CN111979283B - 一种利用复合菌种发酵生产阿维菌素的方法 - Google Patents

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    • C12P39/00—Processes involving microorganisms of different genera in the same process, simultaneously

Abstract

本发明公开了一种利用复合菌种发酵生产阿维菌素的方法，本发明在采用气升式环流反应器作为发酵容器的同时采用阿维链霉菌和顶头孢霉菌的复合菌株进行发酵培养生产阿维菌素，有效降低了发酵培养过程中的COD，显著增加了发酵液中阿维菌素的效价。

Description

一种利用复合菌种发酵生产阿维菌素的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及到一种利用复合菌种发酵生产阿维菌素的方法。
背景技术
阿维菌素Avermectins是具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的一簇结构相似的十六元大环内酯类抗生素，由链霉菌中灰色链霉菌Streptomyces avermitilis发酵产生。天然阿维菌素含有结构相近的8个同系物组分，主要4种有A1a、A2a、B1a和B2a，其总含量≥80％；对应的4个比例较小的同系物是A1b、A2b、B1b和B2b，其总含量≤20％。阿维菌素广泛应用于农业，是一种常见的农药品种，作为杀虫剂，用于防治十字花科小菜蛾、棉铃虫、螨类、菜青虫等。
在本发明的在先申请CN109517865A中，提出利用气升式环流反应器分批补料发酵生产阿维菌素的方法。其包含以下步骤：将阿维链霉菌接种至斜面培养基培养，取孢子斜面，制备成孢子悬浮液；将孢子悬浮液接种到种子培养基，培养至对数生长期；将培养至对数生长期的阿维链霉菌孢子悬浮液移种至装有发酵培养基的气升式环流反应器中进行发酵培养，发酵中后期分批添加补料培养基。在该发明专利申请中，只提及了采用阿维链霉菌进行发酵，由此所得到的发酵液中阿维菌素的效价约为6000-6300mg/L，其仍然有进一步改善的空间。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种利用复合菌种发酵生产阿维菌素的方法，该方法充分利用复合菌种的发酵能力，有效降低了发酵过程中的COD的排放，且使得阿维菌素的发酵效价得到明显提升，极大的降低了生产成本。
如本文所用，除非特别指出，则“约”是指±10％范围内。
具体而言，本发明中利用复合菌种发酵生产阿维菌素的方法，包括以下步骤：
步骤1，将阿维链霉菌和顶头孢霉菌分别接种至斜面培养基培养，取孢子斜面，分别制备成阿维链霉菌孢子悬浮液和顶头孢霉菌孢子悬浮液；
步骤2，将步骤1中得到的阿维链霉菌孢子悬浮液和顶头孢霉菌孢子悬浮液混合液接种到种子培养基，培养至对数生长期得到复合菌种悬液；
步骤3，将步骤2中培养至对数生长期的复合菌种悬液移种至发酵培养基进行发酵培养；
所述步骤3中发酵培养的反应器为气升式环流反应器，发酵方式为分批补料发酵。
进一步的，所述步骤2中阿维链霉菌孢子悬浮液和顶头孢霉菌孢子悬浮液混合液含有0.9-1.5×108个/ml阿维链霉菌孢子菌和1.1-0.5×108个/ml顶头孢霉菌孢子菌。
进一步的，所述斜面培养基包含葡萄糖、琼脂粉、牛肉膏和磷酸二氢钾；
进一步的，斜面培养基包含5-50g/L葡萄糖、5-50g/L琼脂粉、5-50g/L牛肉膏和0.1-2g/L磷酸二氢钾；优选的，所述斜面培养基包含5-30g/L葡萄糖、5-30g/L琼脂粉、5-30g/L牛肉膏和0.1-1g/L磷酸二氢钾；更优选的，所述斜面培养基包含15-30g/L葡萄糖、15-30g/L琼脂粉、5-10g/L牛肉膏和0.5-1g/L磷酸二氢钾；
进一步的，所述斜面培养基的pH为6.0-8.0；优选为6.5-8.0；优选为6.5-7.5；优选为7-7.5；更优选为7-7.2；
进一步的，所述斜面培养基的灭菌条件为115-125℃，20-35min，灭菌压力为0.05-0.3Mpa；优选为115-121℃，20-30min，灭菌压力为0.05-0.2Mpa；更优选为121℃，30min，灭菌压力为0.15Mpa；
进一步的，所述种子培养基包含玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、花生粉和消泡剂；
进一步的，所述种子培养基包含10-90g/L玉米淀粉、5-50g/L黄豆饼粉、5-50g/L酵母粉、5-50g/L花生粉、0.1-20g/L消泡剂；优选的，所述种子培养基包含20-70g/L玉米淀粉、5-30g/L黄豆饼粉、5-30g/L酵母粉、5-30g/L花生粉、0.1-10g/L消泡剂；优选的，所述种子培养基包含10-40g/L玉米淀粉、10-40g/L黄豆饼粉、10-40g/L酵母粉、10-30g/L花生粉、0.1-5g/L消泡剂；更优选的，所述种子培养基包含20-30g/L玉米淀粉、20-30g/L黄豆饼粉、20-30g/L酵母粉、10-20g/L花生粉、0.1-5g/L消泡剂。出人意料的，本发明采用相同的种子培养基可以同时实现阿维链霉菌孢子悬浮液和顶头孢霉菌孢子悬浮液的培养。
进一步的，所述种子培养基的pH为6.0-8.0；优选为6.5-8.0；优选为6.5-7.5；优选为7-7.5；更优选为7-7.2；
进一步的，所述种子培养基的灭菌条件为115-125℃，20-35min，灭菌压力为0.05-0.3Mpa；优选为115-121℃，20-30min，灭菌压力为0.05-0.2Mpa；更优选为121℃，30min，灭菌压力为0.15Mpa；
进一步的，所述发酵培养基包含玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、硫酸铵、碳酸钙和消泡剂；
进一步的，所述发酵培养基包含50-200g/L玉米淀粉、5-100g/L黄豆饼粉、5-50g/L酵母粉、0.01-10g/L硫酸铵、0.5-10g/L碳酸钙和0.1-10g/L消泡剂；优选的，所述发酵培养基包含50-150g/L玉米淀粉、10-50g/L黄豆饼粉、5-30g/L酵母粉、0.02-5g/L硫酸铵、0.5-5g/L碳酸钙和0.1-5g/L消泡剂；更优选的，所述发酵培养基包含80-130g/L玉米淀粉、20-40g/L黄豆饼粉、5-15g/L酵母粉、0.01-0.5g/L硫酸铵、0.5-3g/L碳酸钙和0.1-3g/L消泡剂；
进一步的，所述发酵培养基的pH为6.0-8.0；优选为6.5-8.0；优选为6.5-7.5；优选为7-7.5；更优选为7-7.2；
进一步的，所述发酵培养基的灭菌条件为125-145℃，维持8-25min，灭菌压力为0.3-0.7Mpa；优选为125-135℃，10-20min，灭菌压力为0.4-0.6Mpa；更优选为130℃，15min，灭菌压力为0.5Mpa；
进一步的，所述步骤3中发酵培养的反应器为气升式环流反应器；
进一步的，所述发酵培养的发酵方式为分批补料发酵；
进一步的，所述分批补料的方式为：发酵进行到120-170h、190-220h和240-290h时，分别加入补料培养基；
进一步的，所述分批补料的方式为：发酵进行到120-170h，总糖低于50g/L，还原糖低于15g/L时；发酵进行到190-220h，总糖低于55g/L，还原糖低于20g/L时；发酵进行到240-290h，总糖低于60g/L，还原糖低于20g/L时；分别加入补料培养基；优选为，发酵进行到130-160h，总糖低于50g/L，还原糖低于15g/L时；发酵进行到190-210h，总糖低于55g/L，还原糖低于20g/L时；发酵进行到250-280h，总糖低于60g/L，还原糖低于20g/L时；分别加入补料培养基；
进一步的，加入补料培养基后，调节发酵培养基的pH在6.0-8.0范围内；
进一步的，可以采用碳酸钠和氢氧化钠调节发酵培养基的pH；
进一步的，所述补料培养基包含玉米淀粉、消泡剂、碳酸钙和淀粉酶；
进一步的，所述淀粉酶为α-淀粉酶；
进一步的，所述补料培养基包含100-500g/L玉米淀粉、0.2-1g/L消泡剂、0.2-5g/L碳酸钙和0.1-1g/L淀粉酶；优选为，100-400g/L的玉米淀粉、0.2-0.8g/L消泡剂、0.2-1g/L碳酸钙和0.1-0.5g/L淀粉酶；更优选为，100-300g/L玉米淀粉、0.2-0.5g/L消泡剂、0.2-1g/L碳酸钙和0.1-0.5g/L淀粉酶；
进一步的，所述补料培养基(不含淀粉酶，淀粉酶在补料培养基的其他成分灭菌后，温度降至室温时加入)的灭菌条件为115-125℃，20-35min，灭菌压力为0.05-0.3Mpa；优选为115-121℃，20-30min，灭菌压力为0.05-0.2Mpa；更优选为121℃，30min，灭菌压力为0.15Mpa；
进一步的，所述斜面培养的具体步骤为：使用无菌接种针挖取砂土接种到斜面培养基上培养7-12天，培养条件为：温度25-32℃，湿度30-70％，向培养成熟的孢子斜面注入无菌水，然后刮下大量孢子，制备成孢子悬液；
进一步的，所述种子培养的具体步骤为：采用血球计数板计算孢子悬浮液中孢子的数量，然后将孢子悬浮液接种至种子培养基中，使每毫升种子培养基的孢子数量为2×107-4×109个，通气量40-100N m3/min，罐压为0.03-0.06Mpa，温度25-32℃，溶氧20-50％，进行种子培养40-65h，培养过程中pH控制在6.0-7.5之间，当菌浓不小于20％时，即可进行移种至盛装有发酵培养基的气升式环流反应器中；
进一步的，所述发酵培养的具体步骤为：将培养好的种子液按照发酵培养基体积的8％-15％进行移种，然后发酵培养，培养条件为：罐压为0.03-0.06Mpa，温度25-32℃，溶氧20-50％，培养过程中pH控制在6.0-7.5之间，通气量控制为：0-20h，控制通气量为150-250N m3/min；20-100h，控制通气量为200-300N m3/min；100-150h，控制通气量为150-250Nm3/min；150-300h，控制通气量为100-200N m3/min；发酵过程中分批补料；
进一步的，本发明的补料于发酵中后期进行，即发酵周期进行到120-300h时，每隔12h测试反应器中发酵培养基的总糖和还原糖，当发酵进行到120-170h，反应器内总糖低于50g/L，还原糖低于15g/L时，按照100-500g/L玉米淀粉、0.2-1g/L消泡剂、0.2-5g/L碳酸钙和0.1-0.5g/L淀粉酶的添加量，向反应器内加入补料培养基；发酵进行到190-220h，总糖低于55g/L，还原糖低于20g/L时，按照100-500g/L玉米淀粉、0.2-1g/L消泡剂、0.2-5g/L碳酸钙和0.1-0.5g/L淀粉酶的添加量，向反应器发酵培养基中加入补料培养基；发酵进行到240-290h，总糖低于60g/L，还原糖低于20g/L时，按照100-500g/L玉米淀粉、0.2-1g/L消泡剂、0.2-5g/L碳酸钙和0.1-0.5g/L淀粉酶的添加量，向反应器发酵培养基中加入补料培养基，发酵进行到300h时放罐，测定发酵液中阿维菌素的效价、发酵液过滤值和发酵滤液COD值；
进一步的，以上所述消泡剂为可用于发酵工艺中的油性消泡剂、有机硅消泡剂或复合油类消泡剂，优选为乳化硅油、有机硅或聚醚；
进一步的，所述气升式环流反应器的底部是环状空气分布器，空气分布器呈喷旋状分布，每一个喷射器顶部带有喷嘴，无菌空气通过分布器高速喷入发酵液中，空气与发酵液充分混匀将发酵液乳化，乳化后的发酵液通过位于底部的上升筒到中央的导流筒，与氧气充分混匀的发酵液通过空气向上的动力，在导流筒内外形成循环，导流筒内部是上升区，外部是下降区，使空气在整个反应器中分布均匀。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明采用气升式环流反应器作为发酵培养的反应容器的同时，采用特定配比范围的阿维链霉菌和顶头孢霉菌的复合菌种进行发酵，有效降低了发酵过程中的COD的排放，且使得阿维菌素的发酵效价得到明显提升，极大的降低了生产成本。虽然产生这一现象的机理并不十分明确，但推测是由于在发酵初期，培养基中玉米淀粉含量高，黏度大，但发酵中后期由于碳源消耗，培养基黏度降低，剪切力增大，对阿维菌素发酵产素不利；而且在阿维菌素次级代谢过程中产生的副产物种类繁多，有很多有害有毒物质会对阿维菌素的后期发酵产生抑制作用。而顶头孢霉菌产生的发酵产物头孢菌素C等能够降低有害有毒物质对于后期发酵的影响。
具体实施方式
以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。下述内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，本领域技术人员可以根据所公开的内容对本申请的发明作出多种改变和修饰，而其也应当属于本申请要求保护的范围之中。
下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的说明。本发明实施例中所使用的各种化学试剂如无特殊说明均通过常规商业途径获得。
本发明所用的阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis AV-2320-sucD1)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2015年06月09日，保藏编号：CGMCC No.10970。
本发明所用的顶头孢霉菌(Cephalosporins acremonium EY-1857J)，购买自上海一研生物科技有限公司。
种子发酵罐：冀能化工设计制造，80m3，装液量为50m3
气升式环流反应器：核工业第四研究院设计、中冶集团制造，750m3，装液量为500m3
通用搅拌式发酵罐：核工业第四研究院设计、中冶集团制造，550m3，装液量350m3
菌浓测定：取样摇匀发酵液后，准确量取10mL发酵液于带刻度的离心管中，离心机转速为4000rpm，10min，测得沉淀物的体积占10mL发酵液体积的百分含量即得菌浓。
总糖和还原糖的测定：使用菲林试剂法测定。
阿维菌素的效价测定：取发酵液1mL，加入无水甲醇9mL，充分振荡30min，转速3000rpm离心20min，取上清液，采用HPLC法测定阿维菌素的效价。色谱条件为色谱条件：Agilent1100型高效液相色谱仪：C18反相柱(250mm×4.0mm)；流动相为V(甲醇):V(水)＝9:1；流速为1.0mL/min；检测波长为246nm；柱温25℃；进样量20μL。
发酵液的过滤收率的测定：放罐重量乘以放罐效价即为发酵液折百产量，烘干后菌丝体效价乘以重量即为菌丝体折百产量，收率＝菌丝体产量/发酵液产量
发酵滤液COD测定：使用重铬酸钾法测定。
比较实施例1采用CN109517865A实施例1的方法发酵生产阿维菌素
斜面培养基(g/L)：葡萄糖25，琼脂粉25，牛肉膏10，磷酸二氢钾1，余量为水，调节pH 7.0，121℃灭菌30min，冷却至室温备用；
种子培养基(g/L)：玉米淀粉25，黄豆饼粉25，酵母粉12，花生粉12，消泡剂2.5，余量为水，调节pH 7.0，121℃灭菌30min，冷却至室温备用；
发酵培养基(g/L)：玉米淀粉110，黄豆饼粉25，酵母粉18，硫酸铵0.5，碳酸钙2.5，消泡剂3，余量为水，调节pH 7.0，121℃灭菌30min，冷却至室温备用；
补料培养基(g/L)：玉米淀粉300，消泡剂0.6，碳酸钙2.5，溶于适量水中，121℃灭菌30min，冷却至室温，添加淀粉酶0.3，备用；
(1)斜面培养：将阿维链霉菌接种到斜面培养基中，28℃，50％湿度条件下培养10天，选择长势良好，孢子饱满，颜色合适的斜面注入无菌水，用无菌针刮下大量孢子，制成孢子悬液。
(2)种子培养：采用血球计数板计算孢子悬浮液中孢子的数量，然后将孢子悬浮液接种至种子罐中的种子培养基中，使每毫升种子培养基的孢子数量为2×108个，通气量70Nm3/min，罐压0.05Mpa，DO 30％，28℃条件下培养，培养过程中pH控制在7.0，菌浓不低于20％时，移种。
(3)发酵培养：将(2)中培养好的种子液，按发酵培养基体积12％的接种量，接种到气升式环流反应器的发酵培养基中，罐压0.05Mpa，DO 30％，28℃条件下培养，培养过程中pH控制在6.7；发酵过程中，0-20h，控制通气量为200N m3/min；20-100h，控制通气量为250Nm3/min；100-150h，控制通气量为200N m3/min；150-300h，控制通气量为150N m3/min；
第一次补料：发酵至145h左右，检测到发酵液中总糖的含量为48.5g/L，还原糖的含量为14.6g/L，按照玉米淀粉300g/L，消泡剂0.6g/L，碳酸钙2.5g/L，淀粉酶0.3g/L的量，加入补料培养基，采用碳酸钠调节反应器中培养基的pH为6.7；
第二次补料：发酵至205h左右，检测到发酵液中总糖的含量为56.7g/L，还原糖的含量为16.5g/L，按照玉米淀粉300g/L，消泡剂0.6g/L，碳酸钙2.5g/L，淀粉酶0.3g/L的量，加入补料培养基，采用碳酸钠调节反应器中培养基的pH为6.7；
第三次补料：发酵至270h左右，检测到发酵液中总糖的含量为57.2g/L，还原糖的含量为17.1g/L，按照玉米淀粉300g/L，消泡剂0.6g/L，碳酸钙2.5g/L，淀粉酶0.3g/L的量，加入补料培养基，采用碳酸钠调节反应器中培养基的pH为6.7；
发酵培养至300h时放罐，测定发酵液中阿维菌素的效价，发酵液过滤收率以及发酵滤液COD值。
实施例1采用复合菌种发酵生产阿维菌素
实施例1与比较实施例1的区别在于，步骤(1)和(2)，具体为：
(1)斜面培养：分别将阿维链霉菌和顶头孢霉菌接种到不同的斜面培养基中，28℃，50％湿度条件下培养10天，选择长势良好，孢子饱满，颜色合适的斜面注入无菌水，用无菌针刮下大量孢子，分别制成阿维链霉菌和顶头孢霉菌孢子悬液。
(2)种子培养：采用血球计数板计算阿维链霉菌和顶头孢霉菌孢子悬浮液中孢子的数量，然后将阿维链霉菌和顶头孢霉菌孢子悬浮液接种至种子罐中的种子培养基中，使每毫升种子培养基的阿维链霉菌孢子数量为1.5×108个以及顶头孢霉菌孢子数量为0.5×108个，通气量70N m3/min，罐压0.05Mpa，DO 30％，28℃条件下培养，培养过程中pH控制在7.0，菌浓不低于20％时，移种。
(3)发酵培养同比较实施例1.
实施例2～5采用复合菌种发酵生产阿维菌素
实施例2～5与实施例1的区别在于，步骤(2)中阿维链霉菌和顶头孢霉菌的比例不同，具体参加表1。
比较实施例1和实施例1-5发酵液中阿维菌素的效价和发酵液过滤收率的测定实验结果如表1所示：
表1发酵液中阿维菌素的效价测定结果
Figure GDA0002725903620000081
根据实验结果可知，采用本发明提供的特定配比范围的复合菌种(阿维链霉菌和顶头孢霉菌的比例在0.9～1.5:1.1～0.5之间)发酵方法可以显著提高发酵液中阿维菌素的效价，降低发酵液的COD值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.利用复合菌种发酵生产阿维菌素的方法，包括以下步骤：
步骤1，将阿维链霉菌和顶头孢霉菌分别接种至斜面培养基培养，取孢子斜面，分别制备成阿维链霉菌孢子悬浮液和顶头孢霉菌孢子悬浮液；
步骤2，将步骤1中得到的阿维链霉菌孢子悬浮液和顶头孢霉菌孢子悬浮液混合液接种到种子培养基，培养至对数生长期得到复合菌种悬液；
步骤3，将步骤2中培养至对数生长期的复合菌种悬液移种至发酵培养基进行发酵培养；
所述步骤3中发酵培养的反应器为气升式环流反应器，发酵方式为分批补料发酵；
所述步骤2中阿维链霉菌孢子悬浮液和顶头孢霉菌孢子悬浮液混合液含有1.5×108个/ml阿维链霉菌孢子菌和0.5×108个/ml顶头孢霉菌孢子菌，或者1.2×108个/ml阿维链霉菌孢子菌和0.8×108个/ml顶头孢霉菌孢子菌，或者0.9×108个/ml阿维链霉菌孢子菌和1.1×108个/ml顶头孢霉菌孢子菌。
2.根据权利要求1所述的方法，所述种子培养基包含玉米淀粉、黄豆饼粉、酵母粉、花生粉和消泡剂。
3.根据权利要求1所述的方法，所述种子培养基包含10-90 g/L玉米淀粉、5-50 g/L黄豆饼粉、5-50 g/L酵母粉、5-50 g/L花生粉、0.1-20 g/L消泡剂。
4.根据权利要求1所述的方法，所述种子培养基包含20-70 g/L玉米淀粉、5-30 g/L黄豆饼粉、5-30 g/L酵母粉、5-30 g/L花生粉、0.1-10 g/L消泡剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分批补料的方式为：发酵进行到120-170 h、190-220 h和240-290 h时，分别加入补料培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述分批补料的方式为：发酵进行到120-170 h，总糖低于50 g/L，还原糖低于15 g/L时；发酵进行到190-220 h，总糖低于55 g/L，还原糖低于20 g/L时；发酵进行到240-290 h，总糖低于60 g/L，还原糖低于20 g/L时；分别加入补料培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述补料培养基包含玉米淀粉、消泡剂、碳酸钙和淀粉酶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述补料培养基包含100-500 g/L玉米淀粉、0.2-1 g/L消泡剂、0.5-5 g/L碳酸钙和0.1-0.5 g/L淀粉酶。
9.根据权利要求7或8任一项所述的方法，其特征在于，所述淀粉酶为α-淀粉酶。
10.根据权利要求7或8任一项所述的方法，其特征在于，加入补料培养基后，调节发酵培养基的pH在6.0-8.0范围内。
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