoic acid)和二十二碳六烯酸(DHA，docosahexaenoic acid)是广泛存在于海洋鱼油中的多不饱和脂肪酸，具有防治心血管疾病、治疗糖尿病、抑制肿瘤细胞等多种用途。鱼油中EPA/DHA的主要存在形式为甘油酯型，利用脂肪酶(Lipase，EC 3.1.1.3)的特异催化活性，可以对其进行高效富集和制备。根据催化反应类型，利用脂肪酶制备EPA/DHA甘油酯的方法分为三种，选择性水解法、酯交换法和酯化法。

由于选择性水解法可以直接对来源广泛的天然鱼油进行处理，且水解反应在水相体系中即可进行，仅在提取产物时才需要使用一些低毒的有机溶剂，因此，利用脂肪酶的选择性水解作用来去除鱼油甘油酯骨架上的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸，实现EPA/DHA在甘油骨架上的富集是一条成本相对较低的技术路线。目前的报道中，选择性水解法可以使鱼油中EPA/DHA含量达到原始含量的1.5-2.5倍，但大部分相关研究所用脂肪酶为商业化酶，或者是用毕赤酵母作为表达系统，得到的新型脂肪酶，但是赤酵母表达系统较为复杂，培养周期长。目前没有利用枯草芽孢杆菌表达系统获得高效脂肪酶并对鱼油水解反应进行尝试的报道。

发明内容

本发明的目的为提供一种新型脂肪酶，以及利用该脂肪酶的水解活性催化鱼油中甘油酯的选择性水解，从而实现DHA/EPA富集的方法，从而丰富现有技术，为本研究领域提供更多的参考，也为工业应用提供更多的选择。

本发明提供一种脂肪酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白：

1)自序列表中SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；

2)将自序列表中的SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有脂肪酶活性的蛋白质。

所述脂肪酶的基因序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

本发明还提供了所述脂肪酶的基因载体，优选地，所述基因载体为pP43NMK(+)。

本发明还提供了所述脂肪酶的基因载体的工程菌，优选地，所述基因载体的工程菌为枯草芽孢杆菌WB800。

本发明还提供了所述脂肪酶在催化鱼油水解反应获得富集DHA/EPA的甘油酯中的应用。

优选地，所述脂肪酶的最适温度为30℃，最适pH值为9.0-10.0。

有益效果：本发明的脂肪酶具有一定的脂肪酸选择性和甘油骨架位置选择性，可催化鱼油甘油酯组分中饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸的优先水解，从而使甘油骨架上的EPA/DHA含量升高，36h内即可使鱼油中EPA/DHA含量从17.5％提升至41.3％，达到原始含量的2.36倍。同时，该脂肪酶还表现出了位置选择性，可以得到56.66％EPA/DHA含量的sn-2位甘油单酯，这种形式的DHA甘油酯最容易被人体吸收。

附图说明

图1为本发明的脂肪酶Lip6进化树分析及多重序列比对示意图。

图2为本发明酶学性质研究图，其中图a是脂肪酶Lip6的最适温度，图b是脂肪酶Lip6的温度稳定性，图c是脂肪酶Lip6的最适pH，图d是表面活性剂对脂肪酶Lip6活性的影响。

图3为本发明脂肪酶催化鱼油水解反应及多不饱和脂肪酸富集效果图，其中图a为TLC结果图，图b为将水解后的鱼油甘油酯部分甲酯化后的气相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1全基因组测序的脂类水解酶片段的克隆表达

对本实验筛选出来的浅紫色链霉菌(Streptomyces violascens)进行全基因组测序后，通过序列预测分析，找到一些具有假定脂肪酶活性的片段。挑选部分脂肪酶片段(lip1，lip2，lip3，lip4，lip5，lip6，lip7，lip8，lip9)进行异源表达，载体使用pP43NMK(+)，宿主采用枯草芽孢杆菌WB800。

对上述脂肪酶工程菌进行发酵培养，发酵结束后，取发酵液上清用于长链底物特异性水解功能的验证，以pNPP为底物进行酶活检测。

实施例2脂肪酶Lip6基因序列分析

脂肪酶Lip6的家族分类，使用文献已报道的方法来进行，使用MEGA 6.0软件构建Lip6与其他家族脂类水解酶的进化树，Clustal X软件用于对脂类水解酶进行多序列比对，ESPript 3.0(http://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/)用于比对序列的输出。如图1a所示，脂肪酶Lip6属于脂类水解酶第V家族，并具有典型的催化三联体Ser(212位)，Asp(354位)，His(385位)(图1b)。经GenBank数据库比对，与该酶比较相似的片段均未报道，最低相似度为76％。

实施例3脂肪酶Lip6酶学性质研究

(1)脂肪酶Lip6最适温度

脂肪酶Lip6的最适温度，通过在不同温度(20,25,30,35,40,45,50,55℃)下孵育反应，并检测吸光值A₄₀₅来确定。最适温度下的活性定义为100％，其他温度下的活性以对最高活性的百分比表示。由结果(图2a)可以看出，温度<30℃时，随着温度的升高，脂肪酶活性逐渐升高，温度>30℃后，随着温度升高，脂肪酶活性逐渐降低，Lip6的最适温度为30℃。

(2)脂肪酶Lip6的温度稳定性

由于脂肪酶的最适温度为30℃，选用30℃,35℃,40℃,45℃,50℃,55℃几个温度进行温度稳定性的测定，通过在不同温度(20,25,30,35,40,45,50,55℃)下孵育脂肪酶，并定时取样测定脂肪酶的残余酶活。将每个温度孵育时间为0h下的活性定义为100％，其他时间下的活性以对最高活性的百分比表示。由结果(图2b)可以看出，在40℃水浴96h后仍能保留76％的酶活；当温度高于55℃时，酶活开始快速下降，48h时已经基本完全失活。总的来说，虽然Lip6对通用底物最适温度较低，但它是一个对温度比较稳定的脂肪酶。

(3)脂肪酶Lip6最适pH

pH对脂肪酶Lip6活性的影响，使用不同pH的不同缓冲液来检测。该过程使用的缓冲液包括：100mM柠檬酸缓冲液(pH 4.0-6.0)，100mM磷酸钠缓冲液(pH 6.0-8.0)，100mMTris-HCl缓冲液(pH 8.0-9.0)和100mM甘氨酸-NaOH缓冲液(pH 9.0-10.0)。最适pH下的活性定义为100％，其他pH下的活性以百分比来表示。结果(图2c)显示，Lip6在pH为9.0的甘氨酸-NaOH缓冲液中显示出最高的水解活性，并且较之酸性条件，脂肪酶Lip6在碱性条件下显示出更高的水解活性，说明Lip6属于一个典型的碱性脂肪酶。

(4)表面活性剂对脂肪酶Lip6活性的影响

为了检测表面活性剂对脂肪酶Lip6的影响，我们通过向反应液中添加不同的表面活性剂(终浓度0.5％)来测定，其中使用的试剂包括：SDS，Triton X-100，Span 20，Span80，Tween 20，Tween 60和Tween 80。反应液中未添加表面活性剂时测得的活性定义为100％，添加了表面活性剂的以百分比表示。结果(图2d)表明，与未添加表面活性剂的样品对比，Span 20能较好地保留脂肪酶的活性，曲拉通对酶活有一定程度的抑制作用，而其余几种表面活性剂都大大降低了酶活。

(5)金属离子对酶活的影响

金属离子对脂肪酶Lip6活性的影响，通过向反应体系中添加终浓度为1mM和10mM的金属离子(Zn²⁺，Ca²⁺，Fe³⁺，K⁺，Mg²⁺，Mn²⁺，Ba²⁺，Co²⁺，Cu²⁺，Ni²⁺)以及Na₂-EDTA来测定。未添加金属离子和Na₂-EDTA的作为对照，其活性定义为100％，结果如表1所示。

表1

由表1可看出，在1mM金属离子浓度下，Ca²⁺，Fe³⁺，Mg²⁺，Ba²⁺对酶活有比较明显的提高作用，Mg²⁺将酶活提高了40％。EDTA-Na₂显著抑制了酶活，表明酶的活性中心可能存在金属离子，Zn²⁺，Mn²⁺，Co²⁺对酶活也有比较明显的抑制作用，其余几种离子K⁺略微提高了14％的酶活，Cu²⁺和Ni²⁺略微降低了酶活。在10mM金属离子体系中，K⁺提高了酶活，Mn²⁺，Ni²⁺对酶活有轻微的抑制作用。

(6)有机溶剂对酶活的影响

有机溶剂对脂肪酶Lip6活性的影响，通过向反应体系中添加终浓度为25％、50％和100％的有机溶剂来进行检测，选择的有机溶剂按照亲水性从高到低为DMSO，甲醇，乙醇，丙酮，乙腈，异丙醇，正丙醇，三氯甲烷，环己烷，正己烷，异辛烷。测定前，将酶液与有机溶剂混合后置于20℃下震荡孵育3h，残余的脂肪酶酶活用pNPP进行测定。

对于疏水性有机溶剂，孵育后的混合液通过离心去除有机溶剂后，剩余的酶液水相进行酶活测定；对于亲水性有机溶剂，孵育后的混合液用缓冲液进行稀释，至有机溶剂的浓度为5％后进行测定，消除有机溶剂对酶活测定的影响。

测定结果如表2所示.

表2

由表2可以看出，在25％有机溶剂孵育后，只有正丙醇和三氯甲烷略微降低了酶活，其余有机溶剂处理后酶活都能保留90％以上，甚至DMSO，丙酮，异丙醇和乙腈孵育后的Lip6比在缓冲溶液中保留了更多的酶活。在50％有机溶剂孵育后，甲醇和乙醇显著降低了酶活，异丙醇，正丙醇和三氯甲烷对酶活也有一定的抑制作用，其它溶剂仍然保留了大部分酶活，乙腈仍然比缓冲液保留了更多的酶活。在100％有机溶剂处理后，丙酮和乙腈显著降低了酶活，三氯甲烷因为表现出了一定的抑制作用，其余有机溶剂都保留了大部分酶活，相当一部分溶剂处理后酶活保留率都高于缓冲溶液。可能是因为酶在有机溶剂体系中没能完全分散开，且处于不活跃状态，因此酶活几乎没有损失。

实施例4脂肪酶Lip6催化鱼油水解富集多不饱和脂肪酸

重新发酵脂肪酶Lip6，离心去除沉淀，获得发酵上清液，进行冷冻干燥，制得脂肪酶Lip6酶粉，用于鱼油选择性水解。反应体系如下：1mL鱼油，3mL Tris-HCl缓冲液(100mM，pH＝9.0)，6U脂肪酶Lip6(以对pNPP的水解活性定义),3％Span 20乳化，将反应混合液置于40℃水浴摇床中震荡反应36h，TLC定性检测水解效果，气相色谱法检测多不饱和脂肪酸组分的富集效果。

TLC结果如图3a所示，在TLC图谱上，1为原始鱼油，2为水解后的鱼油，结果表明筛选得到的脂肪酶Lip6对鱼油具有强有力的水解效果。将水解后的鱼油甘油酯部分甲酯化后进行了气相色谱检测(图3b)，EPA甲酯在29.1min出峰，DHA甲酯在38.9min出峰。结果表明，富集后的鱼油甘油酯部分，EPA含量能达到31％，DHA含量为10.3％；其中甘油单酯部分DHA和EPA含量分别为14.88％和41.78％。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种脂肪酶及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 430

<212> PRT

<213> 浅紫色链霉菌(Streptomyces violascens)

<400> 1

Met Gly Pro Asp Arg Arg Arg Glu Arg Gln Val Asp Glu Val Glu Ala

1 5 10 15

Arg Ile Ala Ala Ala Ala Ala Glu Ala Leu Ala Pro Lys Gly Ala Ala

20 25 30

Glu Ala Val Ser Gly Gly Trp Arg Arg Ala Gly Leu Ala Gly Ala Ala

35 40 45

Ile Gly Val Val Ala Ala Gly Ala Ala Ala Gly Val Ala Val Glu Arg

50 55 60

Met Thr Val Gly Arg Gly Met Arg Lys Arg Ala Arg Leu Ala Leu Asp

65 70 75 80

Ala Ser Gly Pro Tyr Gly Thr Leu Arg Gly Thr Pro Gly Ser Ala Val

85 90 95

Ala Glu Asp Gly Thr Ala Leu His Tyr Glu Val Asp Glu Thr Asp Ala

100 105 110

Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ala Arg Arg Arg Arg Leu Phe Gly Arg Lys

115 120 125

Ala Pro Ala Pro Ala Thr Val Val Phe Ser His Gly Tyr Cys Leu Ser

130 135 140

Gln Asp Ser Trp His Phe Gln Arg Ala Ala Leu Ala Gly Val Val Arg

145 150 155 160

Thr Val His Trp Asp Gln Arg Ser His Gly Arg Ser Gly Arg Gly Arg

165 170 175

Ser Gln Ala Glu Gly Val Pro Val Thr Met Glu Gln Leu Gly Arg Asp

180 185 190

Leu Lys Ala Val Ile Asp Ala Ala Ala Pro Glu Gly Pro Leu Val Leu

195 200 205

Val Gly His Ser Met Gly Gly Met Thr Val Met Ala Leu Ala Glu Gln

210 215 220

Phe Pro Glu Leu Val Arg Glu Arg Val Val Gly Val Ala Leu Val Gly

225 230 235 240

Ser Ser Gly Gly Arg Leu Ser Glu Val Asp Phe Gly Leu Pro Ala Val

245 250 255

Gly Val Asn Ala Val Arg Arg Val Leu Pro Gly Val Leu Lys Ala Leu

260 265 270

Gly Ser Gln Val Asp Leu Val Glu Arg Gly Arg Arg Ala Thr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Ala Gly Val Val Lys Arg Tyr Ser Phe Gly Ser Arg Asp Val

290 295 300

Asp Pro Gly Val Ile Arg Phe Ala Glu Arg Leu Ile Glu Ser Thr Pro

305 310 315 320

Ile Asp Val Val Ala Glu Phe Tyr Pro Ala Phe Thr Glu His Asp Lys

325 330 335

Thr Gly Ala Leu Pro Leu Leu Ala Asp Val Pro Val Leu Val Leu Ala

340 345 350

Gly Asp Arg Asp Leu Ile Thr Pro Ser Ala His Ser Glu Val Ile Ala

355 360 365

Ala Ala Leu Pro Asp Ala Glu Leu Val Leu Val Pro Asp Ala Gly His

370 375 380

Leu Val Met Leu Glu His Pro Glu Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala Asp

385 390 395 400

Leu Leu Val Arg Ala Gly Ala Val Pro Gly Ala Thr Thr Val Gly Gly

405 410 415

His Gly Asn Thr Ala His Pro Asp Arg Pro Arg Glu Arg Pro

420 425 430

<210> 2

<211> 1293

<212> DNA

<213> 浅紫色链霉菌(Streptomyces violascens)

<400> 2

gtgggcccgg accggcggag ggagcggcag gtggacgagg tcgaggcacg gatcgcggca 60

gcggccgccg aggcgctggc gccgaagggc gccgccgagg ccgtctcggg cggctggcgc 120

cgggcggggc tcgccggggc cgccataggg gtcgtcgccg ccggagccgc cgccggggtc 180

gccgtggagc ggatgaccgt cgggcgcggc atgcgcaagc gggcccggct ggccctggac 240

gcctcgggcc cgtacggcac gctgcgcggt acgccgggca gcgccgtcgc cgaggacggg 300

acggcgctgc actacgaggt cgacgagacg gacgccgccc cggcggcgtc cgcggcgcgc 360

cgcagacgcc tcttcgggcg gaaggccccc gccccggcca cggtcgtctt cagccacggc 420

tactgcctct cccaggactc ctggcacttc cagcgggccg ccctcgccgg agtggtccgc 480

accgtccact gggaccagcg cagccacggc aggtccgggc gcggccggtc ccaggcagag 540

ggcgtgccgg tcaccatgga gcagctgggc cgggacctga aggcggtcat cgacgcggcc 600

gcgcccgagg ggccgctggt gctggtcggc cactcgatgg gcggcatgac ggtgatggca 660

ctggccgagc agttcccgga gctggtgcgg gagcgggtgg tcggggtcgc gctggtcggc 720

tcctcgggcg ggaggctctc cgaggtcgac ttcgggctcc cggccgtcgg ggtcaacgcc 780

gtgcgccggg tgctgccggg cgtgctgaag gcgctgggct cgcaggtgga cctggtcgag 840

cgggggcggc gggcgacggc cgacctcttc gccggggtgg tcaagcggta ctcgttcggc 900

tcgcgggacg tcgacccggg ggtgatccgg ttcgcggaac ggctgatcga gtcgacgccg 960

atcgacgtgg tcgcggagtt ctacccggcc ttcaccgagc acgacaagac cggggcgctg 1020

ccgctcctgg ccgacgtgcc ggtgctggtg ctggccgggg accgggacct gatcacgccg 1080

agcgcccaca gcgaggtcat cgccgccgcc ctgcccgacg ccgagctggt gctggtcccg 1140

gacgccggac acctggtgat gctggagcac ccggaggcgg tcaccgaccg gctcgccgac 1200

ctgctcgtcc gcgcgggggc cgtgcccggg gcgactaccg ttggcgggca tggaaacacc 1260

gcacacccgg accgcccccg tgagcggccc tga 1293

Claims

1.脂肪酶在催化鱼油水解反应获得富集DHA/EPA的甘油酯中的应用，其特征在于，所述脂肪酶的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。