CN111876349B - 一株产聚赖氨酸的白色链霉菌及其应用 - Google Patents

一株产聚赖氨酸的白色链霉菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产聚赖氨酸的白色链霉菌及其应用，属于微生物领域。白色链霉菌菌株(Streptomyces ghanaensis)，保藏编号CCTCC NO:M 2020214。本发明的白色链霉菌FMME‑545具有较好的传代稳定性，在传代12代之后，其ε‑聚赖氨酸的生产能力均能够稳定在一定水平；在摇瓶水平上发酵生产ε‑聚赖氨酸产量达2.5～3.0g/L，在发酵罐水平上发酵生产ε‑聚赖氨酸产量达35～40g/L。本发明的发酵生产ε‑聚赖氨酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。

Description

一株产聚赖氨酸的白色链霉菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株产聚赖氨酸的白色链霉菌及其应用，属于微生物领域。
背景技术
ε-聚赖氨酸(ε-PL)是由链霉菌产生的由25～35个L-赖氨酸单体通过α-COOH和ε-NH2脱水缩合而成的同型L-赖氨酸聚合物。ε-PL固体粉末为淡黄色，吸湿性强，略有苦味，是赖氨酸的直链状聚合物。它不受pH值影响，对热稳定(120℃，20min)，能抑制耐热菌，故加入后可热处理。但遇酸性多糖类、盐酸盐类、磷酸盐类、铜离子等可能因结合而使活性降低。与盐酸、柠檬酸、苹果酸、甘氨酸和高级脂肪甘油酯等合用又有增效作用。分子量在3600—4300之间的ε-聚赖氨酸其抑菌活性最好，当分子量低于1300时，ε-聚赖氨酸失去抑菌活性。由于聚赖氨酸是混合物，所以没有固定的熔点，250℃以上开始软化分解。ε-聚赖氨酸溶于水，微溶于乙醇。
ε-PL作为一种新型食品防腐剂，相比于传统化学防腐剂和其他生物防腐剂,具有更广的抑菌谱(有效抑制G+、G-、酵母菌和霉菌等)、更好的水溶性、更强的热稳定性(100℃，30min或120℃，20min)和更广的pH适用范围(pH＜9.0)等优点。与此同时，ε-PL的添加不会影响食品原有的风味。另外，ε-PL作为高分子聚合物前体，还被用作生物可降解材料、乳化剂、高吸收性水凝胶、药物载体、抗癌增进剂和生物芯片外被等领域的研究和应用。目前，微生物发酵法生产ε-聚赖氨酸主要通过白色链霉菌直接发酵产生的。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一株产ε-聚赖氨酸的白色链霉菌(Streptomycesghanaensis)FMME-545，已于2020年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2020214，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
本发明的第二个目的是提供一种生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，将所述白色链霉菌加入发酵体系中进行发酵。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵体系中含有甘油50～70g/L，牛肉膏10～13g/L，(NH4)2SO45～7.5g/L，KH2PO41～4g/L，K2HPO4·3H2O1～4g/L，MgSO4·7H2O 1～2g/L，FeSO4·7H2O0.03～0.05g/L，ZnSO4·7H2O 0.03～0.04g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述甘油的浓度优选为60g/L，所述牛肉膏的浓度优选为13g/L，所述(NH4)2SO4的浓度优选为5g/L，所述KH2PO4的浓度优选为4g/L，所述K2HPO4·3H2O浓度优选为4g/L，所述MgSO4·7H2O浓度优选为2g/L，所述FeSO4·7H2O浓度优选为0.05g/L，所述ZnSO4·7H2O浓度优选为0.03g/L。
在本发明的一种实施方式中，接种量为6～12mL/100mL。
在本发明的一种实施方式中，接种量优选为8mL/100mL。
在本发明的一种实施方式中，发酵温度为28～32℃。
在本发明的一种实施方式中，发酵周期为168h～192h。
在本发明的一种实施方式中，接种前进行种子培养，所述种子培养在种子培养基中进行，使孢子终浓度为2×108个/mL。
在本发明的一种实施方式中，种子培养前进行斜面培养，所述斜面培养是指接种一环菌株于贝特纳斜面培养基，于30℃培养7～8天，得到种子液。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是将在每升培养基中含有4～8g湿菌体的种子液以6～12mL/100mL的接种量接种至发酵培养基，在28～32℃，发酵168h～192h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是采用两阶段pH值控制策略：第一阶段：当pH自然下降至3.2～3.4后，流加氨水使pH保持在3.2～3.4并维持10～14h；第二阶段：再将pH调整至3.9～4.0。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是采用两阶段pH值控制策略当pH自然下降至3.3后，流加50％的氨水使pH保持在3.2～3.4并维持12h，结束后将pH调整至4.0。
在本发明的一种实施方式中，在发酵72～84h后添加L-赖氨酸和/或L-谷氨酸，所述L-赖氨酸和/或L-谷氨酸在反应体系中的终浓度为1～10g/L，待L-赖氨酸和/或L-谷氨酸下降至0～0.1g/L，再补料至L-赖氨酸和/或L-谷氨酸在反应体系中的终浓度为1～10g/L，直至发酵结束。
在本发明的一种实施方式中，所述L-赖氨酸在反应体系中的终浓度为1～3g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述L-谷氨酸在反应体系中的终浓度为1～3g/L。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是采用甘油流加方法控制甘油初始浓度和发酵过程补料控制。
本发明的还保护所述白色链霉菌，或所述生产ε-聚赖氨酸的方法在生产ε-聚赖氨酸中的应用。
本发明的有益效果：本发明的白色链霉菌FMME-545具有较好的传代稳定性，在传代12代之后，其ε-聚赖氨酸的生产能力均能够稳定在一定水平；在摇瓶水平上发酵生产ε-聚赖氨酸产量达2.5～3.0g/L，在发酵罐水平上发酵生产ε-聚赖氨酸产量达35～40g/L。本发明发酵生产ε-聚赖氨酸的方法工艺操作简单易行、培养基成本低廉，适用于工业化生产。
生物材料保藏
本发明提供的白色链霉菌，分类命名为Streptomyces ghanaensisFMME-545，已于2020年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2020214，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
附图说明
图1为白色链霉菌的菌落形态图。
图2为白色链霉菌在摇瓶水平发酵过程ε-聚赖氨酸产量变化曲线图。
图3为白色链霉菌在发酵罐水平发酵过程ε-聚赖氨酸产量变化曲线图。
具体实施方式
贝特纳斜面培养基：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母粉1g/L，琼脂2g/L，115℃灭菌15min。
种子培养基(g/L)：葡萄糖50，酵母粉5，(NH4)2SO4 10，K2HPO4·3H2O 0.8，KH2PO41.36，MgSO4·7H2O 0.5，FeSO4·7H2O 0.03，ZnSO4·7H2O 0.04。
ε-聚赖氨酸的测定：
发酵液预处理：取发酵液8000r/min离心10min取上清。
比色法：将上清液用pH 6.9磷酸缓冲液适当稀释(稀释到聚赖氨酸浓度大约为0.1g/L)，取发酵液2ml与1mmol/L甲基橙水溶液2ml混合，于30℃下振荡反应30min。反应结束后，置离心机中以8000r/min，离心15min，取离心上清液用pH 6.9磷酸缓冲液稀释20倍后，以pH 6.9磷酸缓冲液为空白调零，于465nm处测吸光度，并根据标准曲线得到ε-聚赖氨酸的产量。
ε-聚赖氨酸标准曲线的绘制：称取0.15g聚赖氨酸标准品，用pH 6.9磷酸缓冲液定容到1L，得标准贮备液，再分别取标准贮备液2ml、4ml、6ml、8ml、10ml用pH6.9磷酸缓冲液定容到10ml容量瓶。分别取0.03g/L、0.06g/L、0.09g/L、0.12g/L、0.15g/L聚赖氨酸标准溶液2ml与1mmol/L甲基橙水溶液2ml混合，于30℃下振荡反应30min。反应结束后，置离心机中以8000rpm，离心15min，取离心上清液用pH 6.9磷酸缓冲液稀释20倍后，以pH6.9磷酸缓冲液为空白调零，于465nm处分别测吸光度。以ε-聚赖氨酸溶液的浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归方程的回归系数应该在0.990以上方可使用。
实施例1：菌株的筛选
(1)产ε-聚赖氨酸的白色链霉菌的诱变与筛选
将从土壤中筛选得到的白色链霉菌的孢子悬浮液涂布于含有不同浓度的链霉素(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/L、利福平(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L)的琼脂平板上，30℃培养6-8天，根据菌株生长情况，挑取直径较大或者与原始菌株差异较大的菌落，进行初筛，对产量提升较高得到菌株进行复筛，并涂布于贝特纳斜面培养基30℃培养7天。刮取适量的孢子接种于种子培养基中30℃培养24h，转接于发酵培养基中进行摇瓶发酵，200rpm、72h。发酵上清液与甲基橙混合反应，ε-聚赖氨酸产量达到1.81g/L。
(2)产ε-聚赖氨酸白色链霉菌的鉴定
将待测菌株的孢子接入种子培养基中，30℃，200r/min，培养24h后收集菌体，提取目的菌株的基因组DNA。16S rDNA片段的PCR扩增和测序由上海生工生物科技有限公司完成，将测序结果在Genbank数据库中与已有序列进行Blast比对分析，通过DNAMAN序列比对选取与白色链霉菌的16S rDNA序列相似性高达99％的菌株，将其命名为白色链霉菌FMME-545。
实施例2：白色链霉菌FMME-545的传代稳定性
将筛选得到的白色链霉菌FMME-545进行12代的传代培养，将10代以后的菌株接种至发酵培养基中进行摇瓶发酵。发酵结束后测定ε-聚赖氨酸产量，产量为1.81g/L。传代培养后ε-聚赖氨酸产量见表1。
表1白色链霉菌FMME-545传代培养后ε-聚赖氨酸产量
Figure BDA0002591994360000041
实施例3：发酵培养基的优化
斜面培养：接种一环菌株于斜面培养基，于30℃培养8天；
种子培养：向装液量100mL/500mL的种子培养基中接入孢子悬液，使孢子终浓度在2×108个/mL；温度30℃，摇床转速200r/min条件下，培养24h，至在每升培养基中含有4～8g湿菌体。
发酵培养：将种子液以8mL/100mL接种至发酵培养基，温度30℃，摇床转速200r/min条件下，发酵72h。
(1)发酵培养基碳源的优化
碳源分别为甘油(60g/L)和葡萄糖(60g/L)，培养基中的其他组分分别为酵母粉8g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，ZnSO4·7H2O0.04g/L。结果如表2所示，选择60g/L的甘油为碳源。
表2不同碳源的发酵培养基中ε-聚赖氨酸产量
碳源 浓度(g/L) ε-聚赖氨酸(g/L)
甘油 60 1.81
葡萄糖 60 1.43
(2)发酵培养基氮源的优化
在上述优化了发酵培养基中碳源的基础上，对发酵培养基中的氮源进行优化。
有机氮源分别为牛肉膏(7、10、13g/L)和酵母粉(5、7.5、10g/L)，培养基中的其他组分分别为甘油60g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，FeSO4·7H2O0.03g/L，ZnSO4·7H2O 0.04g/L。结果如表3所示，选取13g/L的牛肉膏作为氮源。
表3不同有机氮源的发酵培养基中ε-聚赖氨酸产量
Figure BDA0002591994360000051
无机氮源为(NH4)2SO4(5、7.5、10g/L)，培养基中的其他组分分别为甘油60g/L，牛肉膏13g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，ZnSO4·7H2O 0.04g/L。结果如表4所示，选择5g/L的(NH4)2SO4作为无机氮源。
表4不同浓度的无机氮源发酵培养基中ε-聚赖氨酸产量
Figure BDA0002591994360000052
(3)发酵培养基磷酸盐的优化
在上述氮源、碳源优化的基础上，对发酵培养基中磷酸盐做优化。
KH2PO4分别为0、1、2、4g/L，培养基中的其他组分分别为甘油60g/L，牛肉膏13g/L，(NH4)2SO4 5g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，ZnSO4·7H2O 0.04g/L。结果如表5所示，选择4g/L的KH2PO4。
表5不同浓度的KH2PO4的发酵培养基中ε-聚赖氨酸产量
Figure BDA0002591994360000061
K2HPO4·3H2O分别为0、1、2、4g/L，培养基中的其他组分分别为甘油60g/L，牛肉膏13g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO44 g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，ZnSO4·7H2O0.04g/L。结果如表6所示，K2HPO4·3H2O的浓度选取为4g/L。
表6不同浓度的K2HPO4·3H2O发酵培养基中ε-聚赖氨酸产量
Figure BDA0002591994360000062
(4)发酵培养基金属离子的优化
在上述氮源、碳源、磷酸盐优化的基础上，对发酵培养基中金属离子做优化。
①Mg2+的优化
MgSO4·7H2O浓度分别为0、1、2g/L，培养基中的其他组分分别为甘油60g/L，牛肉膏13g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 4g/L，K2HPO4·3H2O4 g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，ZnSO4·7H2O0.04g/L。结果表7所示，MgSO4·7H2O浓度选取2g/L。
表7不同浓度MgSO4·7H2O的发酵培养基中ε-聚赖氨酸产量
浓度(g/L) ε-聚赖氨酸(g/L)
0 2.21
1 2.45
2 2.52
②Fe2+的优化
FeSO4·7H2O浓度分别为0、0.03、0.05g/L，培养基中的其他组分分别为甘油60g/L，牛肉膏13g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 4g/L，K2HPO4·3H2O4 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，ZnSO4·7H2O 0.04g/L。结果如表8所示，FeSO4·7H2O浓度选取0.05g/L。
表8不同浓度FeSO4·7H2O的发酵培养基中ε-聚赖氨酸产量
浓度(g/L) ε-聚赖氨酸(g/L)
0 2.39
0.03 2.52
0.05 2.56
③Zn2+的优化
ZnSO4·7H2O浓度分别为0、0.03、0.04g/L，培养基中的其他组分分别为甘油60g/L，牛肉膏13g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 4g/L，K2HPO4·3H2O4 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L。结果如表9所示，ZnSO4·7H2O浓度选取0.03g/L。
表9不同浓度ZnSO4·7H2O的发酵培养基中ε-聚赖氨酸产量
浓度(g/L) ε-聚赖氨酸(g/L)
0 2.48
0.03 2.61
0.04 2.56
通过优化实验，最终确定了最优的发酵培养基组分为：
发酵培养基(g/L)：甘油60g/L，牛肉膏13g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 4g/L，K2HPO4·3H2O4 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，ZnSO4·7H2O 0.03g/L。
结果如图2所示，在发酵了72h，ε-聚赖氨酸产量达到2.61g/L。
实施例4：发酵罐发酵pH的优化
斜面培养、种子培养条件同实施例3。
发酵培养：将种子液以8mL/100mL接种至发酵培养基，温度30℃，初始搅拌转速为200r/min，通气量为2.5L/min，初始pH为6.8。发酵培养基成分为甘油60g/L，牛肉膏13g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 4g/L，K2HPO4·3H2O4 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，ZnSO4·7H2O 0.03g/L。
当pH分别自然下降至3.0、3.1、3.2、3.3、3.4，流加50％的氨水维持相应的pH(3.0、3.1、3.2、3.3、3.4)12h后，重新将pH回调至3.8。发酵192h后测定ε-聚赖氨酸的终产量，结果如表10所示。
表10自然下降的pH值对ε-聚赖氨酸产量的影响
Figure BDA0002591994360000071
Figure BDA0002591994360000081
当pH自然下降至3.3后，流加50％的氨水维持12h后，重新将pH分别回调至3.6、3.7、3.8、3.9、4.0。发酵192h后测定ε-聚赖氨酸的终产量，结果如表11所示。
表11回调后的pH值对ε-聚赖氨酸产量的影响
L-赖氨酸浓度(g/L) ε-聚赖氨酸(g/L)
3.6 28.9
3.7 29.2
3.8 31.5
3.9 32.1
4.0 33.9
通过优化实验，最终确定了最优的pH调控策略为：当pH自然下降至3.3后，流加50％的氨水维持12h后，重新将pH回调至4.0。
实施例5：补料添加前体物质对发酵的影响
斜面培养、种子培养条件及发酵培养同实施例4。
在上述优化了发酵培养基以及pH调控策略的基础上，添加前体物质(L-赖氨酸和L-谷氨酸)，进一步罐上优化。
(1)L-赖氨酸的优化
L-赖氨酸在发酵体系中的浓度分别为1、2、3、4、5g/L，发酵培养基成分为甘油60g/L，牛肉膏13g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 4g/L，K2HPO4·3H2O4 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，ZnSO4·7H2O 0.03g/L。L-赖氨酸在发酵72h后开始添加相应浓度，待其下降至0-0.1g/L，再补料添加相应浓度的L-赖氨酸，直至发酵192h。结果如表12所示，在添加L-赖氨酸浓度为2g/L时，ε-聚赖氨酸产量比较高。在此条件下的ε-聚赖氨酸在发酵罐中的产量动态变化如图3所示，在发酵72h、96h、120h、156h、192h时，ε-聚赖氨酸产量分别可达16.82、24.53、31.15、35.82、39.50g/L。
表12不同浓度L-赖氨酸的发酵培养基中ε-聚赖氨酸产量
Figure BDA0002591994360000082
Figure BDA0002591994360000091
(2)L-谷氨酸的优化
L-谷氨酸在发酵体系中的浓度分别为1、2、3、4、5g/L，发酵培养基成分为甘油60g/L，牛肉膏13g/L，(NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 4g/L，K2HPO4·3H2O4 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，FeSO4·7H2O 0.05g/L，ZnSO4·7H2O 0.03g/L。L-谷氨酸在发酵72h后开始添加相应浓度，待其下降至0-0.1g/L，再补料添加相应浓度的L-谷氨酸，直至发酵192h，结果如表13所示。
表13不同浓度L-谷氨酸的发酵培养基中ε-聚赖氨酸产量
L-谷氨酸浓度(g/L) ε-聚赖氨酸(g/L)
1 36.9
2 38.1
3 35.3
4 31.5
5 31.2
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (8)

1.一株白色链霉菌(Streptomyces ghanaensis)，已于2020年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO:M 2020214。
2.一种生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，将权利要求1所述白色链霉菌加入发酵体系，发酵生产ε-聚赖氨酸；所述发酵体系中含有甘油50～70g/L，牛肉膏10～13g/L，(NH4)2SO45～8g/L，K2HPO4·3H2O 1～4g/L，KH2PO41～4g/L，MgSO4·7H2O 1～3g/L，FeSO4·7H2O0.03～0.06g/L，ZnSO4·7H2O 0.02～0.05g/L。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将4～8g/L的白色链霉菌以体积比6～12％的接种量接种至发酵体系中。
4.据权利要求3所述的方法，其特征在于，发酵温度为28～32℃，发酵72～192h。
5.据权利要求4所述的方法，其特征在于，使pH自然下降，当pH下降至3.0～3.4，调节pH使其维持在3.0～3.4并保持8～24h，再将pH调至3.8～4.0，继续发酵。
6.据权利要求5所述的方法，其特征在于，发酵60h～96h后添加L-赖氨酸和/或L-谷氨酸，添加终浓度为1～10g/L。
7.据权利要求6所述的方法，其特征在于，待L-赖氨酸和/或L-谷氨酸下降至0～0.1g/L，补料至L-赖氨酸和/或L-谷氨酸在反应体系中的终浓度为1～10g/L，直至发酵结束。
8.权利要求1所述白色链霉菌或权利要求2～7任一所述方法在生产ε-聚赖氨酸中的应用。
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