CN117305092A - 连续发酵方法、连续发酵系统 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物发酵技术领域。本发明公开了一种连续发酵方法、连续发酵系统。连续发酵方法包括：在连续发酵系统中接种菌株并在好氧环境下进行发酵培养；收集发酵液，经回收和/或纯化，得到发酵产物；其中，发酵培养中，根据发酵罐中的菌体浓度，控制流加到发酵罐的培养基的流加速率以及将发酵液排出发酵罐的排料速率。本发明通过检测菌体浓度，自适应改变排料速率，从而维持菌体浓度稳定，避免发酵液起泡严重，使得连续发酵过程可长时间高效稳定运行。
Description
技术领域
本发明涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种可以减少发酵生产时的气泡的连续发酵方法和一种连续发酵系统。
背景技术
在微生物发酵生产中往往会产生气泡，其中，鼠李糖脂在发酵过程中的起泡问题较为严重。鼠李糖脂是糖脂类生物表面活性剂，主要由铜绿假单胞菌和相关菌株产生。鼠李糖脂最突出的特性是它的表面活性，如能显著降低水的表面张力改变固体表面的润湿性，具有乳化、破乳、发泡、洗涤、分散与絮凝、抗静电和润滑等多种功能。
由于鼠李糖脂是一种强表面活性剂，在现有技术的发酵过程中会通过加入大量消泡剂来控制液位。特别是在鼠李糖脂的发酵后期，由于鼠李糖脂含量较高导致发酵液起泡严重，消泡剂用量急剧增加。而消泡剂的使用一方面会影响鼠李糖脂的产品质量，另一方面也增加了发酵成本。
因此，亟需一种可在发酵生产中减少气泡产生的发酵方法。
发明内容
本发明旨在解决现有技术中存在的发酵液起泡严重的问题，提供一种连续发酵方法和一种连续发酵系统。
本发明一方面，提供了一种连续发酵方法，包括：
在连续发酵系统中接种菌株并在好氧环境下进行发酵培养；
收集所述发酵培养得到的发酵液，经回收和/或纯化，得到发酵产物；
其中，所述发酵培养中，根据发酵罐中的菌体浓度，控制流加到发酵罐的培养基的流加速率以及将发酵液排出发酵罐的排料速率，包括：
检测所述发酵罐中的菌体浓度；
当所述菌体浓度大于或等于第一阈值时，流加所述培养基，并计算Qn1=K1-Kg×OD600×Kn，其中，Qn1为第一速率，K1为第一常数，Kg为菌体比生长速率，OD600为吸光值，反映菌体浓度，Kn为培养基转化系数，控制所述排料速率为所述第一速率；
当所述菌体浓度小于第一阈值时，流加所述培养基，并计算Qn2=K1+Kg×OD600×Kn，其中，Qn2为第二速率，控制所述排料速率为所述第二速率。
在一些实施方案中，所述发酵培养中，还根据期望的发酵罐中发酵产物的浓度控制碳源流加速率，包括：
根据期望的发酵罐中发酵产物的浓度，控制碳源流加速率为：Qc=Qm×Cm1/Km，其中，Qc为碳源流加速率，Cm1为期望的发酵罐中发酵产物的浓度，Km为碳源转化率，Qm为将发酵液排出发酵罐的排料流量，Qm=Vk×S×ρ，Vk为气泡上升速率，ρ为气泡密度，S为所述发酵罐的直径。
在一些实施方案中，所述发酵培养中，根据所述发酵罐中的产泡速率控制通气量和碳源的流加速率，包括：
在每个采样时刻，检测所述发酵罐中发酵产物的实时浓度和通气量，根据所述实时浓度和所述通气量计算产泡速率，如果当前采样时刻计算的产泡速率大于或等于上一采样时刻计算的产泡速率，则减少所述通气量；如果当前采样时刻计算的产泡速率小于上一采样时刻计算的产泡速率，则增加所述通气量；其中，所述产泡速率为：Vg=Km×exp（L/K2）×Cm×exp（T/K3），其中，Vg为所述产泡速率，Km为比例系数，L为所述通气量，T为搅拌转速，Cm为发酵产物的实时浓度，K2为第二常数，K3为第三常数，exp为自然指数。
在一些实施方案中，所述发酵产物为鼠李糖脂；所述菌株是能够通过发酵培养生产鼠李糖脂的菌株，优选恶臭假单胞杆菌。可以理解的是，当所期望的发酵产物为鼠李糖脂以外的物质时，也可以根据本领域的知识，将所述菌株替换为能够生产所期望的发酵产物的菌株。
在一些实施方案中，所述第一阈值为65-75，优选为70。
在一些实施方案中，所述期望的发酵罐中发酵产物的浓度为10-20 g/L。
在一些实施方案中，所述发酵培养中，加入的碳源选自大豆油、甘油、葡萄糖、棕榈油、餐厨废弃油脂中的至少一种。
在一些实施方案中，所述培养基为氮源培养基。可以理解的是，在所述发酵培养中，为了保证菌体的正常生长，可以按照本领域常规操作添加碳源。优选地，所述氮源培养基包含：2 g/L NaNO3、15.1 g/L KH2PO4、15.1 g/L Na2HPO4、0.08 g/L FeCl3·6H2O、0.75g/L ZnSO4·7H2O、0.08 g/L CoCl2·6H2O、0.075 g/L CuSO4·5H2O、0.75 g/L MnSO4·H2O、0.15 g/L H3BO3、0.05 g/L Na2MoO4·2H2O。
在一些实施方案中，所述培养基还可以是回收培养基，所述回收培养基是在发酵过程中去除了发酵液中的萃取剂、菌体和/或发酵产物后所得的液体，以降低生产成本。
在一些优选实施方案中，所述发酵培养中，根据发酵罐中的菌体浓度，控制流加到发酵罐的培养基的流加速率以及将发酵液排出发酵罐的排料速率，包括：
检测所述发酵罐中的菌体浓度；
当所述菌体浓度大于或等于第一阈值时，流加所述回收培养基，并计算Qn1=K1-Kg×OD600×Kn，其中，Qn1为第一速率，K1为第一常数，Kg为菌体比生长速率，OD600为吸光值，反映菌体浓度，Kn为培养基转化系数，控制所述排料速率为所述第一速率；
当所述菌体浓度小于第一阈值时，流加所述氮源培养基，并计算Qn2=K1+Kg×OD600×Kn，其中，Qn2为第二速率，控制所述排料速率为所述第二速率。
本发明提供的发酵方法中，所述连续发酵系统可以是本领域常用的、可以实现连续发酵的发酵系统。优选地，可以使用以下提供的连续发酵系统，以进一步减少气泡的产生、提高发酵效率。
另一方面，本发明提供了一种连续发酵系统，其可应用于本申请所述连续发酵方法中。本发明提供的所述连续发酵系统包括碳源补料罐、氮源补料罐、培养基缓冲罐、发酵罐、溢流罐、陶瓷膜、第一萃取离心装置、第二萃取离心装置以及气体塔，其中，所述碳源补料罐的出料口以及所述氮源补料罐的出料口分别与所述发酵罐的进料口可控连通，所述发酵罐的溢流口与所述溢流罐的进料口可控连通，所述溢流罐的出料口分别与所述陶瓷膜的进料口以及所述第一萃取离心装置的进料口可控连通，所述陶瓷膜的出料口与所述第二萃取离心装置的进料口可控连通，所述第二萃取离心装置的回收口与所述气体塔的进料口连通，所述气体塔的出料口与所述培养基缓冲罐的进料口可控连通，所述培养基缓冲罐的出料口与所述发酵罐的进料口可控连通。
在一些实施方案中，所述连续发酵系统还包括混合罐以及精馏塔，所述第一萃取离心装置的出料口以及所述第二萃取离心装置的出料口与所述混合罐的进料口可控连通，所述混合罐的出料口与所述精馏塔的进料口连通。
在一些实施方案中，所述第二萃取离心装置为离心萃取塔。
在一些实施方案中，所述第一萃取离心装置、所述第二萃取离心装置中的萃取剂选自三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、正庚烷、正癸烷、乙酸乙酯和乙腈中的至少一种。
在一些实施方案中，所述发酵罐的运行温度为30-37℃。
在一些实施方案中，所述发酵液的pH为6.8-7.1。
本发明提供的连续发酵方法，在发酵培养中，根据发酵罐中的菌体浓度，控制流加到发酵罐的回收培养基和氮源培养基的流加速率以及将发酵液排出发酵罐的排料速率，以自适应地改变发酵液排出发酵罐的排料速率，从而维持菌体浓度稳定，避免发酵液起泡严重，使得连续发酵过程可长时间高效稳定运行。
附图说明
图1为本发明一实施例中的连续发酵方法的工作流程图；
图2为本发明一实施例中的连续发酵系统的系统原理图；
图3为本发明一实施例中的连续发酵系统的生产速率图。
标记说明：
10-碳源补料罐；11-氮源补料罐；12-培养基缓冲罐；13-发酵罐；14-溢流罐；15-陶瓷膜；16-第一萃取离心装置；17-第二萃取离心装置；18-混合罐；19-气体塔；20-精馏塔；21-第一泵；22-第二泵。
具体实施方式
如图1所示，其为本发明一实施例中鼠李糖脂的连续发酵方法的工作流程图，包括：
步骤S101，在连续发酵系统中接种菌株并在好氧环境下进行发酵培养；
步骤S102，收集发酵培养得到的发酵液，经回收和/或纯化，得到发酵产物；
其中，发酵培养中，根据发酵罐中的菌体浓度，控制流加到发酵罐的培养基的流加速率以及将发酵液排出发酵罐的排料速率，包括：
检测所述发酵罐中的菌体浓度；
当菌体浓度大于或等于第一阈值时，流加培养基，并计算Qn1=K1-Kg×OD600×Kn，其中，Qn1为第一速率，K1为第一常数，Kg为菌体比生长速率，OD600为菌体浓度，Kn为培养基转化系数，控制排料速率为第一速率；
当菌体浓度小于第一阈值时，流加培养基，并计算Qn2=K1+Kg×OD600×Kn，其中，Qn2为第二速率，控制排料速率为第二速率。
具体地，执行步骤S101进行发酵培养，并执行步骤S102，收集发酵液，经回收和/或纯化，得到发酵产物。
其中，在发酵培养中，根据发酵罐中的菌体浓度，控制流加到发酵罐的培养基的流加速率以及将发酵液排出发酵罐的排料速率。
具体地，引入菌体浓度数学模型：
在线检测菌体浓度OD600，当OD600≥第一阈值时，流加培养基，Qn1=K1-Kg×OD600×Kn，其中，第一阈值优选为70，Qn1为第一速率，Kg为菌体比生长速率，与菌体活性有关，可以通过实验确定；优选地，Kg取0.09-0.12。Kn为培养基转化系数，K1为通过实验得到的第一常数，在针对鼠李糖脂连续发酵时，第一常数K优选为80。当OD600<第一阈值时，流加培养基，Qn2=K1+Kg×OD600×Kn，其中，Qn2为第二速率。控制排料速率Qs=第一速率Qn1或第二速率Qn2。
其中，排料速率为从发酵罐排出的速率。优选地，如图2所示，排料速率为发酵液从发酵罐13排出的速率。通过调整排料速率，从而调整菌体浓度，使得菌体浓度维持稳定。
本实施例的鼠李糖脂连续发酵方法，在发酵过程中采用萃取原位分离鼠李糖脂，解除了鼠李糖脂对发酵体系的影响，提高了鼠李糖脂的生产效率。同时，本实施例的鼠李糖脂连续发酵方法，在发酵培养中，根据发酵罐中的菌体浓度，控制流加到发酵罐的培养基的流加速率以及将发酵液排出发酵罐的排料速率，通过检测菌体浓度，自适应地改变排料速率，从而维持菌体浓度稳定，避免发酵液起泡严重，使得连续发酵过程可长时间高效稳定运行。
在另一个实施例中的鼠李糖脂的连续发酵方法的工作流程包括：
步骤S101，在连续发酵系统中接种菌株并在好氧环境下进行发酵培养；
步骤S102，收集发酵培养得到的发酵液，经回收和/或纯化，得到发酵产物；
其中，发酵培养中，根据发酵罐中的菌体浓度，控制流加到发酵罐的培养基的流加速率以及将发酵液排出发酵罐的排料速率，包括：
检测所述发酵罐中的菌体浓度；
当菌体浓度大于或等于第一阈值时，流加回收培养基，并计算Qn1=K1-Kg×OD600×Kn，其中，Qn1为第一速率，K1为第一常数，Kg为菌体比生长速率，OD600为菌体浓度，Kn为培养基转化系数，控制排料速率为第一速率；
当菌体浓度小于第一阈值时，流加氮源培养基，并计算Qn2=K1+Kg×OD600×Kn，其中，Qn2为第二速率，控制排料速率为第二速率。
具体地，执行步骤S101进行发酵培养，并执行步骤S102，收集发酵液，经回收和/或纯化，得到发酵产物。
其中，在发酵培养中，根据发酵罐中的菌体浓度，控制流加到发酵罐的培养基的流加速率以及将发酵液排出发酵罐的排料速率。
具体地，引入菌体浓度数学模型：
在线检测菌体浓度OD600，当OD600≥第一阈值时，流加回收培养基，Qn1=K1-Kg×OD600×Kn，其中，第一阈值优选为70，Qn1为第一速率，Kg为菌体比生长速率，与菌体活性有关，可以通过实验确定；优选地，Kg取0.09-0.12。Kn为培养基转化系数，K1为通过实验得到的第一常数，在针对鼠李糖脂连续发酵时，第一常数K优选为80。当OD600<第一阈值时，流加氮源培养基，Qn2=K1+Kg×OD600×Kn，其中，Qn2为第二速率。控制排料速率Qs=第一速率Qn1或第二速率Qn2。
其中，排料速率为从发酵罐排出的速率。优选地，如图2所示，排料速率为发酵液从发酵罐13排出的速率。通过调整排料速率，从而调整菌体浓度，使得菌体浓度维持稳定。
如图2所示，当OD600≥第一阈值时，打开阀门V-521，关闭阀门V-519，连通发酵罐13与培养基缓冲罐12，流加回收培养基；当OD600<第一阈值时，打开阀门V-519，关闭阀门V-521，连通发酵罐13与氮源补料罐11，流加氮源培养基。培养基缓冲罐12中为回收培养基，氮源补料罐11中为氮源培养基。
其中，回收培养基是在发酵过程中去除了发酵液中的萃取剂、菌体和/或发酵产物后所得的液体。
氮源培养基包含：2 g/L NaNO3、15.1 g/L KH2PO4、15.1 g/L Na2HPO4、0.08 g/LFeCl3·6H2O、0.75 g/L ZnSO4·7H2O、0.08 g/L CoCl2·6H2O、0.075 g/L CuSO4·5H2O、0.75g/L MnSO4·H2O、0.15 g/L H3BO3、0.05 g/L Na2MoO4·2H2O。
本实施例的鼠李糖脂连续发酵方法，在提高了鼠李糖脂的生产效率、避免发酵液起泡严重、使得连续发酵过程可长时间高效稳定运行的同时，实现了发酵液的回收利用，降低了生产成本。
在其中一个实施例中，所述发酵培养中，根据期望的发酵罐中发酵产物（例如，鼠李糖脂）的浓度控制碳源流加速率，包括：
根据期望的发酵罐中发酵产物的浓度，控制碳源流加速率为：Qc=Qm×Cm1/Km，其中，Qc为碳源流加速率，Cm1为期望的发酵罐中发酵产物的浓度，Km为碳源转化率，Qm为将发酵液排出发酵罐的排料流量，Qm=Vk×S×ρ，Vk为气泡上升速率，ρ为气泡密度，S为所述发酵罐的直径。
具体来说，预先设定期望的鼠李糖脂浓度，并根据期望的鼠李糖脂浓度计算并控制碳源流加速率Qc。其中，Qc=Qm×Cm1/Km，其中，Qc为碳源流加速率，Cm1为期望的发酵罐中鼠李糖脂浓度，Km为碳源转化率，在针对鼠李糖脂连续发酵时，碳源转化率为碳源到鼠李糖脂的转化率，优选为0.51-0.55，Qm为进入溢流罐14的流量，Qm=Vk×S×ρ，Vk为气泡上升速率，ρ为气泡密度，S为发酵罐13的直径。
本实施例通过控制碳源流加速率，以维持鼠李糖脂浓度稳定，使得连续发酵稳定运行。
在其中一个实施例中，发酵培养中，根据发酵罐中的产泡速率控制通气量和碳源的流加速率，包括：
在每个采样时刻，检测发酵罐中发酵产物（例如，鼠李糖脂）的实时浓度和通气量，根据实时浓度和通气量计算产泡速率，如果当前采样时刻计算的产泡速率大于或等于上一采样时刻计算的产泡速率，则减少通气量；如果当前采样时刻计算的产泡速率小于上一采样时刻计算的产泡速率，则增加通气量；其中，所述产泡速率为：Vg=Km×exp（L/K2）×Cm×exp（T/K3），其中，Vg为产泡速率，Km为比例系数，L为通气量，T为搅拌转速，Cm为发酵产物的实时浓度，K2为第二常数，K3为第三常数，exp为自然指数。
具体来说，引入气泡生产速率模型：Vg=Km×exp（L/K2）×Cm×exp（T/K3）, 其中，Km为比例系数，Vg为产泡速率（或称气泡生产速率），即单位时间气泡上升高度，L为通气量，T为搅拌转速，Cm为鼠李糖脂浓度，K2为第二常数，优选为25，K3为第三常数，优选为250。通过微调通气量L，控制产泡速率Vg恒定。
其中，通气量为向发酵罐13中的鼓气量，碳源流加速率为碳源补料罐10的输出流量。
本实施例根据产泡速率调整通气量，使得产泡速率恒定，以使得连续发酵稳定运行。
在一些实施例中，连续向发酵罐13中流加碳源以及氮源，且根据发酵罐13的菌体浓度，控制流加速率和排料速率，根据期望的鼠李糖脂浓度控制碳源流加速率，根据发酵罐13中的产泡速率，控制通气量和碳源流加速率。
在其中一个实施例中，发酵培养所用的碳源选自大豆油、甘油、葡萄糖、棕榈油、餐厨废弃油脂中的至少一种。
在其中一个实施例中，发酵液pH为6.8-7.1。
本发明提供的连续发酵方法适用于对任意菌株在好氧环境下进行发酵培养，从而获得该菌株的发酵产物。特别地，本发明提供的连续发酵方法特别适合用于在发酵过程中容易产生气泡的情况，从而减少起泡，提升发酵效率和产物产量（当发酵产物为鼠李糖脂时，收率>99%）。在其中一个实施例中，发酵产物为鼠李糖脂，相应地，菌株是能够通过发酵培养生产鼠李糖脂的菌株，优选恶臭假单胞杆菌。
在其中一个实施例中，所述第一阈值为65-75，优选为70。
第一阈值用于限制发酵罐内的菌体浓度，使得菌体浓度保持在第一阈值范围内。因此，当第一阈值过高，则菌体浓度过高，会影响碳源转化率；而当第一阈值过低，则菌体浓度过低，会降低产率。
本实施例通过限制第一阈值在合适范围，从而使得菌体浓度保持在合适范围，一方面避免影响碳源转化率，另一方面避免降低产率。
在其中一个实施例中，所述期望的发酵罐中发酵产物的浓度为10-20 g/L。
本实施例中，根据期望的发酵罐中发酵产物的浓度来设置碳源流加速率，从而使得发酵罐内发酵产物的浓度保持在期望的发酵罐中发酵产物的浓度，避免浓度过低降低产量，也避免浓度过高，导致产泡速率过高，控制不住液位。
本实施例通过限制期望的发酵罐中发酵产物的浓度在合适的范围，从而控制碳源流加速率，以维持发酵罐中发酵产物的浓度稳定在合适的范围内，一方面避免降低产率，另一方面避免无法控制液位。
如图2所示，其为本发明其中一个实施例中的连续发酵系统，包括碳源补料罐10、氮源补料罐11、培养基缓冲罐12、发酵罐13、溢流罐14、陶瓷膜15、第一萃取离心装置16、第二萃取离心装置17以及气体塔19，其中，碳源补料罐10的出料口以及氮源补料罐11的出料口分别与发酵罐13的进料口可控连通，发酵罐13的溢流口与溢流罐14的进料口可控连通，溢流罐14的出料口分别与陶瓷膜15的进料口以及第一萃取离心装置16的进料口可控连通，陶瓷膜15的出料口与第二萃取离心装置17的进料口可控连通，第二萃取离心装置17的回收口与气体塔19的进料口连通，所述气体塔19的出料口与培养基缓冲罐12的进料口可控连通，培养基缓冲罐12的出料口与发酵罐13的进料口可控连通。
具体地，碳源补料罐10的出料口通过阀V-515与发酵罐13的进料口连通，氮源补料罐11的出料口通过阀V-519与发酵罐13的进料口可控连通，同时，洁净空气通入发酵罐13。发酵罐13的溢流口通过溢流阀V-516与溢流罐14的进料口可控连通，溢流罐14的出料口分别通过第一泵21与陶瓷膜15的进料口以及通过第二泵22与第一萃取离心装置16的进料口可控连通，陶瓷膜15的出料口通过阀V-520与第二萃取离心装置17的进料口可控连通。同时，萃取剂通过阀V-525进入第一萃取离心装置16，萃取剂通过阀V-524进入第二萃取离心装置17。第二萃取离心装置17的回收口通过V-522与气体塔19连通，气体塔19通过阀V-518与培养基缓冲罐12的进料口可控连通，培养基缓冲罐12的出料口通过阀V-521与发酵罐13的进料口可控连通。同时洁净空气通入气体塔19，气体塔19排出有机废气。
在一些实施例中，陶瓷膜15的回收口通过阀V-523与发酵罐13的回收口可控连通。
本实施例的连续发酵系统包括碳源补料罐、氮源补料罐、培养基缓冲罐、发酵罐、溢流罐、陶瓷膜、第一萃取离心装置、第二萃取离心装置，在整个系统中，无消泡剂引入，提升产品质量，降低发酵成本。本实施例提供的连续发酵系统特别适合与本发明提供的连续发酵方法配合用于发酵培养，可以进一步减少发酵过程中产生的气泡。因此，本实施例提供的连续发酵系统也特别适合用于鼠李糖脂的生产。同时，本实施例设置有溢流罐，发酵罐内泡沫到达一定液位时，会从发酵罐的溢流口溢出来的发酵液流到溢流罐里，在溢流罐中静置，由于没有通风和搅拌，发酵液静置在溢流罐中，泡沫会逐渐消失，变成不含泡沫的发酵液，从而进一步减少了气泡的产生。
在其中一个实施例中，连续发酵系统还包括混合罐18以及精馏塔20，所述第一萃取离心装置16的出料口以及所述第二萃取离心装置17的出料口与所述混合罐18的进料口可控连通，所述混合罐18的出料口与所述精馏塔20的进料口连通。
具体地，第一萃取离心装置16的出料口通过阀V-517与混合罐18的进料口可控连通，第一萃取离心装置16通过阀V-514排出含菌废液。第二萃取离心装置17的出料口与混合罐18的进料口连通，混合罐18的出料口与精馏塔20的进料口连通，同时混合罐18的进水口注水。精馏塔20排出萃取剂和粗产品。
其中，第一萃取离心装置16用于去除老化菌体。溢流罐14的出料口流出的一部分发酵液进入第一萃取离心装置16后分离出发酵产物，并排出含有老化菌体的含菌废液，第一萃取离心装置16分离得到的发酵产物经混合罐18进入精馏塔20。
第二萃取离心装置17用于回收发酵液以得到回收培养基。溢流罐14的出料口流出的另一部分发酵液进入陶瓷膜15回收菌体，含发酵产物的发酵液经过第二萃取离心装置17分离出发酵产物后，剩余发酵液再经过气体塔19去除残余萃取剂，然后进入培养基缓冲罐12（作为回收培养基）待用；第二萃取离心装置17分离得到的发酵产物经混合罐18同样进入精馏塔20，精馏塔20对从第一萃取离心装置16分离得到的发酵产物以及从第二萃取离心装置17分离得到的发酵产物精馏后排出萃取剂和粗产品。
本实施例增加混合罐实现混合后出料。
在其中一个实施例中，发酵罐全程运行温度为30-37℃。
在其中一个实施例中，第二萃取离心装置17为离心萃取塔。
在其中一个实施例中，第一萃取离心装置16、第二萃取离心装置17中的萃取剂是：三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、正庚烷、正癸烷、乙酸乙酯和乙腈的一种或多种。
在其中一个实施例中，碳源补料罐中的碳源选自大豆油、甘油、葡萄糖、棕榈油、餐厨废弃油脂中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述氮源补料罐中的氮源培养基为2 g/L NaNO3、15.1 g/LKH2PO4、15.1 g/L Na2HPO4、0.08 g/L FeCl3·6H2O、0.75 g/L ZnSO4·7H2O、0.08 g/LCoCl2·6H2O、0.075 g/L CuSO4·5H2O、0.75 g/L MnSO4·H2O、0.15 g/L H3BO3、0.05 g/LNa2MoO4·2H2O。
作为本发明最佳实施例一种鼠李糖脂连续发酵方法的工作流程，包括：
好氧发酵阶段，包括：向发酵罐13中的培养基接种恶臭甲单胞杆菌，好氧环境下发酵培养至菌体浓度OD600为65；
初始积累阶段，包括：连续通过碳源补料罐10向发酵罐13中流加碳源，通过氮源补料罐11向发酵罐13流加氮源培养基，待发酵液泡沫液位达到80%时，不断提高发酵罐13的罐压，并降低发酵罐13的通气量以保持发酵液泡沫液位维持在80%，待发酵罐13内的鼠李糖脂含量高于10g/L时，开启溢流阀V-516，进入稳态连续发酵阶段；
稳态连续发酵阶段，包括：连续向发酵罐13中流加碳源以及氮源，溢流罐14的出料口流出的一部分发酵液进入第一萃取离心装置16后分离出鼠李糖脂，并排出含有老化菌体的含菌废液，第一萃取离心装置16分离得到的鼠李糖脂经混合罐18进入精馏塔20。溢流罐14的出料口流出的另一部分发酵液进入陶瓷膜15回收菌体，含鼠李糖脂的发酵液经过第二萃取离心装置17分离出鼠李糖脂，去除鼠李糖脂的发酵液再经过气体塔19去除残余萃取剂后，进入培养基缓冲罐12待用，第二萃取离心装置17分离得到的鼠李糖脂经混合罐18同样进入精馏塔20，精馏塔20对从第一萃取离心装置16分离得到的鼠李糖脂以及从第二萃取离心装置17分离得到的鼠李糖脂精馏后排出萃取剂和粗产品。
发酵结束后处理阶段，包括：在鼠李糖脂浓度持续上升，且鼠李糖脂>20g/L时，停止向发酵罐13中流加碳源以及氮源，溢流罐14内的发酵液通过第二萃取离心装置17萃取分离得到鼠李糖脂后，剩余的发酵液作为发酵废液。
具体来说，在好氧发酵阶段：向发酵罐13中的培养基接种恶臭甲单胞杆菌，好氧环境下培养至OD600为65；
在鼠李糖脂初始积累阶段：连续向发酵罐中流加碳源和氮源，待发酵液泡沫液位达到80%时，不断提高发酵罐罐压，并降低通气量以保持发酵液泡沫液位维持在80%。待鼠李糖脂含量高于10g/L时，开启溢流阀，进入稳态连续发酵。
之后为稳态连续发酵阶段：菌体利用连续流加氮源不断产生新鲜菌体。当发酵液液位高于80%，含大量泡沫的发酵液通过溢流管线进入溢流罐，发酵液在溢流罐中自然消泡，部分发酵液进入第一萃取离心装置后回收鼠李糖脂，并排出老化菌体，部分发酵液进入陶瓷膜回收菌体，含鼠李糖脂的发酵液经过第二萃取离心装置除鼠李糖脂后，再经过气体塔去除残余萃取剂后，进入发酵补料罐待用。
最后是发酵结束后处理阶段：鼠李糖脂浓度持续上升无法控制，且鼠李糖脂>20g/L时，停止补料。罐内发酵液通过第二萃取离心装置17萃取分离出鼠李糖脂后，剩余发酵液为发酵废液。
实施例1：不同OD600对平均生产率的影响
一种鼠李糖脂连续发酵方法，包括如下步骤：
好氧发酵阶段：向发酵罐13中的培养基接种恶臭甲单胞杆菌，好氧环境下培养至OD600为65；
鼠李糖脂初始积累阶段：连续向发酵罐中流加碳源和氮源，待发酵液泡沫液位达到80%时，不断提高发酵罐罐压，并降低通气量以保持发酵液泡沫液位维持在80%。待鼠李糖脂含量高于10g/L时，开启溢流阀，进入稳态连续发酵。
稳态连续发酵阶段：菌体利用连续流加氮源不断产生新鲜菌体。当发酵液液位高于80%，含大量泡沫的发酵液通过溢流管线进入溢流罐，发酵液在溢流罐中自然消泡，部分发酵液进入第一萃取离心装置后回收鼠李糖脂，并排出老化菌体，部分发酵液进入陶瓷膜回收菌体，含鼠李糖脂的发酵液经过第二萃取离心装置除鼠李糖脂后，再经过气体塔去除残余萃取剂后，进入发酵补料罐待用。
发酵结束后处理：鼠李糖脂浓度持续上升导致气泡严重，气泡在溢流罐中无法及时消泡，且鼠李糖脂>20g/L时，第二萃取离心装置17已经无法回收过量的鼠李糖脂，连续发酵过程的平衡被打破，此时停止补料。罐内发酵液连续过第二离心萃取装置分离得到鼠李糖脂后，剩余的发酵液为发酵废液。
通过菌体浓度数学模型控制流加速率和排料速率，并维持菌体浓度OD600=65，OD600=70，OD600=75；通过气泡生产速率模型数学模型连续控制通气量和碳源流加速率。维持发酵罐中鼠李糖脂浓度10-20g/L。
在线检测OD600，当OD600≥70时，流加回收培养基，Qm=80-Kg×OD600×Kn，Kg为菌体比生长速率，与菌体活性有关，Kg取0.09-0.12，Kn为培养基转化系数，当OD600<70时，流加氮源培养基，Qn=80+Kg×OD600×Kn。进入第一萃取离心装置速率Qs=Qn或Qm。采用气泡生产速率模型，Vg=Km×exp（L/25）×Cm×exp（T/250）, Km为比例系数，Vg为气泡生产速率，即单位时间气泡上升高度，L通气量，T为搅拌转速，Cm鼠李糖脂浓度。Qm=Vk×S×ρ，S为发酵罐直径，Qm为进入溢流罐流量。Qc=Qm×Cm1/Km，Cm1为期望的发酵罐中发酵产物的浓度，Km为碳源转化率，取0.51-0.55。通过微调L通气量，控制Vg产泡速率恒定，通过控制Qc碳源流加速率维持鼠李糖脂浓度稳定在期望的发酵罐中发酵产物的浓度。通过保持产泡速率和鼠李糖脂浓度恒定，使得连续发酵稳定运行。
发酵罐全程运行温度为30-37℃，碳源为大豆油；发酵液pH为6.8-7.1。
第二萃取离心装置17为3级离心萃取，鼠李糖脂收率>99%。
氮源补料罐中的氮源培养基包括：2 g/L NaNO3、15.1 g/L KH2PO4、15.1 g/LNa2HPO4、0.08 g/L FeCl3·6H2O、0.75 g/L ZnSO4·7H2O、0.08 g/L CoCl2·6H2O、0.075 g/LCuSO4·5H2O、0.75 g/L MnSO4·H2O、0.15 g/L H3BO3、0.05 g/L Na2MoO4·2H2O。
如表1所示，连续发酵108h，OD600取65时转化率52.2%，鼠李糖脂平均生产速率0.62g/L·h。转化率和平均生产速率综合最优。
表1 不同OD600对平均生产率的影响
实施例2：不同温度对平均生产率的影响
该实施例与实施例1的内容一致，区别在于，鼠李糖脂浓度发酵温度分别为30℃、35℃、37℃。
结果如表2所示，温度越高，菌活性影响越高，当温度越高，碳源转化率越低。当温度为35℃，鼠李糖脂转化率53.5%，鼠李糖脂生产速率0.62g/L·h。考虑到转化率，成本最优，选择温度35℃为最优温度。
表2 不同温度对平均生产速率的影响
实施例3：鼠李糖脂连续发酵
该实施例与实施例1的内容一致，区别在于，发酵温度取35℃,控制OD600选择65，发酵周期延长至216h。
结果如图3所示，最高鼠李糖脂产率为0.738g/L·h，最低鼠李糖脂产率为0.622g/L·h，发酵全周期，平均鼠李糖脂产率为0.640 g/L·h，碳源收率53.9%，具有良好的经济效应。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种连续发酵方法，其特征在于，包括：
在连续发酵系统中接种菌株并在好氧环境下进行发酵培养；
收集所述发酵培养得到的发酵液，经回收和/或纯化，得到发酵产物；
其中，所述发酵培养中，根据发酵罐中的菌体浓度，控制流加到发酵罐的培养基的流加速率以及将发酵液排出发酵罐的排料速率，包括：
检测所述发酵罐中的菌体浓度；
当所述菌体浓度大于或等于第一阈值时，流加所述培养基，并计算Qn1=K1-Kg×OD600×Kn，其中，Qn1为第一速率，K1为第一常数，Kg为菌体比生长速率，OD600为菌体浓度，Kn为培养基转化系数，控制所述排料速率为所述第一速率；
当所述菌体浓度小于第一阈值时，流加所述培养基，并计算Qn2=K1+Kg×OD600×Kn，其中，Qn2为第二速率，控制所述排料速率为所述第二速率。
2.根据权利要求1所述的连续发酵方法，其特征在于，所述发酵培养中，根据期望的发酵罐中发酵产物的浓度控制碳源流加速率，包括：
根据期望的发酵罐中发酵产物的浓度，控制碳源流加速率为：Qc=Qm×Cm1/Km，其中，Qc为碳源流加速率，Cm1为期望的发酵罐中发酵产物的浓度，Km为碳源转化率，Qm为将发酵液排出发酵罐的排料流量，Qm=Vk×S×ρ，Vk为气泡上升速率，ρ为气泡密度，S为所述发酵罐的直径。
3.根据权利要求1所述的连续发酵方法，其特征在于，所述发酵培养中，根据所述发酵罐中的产泡速率控制通气量和碳源的流加速率，包括：
在每个采样时刻，检测所述发酵罐中发酵产物的实时浓度和通气量，根据所述实时浓度和所述通气量计算产泡速率，如果当前采样时刻计算的产泡速率大于或等于上一采样时刻计算的产泡速率，则减少所述通气量；如果当前采样时刻计算的产泡速率小于上一采样时刻计算的产泡速率，则增加所述通气量；其中，所述产泡速率为：Vg=Km×exp（L/K2）×Cm×exp（T/K3），其中，Vg为所述产泡速率，Km为比例系数，L为所述通气量，T为搅拌转速，Cm为发酵产物的实时浓度，K2为第二常数，K3为第三常数，exp为自然指数。
4.根据权利要求1-3任一项所述的连续发酵方法，其特征在于，所述发酵产物为鼠李糖脂；所述菌株是能够通过发酵培养生产鼠李糖脂的菌株，优选恶臭假单胞杆菌。
5.根据权利要求4所述的连续发酵方法，其特征在于，所述第一阈值为65-75，优选为70；
所述期望的发酵罐中发酵产物的浓度为10-20 g/L。
6.根据权利要求1-3任一项所述的连续发酵方法，其特征在于，所述发酵培养中，加入的碳源选自大豆油、甘油、葡萄糖、棕榈油、餐厨废弃油脂中的至少一种；
所述培养基为氮源培养基，其包含：2 g/L NaNO3、15.1 g/L KH2PO4、15.1 g/L Na2HPO4、0.08 g/L FeCl3·6H2O、0.75 g/L ZnSO4·7H2O、0.08 g/L CoCl2·6H2O、0.075 g/LCuSO4·5H2O、0.75 g/L MnSO4·H2O、0.15 g/L H3BO3、0.05 g/L Na2MoO4·2H2O。
7.一种连续发酵系统，其特征在于，所述连续发酵系统应用于权利要求1-5任一项所述连续发酵方法中，包括碳源补料罐（10）、氮源补料罐（11）、培养基缓冲罐（12）、发酵罐（13）、溢流罐（14）、陶瓷膜（15）、第一萃取离心装置（16）、第二萃取离心装置（17）以及气体塔（19），其中，所述碳源补料罐（10）的出料口以及所述氮源补料罐（11）的出料口分别与所述发酵罐（13）的进料口可控连通，所述发酵罐（13）的溢流口与所述溢流罐（14）的进料口可控连通，所述溢流罐（14）的出料口分别与所述陶瓷膜（15）的进料口以及所述第一萃取离心装置（16）的进料口可控连通，所述陶瓷膜（15）的出料口与所述第二萃取离心装置（17）的进料口可控连通，所述第二萃取离心装置（17）的回收口与所述气体塔（19）的进料口连通，所述气体塔（19）的出料口与所述培养基缓冲罐（12）的进料口可控连通，所述培养基缓冲罐（12）的出料口与所述发酵罐（13）的进料口可控连通。
8.根据权利要求7所述的连续发酵系统，其特征在于，所述连续发酵系统还包括混合罐（18）以及精馏塔（20），所述第一萃取离心装置（16）的出料口以及所述第二萃取离心装置（17）的出料口与所述混合罐（18）的进料口可控连通，所述混合罐（18）的出料口与所述精馏塔（20）的进料口连通。
9.根据权利要求7或8所述的连续发酵系统，其特征在于，所述第二萃取离心装置（17）为离心萃取塔；
所述第一萃取离心装置（16）、所述第二萃取离心装置（17）中的萃取剂选自三氯甲烷、二氯甲烷、正己烷、正庚烷、正癸烷、乙酸乙酯和乙腈中的至少一种。
10.根据权利要求7或8所述的连续发酵系统，其特征在于，所述发酵罐（13）的运行温度为30-37℃；
所述发酵液的pH为6.8-7.1。
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| CN109504629A (zh) * | 2018-12-14 | 2019-03-22 | 万华化学集团股份有限公司 | 一种分段调控的连续培养菌种的方法 |
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