CN104830933A

CN104830933A - 一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法

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Publication number: CN104830933A
Application number: CN201510287228.8A
Authority: CN
Inventors: 林青
Original assignee: HEBEI SHENGXUE DACHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HEBEI SHENGXUE DACHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2015-08-12
Anticipated expiration: 2035-05-29
Also published as: CN104830933B

Abstract

一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，在发酵培养的过程中，流加补入混合氨基酸母液，所述混合氨基酸母液的成分包含L-赖氨酸、L-异亮氨酸、D-谷氨酸。本发明提供的方法提高了发酵水平，达到了国内外的杆菌肽发酵的最高水平，并且所使用的混合氨基酸母液成分常见易得，价格低廉，控制简便，可以运用于大规模生产，降低了生产能耗和生产成本。

Description

一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵的技术领域，具体涉及一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法。

背景技术

杆菌肽属多肽类抗生素，其结构是由12个氨基酸组成含有噻唑环的多肽复合体，它许多异构物，分别为杆菌肽A、B₁、B₂、B₃、D_l、D₂、D₃和E。其中A组分分子式为C₆₆H₁₀₃N₁₇O₁₆S₅，在所有的异构体中，其活性最高，含量也最为丰富。

杆菌肽是目前国内外广泛用于饲料中的一种新型的理想广谱抗菌素，它能够有效抑制G⁺和G^—细菌，如金黄色葡萄球菌、链球菌等。作用机理是由于它是类脂质焦磷酸的特异性抑制剂，能抑制细胞壁所合成的脱磷化过程，影响磷脂载体的转运及向细胞壁支架输送粘肽，从而抑制细胞壁的合成；另一方面是与敏感菌的细胞膜结合，损伤细胞膜，使细胞膜的通透性增加，导致细胞质外流；其次是干扰敏感菌细胞内原浆蛋白的合成。具有抗菌谱广、排泄快、畜禽吸收量少、安全性评估良好、不产生耐药性等很多优良特性，是饲料添加剂中传统抗生素的有效替代品，已被应用于生物表面活性剂、饲料添加剂、食品防腐剂和作为生物学的研究工具等。

目前杆菌肽的工业生产主要通过微生物发酵法制得，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)是目前广泛应用的工业生产菌种。杆菌肽的发酵生产过程研究国外报道较多，国内相关报道不多，且发酵水平不高。我国的杆菌肽发酵生产始于20世纪60年代，随着我国畜牧养殖业的兴起，杆菌肽于上个世纪90年代开始大量生产，以地衣芽孢杆菌为菌种，以玉米淀粉、豆粕粉为主要碳、氮源，培养温度为37℃，经30-40h耗氧发酵培养生物合成杆菌肽，但发酵水平不高，生产能耗和生产成本高。目前的研究也主要集中在菌种的选育和发酵条件的优化方面，但是未取得突破行的进展，与国外报道的1200u/ml的水平相差还是很大，我国杆菌肽发酵工业的生产水平亟待提高。

发明专利申请号为201210352122.8的专利“一种利用氧载体提高发酵液中杆菌肽效价的方法”，提出了在微生物发酵培养基中添加氧载体，是通过增加发酵液中氧气的容量，提高氧气传递速率，提高杆菌肽的产量，但是其需要用特定的地衣芽孢杆菌来进行发酵，而且其对杆菌肽的产量并没有大幅度的提高，杆菌肽的产量依然很小，不能满足杆菌肽的效价需求。发明专利申请号为201410163014.9的专利“一种连续流加补料分批发酵提高杆菌肽效价”，提出在发酵的过程中补入“豆粕粉、玉米粉、玉米淀粉、玉米浆、葡萄糖”此专利中补入的补料提供的是生长代谢所需的营养物质，是在生长期补入，该时期加入的补料使杆菌肽效价有所提高，但是依然不能达到国外的效价水平，杆菌肽发酵工业的生产水平依然亟待提高。

发明内容

本发明提供了一种在发酵过程中流加混合氨基酸做为前体物质来提高杆菌肽效价的方法，其目的在于克服现有技术的不足，提高发酵单位，缩小与国外技术水平的差距，降低生产能耗和生产成本，本发明为实现其目的采用的技术方案是：

一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，在发酵培养的过程中，流加补入混合氨基酸母液，所述混合氨基酸母液的成分包含L-赖氨酸、L-异亮氨酸、D-谷氨酸、水。

当发酵时间为10-16h时，开始流加补入混合氨基酸母液，直至发酵终止。

所述混合氨基酸母液的流加速度为每小时流加发酵液体积的0.25％-0.35％，流加总量为发酵液总体积的8％-10％。

所述的混合氨基酸母液中以质量体积比计，L-赖氨酸的含量为：4.8％-6％。

所述的混合氨基酸母液中以质量体积比计，L-异亮氨酸的含量为：9％-12％。

所述的混合氨基酸母液中以质量体积比计，D-谷氨酸的含量为：3％-6％。

一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，具体的操作步骤为：

a、种子培养：将地衣芽孢杆菌菌悬液接种于装有种子培养基的种子罐中，在温度36-38℃、转速590-610rpm、通气量0.4-0.6vvm的条件下培养15-17h，得到种子液；

b、发酵培养：将步骤a中制备的种子液按照体积比10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度36-38℃、转速590-610rpm、通气量0.9-1.1vvm的条件下进行发酵，培养4h后，以0.4L/h的速率匀速流加补料，所述补料的成分及含量以质量体积比计为豆粕粉8％、玉米粉1％、玉米淀粉2％、玉米浆0.5％、葡萄糖6％、余量为水的补料，共流加4L补料，补料结束后控制pH7.0-7.5，39-41h终止发酵；

c、流加混合氨基酸母液：发酵进行到10-16h后，开始流加混合氨基酸母液，直至发酵终止，得到杆菌肽；

d、检测发酵效价：发酵结束后检测杆菌肽的发酵单位。

所述的步骤a种子培养中种子培养基的成分与用量为：以质量体积比计，黄豆饼粉3％、玉米粉2％、玉米淀粉1％、玉米浆0.5％、硫酸铵0.15％、碳酸钙0.3％，余量为水，调节培养基的pH为6.8。

所述的步骤b发酵培养中发酵培养基的成分与用量为：以质量体积比计，豆粕粉9％、玉米粉2％、玉米淀粉3％、硫酸铵0.3％、硫酸镁0.003％、碳酸钙0.5％，余量为水，调节培养基的pH为7.2。

所述的步骤b发酵培养中发酵培养基的体积为发酵罐容积的50-80％。

本发明的有益效果是：本发明提供的方法提高了发酵水平，达到了国内外的杆菌肽发酵的最高水平，并且所使用的混合氨基酸母液成分常见易得，价格低廉，控制简便，可以运用于大规模生产，降低了生产能耗和生产成本。

本发明通过添加氨基酸母液的方法，强化了产物的合成方向，使得目标产物的含量大幅度提高。本发明经过长期的研究，总结发现只有在发酵10-16h(尤以13h最好)这个时间内补加氨基酸母液结合在生长期结束后补料的方式才会使得发酵液的效价达到国外的水平，实现发酵单位为1270u/ml的高效价，这个时间之外的补加会被当成氮源利用掉，参与菌体的生长代谢或能量代谢，不参与效价的提高，或减弱效价的提高。

本发明经过长期的创造性研究，总结出：必须严格把控混合氨基酸母液中L-赖氨酸、L-异亮氨酸、D-谷氨酸的用量比例，用量比例改变都会影响发酵液效价，L-赖氨酸、L-异亮氨酸、D-谷氨酸的用量多一是会造成营养物质饱和效价不会再提高，二是会造成抑制、阻遏作用，发酵液效价不仅不会提高反而会下降，这是经过长期的创造性研究发现总结的，并非一朝一夕的理论实验得到的；L-赖氨酸、L-异亮氨酸、D-谷氨酸的用量少，发酵液效价无法提高或者提高幅度很小，因而严格控制L-赖氨酸、L-异亮氨酸、D-谷氨酸的用量比例至关重要。

具体实施方式

本发明提供了一种在发酵过程中流加混合氨基酸做为前体物质来提高杆菌肽效价的方法，其目的在于克服现有技术的不足，提高发酵单位，缩小与国外技术水平的差距，降低生产能耗和生产成本，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。

实施例1.不补料制备杆菌肽

a、种子培养：将地衣芽孢杆菌菌悬液接种于装有种子培养基的种子罐中，在温度37℃、转速600rpm、通气量0.5vvm的条件下培养16h；

b、发酵培养：将步骤a中制备的种子液按照体积比10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度37℃、转速600rpm、通气量1.0vvm的条件下进行发酵，培养4h后，开始以0.4L/h的速率匀速流加成分及含量为豆粕粉8％、玉米粉1％、玉米淀粉2％、玉米浆0.5％、葡萄糖6％、余量为水的补料(以质量体积比计)，共流加4L补料，补料结束后调节转速控制pH7.0-7.5，40h终止发酵，作为对照。

c、检测发酵单位：发酵结束后用HPLC法检测杆菌肽的发酵单位为981u/ml。

实施例2.在发酵过程中补入L-赖氨酸。

a、种子培养：将地衣芽孢杆菌菌悬液接种于装有种子培养基的种子罐中，在温度37℃、转速600rpm、通气比0.5vvm的条件下培养16h；

b、发酵培养：将步骤a中制备的种子液按照体积比10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度37℃、转速600rpm、通气比1.0vvm的条件下进行发酵，培养4h后，开始以0.4L/h的速率匀速流加成分及含量为豆粕粉8％、玉米粉1％、玉米淀粉2％、玉米浆0.5％、葡萄糖6％、余量为水的补料(以质量体积比计)，共流加4L补料，补料结束后调节转速控制pH7.0-7.5，40h终止发酵；

c、流加氨基酸母液：发酵进行到13h后，开始流加混合氨基酸母液，40h发酵结束停止流加，氨基酸母液的含量为：以质量体积比计，L-赖氨酸5％、余量为水，流加速率为每小时流加发酵液体积的0.33％，匀速流加，流加总量为发酵液总体积的10％。

d、检测发酵单位：发酵结束后HPLC检测杆菌肽的发酵单位为1120u/ml，比对照提高14.17％。

实施例3.在发酵过程中补入L-异亮氨酸

c、流加氨基酸母液：发酵进行到13h后，开始流加混合氨基酸母液，40h发酵结束停止流加，氨基酸母液的含量为：以质量体积比计，L-异亮氨酸12％、余量为水，流加速率为每小时流加发酵液体积的0.30％，匀速流加，流加总量为发酵液总体积的9％。

d、检测发酵单位：发酵结束后HPLC检测杆菌肽的发酵单位为1159u/ml，比对照提高18.14％。

实施例4.在发酵过程中补入D-谷氨酸

c、流加氨基酸母液：发酵进行到13h后，开始流加混合氨基酸母液，40h发酵结束停止流加，氨基酸母液的含量为：以质量体积比计D-谷氨酸3％、余量为水，流加速率为每小时流加发酵液体积的0.28％，匀速流加，流加总量为发酵液总体积的8.4％。

d、检测发酵单位：发酵结束后HPLC检测杆菌肽的发酵单位为1046u/ml，比对照提高6.63％。

实施例5.在发酵过程中补入混合氨基酸母液

一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，包括以下操作步骤：

c、流加混合氨基酸母液：发酵进行到13h后，开始流加混合氨基酸母液，40h发酵结束停止流加，混合氨基酸母液的含量为：以质量体积比计，L-赖氨酸5％、L-异亮氨酸10％、D-谷氨酸4％，流加速率为每小时流加发酵液体积的0.33％，匀速流加，流加总量为发酵液总体积的10％。

d、检测发酵单位：发酵结束后利用HPLC检测杆菌肽的发酵单位为1270u/ml，比对照提高29.46％。

实施例6.在发酵过程中补入混合氨基酸母液

a、种子培养：将地衣芽孢杆菌菌悬液接种于装有种子培养基的种子罐中，在温度36℃、转速590rpm、通气比0.4vvm的条件下培养15h；

b、发酵培养：将步骤a中制备的种子液按照体积比10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度36℃、转速590rpm、通气比0.9vvm的条件下进行发酵，培养4h后，开始以0.4L/h的速率匀速流加成分及含量为豆粕粉8％、玉米粉1％、玉米淀粉2％、玉米浆0.5％、葡萄糖6％、余量为水的补料(以质量体积比计)，共流加4L补料，补料结束后调节转速控制pH7.0-7.5，39h终止发酵；

c、流加混合氨基酸母液：发酵进行到10h后，开始流加混合氨基酸母液，39h发酵结束停止流加，混合氨基酸母液的含量为：以质量体积比计，L-赖氨酸4.8％、L-异亮氨酸9％、D-谷氨酸3％，流加速率为每小时流加发酵液体积的0.3％，匀速流加，流加总量为发酵液总体积的9％。

d、检测发酵单位：发酵结束后利用HPLC检测杆菌肽的发酵单位为1208u/ml，比对照提高23.14％。

实施例7.在发酵过程中补入混合氨基酸母液

a、种子培养：将地衣芽孢杆菌菌悬液接种于装有种子培养基的种子罐中，在温度38℃、转速610rpm、通气比0.6vvm的条件下培养17h；

b、发酵培养：将步骤a中制备的种子液按照体积比10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，在温度38℃、转速610rpm、通气比1.1vvm的条件下进行发酵，培养4h后，开始以0.4L/h的速率匀速流加成分及含量为豆粕粉8％、玉米粉1％、玉米淀粉2％、玉米浆0.5％、葡萄糖6％、余量为水的补料(以质量体积比计)，共流加4L补料，补料结束后调节转速控制pH7.0-7.5，41h终止发酵；

c、流加混合氨基酸母液：发酵进行到16h后，开始流加混合氨基酸母液，41h发酵结束停止流加，混合氨基酸母液的含量为：以质量体积比计，L-赖氨酸6％、L-异亮氨酸12％、D-谷氨酸6％，流加速率为每小时流加发酵液体积的0.25％，匀速流加，流加总量为发酵液总体积的8％。

d、检测发酵单位：发酵结束后利用HPLC检测杆菌肽的发酵单位为1231u/ml，比对照提高25.51％。

Claims

1.一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，在发酵培养的过程中，流加补入混合氨基酸母液，所述混合氨基酸母液的成分包含L-赖氨酸、L-异亮氨酸、D-谷氨酸、水。

2.根据权利要求1所述的一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，当发酵时间为10-16h时，开始流加补入混合氨基酸母液，直至发酵终止。

3.根据权利要求1所述的一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，所述混合氨基酸母液的流加速度为每小时流加发酵液体积的0.25％-0.35％，流加总量为发酵液总体积的8％-10％。

4.根据权利要求1所述的一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，所述的混合氨基酸母液中以质量体积比计，L-赖氨酸的含量为：4.8％-6％。

5.根据权利要求1所述的一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，所述的混合氨基酸母液中以质量体积比计，L-异亮氨酸的含量为：9％-12％。

6.根据权利要求1所述的一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，所述的混合氨基酸母液中以质量体积比计，D-谷氨酸的含量为：3％-6％。

7.根据权利要求1所述的一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，具体的操作步骤为：

d、检测发酵效价：发酵结束后检测杆菌肽的发酵单位。

8.根据权利要求7所述的一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，所述的步骤a种子培养中种子培养基的成分与用量为：以质量体积比计，黄豆饼粉3％、玉米粉2％、玉米淀粉1％、玉米浆0.5％、硫酸铵0.15％、碳酸钙0.3％，余量为水，调节培养基的pH为6.8。

9.根据权利要求7所述的一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，所述的步骤b发酵培养中发酵培养基的成分与用量为：以质量体积比计，豆粕粉9％、玉米粉2％、玉米淀粉3％、硫酸铵0.3％、硫酸镁0.003％、碳酸钙0.5％，余量为水，调节培养基的pH为7.2。

10.根据权利要求7所述的一种流加混合氨基酸母液提高杆菌肽效价的方法，其特征在于，所述的步骤b发酵培养中发酵培养基的体积为发酵罐容积的50-80％。