CN112048535A - 一种甾体中间体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种甾体中间体的制备方法，属于生物制药技术领域。本发明先制备中间体A的甾体混悬液，然后投入含有霉菌种子的发酵培养基中，所述中间体A在霉菌的作用下发生C₁₁位α羟化反应，在转化阶段对发酵液的pH值进行控制，并在发酵后期补加种子液，得到中间体C。本发明提供的技术方案，在转化过程中，增加了控制pH值和后期补种两个技术手段，使得底物中间体A基本消耗殆尽，转化更为彻底，副产物占比可控制在0.7％以下，大幅提高反应效率，解决了甾体中间体转化率低、副产物占比高的问题。

Description

一种甾体中间体的制备方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及一种甾体中间体的制备方法。

背景技术

甾体激素类药物是指分子结构中具有甾体结构的、在临床上广为应用的一类药物，主要包括肾上腺皮质激素和性激素两大类，在化学药物体系中占有重要的地位。近年来我国的甾体药物行业发展加速，已成为医药工业体系的重要组成部分。与一般化学药品生产相比，甾体药物的生产技术同时涉及化学合成和生物发酵技术两方面，因此具有工艺开发时间长、技术起点高的特点。作为甾体激素类药物的代表，倍他米松以及地塞米松均属于肾上腺皮质激素，具有抗炎、抗感染、抗休克和抑制免疫等药理作用。

在以皂素衍生物制备倍他米松和地塞米松的工艺过程当中，倍他米松/地塞米松羟化物(中间体C)是一个非常关键的中间体，由倍他米松/地塞米松脱溴物(中间体A)经过生物转化制备而得，反应式如下式所示:

C₁₁α羟化的生物转化过程实际是分两步完成的，首先是底物的C₂₁位的醋酸脂基团的水解，其次是水解后C₁₁位的羟化。底物倍他米松/地塞米松脱溴物 (中间体A)在C₂₁位醋酸酯水解后得到中间产物倍他米松/地塞米松水解物(中间体B)，再完成C₁₁位α羟化得到终产物——倍他米松/地塞米松羟化物(中间体C)，其中倍他米松/地塞米松水解物(中间体B)为副产物。

相关中间体化学名对照表：

申请人于2019年提交了一份公开号为CN110747249A的发明专利，对上述生物转化过程中的投料方式进行了改进，将底物中间体A的投料浓度提高到20g/L以上，产物中间体C的生物转化率达到了90％左右，在发酵阶段杂质中间体B控制在1％～1.5％。

现有技术虽然提高了甾体C₁₁羟化的生物转化率和底物投料浓度，但转化后期仍有约6％～10％左右的底物不能彻底转化，产生的副产物含量较高。为了得到高纯度的产物，后处理工艺包括了提取和精制两个步骤，另外未转化的原料也需要回收，增加了环保压力。

发明内容

本发明提供了一种甾体中间体的制备方法，能够解决上述现有技术问题中的一种或多种。

发明人针对现有技术的现状，对转化过程进行了深入细致的研究，研究过程中发现，现有工艺在转化过程中发酵液的pH呈持续上升现象。pH升高的主要原因是菌体自身代谢产物的积累所致，pH过高会抑制菌体生长并减少羟化酶的产生。另外发酵后期随着转化率的上升，产物浓度逐步增加，在一定程度上也会抑制羟化酶的活力，使转化速度变缓甚至停滞。因此工艺改进主要围绕提高发酵后期羟化酶的活力而开展，改进后中间体C的生物转化率达到了98％以上，底物完全转化，杂质B也得到了较好的控制。

根据本发明的一个方面，提供了一种甾体中间体的制备方法，先制备中间体A(倍他米松脱溴物或地塞米松脱溴物)的甾体混悬液，然后投入含有霉菌种子的发酵培养基中，所述中间体A在霉菌的作用下发生C₁₁位α羟化反应，在反应阶段对发酵液的pH进行控制，并在发酵后期补加种子液，得到中间体 C(倍他米松羟化物或地塞米松羟化物)。

生物发酵过程中使用的霉菌为金龟子绿僵菌、匍枝根霉、赭曲霉中的一种或多种。

具体步骤如下：

(a)种子液制备：制备霉菌斜面菌种并将其接种于第一培养基中，培养后得种子液；

(b)发酵预培养：将步骤(a)得到的种子液接入第二培养基重进行预培养；

(c)投料及转化：制备中间体A的混悬液并将其投入步骤(b)的发酵液中，使用pH调节剂控制转化阶段发酵液的pH值；

(d)补种：按照步骤(a)制备种子液，在发酵转化后期将新制备的种子液加入发酵液中继续转化；

(e)粗品制备：收集滤液，用有机溶剂萃取后浓缩得产物中间体C。

在一些实施方式中，步骤(a)中，第一培养基成分配比为：第一氮源物质10g/L、葡萄糖10g/L和KH₂PO₄ 1g/L；步骤(b)中，第二培养基成分配比为：第二氮源物质35g/L、葡萄糖25g/L、KH₂PO₄ 2g/L和MgSO₄ 1.5g/L。

在一些实施方式中，第一氮源物质可以为酵母浸粉、蛋白胨、酵母粉、酵母膏中的一种或多种；第二氮源物质可以为蛋白胨、酵母粉、磷酸氢二铵中的一种或多种。第一氮源物质和第二氮源物质在制备过程中起到补充氮源的作用。

在一些实施方式中，步骤(c)中，甾体混悬液的制备方法为：在投料罐中加入表面活性剂以及第三氮源物质，加水溶解，并将混合水溶液灭菌。将投料罐内物料灭菌后冷却至29℃以下，加入一定数量的中间体A，搅拌2小时使之充分乳化，得甾体混悬液。

在一些实施方式中，制备甾体混悬液过程中，使用的第三氮源物质为酵母浸粉、蛋白胨、酵母粉、酵母膏中的一种或多种；使用的表面活性剂包含吐温-80、司盘-80、吐温-40、吐温-20、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠中的一种或多种，其在甾体混悬液制备过程中起乳化分散作用。

在一些实施方式中，步骤(c)中，中间体A的投料浓度为15～20g/L，转化阶段溶液pH值控制在5.5～6.5，反应阶段温度为27～29℃，搅拌速率为 180～220rpm，通气量0.4～0.75vvm，转化周期为72～74hr。

在一些实施方式中，使用的pH调节剂为硫酸、盐酸、磷酸、冰醋酸中的一种或多种。

在一些实施方式中，步骤(d)中，在转化进行46～54hr时补加种子液，补加种子液的体积量为发酵液体积的10％～20％。

在一些实施方式中，作为底物的中间体A为16β甲基-17α羟基-孕甾-1、 4-二烯-3、20-二酮-21-醋酸酯；制得产品中间体C为16β甲基-11α、17α、 21三羟基-孕甾-1、4-二烯-3、20-二酮。

在一些实施方式中，作为底物的中间体A为16α甲基-17α羟基-孕甾-1、 4-二烯-3、20-二酮-21-醋酸酯；制得产品中间体C为16α甲基-11α、17α、 21三羟基-孕甾-1、4-二烯-3、20-二酮。

本发明的有益效果是：

在转化过程中，增加了控制pH值和后期补种两个技术手段，使得底物中间体A基本消耗殆尽，转化更为彻底，副产物占比可控制在0.7％以下，大幅提高反应效率，解决了甾体中间体转化率低、副产物占比高的问题。

同时，本发明提供的技术方案，工艺简便，不需要新增额外设备。由于转化后底物和副产物含量均较低，不用再回收底物，无需精制就可得到高纯度的甾体中间体，简化了后处理工艺，适合大规模工业化生产。

附图说明

图1是本发明中间体A转化为中间体C的反应原理图；

图2是本发明实施例1的pH值变化趋势对照表；

图3是本发明实施例4的转化率HPLC转化图谱；

图4是本发明实施例5的转化率HPLC转化图谱；

图5是本发明实施例6的转化率HPLC转化图谱；

图6是本发明实施例7的转化率HPLC转化图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1控制pH与否对转化率的影响试验

本实施例采用金龟子绿僵菌作为发酵菌种，以地塞米松脱溴物(中间体A) 为底物，对其C₁₁位进行转化改造，得到具有C₁₁位α-羟基、C₂₁位羟基的甾体激素类物质重要中间体地塞米松羟化物(中间体C)。本实施例中，对试验组发酵液的pH值进行控制，而对对照组中的发酵液不予干预，对转化结果进行对比。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

将金龟子绿僵菌菌种转接在PDA斜面培养基上培养，控制温度28±1℃，培养5天得斜面菌种，备用；

种子培养基配比为：酵母浸粉10g/L、葡萄糖10g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L，配制完成后分装为200mL摇瓶，灭菌后冷却至室温，备用；

取得到的斜面菌种接种到200mL摇瓶中，控制温度28±1℃，摇床转速 180rpm，培养42hr后得到种子液。

(2)预培养液制备

发酵培养基配比为：蛋白胨25g/L、磷酸氢二铵10g/L、葡萄糖25g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄ 1.5g/L，配制完成后分别取2L装入两只发酵罐中，灭菌后冷却至室温，每只发酵罐中接入培养好的种子液各200mL，通入无菌空气搅拌培养，控制温度28±1℃，设置通气量为0.5vvm，搅拌速度200rpm，罐压 0.04～0.06MPa，培养10hr，得到预培养液，备用。

(3)制备甾体混悬液

取2只三角瓶，每只加1.5g吐温-80、5g酵母浸粉和水300mL搅拌均匀，灭菌后备用。在投料前约3小时开始制备甾体混悬液，每瓶加入50g的地塞米松脱溴物(中间体A)，振摇乳化2小时，得甾体混悬料液。

(4)生物转化及pH调节

向步骤(2)所述的两个发酵罐中分别投入甾体混悬液料液，继续通入无菌空气，控制温度28±1℃，通气量0.5vvm，搅拌转速200rpm，罐压 0.04～0.06MPa，发酵进入生物转化阶段并开始记录转化周期。

两只发酵罐分别编号为1^#罐、2^#罐，利用pH在线监控装置记录发酵液的 pH值变化情况，其中1^#罐为对照组，不对pH进行干预，2^#罐为pH调节组，用磷酸调节发酵液pH值，使其保持在5.5～6.5范围内。

(5)提取

转化至48hr，进行第一次取液，从两个发酵罐中分别取发酵转化液1mL；转化至72hr，进行第二次取液；继续转化培养至96hr，进行第三次取液；HPLC 面积归一化法检测。

(6)结果与分析

本实施例结果如附图图2和表1所示：

表1.转化率HPLC检测数据对照表

对比试验结果表明，pH调控后底物可被进一步消耗，转化率随之提高，同时副产物含量有所下降。而到发酵末期(72小时之后)，转化速度变缓，即使延长转化周期，转化率的提升也不到1％，羟化反应基本停滞。

实施例2补种与否对转化率的影响试验

本实施例采用金龟子绿僵菌作为发酵菌种，以倍他米松脱溴物(中间体A) 为底物，对其C11位进行转化改造，得到具有C11位α-羟基、C21位羟基的甾体激素类物质重要中间体倍他米松羟化物(中间体C)。本实施例中，在反应后期向试验组中补加种子液，而对对照组中的发酵液不予干预，对转化结果进行对比。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

将金龟子绿僵菌菌种转接在PDA斜面培养基上培养，控制温度28±1℃，培养5天得斜面菌种，备用；

种子培养基配比为：酵母浸粉10g/L、葡萄糖10g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L，配制完成后分装为200mL摇瓶，灭菌后冷却至室温，备用；

取得到的斜面菌种接种到200mL摇瓶中，控制温度28±1℃，摇床转速 180rpm，培养42hr后得到种子液。

(2)预培养液制备

发酵培养基配比为：蛋白胨25g/L、磷酸氢二铵10g/L、葡萄糖25g/L、 KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄ 1.5g/L，配制完成后分别取2L装入两只发酵罐中，灭菌后冷却至室温，每只发酵罐中接入培养好的种子液各200mL，通入无菌空气搅拌培养，控制温度28±1℃，设置通气量为0.5vvm，搅拌速度200rpm，罐压 0.04～0.06MPa，培养10hr，得到预培养液，备用。

(3)制备甾体混悬液

取2只三角瓶，每只加1.5g吐温-80、5g酵母浸粉和水300mL搅拌均匀，灭菌后备用。在投料前约3小时开始制备甾体混悬液，每瓶加入50g的地塞米松脱溴物(中间体A)，振摇乳化2小时，得甾体混悬料液。

(4)生物转化及补种

向步骤(2)所述的两个发酵罐中分别投入甾体混悬液料液，继续通入无菌空气，控制温度28±1℃，通气量0.5vvm，搅拌转速200rpm，罐压 0.04～0.06MPa，发酵进入生物转化阶段并开始记录转化周期。

两只发酵罐分别编号为1#罐、2#罐，转化过程中两罐均不进行pH调节。另准备1瓶装有500mL种子培养基的摇瓶，接种金龟子绿僵菌斜面菌种，在发酵液转化10hr时开始摇瓶培养。在发酵液转化50hr时，将种子液加入2^#罐，作为试验组；1^#罐作为对照组，不向其进行补加种子液操作。

(5)提取

转化至50hr，进行第一次取液，从两只发酵罐中分别取发酵转化液1mL；转化至72hr，进行第二次取液；继续转化培养至96hr，进行第三次取液；HPLC 面积归一化法检测。

(6)结果与分析

本实施例结果如表2所示：

表2.补种对照试验的转化率HPLC检测数据对照表

对比试验结果表明，在缺少控制反应发酵液pH值这一步骤的前提下，反应后期是否补种对转化率的提升作用非常有限，即使延长转化周期，仍有大约5％的底物不能完全转化。出现这一现象的原因为，转化反应过程中发酵液的pH值持续上升，在pH值较高的环境下，菌体的生长和羟化酶的活力都收到抑制，即使在后期补加了新鲜的种子液，也由于pH条件不利于菌种的生长而影响羟化酶发挥作用，从而难以大幅度提高反应的转化率。该试验从侧面验证了“控制反应发酵液pH值”这一技术手段的必要性。

实施例3转化后期补加物质的区别对转化率的影响试验

本实施例采用金龟子绿僵菌作为发酵菌种，以地塞米松脱溴物(中间体A) 为底物，对其C₁₁位进行转化改造，得到具有C₁₁位α-羟基、C₂₁位羟基的甾体激素类物质重要中间体地塞米松羟化物(中间体C)。本实施例中，在转化后期，向试验组发酵液补加种子液，而向对照组中的发酵液补加种子培养基，对转化结果进行对比。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

将金龟子绿僵菌菌种转接在PDA斜面培养基上培养，控制温度28±1℃，培养5天得斜面菌种，备用；

种子培养基配比为：酵母浸粉10g/L、葡萄糖10g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L，配制完成后分装为200mL摇瓶，灭菌后冷却至室温，备用；

取得到的斜面菌种接种到200mL摇瓶中，控制温度28±1℃，摇床转速 180rpm，培养42hr后得到种子液。

(2)预培养液制备

发酵培养基配比为：蛋白胨25g/L、磷酸氢二铵10g/L、葡萄糖25g/L、 KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄ 1.5g/L，配制完成后分别取2L装入两只发酵罐中，灭菌后冷却至室温，每只发酵罐中接入培养好的种子液各200mL，通入无菌空气搅拌培养，控制温度28±1℃，设置通气量为0.5vvm，搅拌速度200rpm，罐压 0.04～0.06MPa，培养10hr，得到预培养液，备用。

(3)制备甾体混悬液

取2只三角瓶，每只加1.5g吐温-80、5g酵母浸粉和水300mL搅拌均匀，灭菌后备用。在投料前约3小时开始制备甾体混悬液，每瓶加入50g的地塞米松脱溴物(中间体A)，振摇乳化2小时，得甾体混悬料液。

(4)生物转化及补种

向步骤(2)所述的两个发酵罐中分别投入甾体混悬液料液，继续通入无菌空气，控制温度28±1℃，通气量0.5vvm，搅拌转速200rpm，罐压 0.04～0.06MPa，发酵进入生物转化阶段并开始记录转化周期。

两只发酵罐分别编号为1^#罐、2^#罐，转化过程两罐均进行pH调节，用磷酸将发酵液pH值控制在5.5～6.5。提前准备2瓶200ml摇瓶种子培养基，其中一瓶接种金龟子斜面菌种，并在发酵转化周期约10hr开始摇瓶培养。

在发酵转化50hr时，将200ml种子培养基加入1^#罐，作为对照组；将接有菌种并培养了40hr的200ml种子液加入2^#罐，作为试验组；继续发酵转化。

(5)提取

在补种之前，进行第一次取液，分别从两个发酵罐中各取发酵转化液1mL；转化至74hr，进行第二次取液；用HPLC面积归一化法检测。

(6)结果与分析

本实施例结果如表3所示：

表3.补加不同物料的转化率HPLC检测数据对照表

由上表结果可知，在发酵转化结束前24hr补加10％体积的种子液，可以进一步提高转化率，并将底物和副产物控制在较低浓度；而补加培养基的对比方案在转化率提升方面效果不明显。出现这一现象的原因是补加的菌种处于生长旺盛期，不仅可以促进羟化酶的持续产生，还可改善发酵液的流动性及溶氧水平，增加底物与菌体细胞的接触机会；双重作用下转化速率加快，转化率也明显上升。单纯补加培养基只能改善发酵液的流动性和溶氧水平，对原有菌种持续产生羟化酶的作用影响不大。以上试验数据验证了补加种子液的技术方案行之有效。

实施例4

本实施例提供了一种甾体中间体的制备方法，采用匍枝根霉作为发酵菌种，以倍他米松脱溴物(中间体A)为底物，对其C₁₁位进行转化改造，转化过程中对发酵液的pH值进行控制，并在发酵后期补加种子液，得到具有C₁₁位α-羟基、C₂₁位羟基的甾体激素类物质重要中间体倍他米松羟化物(中间体 C)，反应原理如图1所示。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

将匍枝根霉转接在PDA斜面培养基上培养，控制温度28±1℃，培养5天得斜面菌种，备用；

制备种子培养基，其配比为：酵母浸粉10g/L、葡萄糖10g/L、KH₂PO₄ 1.5g/L，配制完成分装为200mL摇瓶，灭菌后冷却至室温，备用。

取得到的斜面菌种接种到200mL摇瓶种子培养基中，控制温度28±1℃，摇床转速150rpm，培养44hr后得到种子液。

在容积为5L的发酵罐中配置2L发酵培养基，配比为：蛋白胨25g/L、磷酸氢二铵10g/L、葡萄糖25g/L、KH₂PO₄ 2g/L、MgSO₄ 1.5g/L；高温灭菌后冷却至28℃，接入种子液200mL，通入无菌空气搅拌培养，控制温度28±1℃，通气量0.5vvm，搅拌转速220rpm，罐压0.04～0.06MPa，培养8hr，得到预培养液。

(2)制备甾体混悬液

取1只圆底瓶，加1.5g吐温-80、0.5g司盘-80、5g酵母浸粉和水300mL 搅拌均匀，灭菌后，向瓶中加入50g的倍他米松脱溴物(中间体A)，搅拌乳化2小时，得甾体混悬料液。

(3)生物转化、pH调节及补种

将制备好的甾体混悬液转入预培养液中，得初始发酵液，其中倍他米松脱溴物(中间体A)在初始发酵液中的初始浓度约为20g/L，继续通入无菌空气，控制温度28±1℃，通气量0.5vvm，搅拌转速220rpm，罐压0.04～0.06MPa，发酵进入生物转化阶段并开始记录转化周期。

转化过程中启用pH自动调节系统，用2M硫酸控制发酵液的pH值，使其保持在5.5～6.0范围内。

另准备1瓶装有500mL种子培养基的摇瓶，接种匍枝根霉斜面菌种，在发酵液转化8～10hr时开始摇瓶培养。在发酵液转化50hr时，将500mL种子液加入发酵罐中，此时加入的种子液体积约为发酵液的20％，继续发酵培养，转化周期为74hr。

(4)提取与检测

生物转化结束后，取发酵转化液1ml，加至20～30mL乙腈中超声30分钟，离心超滤后进行HPLC分析，转化图谱如图3所示，最终转化率为99.3％，杂质中间体B含量为0.6％，底物中间体A含量＜0.1％。

实施例5

本实施例提供了一种甾体中间体的制备方法，采用赭曲霉作为发酵菌种，以倍他米松脱溴物(中间体A)为底物，对其C₁₁位进行转化改造，转化过程中对发酵液的pH值进行控制，并在发酵后期补加种子液，得到具有C₁₁位α- 羟基、C₂₁位羟基的甾体激素类物质重要中间体倍他米松羟化物(中间体C)，反应原理如图1所示。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

该步骤整体与实施例4相同，区别在于，发酵菌种为赭曲霉，菌种培养时间为7天，预培养液的培养时间为10hr。

(2)制备甾体混悬液

该步骤整体与实施例4相同，区别在于，表面活性剂仅为1.5g吐温-40 和5g酵母粉，加入的倍他米松脱溴物(中间体A)的重量为43g。

(3)生物转化、pH调节及补种

该步骤整体与实施例4相同，区别在于，倍他米松脱溴物(中间体A)在初始发酵液中的初始浓度约为17g/L，pH调节剂为盐酸，发酵液的pH值保持在6.0±0.3，在发酵液转化46hr时补加种子液，种子液体积约为发酵液的 15％，转化周期为72hr。

(4)提取与检测

生物转化结束后，取发酵转化液1mL，加至20～30ml甲醇中超声30分钟，离心超滤后进行HPLC分析，转化图谱如图4所示，最终转化率为99.35％，杂质中间体B含量为0.59％，底物中间体A含量＜0.1％。

实施例6

本实施例提供了一种甾体中间体的制备方法，采用金龟子绿僵菌作为发酵菌种，以倍他米松脱溴物(中间体A)为底物，对其C₁₁位进行转化改造，转化过程中对发酵液的pH值进行控制，并在发酵后期补加种子液，得到具有 C₁₁位α-羟基、C₂₁位羟基的甾体激素类物质重要中间体倍他米松羟化物(中间体C)，反应原理如图1所示。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

该步骤整体与实施例4相同，区别在于，发酵菌种为金龟子绿僵菌，菌种培养时间为6天，接入种子液的体积为100mL，预培养液的培养时间为12hr。

(2)制备甾体混悬液

该步骤整体与实施例4相同，区别在于，表面活性剂为1.5g吐温-20、 0.5g十二烷基苯磺酸钠和5g酵母浸粉。

(3)生物转化、pH调节及补种

该步骤整体与实施例4相同，区别在于，pH调节剂为冰醋酸，发酵液的 pH值保持在6.0～6.5范围内，在发酵液转化50hr时补加250mL种子液，种子液体积约为发酵液的10％，转化周期为74hr。

(4)提取与检测

生物转化结束后，取发酵转化液1mL，加至20～30mL乙腈中超声30分钟，离心超滤后进行HPLC分析，转化图谱如图5所示，最终转化率为99.38％，杂质中间体B含量为0.57％，底物中间体A含量＜0.1％。

实施例7

本实施例提供了一种甾体中间体的制备方法，采用金龟子绿僵菌作为发酵菌种，以倍他米松脱溴物(中间体A)为底物，对其C₁₁位进行转化改造，转化过程中对发酵液的pH值进行控制，并在发酵后期补加赭曲霉种子液，得到具有C₁₁位α-羟基、C₂₁位羟基的甾体激素类物质重要中间体倍他米松羟化物(中间体C)，反应原理如图1所示。

本实施例的具体步骤如下：

(1)菌种培养

该步骤整体与实施例4相同，区别在于，发酵菌种为金龟子绿僵菌，种子液的培养时间为42hr，接入种子液的体积为150mL，预培养液的培养时间为10hr。

(2)制备甾体混悬液

该步骤整体与实施例4相同，区别在于，表面活性剂为1.5g吐温-80、 0.5g十二烷基硫酸钠和5g酵母粉。

(3)生物转化、pH调节及补种

该步骤整体与实施例4相同，区别在于，pH调节剂为磷酸，发酵液的pH 值保持在5.5～6.5范围内，补加的种子液中接种赭曲霉斜面菌种，补加种子液的体积为350mL，约为发酵液的15％。

(4)提取与检测

生物转化结束后，取发酵转化液1mL，加至20～30mL甲醇中超声30分钟，离心超滤后进行HPLC分析，转化图谱如图6所示，最终转化率为99.35％，杂质中间体B含量为0.61％，底物中间体A含量＜0.1％。

本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种甾体中间体的制备方法，其特征在于，在中间体A发生羟化反应时，对反应液的pH值进行控制，并在反应后期补加种子液，得到中间体C。

2.根据权利要求1所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，反应液的pH值控制在5.5～6.5；反应后期补加种子液的体积量为反应液体积的10％～20％。

3.根据权利要求2所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下具体步骤：

(a)种子液制备：制备霉菌斜面菌种并将其接种于第一培养基中，培养后得种子液；

(b)发酵预培养：将步骤(a)得到的种子液接入第二培养基重进行预培养；

(c)投料及转化：制备中间体A的混悬液并将其投入步骤(b)的培养液中，在反应过程中使用pH调节剂控制反应液的pH值；

(d)补种：按照步骤(a)再次制备种子液，在发酵转化后期将新制备的种子液加入反应液中继续转化；

(e)粗品制备：收集滤液，用有机溶剂萃取后浓缩得产物中间体C。

4.根据权利要求3所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述第一培养基包含第一氮源物质、葡萄糖和KH₂PO₄；所述第一氮源物质为酵母浸粉、蛋白胨、酵母粉、酵母膏中的一种或多种。

5.根据权利要求3所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，步骤(b)中，所述第二培养基包含第二氮源物质、葡萄糖、KH₂PO₄和MgSO₄；所述第二氮源物质为蛋白胨、酵母粉、磷酸氢二铵中的一种或多种。

6.根据权利要求3所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，所述混悬液的制备方法为：在投料罐中加入表面活性剂以及第三氮源物质，加水溶解，并将混合水溶液灭菌，将投料罐内物料灭菌后冷却至29℃以下，加入一定数量的中间体A，搅拌2小时使之充分乳化；所述表面活性剂为吐温-80、司盘-80、吐温-40、吐温-20、十二烷基硫酸钠、十二烷基苯磺酸钠中的一种或多种；所述第三氮源物质为酵母浸粉、蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母膏中的一种或多种。

7.根据权利要求3所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，步骤(c)中，中间体A的投料浓度为17～20g/L，反应阶段温度为27～29℃，搅拌速率为180～220rpm，通气量0.4～0.75vvm，转化周期为72～74hr；所述pH调节剂为硫酸、盐酸、磷酸、冰醋酸中的一种或多种。

8.根据权利要求3所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，步骤(d)中，在转化进行46～54hr后补加种子液。

9.根据权利要求3所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，所述霉菌为金龟子绿僵菌、匍枝根霉、赭曲霉中的一种或多种。

10.根据权利要求1所述的甾体中间体的制备方法，其特征在于，所述中间体A为：

所述中间体C为：

其中，C16位

为β甲基或α甲基。

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