CN1288238C - 日本酒曲霉及其用于制备降胆固醇产品的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及天然存在的日本酒曲霉，它不能产生毒素而是产生至少一种能够降低血清胆固醇浓度的发酵食品用化合物。本发明也涉及这种霉菌在食品制造中的用途、通过以本发明霉菌接种粮食来制造显示出降胆固醇性能的发酵食品的方法、含有由本发明霉菌所产生的化合物的具有降胆固醇性能的食品。

Description

日本酒曲霉及其用于制备降胆固醇产品的用途
本发明涉及产生降胆固醇化合物的微生物以及这些微生物在制造具有降胆固醇性能的发酵食品比如生物水解物、大豆酱油或调味品中的用途。
生物水解物比如大豆酱油传统上是通过两步或三步法制造的：第一步是制造日本酒曲。在该第一步中，将煮制大豆或脱脂豆粉与烤制小麦混合，以日本酒曲霉培养物接种该混合物，在需氧和间歇搅拌的条件下培养1～4天来制造日本酒曲。第二步包括通过向初始水解中添加水和盐来制备酱醪。使该酱醪经酱醪酵母发酵约6～8个月。最后一步是实现使液体酱油与固体分离。
在本发明全文中，术语“日本酒曲”指的是蛋白质源和碳水化合物源的混合物经日本酒曲培养物发酵的产物，更具体地是煮制豆类或油料种子与煮制或烤制谷物的混合物，比如煮制大豆或菜豆与煮制或烤制小麦或稻米的混合物。
在本发明全文中，日本酒曲培养物指的是市场上可以获得的类型的培养物或日本酒曲霉孢子，特别是包含“黄曲霉”孢子。
发酵任何其他蛋白质源可以获得其他种类的生物水解物。这类优选含有富谷氨酸蛋白质的原料，比如油料种子饼、豆类或者谷蛋白，在脱水或液体汤、酱油和调味品组合物中以水解的形式广泛用作起始原料。
制备液体调味品所用的这类生物水解物非常受人欢迎，因为它们具有强烈且浓香的口味，因此在许多膳食中都用作调味品。这些水解物也可用作食品或调味品工业的香味原料，因为它们的香味变化万千。
现如今营养意识正引导着食品工业提供不仅具有最佳的风味特性而且还具有加强的营养功效的食品。过高的血清胆固醇水平是导致冠状动脉和外围血管粥样硬化的主要危害因素，这一重要性已为公众所认识。深入的临床研究得出结论，通过降低血清胆固醇水平可以减少罹患冠状动脉疾病的风险，特别是降低“低密度脂蛋白”的水平。因为身体中绝大部分的胆固醇都是经由肝脏中的从头生物合成过程而产生的，而通常仅有一小部分来自食物吸收，抑制胆固醇生物合成就成为降低高血浆胆固醇水平的特别引人注目的方法。
比如在亚洲国家，人们正在使用许多发酵产品，因为它们对健康有益。这些食品通常来自霉菌发酵的植物性原料。一个很好的例子是中国“Red-Yeast-Rice”，它是经红曲霉属霉菌发酵过的稻米。该产品含有红曲菌素类代谢产物，已表明其具有降胆固醇效果。这些红曲菌素属于“抑制素族”化合物，它们在胆固醇生物合成中起到酶抑制剂的作用，胆固醇的生物合成称为HMG-CoA向甲羟戊酸(mevalonate)转化的HMG-CoA还原酶感应。抑制素已成功地以纯形式应用于药品中，其主要功能就是降低LDL胆固醇(低密度脂蛋白胆固醇)的水平。该事实说明，HMG-CoA还原酶在胆固醇生物合成中起到关键酶的作用。因此，比如MERCK的产品MEVACOR含有从丝状霉菌土曲霉分离和纯化的洛伐他汀。该化合物也与抑制素族有关并且表现出抗HMG-CoA还原酶抑制活性。另一方面，PHARMANEX上市了“膳食补充品”Cholestin，它含有红曲菌素族分子，并且其中活性代谢产物是通过丝状霉菌紫色红曲霉产生的。
但是，已发现紫色红曲霉有可能会产生被称为枯霉素的肾毒性和/或诱变性化合物(Sabater-Vilar M，Maas RF和Fink-Gremmels J.Mutat.Res.1999年7月21日；444(1)：7-16)。因此，从法律、安全性和毒物学的观点出发，含有该霉菌的膳食补充用品Cholestine以及其他所有任何可能的食品的地位在美国和欧洲国家正受到严厉的抨击。土曲霉也会遇到同样的问题，因为已知它也有产生枯霉素的可能。
因此，土曲霉或紫色红曲霉并不是食品加工中适用的微生物，也不能直接用于食品中。因此，已知许多丝状霉菌可以产生属于抑制素族的化合物，但是这些霉菌不是“食品级”的，因为它们都有可能产生毒素并且因此而无法用于食品发酵方法中以及与此相关的食品中。
EP 556699(NOVOPHARM)公开了通过引入土曲霉基因组DNA将不产洛伐他汀的曲霉菌株(米曲霉)转变成产洛伐他汀的菌株。该专利教导可以利用基因改良方法作为获得产抑制素丝状霉菌的手段，该丝状霉菌具有“食品级”的地位。该专利所要求的米曲霉种丝状霉菌因而并非“天然的”而是来自重组体。
本发明的目的是提供天然的食品级微生物，以用于具有降胆固醇性能的发酵食品中。
作为天然或天然存在的微生物，应理解为是未经过基因改良并且可以从环境中筛选取得的微生物。
因此，本发明微生物是经过分离的天然存在微生物，该微生物不能制造毒素而是产生至少一种能够降低血清胆固醇浓度的化合物。
本发明的目的是提供天然存在的微生物，它不能制造毒素而是产生至少一种能够降低血清胆固醇浓度的发酵食品用化合物。
不能制造毒素指的是无论在什么样的环境和/或生长条件下该微生物均不具有制造毒素的能力。
本发明也涉及制造发酵食品比如蛋白质水解物的方法，其包括这些步骤：以本发明微生物接种含蛋白质原料以产生日本酒曲，向所得到的制剂中添加水并且水解所得到的制剂，从而获得水解物。
最后，本发明也涉及至少一种从本发明微生物产生的化合物在发酵食品中、在制造调节血清胆固醇水平用的食品或药物中或者在治疗与胆固醇有关的疾病中的用途。
因此，本发明的目的是提供具有降血清胆固醇性能的食品，其特征在于它含有至少一种从本发明微生物产生的化合物。
在本发明全文中，术语“发酵食品”指的是可食用产品，其制造方法包括至少一个与本发明至少一种微生物的应用有关的发酵步骤。而且，术语“可食用产品”也应该理解成摄入时对人体健康不产生毒害或毒副作用的产品。特别地，由于降胆固醇化合物的存在，这类“发酵食品”可提供有益健康的功效。实际上，本发明的微生物可以选自对人体摄入显示出安全史的微生物。
值得注意的是，得益于使用本发明微生物而获得的降胆固醇效果是通过抑制胆固醇生物合成来实现的。
在本发明特定的实施方案中，降胆固醇效果是通过抑制HMG-CoA还原酶来实现的。实际上，一种由本发明微生物所产生的降胆固醇化合物是洛伐他汀，该化合物能够通过HMG-CoA还原酶抑制作用来降低胆固醇的浓度。
但是，本发明微生物可产生至少一种降胆固醇化合物，该化合物不是洛伐他汀并且也能抑制胆固醇的生物合成。HMG-CoA还原酶使HMG-CoA催化转化成甲羟戊酸，但是该步骤只是整个胆固醇生物合成链中的一步。由本发明微生物所产生的至少一种化合物抑制了至少一个甲羟戊酸下游步骤。通过添加甲羟戊酸而跳过HMG-CoA/甲羟戊酸步骤，就可观察到这种下游抑制作用。
本发明微生物的一个重要特性是它不能产生毒素，特别是不能产生黄曲霉毒素。
所述能够产生至少一种降胆固醇化合物而不产生任何毒素的微生物是产品制造中所用的微生物，特别是丝状霉菌比如红曲霉、青霉并且更优选比如属于曲霉属的霉菌，前提是选择微生物时要基于它能够合成降胆固醇化合物，并且不能产生毒素。因此，该微生物可以选自种类众多的对人体摄入有安全史并且可用于制造食品或者可用于食品本身的微生物。
在本发明方法的优选实施方案中，通过应用本发明微生物所制造的食品可以是液体调味品，比如大豆酱油、调味品酱或粉。
本发明的微生物可用于传统的大豆酱油或调味品制造方法中。它也可以单独或者与其他日本酒曲霉组合而应用于任何方法中，比如EP0429760(制造调味剂用方法)、EP 0829205(调味产品)或EP 0824873(调味品制造方法)所述的方法。
本发明还一个目的是在制造调节血清低胆固醇水平用的发酵食品或药品中或者在治疗与胆固醇有关的疾病中应用本发明的微生物。
本发明的另一个目的是在制造调节血清低胆固醇水平用的发酵食品或药品中或者在治疗与胆固醇有关的疾病中应用至少一种从本发明微生物产生的化合物。
在所述方法的各个步骤中，具有特色的一步是采用至少一种本发明微生物来发酵植物原料，或比如采用至少一种本发明微生物与不产生降胆固醇化合物的传统发酵微生物的组合。该第一日本酒曲步骤也可以在添加了比如不同来源的蛋白酶的情况下进行。
在该方法涉及制造液体调味品比如大豆酱油的优选实施方案中，所述微生物是霉菌，比如优选属于曲霉属的日本酒曲霉，该日本酒曲霉是从各种不同的现有日本酒曲霉菌株中选择性筛选和分离出来的，基于其能够产生至少一种降胆固醇化合物而无法产生毒素。为达到该目的并且针对该优选的实施方案，根据布达佩斯条约于2000年6月14日和2000年7月27日在国立微生物保藏中心CNCM，CollectionNationale de Culture de Microorganismes，Institut Pasteur，Rue du Dr Roux，75724 Paris，France保藏了12株曲霉属菌株作为例示，被接收的是N°CNCM I-2489、CNCM I-2490、CNCM I-2525、CNCM I-2526、CNCM I-2527、CNCM I-2528、CNCM I-2529、CNCM I-2530、CNCM I-2531、CNCM I-2532、CNCM I-2533和CNCM I-2534。
在该优选的实施方案中，含蛋白质原料可以是植物原料比如小麦粒、大豆、稻米、玉米、油料种子或者植物原料的某部分，比如小麦面筋、麦麸，或者这些植物原料或植物原料部分的任何混合物。大豆酱油制造方法的不同步骤可以按照发酵酱油比如大豆酱油制造领域熟练人员的常规知识来实现。主要特征是使用或添加本发明的微生物，优选日本酒曲霉。
将粉碎的大豆，即豆粉浸泡几小时，然后使豆粉处于约120℃～140℃的温度几分钟，以此来蒸煮大豆原料。煮制大豆粉可以与粉碎的烤制麦粒，即烤制麦粉混合。
冷却后，以本发明的日本酒曲霉孢子或者这些霉菌孢子与比如来自供应商的常规孢子的混合物接种该混合物。然后使该混合物在具备间歇搅拌和恒定曝气的盘上或者专门为此目的而设计的工业设备中发酵。发酵步骤促使混合物中存在的日本酒曲霉制造蛋白酶，尤其促使混合物中存在的本发明霉菌制造至少一种能够降低胆固醇浓度的化合物。
日本酒曲混合物比如可以通过与水混合而得以悬浮。水解步骤比如在30℃～60℃下可以进行几个小时。
后续步骤可以按照本领域熟练人员已知的经典方法进行。因此，酱醪步骤可以通过添加盐和比如假丝酵母versatilis种或鲁氏糖酵母种常规酱醪酵母来实现。使按此方式接种的酱醪比如在搅拌和曝气下发酵几天直至几个月。
然后比如可以在压滤机中压制酱醪、除去不溶物并且将所获得的液体进行巴氏杀菌处理。
因此，通过该特定方法有可能获得发酵的液体调味品，比如大豆酱油，其口味和香味与通过传统方法所获得的发酵大豆酱油相当。该大豆酱油的主要特色，除了其香味之外，是其健康功效，这是因为其中含有至少一种降胆固醇化合物而不存在着任何毒素，比如黄曲霉毒素。
因此，该发酵液体调味品可以用作调味品和/或降胆固醇膳食补充品。
本发明的微生物可以是任何的食品微生物，它适宜用于制备发酵食品，它能够产生至少一种降胆固醇化合物但却不能制造毒素，因此可用于任何发酵食品的生产制造中。本发明的微生物可以是发酵的加香产品(比如日本清米酒、大豆酱油、蔬菜调味品和花生酱油)制造中存在的或者所用的丝状霉菌，前提是从所有天然存在的微生物中筛选和分离微生物时要基于其产生至少一种降胆固醇化合物而不产生毒素的能力。
因此，为了筛选和鉴别符合前述条件的微生物，可以将来自不同来源的不同种类的微生物进行核查并且经一种筛选方法，比如按照以下实施例中所述的方法。以下实施例是为了说明鉴别本发明微生物的一种筛选方法而给出的。该特异性筛选方法包括这些步骤：在生长培养基上培养微生物、制备并纯化该培养物粗抽提物并且将后者进行洛伐他汀和毒素分析以及测定胆固醇合成抑制的试验。这种方法可适用于任何一种微生物，以便核查它是否满足所需的基准。而且，培养微生物、分离并检测洛伐他汀和/或毒素、评价发酵抽提物对胆固醇生物合成的影响的其他任何等效方法均可用来鉴别该微生物是否满足基准要求并且符合本发明微生物的特性。
如下实施例中描述了用以筛选本发明微生物的方法。该方法并不限于所筛选的微生物。毒素检测和鉴别方法在这里只涉及黄曲霉毒素类化合物，但是可以对其进行改变和适应性修改而用于任何种类的毒性化合物。
实施例1
微生物生长条件：
采用约107个试验微生物分生孢子来接种处于250ml无遮板锥形瓶中的40毫升(ml)介质A以获得初级种子培养物。每升种子介质(介质A)含有10g葡萄糖、5g玉米浆、40g番茄酱、10g燕麦粉，和微量元素：1g FeSO4·7H2O、1g MnSO4·4H2O、200mg ZnSO4·7H2O、100mgCaCl2·2H2O、25mg CuCl·2H2O、56mg H3BO3和19mg (NH4)6Mo7O24·4H2O。这些培养物在30℃下在200rpm的轨道式摇动器中培养24h。
通过向1L含有200ml生产介质(B)的无遮板锥形瓶中添加6ml初级种子培养物就可以制备次级培养物。
每升生产介质(B)含有45g葡萄糖或乳糖、24g胨化牛奶、2.5g酵母抽提物和2.5g聚乙二醇P2000(pH为6.5)。将烧瓶在28℃下在200rpm的轨道式摇动器中振摇12天。
抽提和纯化：
发酵之后(280h)，将培养物(200ml)以80％甲醇(200ml)浸渍2h。混合物通过滤纸过滤并且蒸发滤液。以水回收粗的抽提物，以3N盐酸(HCl)酸化该溶液并且调节pH值到3。以乙酸乙酯(按体积比)多次萃取该含水抽提物。以无水硫酸钠干燥有机相并且在真空中蒸发之(30℃)以除掉有机溶剂。以10ml甲醇溶解残余物，用于分析色谱(HPLC和TLC)、光谱(LC、MS和LC/MS/MS)和体外试验(3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A还原酶[HMG-CoA还原酶；甲羟戊酸：NADP+氧化还原酶(CoA酰化)，EC 1.1.11.34]的酶抑制效果)，以鉴别并且定量洛伐他汀。通过HPLC来评价黄曲霉毒素的生成。
洛伐他汀分析：
通过高效液相色谱(HPLC)和质谱法来确定洛伐他汀。
HPLC分析：采用Nucleosil 100-5 C18柱(250×4mm)(Macherey& Nagel)，以及后柱(Lichrospher 100RP-18，Merck)。溶剂A：磷酸0.05％水溶液，溶剂B是乙腈。分离以线性梯度从95％A和5％B开始，然后在45min内达到50％A和50％B，在46min内达到30％A和70％B，然后在48min内达到10％A和90％B，最后在50min内达到0％A和100％B，然后继续等度处理4min。将初始条件保持6min以使柱再平衡。流率是1ml/min。采用的检测器是Hewlett Packard G1315 A 1100系列，检测波长为λmax＝254nm。
HPLC/MS和HPLC/MS/MS分析：分离采用Waters HPLC系统进行，该系统由757型自动取样器、带系统控制器的600-MS泵和486-MS型UV检测器构成。利用模拟输入将258nm处的UV吸收记录到质谱仪数据系统中。采用Nucleosil 100-C18 HPLC柱(250mm×4mm内径，Macherey & Nagel)，以及质谱仪之前的柱后1/10分流器。溶剂A是三氟乙酸0.1％水溶液，溶剂B是乙腈。流率采用1ml/min，分离以线性梯度从95％A和5％B开始，然后在30min内达到50％A和50％B，在31min内达到30％A和70％B，然后在33min内达到10％A和90％B，最后在35min内达到0％A和100％B，然后继续等度处理5min。在5min内达到了初始条件，并且将其保持5min以使柱再平衡。
质谱仪是配备有电雾化电离源的Finnigan TSQ 700三重四极质谱仪(San Jose，CA，USA)。利用在Ultrix 4.2A下运行的DECstation2100(Digital Equipment，USA)采用7.0版Finnigan软件包ICIS2来采集数据。传输毛细管设为200℃并且喷雾设为4.2kV。通过在1s内从m/z 50扫描至m/z 600以正模式获得了全程扫描质谱。按照试验室体系采用压力为1mTorr的氩作为碰撞气体以-15eV的碰撞能获得了m/z 20～m/z 450的子离子光谱。在选择性反应监控来自质子化m/z 405母离子的m/z 199、285和m/z 303子离子之后，采用相同的条件来检测洛伐他汀。通过LC/MS/MS来检测这些结构上密切相关的子离子，可实现样品中洛伐他汀的特异性测定。
黄曲霉毒素分析：
采用可在线检测电化学所产生的溴的柱后衍生手段和荧光检测通过等度HPLC法测定甲醇抽提物中每种黄曲霉毒素的浓度。采用反相ODS Hypersil柱(3μm，125mm×4.6mm内径)，连同ODS Hypersil保护柱(3μm，25mm×4.6mm内径)，均来自Metrohm-Bischoff AG(Leonberg，Germany)。流动相由水/乙腈/甲醇(体积比60∶5∶35)混合物构成，每升流动相含有119mg溴化钾和100μL 65％硝酸。以1.0ml/min的流率在室温下进行洗脱。柱后衍生系统由具有可变控制电源的KOBRA电池( Diagnostics TechnologiesLtd.，Galsgow，Scotland)构成。电流设置值调整为100μA。以Waters 470型扫描荧光检测仪(激发波长365nm，发射波长428nm)监控每种黄曲霉毒素。
通过按照Trucksess等人(1991)所述的程序采用基于免疫亲合柱提纯手段的选择性更强的方法确证了正培养物上层清液中黄曲霉毒素的存在。将1ml甲醇抽提物等分部分以50ml蒸馏水稀释并且施用至含有对黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2特异性的单克隆抗体的AflaTest-P免疫亲合柱(Vicam，Watertown，MA，USA)。在柱上分离、纯化并且浓缩毒素，利用纯甲醇使其与抗体分开，并且通过具备柱后衍生和荧光检测手段的反相HPLC定量之，其条件与之前所述相同。
胆固醇合成抑制试验：
使人类肝T9A4细胞在不含血清的LCM介质(Biofluids，Rockville，MD，USA)中在3.5％二氧化碳下在37℃生长。将这些细胞接种到24孔板中并且在不存在(对照)或存在发酵抽提物级分的情况下与1mM 14C乙酸(acetate)(1mCi/mmol，Amersham)一起培育20h。细胞也与1.17mM 14C甲羟戊酸(0.85mCi/mmol，Amersham)一起培育20h，以便评价由待测微生物所产生的化合物是否在HMG-CoA至甲羟戊酸的转化步骤的下游中还具有抑制效果。
通过以己烷∶异丙醇(3∶2)在室温下培育30min来进行两次类脂抽提。组合的抽提物在氮气下干燥、再次溶解在己烷中并且在己烷∶乙醚∶乙酸(75∶25∶1)溶剂混合物中进行高效薄层色谱(Merck，Darmstadt，Germany)分离。以瞬时成象设备(Camberra Packard，Zurich，Switzerland)测量向胆固醇中引入14C乙酸的程度来测定胆固醇的新合成情况，并且以占对照物百分数的形式表示之。
表1表示抽提物在14C乙酸存在下在人类肝T9A4细胞中的体外血胆固醇过少活性。很容易就可以看到，当使由本发明微生物经过发酵而获得的抽提物与细胞一起培育时，减少了人类肝T9A4细胞中的胆固醇合成。因为从A4和A27菌株获得的抽提物中洛伐他汀含量低于0.1μg/ml，因此所观察到胆固醇合成抑制效果可归因于抽提物中存在的洛伐他汀，但是还要归因于由其他不产生洛伐他汀的菌株所产生的与此类似的其他化合物。
由菌株A12、A21、A34、A39、A45、A50、A51、FJ2和FJ5所获得的抽提物不含有任何量的洛伐他汀(MS图谱未检出)，但是从表1可以看出，尽管不合洛伐他汀，但这些抽提物显示出强的胆固醇生物合成抑制活性。这表明，本发明的这些微生物产生了能够降低血清胆固醇浓度的非洛伐他汀化合物，其起到抑制剂的作用，可抑制至少一个处于HMG-CoA还原酶催化步骤下游的步骤。
图1表示以洛伐他汀标准物获得的MS图谱。图2和图3分别表示由本发明微生物菌株A-27和A-4经过发酵而获得的抽提物的MS图谱。这些菌株所获得的抽提物的洛伐他汀含量低于0.1μg/ml。
当然，本发明微生物所获得的抽提物均不含任何量的黄曲霉毒素。
表2显示抽提物在14C甲羟戊酸存在下在人类肝T9A4细胞中的体外胆固醇合成抑制活性。此时可以看到，洛伐他汀的存在并未抑制住胆固醇的生物合成，而菌株A21、A34、A39、FJ2和FJ5所获得的发酵抽提物却显示出明显的胆固醇生物合成抑制效果。这说明，这些菌株产生了至少一种抑制至少一个甲羟戊酸下游步骤的化合物。
  表1：菌株抽提物在14C乙酸存在下在人类肝试样中的体外hypocholesterolemic活性
  菌株代号   粗抽提物最终浓度(μg干物质/ml)   胆固醇合成抑制百分数
  A4   39   23
  A27   51   45
  A12   70   59
  A21   38   54
  A34   50   55
  A39   47   64
  A45   44   47
  A50   43   29
  A51   41   7
  FJ2   37   61
  FJ5   40   46
  LOVASTATIN   0,5   56
  表2：菌株抽提物在14C甲羟戊酸存在下在人类肝试样中的体外hypocholesterolemic活性
  菌株代号   粗抽提物最终浓度(μg干物质/ml)   胆固醇合成抑制百分数
  A21   38   82
  A34   50   66
  A39   47   72
  FJ2   37   64
  FJ5   40   42
  LOVASTATIN   0,5   0
实施例2
大豆日本酒曲发酵
将175g脱脂大豆(75重量％)和烤制小麦(25重量％)的混合物在盖严的高压釜中在120℃下蒸汽蒸煮7min，然后冷却到低于40℃。以109cfu本发明微生物(菌株A27)在SP2(20mM KH2PO4-HCl，pH值2.0，0.9％NaCl)中的分生孢子悬浮体接种该煮制大豆-小麦混合物。将该接种混合物转移到3L蘑菇培育袋(孔隙率25cc/min，160mm滤器，Van Leer，United Kingdom)中并且在Lab-Term培养箱(Kühner，Switzerland)中在30℃下培养最长70h。监测日本酒曲床的内温，使其不超过34℃。
所获得的日本酒曲用以按照实施例1所用的方法从液体细胞培养物制备抽提物。
从表3很容易就可看到，从固体日本酒曲发酵所获得的抽提物显示出胆固醇合成抑制性能。
实施例3
麦麸日本酒曲发酵
方法与实施例2相同，只是采用了120g麦麸(干物质：86％)+73g水+100μL乙酸的混合物，而不是大豆与烤制小麦的混合物。
按照与前述类似的方法获得抽提物。
从表3很容易就可看到，从固体日本酒曲发酵所获得的抽提物显示出胆固醇合成抑制性能。
  表3：固态菌株抽提物在14C乙酸存在下在人类肝试样中的体外hypocholesterolemic活性
  菌株代号   浓度(μg/ml)   胆固醇合成抑制百分数
  A27a(SK)   11   45
  A27b(WBK)   30   42
aK：大豆日本酒曲霉
bWB：麦麸日本酒曲霉

Claims (5)

1.经过分离的天然存在的微生物，其选自曲霉属保藏号CNCMI-2489、CNCM I-2490、CNCM I-2525、CNCM I-2526、CNCM I-2527、CNCM I-2528、CNCM I-2529、CNCM I-2530、CNCM I-2531、CNCM I-2532、CNCM I-2533和CNCM I-2534。
2.权利要求1所述的微生物在制造用于调节血清胆固醇水平或者治疗与胆固醇有关的疾病的食品或药物中的用途。
3.至少一种从权利要求1所述的微生物产生的化合物在制造用于调节血清胆固醇水平或者治疗与胆固醇有关的疾病的食品或药物中的用途。
4.制造发酵食品的方法，包括以下步骤：
-以包含至少一种权利要求1所述的微生物的接种物接种作物材料以实现发酵，
-水解所得到的制剂以获得水解物。
5.具有降血清胆固醇性能的食品，其特征在于它含有至少一种权利要求1所述的微生物产生的化合物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60218822T2 (de) * 2001-02-09 2007-07-12 Unilever N.V. Nahrungsmittel enthaltend sojaprotein und statin
JP2007267696A (ja) * 2006-03-31 2007-10-18 Gunze Ltd 焙煎紅麹およびその製造法
CN102654490A (zh) * 2011-03-02 2012-09-05 上海市食品药品检验所 液相色谱－串连质谱法测定五加科植物中真菌毒素含量的方法
CN102199544B (zh) * 2011-03-18 2012-07-04 天津科技大学 具有高效胆固醇降解能力的红曲霉m3菌株
CN105219653B (zh) * 2015-09-22 2018-08-03 浙江师范大学 产洛伐他汀的棒曲霉(Aspergillus clavatus)Ac-32菌株及其应用

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS59122428A (ja) * 1982-12-28 1984-07-14 Advance Res & Dev Co Ltd コレステロ−ル低下活性蛋白質
NZ245713A (en) * 1992-02-10 1994-12-22 Novopharm Ltd Production of the antibiotic lovastatin from genetically engineered aspergillus strains
CA2062023A1 (en) * 1992-02-10 1993-08-11 Jagroop S. Dahiya Novel fungal strains and use thereof in antibiotic production
HU208997B (en) * 1992-06-17 1994-02-28 Gyogyszerkutato Intezet Microbiological method for producing mevinoline
US5284758A (en) * 1992-08-14 1994-02-08 Merck & Co., Inc. Process for forming cholesterol lowering compound using pseudodiplodia sp.
FR2740471B1 (fr) * 1995-10-31 1997-12-19 Gervais Danone Co Ferments lactiques, et leur utilisation pour l'obtention de produits hypocholesterolemiants
US6046022A (en) * 1996-09-30 2000-04-04 Peking University Methods and compositions employing red rice fermentation products
US6064022A (en) * 1998-06-12 2000-05-16 Outokumpu Oyj Electrostatic separation of particles
US6372462B2 (en) * 1999-10-15 2002-04-16 Medmyco Ltd. Process for producing, methods and compositions of cholesterol lowering agents from higher basidiomycetes mushrooms

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