CN114317648B - 一种提高多粘菌素e发酵水平的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高多粘菌素E发酵水平的方法，包括发酵培养基及发酵过程控制，所述发酵过程控制包括培养温度、溶氧、pH、通气量、罐压和转速控制，所述发酵过程控制包括补料磷酯酰丝氨酸和补料液化淀粉。本发明使用优化后的发酵培养基，通过补加氨水将pH自控，并通过控制温度、溶氧在较合适值，在发酵周期30‑50h补入磷脂酰丝氨酸，保证多黏芽孢杆菌的代谢活性，当发酵液残糖降低至30g/L时，流加补入液化淀粉，控制残糖在20‑30g/L，能够改善中后期代谢速度、发酵单位增长速率。
Description
技术领域
本发明属于微生物制药技术领域，具体涉及一种提高多粘菌素E发酵水平的方法。
背景技术
多粘菌素E（polymyxin E）是一种由多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)产生的多肽类抗生素，多粘菌素E的结构主要由三部分组成，环状7肽、线性3肽、疏水酰基尾。当疏水酰基尾为甲基辛酸时，即多粘菌素E1组分，疏水酰基尾为异辛酸，即多粘菌素E2组分。多粘菌素E主要应用于革兰氏阴性菌，被广泛接受的作用机制主要是对细胞膜的破坏。近些年来由于多重耐药菌的出现，已经成为了当今世界的医疗健康的挑战，而由于多粘菌素E杀菌机理主要作用于细胞膜，对这些耐药菌有很好的抗性作用，因此被称为针对多重耐药菌的“最后一道防线”。
多粘菌素E结构式如下：
现有多粘菌素E的发酵水平，如专利 一种发酵生产多粘菌素E的方法，授权公告号103695512B，通过配方调整，最高发酵水平可达到710000u/mL。其发酵水平仍有可提升空间。
在多粘菌素E的生物合成过程中，菌体初级代谢的中间产物对次级代谢产物的合成有一定的诱导作用，达到一定的浓度后启动次级代谢活动。多黏芽孢杆菌次级代谢产物多粘菌素E，通过转运蛋白将其从胞内排至胞外，这种分泌途径往往通过消耗ATP来进行能量供给，合成的多粘菌素若无法排出胞外，可对细胞造成一定损伤，造成菌体提前衰老、自溶，从而造成多粘菌素E发酵水平降低。现有的多粘菌素E发酵工艺中，发酵中期以后，代谢速度下降、多粘菌素E产率下降，与细胞膜的破坏有一定关系。而保证细胞膜的完整性、维持菌体的正常代谢，保证中后期发酵产率，是提高发酵水平的一种方法。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，提供了一种可有效提高多粘菌素E发酵水平的方法。
本发明采用的技术方案为：
一种提高多粘菌素E发酵水平的方法，包括发酵培养基及发酵过程控制，所述发酵过程控制包括培养温度、溶氧、pH、通气量、罐压和转速控制，所述发酵过程控制包括补料磷脂酰丝氨酸和补料液化淀粉。
进一步地，所述发酵培养基以g/100mL为单位计算由以下成分组成：玉米淀粉7.0-9.0，α淀粉酶0.008-0.010，葡萄糖0.5-1.5，黄豆饼粉0.4-0.6，玉米浆 0.4-0.6，硫酸铵 0.6-0.8，磷酸氢二钾 0.03-0.05，碳酸钙 0.4-0.6，硫酸镁 0.001-0.003，消泡剂0.03-0.05，其余为水。
进一步地，所述发酵培养基以g/100mL为单位计算由以下成分组成：玉米淀粉8.0-9.0，α淀粉酶 0.009-0.010，葡萄糖 1.0-1.5，黄豆饼粉0.5-0.6，玉米浆 0.5-0.6，硫酸铵0.7-0.8，磷酸氢二钾 0.04-0.05，碳酸钙 0.5-0.6，硫酸镁 0.002-0.003，消泡剂0.04-0.05，其余为水。
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进一步地，所述发酵过程控制具体为：接种量5%-9%，培养温度32-33℃，全程氨水控制pH 5.8-6.0，通气量0.6-1.0 vvm，罐压0.04MPa-0.06MPa，转速200-400rpm，控制溶氧30%以上。
进一步地，所述补料磷脂酰丝氨酸的补入总量为W/V 0.005%，补入的时间为发酵周期30-50h时。
进一步地，所述补料磷脂酰丝氨酸的补入总量为W/V 0.004-0.006%，补入的时间为发酵周期40h时。
进一步地，所述液化淀粉为灭菌后的液化淀粉液，补入总量为W/V 50~60%，控制发酵液残糖为20-30g/L。
本发明获得的有益效果为：本发明使用优化后的发酵培养基，通过补加氨水将pH自控，并通过控制温度、溶氧在较合适值，在发酵周期30-50h补入磷脂酰丝氨酸，保证多黏芽孢杆菌的代谢活性，当发酵液残糖降低至30g/L时，流加补入液化淀粉，控制残糖在20-30g/L，能够改善中后期代谢速度、发酵单位增长速率。
本发明通过发酵配方设计、补加补料的方法，对发酵工艺进行精确调控，有效提升了发酵水平，实施例6与实施例1相比，提高了23.99%。关键补料的补入，不但有效提高了发酵水平，还有效减少了发酵过程中的菌体自溶，缓解了发酵中后期泡沫大的问题，有效减少了发酵逃液的发生，提高了发酵指数，有效降低了污水量，对多粘菌素的清洁生产有了很好的推动作用。
本发明原理：磷脂酰丝氨酸，通常位于细胞膜的内层，是细胞膜组分之一，它能影响着细胞膜的流动性、通透性，并且能激活多种酶类的代谢和合成，与一系列的膜功能有关，它是唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能状态的磷脂，还能够帮助细胞壁保持柔韧性。磷脂酰丝氨酸在修复细胞膜、保持细胞膜的完整性、延缓菌体自溶等方面有很好的作用。补加一定量的磷脂酰丝氨酸，会对细胞膜有很好的修复作用，因此磷脂酰丝氨酸对发酵水平的提升有一定的作用。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
实施例
按照发酵培养基配方（以g/100mL为单位计算）称取物料：玉米淀粉 8.0，α淀粉酶0.009，葡萄糖 1.0，黄豆饼粉2.6，玉米浆 0.5，硫酸铵 0.7，磷酸氢二钾 0.04，碳酸钙0.5，硫酸镁 0.002，消泡剂0.04，加水后通蒸汽灭菌，维持121-123℃灭菌25min后降温，温度降低至32.5℃后，接入总体积7%的种液，培养温度32.5℃，全程氨水控制pH 5.9，通气量0.6-1.0 vvm，罐压0.04MPa-0.06MPa，转速200-400rpm，控制溶氧30%以上，培养86h。
最终发酵液检测结果如下表所示：
| 名称 | 发酵效价 万u/mL |
| 实施例1 | 64.2 |
实施例
与实施例1不同之处在于：当发酵液残糖降低至30g/L时补入液化淀粉，控制总糖20-30g/L。
最终发酵液检测结果如下表所示：
| 名称 | 发酵效价 万u/mL |
| 实施例2 | 69.8 |
实施例
与实施例2不同之处在于：在发酵50h补入灭菌后的磷脂酰丝氨酸，补入总质量为0.005%。
最终发酵液检测结果如下表所示：
| 名称 | 发酵效价 万u/mL |
| 实施例3 | 77.6 |
实施例
与实施例3不同之处在于：在发酵50h补入灭菌后的磷脂酰丝氨酸，补入总量为0.006%。
最终发酵液检测结果如下表所示：
| 名称 | 发酵效价 万u/mL |
| 实施例4 | 77.1 |
实施例
与实施例3不同之处在于：在发酵50h补入灭菌后的磷脂酰丝氨酸，补入总量为0.004%。
最终发酵液检测结果如下表所示：
| 名称 | 发酵效价 万u/mL |
| 实施例5 | 74.7 |
实施例
与实施例3不同之处在于：在发酵40h补入灭菌后的磷脂酰丝氨酸，补入总量为0.005%。
最终发酵液检测结果如下表所示：
| 名称 | 发酵效价 万u/mL |
| 实施例6 | 79.6 |
实施例
与实施例3不同之处在于：在发酵30h补入灭菌后的磷脂酰丝氨酸，补入总量为0.005%。
最终发酵液检测结果如下表所示：
| 名称 | 发酵效价 万u/mL |
| 实施例7 | 77.3 |
由以上实施例与实施例1进行对比，经过配方调整、补加补料，有效提升了多粘菌素E的发酵水平，由实施例1的64.2万u/mL，提高到实施例6的79.6万u/mL，提高了23.99%，发酵水平提升效果明显。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种提高多粘菌素E发酵水平的方法，包括发酵培养基及发酵过程控制，其特征在于：所述发酵过程控制包括培养温度、溶氧、pH、通气量、罐压和转速控制，所述发酵过程控制包括补料磷脂酰丝氨酸和补料液化淀粉；所述发酵培养基以g/100mL为单位计算由以下成分组成：玉米淀粉7.0-9.0，α淀粉酶0.008-0.010，葡萄糖0.5-1.5，黄豆饼粉0.4-0.6，玉米浆0.4-0.6，硫酸铵0.6-0.8，磷酸氢二钾0.03-0.05，碳酸钙0.4-0.6，硫酸镁0.001-0.003，消泡剂0.03-0.05，其余为水；
所述发酵过程控制具体为：接种量5％-9％，培养温度32-33℃，全程氨水控制pH 5.8-6.0，通气量0.6-1.0vvm，罐压0.04MPa-0.06MPa，转速200-400rpm，控制溶氧30％以上；
所述补料磷脂酰丝氨酸的补入总量为W/V 0.005％，补入的时间为发酵周期30-50h时；
所述液化淀粉为灭菌后的液化淀粉液，补入总量为W/V 50～60％，控制发酵液残糖为20-30g/L。
2.根据权利要求1所述一种提高多粘菌素E发酵水平的方法，其特征在于：所述发酵培养基以g/100mL为单位计算由以下成分组成：玉米淀粉8.0-9.0，α淀粉酶0.009-0.010，葡萄糖1.0-1.5，黄豆饼粉0.5-0.6，玉米浆0.5-0.6，硫酸铵0.7-0.8，磷酸氢二钾0.04-0.05，碳酸钙0.5-0.6，硫酸镁0.002-0.003，消泡剂0.04-0.05，其余为水。
3.根据权利要求2所述一种提高多粘菌素E发酵水平的方法，其特征在于：所述发酵培养基以g/100mL为单位计算由以下成分组成：玉米淀粉8.0，α淀粉酶0.009，葡萄糖1.0，黄豆饼粉0.5，玉米浆0.5，硫酸铵0.7，磷酸氢二钾0.04，碳酸钙0.5，硫酸镁0.002，消泡剂0.04，其余为水。
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