CN108034615B - 一种芽孢杆菌流加补料的发酵方法 - Google Patents

一种芽孢杆菌流加补料的发酵方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种芽孢杆菌流加补料的发酵方法，包括如下步骤：将芽孢杆菌菌种进行一级、二级种子扩大培养；将扩大培养后的菌种接入具有发酵罐有效容积50‑70％的基础培养基中进行发酵培养；在发酵培养过程中发酵过程中进行两次流加补料。本发明的方法通过补料流加碳源和基础培养基中相对缺乏的限制性氨基酸，发酵培养后尤其是对于枯草芽孢杆菌，经喷雾干燥得到的菌粉每克CFU不少于2.0×1011个枯草芽孢杆菌，显著提高单位产量，降低了单位成本。将利用上述发酵方法培养过的枯草芽孢杆菌ANSB060用于降解黄曲霉毒素，反应48小时后，体系中黄曲霉毒素B1可以被完全清除。

Description

一种芽孢杆菌流加补料的发酵方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体涉及一种芽孢杆菌流加补料的发酵方法。
背景技术
随着消费者对食品卫生和安全性的普遍关注以及研究者对霉菌毒素研究的不断深入，原料和饲料中的霉菌毒素污染情况也日益引起动物营养界和饲料界的重视。目前已知的霉菌毒素有300多种，其中黄曲霉毒素(AF)是一类主要由曲霉属的真菌，如黄曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(A.parasiticus)产生的有毒次级代谢产物，具有强的毒性、致癌性和诱变性，严重威胁动物生产和人类的健康。
自从1960年黄曲霉毒素被发现以来，科学工作者便不断地研究该类毒素的防控和脱毒方法。目前对黄曲霉毒素解毒方法的研究大部分集中在化学脱毒法和物理脱毒法。传统的理化方法去毒都存在一些问题，如导致饲料中的营养损失，影响饲料的感官品质，有些方法所需要的设备价格昂贵等等，从而限制了实际生产中的应用。利用微生物脱毒的方法有很多报道，多集中在野生菌的筛选上，例如，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis ANSB060(简称枯草芽孢杆菌ANSB060)，是本发明人实验室筛选得到的一株可以高效降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌，已于2009年11月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.3440，在中国专利文献CN 101705203A中公开。为具有降解霉菌毒素的菌种寻找适合的发酵方法，在发酵过程中尽快提高菌种的活菌数、转化芽孢率和降解霉菌毒素的活性，具有非常重要的意义，可以极大地降低工业化发酵生产中的成本，增加效率。
发明内容
本发明的要解决的技术问题是为了克服现有技术中存在的问题，提供一种一种芽孢杆菌流加补料的发酵方法，此方法可以提高芽孢杆菌发酵活菌数、转化芽孢率及其对霉菌毒素的降解效率。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种芽孢杆菌流加补料的发酵方法，包括如下步骤：
(1)将芽孢杆菌菌种进行一级、二级种子扩大培养；
(2)将扩大培养后的菌种接入具有发酵罐有效容积50-70％的基础培养基中进行发酵培养；在发酵培养过程中进行两次流加补料：
当发酵至8-10h进行第一次流加补料，补加培养基A，补加量为基础培养基体积的0.1-1.0‰；所述培养基A包括质量百分比为5-15％的碳源；
当发酵至12-16h进行第二次流加补料，补加培养基B，补加量为基础培养基体积的0.1-1.0‰；所述培养基B包括质量百分比为5-10％的碳源和2.54-7％的基础培养基中缺乏的菌种限制性氨基酸。
上述发酵方法中，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌，优选的，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌ANSB060。
上述发酵方法中，所述发酵培养的方法为：将含有二级菌种的二级种子培养基按体积比1:20-100接种于基础培养基中，控制罐压为0.02Mpa-0.05Mpa，在30-35℃下培养24-36h。
上述发酵方法中，所述基础培养基包括的原料按质量百分比为：葡萄糖0.3％-1.2％，豆柏1％-4％，玉米浆1％-3％，酵母粉1％-3％，蛋白胨1％-3％，磷酸氢二钾0.01％-0.05％，硫酸镁0.1％-0.2％，硫酸锰0.002％；培养基pH为6.5-7.5。
上述发酵方法中，所述一级种子扩大培养的方法为：将浓度为1×1010-2×1011cfu/mL的菌液按体积比1:200-400接种于一级种子培养基中，在温度为37-40℃下，摇瓶培养16-24h，优选的，控制转速为180-200r/min。
上述发酵方法中，所述一级种子扩大培养所用的培养基为，每1000mL含有：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1.0g，pH值为7.2。
上述发酵方法中，所述二级种子扩大培养的方法为：将含有一级菌种的一级种子培养基按体积比1:20-100接种于二级种子培养基中；在30℃-35℃培养8-10h，优选的，所述培养为摇瓶培养，控制转速为180-200r/min。
上述发酵方法中，所述二级种子培养所用培养基的原料及用量为：葡萄糖0.5％-3％，酵母抽提物0.5％-3％，蛋白胨0.5％-3％，磷酸氢二钾0.02％-0.05％，氯化钠0.5％-1％，硫酸镁0.02％-0.1％，培养基pH值为6.5-7.5。
上述发酵方法中，所述所述培养基A和培养基B的碳源为葡萄糖，所述基础培养基中缺乏的菌种限制性氨基酸为酪氨酸、蛋氨酸和亮氨酸。
上述发酵方法中，优选的，所述培养基A的原料及用量为:葡萄糖5-15％，培养基pH值为6.5-7.5；所述培养基B的原料及用量为:葡萄糖5-10％，酪氨酸1.2％～2.5％，蛋氨酸0.7％～3.0％，亮氨酸0.5％～1.5％，培养基pH值为6.5-7.5。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的一种芽孢杆菌流加补料的发酵方法，通过补料流加碳源和基础培养基中相对缺乏的限制性氨基酸(酪氨酸、蛋氨酸、亮氨酸的混合物)能显著提高活菌数量，尤其是对于枯草芽孢杆菌，经喷雾干燥得到的菌粉每克CFU不少于2.0×1011个枯草芽孢杆菌，显著提高单位产量，降低了单位成本。将利用上述发酵方法培养过的枯草芽孢杆菌ANSB060用于降解黄曲霉毒素B1，反应48小时后，体系中黄曲霉毒素可以被完全清除。
具体实施方式
下面将通过具体的实施例对本发明作进一步详细的说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。以下实施例中所使用的原料、试剂和仪器，如无特殊说明，均为市售，若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
在以下实施例中使用的枯草芽孢杆菌ANSB060，已于2009年11月12日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.3440，在中国专利文献CN101705203A中公开。
实施例1
1、一级种子液制备
将5000mL的三角瓶装2000mL一级种子培养基，取5mL枯草芽孢杆菌ANSB060活菌冻干管菌种(2×1011cfu/mL)接种于一级种子培养基中，摇瓶发酵培养16h，发酵温度37℃，转速180-200r/min，配养基组分如下(g/L)：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1.0g，pH值为7.2。2、二级种子液制备
在500L发酵罐中装有300L二级种子培养基，115-121℃湿热灭菌15-20min，按照体积比1:100将一级种子培养基接种于二级种子培养基中；在35℃培养10h；二级种子培养所用培养基的原料及用量为:葡萄糖2％,酵母抽提物0.5％，蛋白胨3％，磷酸氢二钾0.02％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.1％，培养基pH调为7.0。
3、流加补料发酵方法
在10m3发酵罐中装有7m3发酵培养基，115-121℃湿热灭菌15-20min，将70L二级种子接种于发酵培养基中，控制罐压为0.02Mpa，在35℃培养24h。
其中，发酵所用培养基的原料及用量为：葡萄糖1.2％，豆柏2.5％，玉米浆3％，酵母粉2％，蛋白胨1.5％，磷酸氢二钾0.05％，硫酸镁0.1％，硫酸锰0.002％，培养基pH值为7.0。
发酵过程中总共补料两次：当发酵至10h时进行第一次流加补料，补料为培养基A，加入量为初始基础培养基体积的1.0‰；培养基A的原料及用量为:葡萄糖5％，培养基pH值为6.5；
当发酵至16h进行第二次流加补料，补料培养基B，加入量为初始基础培养基体积的0.1‰，培养基B的原料及用量为：葡萄糖10％，酪氨酸1.2％，蛋氨酸3.0％，亮氨酸1.5％，培养基pH值为6.5。
将发酵培养后的枯草芽孢ANSB01G制备成菌粉，制备方法为：将发酵液加热到50℃，进入浓缩器，在真空度为70kpa-95kpa下进行浓缩，浓缩发酵液用多级低温喷雾流化干燥设备进行干燥，经检测，每克菌粉枯草芽孢杆菌CFU为2.5×1011个。
分别吸取900μl上述流加补料发酵得到的枯草芽孢杆菌ANSB060发酵液、分批培养枯草芽孢杆菌ANSB01G发酵液与100μl黄曲霉毒素B1(500ppb)反应，分别作为处理组和阳性对照组；空白对照组为900μl PBS缓冲液中加入100μl黄曲霉毒素B1(500ppb)；将反应体系的pH值调节为7.2，处理组、阳性对照组和空白对照分别在30℃反应48h。将反应后得到的各样品用1ml甲醇终止，离心5min，用0.22μm滤膜过滤，采用高效液相色谱柱后衍生技术检测黄曲霉毒素B1的浓度。
其中，分批培养枯草芽孢杆菌ANSB01G的培养方法为：取活菌浓度为2×1011cfu/mL的枯草芽孢杆菌ANSB01G 1ml，接种于80ml培养基中，在37℃进行摇瓶发酵培养24h，转速200r/min，pH值7.0。
检测条件：色谱柱：Cloversil C18，150mm×4.6mm×5μm；流动相为甲醇：水＝1：1，流速1mL/min，激发波长360nm，发射波长440nm，上样量20μl，AFB1检出限为0.05ppb。
枯草芽孢杆菌ANSB01G发酵液处理组未能检出AFB1，阳性对照组AFB1含量为4.7ppb，PBS空白对照组AFB1含量为24.9ppb，通过本发明的流加培养方法进行培养后，枯草芽孢杆菌ANSB01G对黄曲霉毒素降解效率提高19个百分点。
实施例2
1、一级种子液制备
将5000mL的三角瓶装2000mL一级种子培养基，取10mL枯草芽孢杆菌ANSB060活菌冻干管菌种(1×1010cfu/mL)接种于一级种子培养基中，摇瓶发酵培养16h，发酵温度37℃，转速180-200r/min，配养基组分如下(g/L)：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1.0g，pH值为7.2。2、二级种子液制备
在500L发酵罐中装有200L二级种子培养基，115-121℃湿热灭菌15-20min，按照体积比1:20将一级种子培养基接种于二级种子培养基中；在35℃培养10h；二级种子培养所用培养基的原料及用量为：葡萄糖3％,酵母抽提物3％，蛋白胨1％，磷酸氢二钾0.02％，氯化钠0.5％，硫酸镁0.1％，培养基pH调为7.0。
3、流加补料发酵方法
在40m3发酵罐中装有30m3枯草芽孢杆菌活菌发酵培养基，115-121℃湿热灭菌15-20min，将300L二级种子接种于枯草芽孢杆菌活菌发酵培养基中，控制罐压0.05Mpa，在30℃培养36h。
其中，发酵所用培养基的原料及用量为：葡萄糖0.3％，豆柏4％，玉米浆1％，酵母粉3％，蛋白胨3％，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.2％，硫酸锰0.001％，培养基pH为7.0.
发酵过程中总共补料两次：当发酵至8h进行第一次流加补料，补料为培养基A，加入量为初始基础培养基体积的0.1‰；补料培养基A的原料及用量为:葡萄糖15％，培养基pH为6.5；
当发酵至14h进行第二次流加补料，补料培养基B，加入量为初始基础培养基体积的1.0‰。补料培养基B的原料及用量为:葡萄糖5％，酪氨酸2.5％，蛋氨酸2.5％，亮氨酸0.5％％，培养基pH为6.5。
经实施例1中的高效液相色谱柱后衍生技术检测黄曲霉毒素B1的浓度，流加发酵枯草芽孢杆菌发酵液处理组未能检出AFB1，PBS对照组AFB1含量为25.0ppb。

Claims (7)

1.一种芽孢杆菌流加补料的发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将芽孢杆菌菌种进行一级、二级种子扩大培养；
（2）将扩大培养后的菌种接入具有发酵罐有效容积50-70%的基础培养基中进行发酵培养；在发酵培养过程中进行两次流加补料：
当发酵至8-10h进行第一次流加补料，补加培养基A，补加量为基础培养基体积的0.1-1.0‰；所述培养基A包括质量百分比为5-15%的碳源；
当发酵至12-16h进行第二次流加补料，补加培养基B，补加量为基础培养基体积的0.1-1.0‰；所述培养基B包括质量百分比为5-10%的碳源和2.54-7%的基础培养基中缺乏的菌种限制性氨基酸；
所述所述培养基A和培养基B的碳源为葡萄糖，所述基础培养基中缺乏的菌种限制性氨基酸为酪氨酸、蛋氨酸和亮氨酸；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌；
所述培养基A的原料及用量为: 葡萄糖5-15%，培养基pH值为6.5-7.5；所述培养基B的原料及用量为: 葡萄糖5-10%，酪氨酸1.2%~2.5%，蛋氨酸0.7%~3.0%，亮氨酸0.5%~1.5%，培养基pH值为6.5-7.5。
2.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述发酵培养的方法为：将含有二级菌种的二级种子培养基按体积比1:20-100接种于基础培养基中，控制罐压为0.02Mpa-0.05Mpa，在30-35℃下培养24-36h。
3.根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，所述基础培养基包括的原料按质量百分比为：葡萄糖0.3% -1.2%，豆柏1% -4%，玉米浆1% -3%，酵母粉1% -3%，蛋白胨1% -3%，磷酸氢二钾0.01% -0.05%，硫酸镁0.1% -0.2%，硫酸锰0.002%；培养基pH为6.5-7.5。
4.根据权利要求1-3任一项所述的发酵方法，其特征在于，所述一级种子扩大培养的方法为：将浓度为1×1010-2×1011cfu/mL的菌液按体积比1:200-400接种于一级种子培养基中，在温度为37-40℃下，摇瓶培养16-24h。
5.根据权利要求4所述的发酵方法，其特征在于，所述一级种子扩大培养所用的培养基为，每1000mL含有：胰蛋白胨10g、酵母浸膏2g、葡萄糖2g、牛肉膏3g、氯化钠4g、磷酸氢二钠3g、七水硫酸镁1.0g，pH值为7.2。
6.根据权利要求1-3任一项所述的发酵方法，其特征在于，所述二级种子扩大培养的方法为：将含有一级菌种的一级种子培养基按体积比1:20-100接种于二级种子培养基中；在30℃-35℃培养8-10h。
7.根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于，所述二级种子培养所用培养基的原料及用量为：葡萄糖0.5% -3%，酵母抽提物0.5% -3%，蛋白胨0.5% -3%，磷酸氢二钾0.02% -0.05%，氯化钠0.5% -1%，硫酸镁0.02% -0.1%，培养基 pH值为 6.5-7.5。
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