TWI422676B - 連續生物轉換系統與方法 - Google Patents

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Description

連續生物轉換系統與方法
本發明是有關於高產率的連續生物轉換方法與系統。
雌激素(estrogen)與雄激素(男性荷爾蒙，androgens)是動物體內重要的類固醇荷爾蒙，用於發展與維護其生殖系統。其中，β-雌二醇(β-Estradiol)與睪丸素(testosterone)是最常見的雌激素與雄激素，其可被應用於生育控制[文獻1]、乳癌治療[文獻2]、骨質疏鬆的置換治療與慢性肺阻塞治療[文獻3,4]。
由於對生態與環境保護的關注增加，以及產品經濟效應的考量，一些工業產品或藥物產品的製造，已逐漸採用微生物技術取代傳統的化學合成。在1937年，Mamoli等提出利用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)將雄二酮(androstenedione)還原成睪丸素(testosterone)[5]。迄今，雖然許多文獻報告指出17-酮甾類(17-oxosteroids)的還原或氧化可透過各種微生物完成，但因為位向選擇性(regio-selectivity)與立體選擇性(stereo-selectivity)考量，酵母仍是較優先的生物催化劑選擇。用於還原雌素酮的酵素被歸類成十七β-羥基類 固醇去氫酶(17 β-hydroxysteroid dehydrogenase)。
但是，利用酵母做生物轉換常常會遭遇到基質抑制(substrate inhibition)與/或產物抑制(product inhibition)，使產率降低。為改善產率，通常是透過調整製程參數例如溫度、pH值、攪拌速度、含氧量[文獻6,7]等手段，或者，利用微生物細胞固定化的方法達成[文獻8,9]。近來，針對不溶於水的基質，導入有機與水反應介質的雙相性細胞培養(biphasic cell culture)可降低基質抑制與產物抑制，進而增加產率與立體選擇性[文獻10-12]。另外，文獻[13]揭露以非離子介面活性劑的雲點系統(cloud point system)進行膽固醇生物轉換的效果良好。Singer等研究在雄二酮(androstenedione)的還原中，添加各種環糊精(cyclodextrin)於批次(batch)細胞培養，可降低基質抑制與產物抑制[文獻14]。在過去數十年，基因工程經常以重組的去氧核糖核酸(DNA)複製微生物，有效獲得所需產品[文獻15]。
上述方法是以批次培養方式達到改善產率的目的，另外也有些方法利用反應器設計，例如饋料批次式(fed-batch)、半饋料批次式(semi-fed-batch)的細胞培養，改善生產的效率與成本[文獻16-18]。連續式的細胞培養系統也被證明可降低基質抑制[文獻19-21]。然而，多數的連續式細胞培養系統通常僅具有單一反應器用於製造介質前驅物(medium precursor)或有用的酵素，產率仍無法達到要求[文獻22,23]。因此，在本領域需要提供一種新穎的生物轉換系統與方法，可在短的反應時間內，達到改善產率、增加產物回收的目的。(參考文獻：[1]Hill JW,Kolb DK.Chemistry for Changing Times.New Jersey：Pearson Education,Inc.；2007.Chapter 19；[2]Sutherland TE, Anderson RL,Hughes RA,Altmann E,Schuliga M,Ziogas J,Stewart A.2-Methoxyestradiol-a unique blend of activities generating a new class of anti-tumour/anti-inflammatory agents.DrugDiscov Today 2007；12：577-584；[3]Andersson TLG,Stehle B,Davidsson B,Höglund P.Drug concentration effect relationship of estradiol from two matrix transdermal delivery systems：Menorest® and Climara®.Maturitas 2000；35：245-252；[4]Mazer NJ.New clinical applications of transdermal testosterone delivery in men and women.J.Control.Release 2000；65：303-315；[5]Donova MV,Egorova OV,Nikolayeva VM.Steroid 17 β-reduction by microorganisms-a review.Process Biochem 2005；40：2253-2262；[6]Berry H,Debat H,Larreta-Garde V.Excess substrate inhibition of soybean lipoxygenase-1 is mainly oxygen-dependent.FEBS Lett 1997；408：324-326；[7]Mösche M,Jördening H-J.Comparison of different models of substrate and product inhibition in anaerobic digestion.Water Res 1999；33：2545-2554；[8]Bekatorou A,Koutinas AA,Kaliafas A,Kanellaki M.Freeze-dried Saccharomyces cerevisiae cells immobilized on gluten pellets for glucose fermentation.Process Biochem 2001；36：549-557；[9]Tsen J-H,Lin Y-P,King VA-E.Fermentation of banana media by using κ-carrageenan immobilized Lactobacillus acidophilus.Int J Food Microbiol 2004；91：215-220；[10]Çelik D,Bayraktar E,Mehmetoglu Ü.Biotransformation of 2-phenylethanol to phenylacetaldehyde in a two- phase fed-batch system.Biochem Eng J 2004；17：5-13；[11]Cheng C,Tsai H-R.Yeast-mediated enantioselective synthesis of chiralR-(+)-and S-(-)-1-phenyl-1-butanol fromprochiral phenyln-propyl ketone in hexane-water biphasicculture.J Chem Technol Biotechnol 2008；83：1479-1485；[12]León R,Fernandes P,Pinheiro HM,Cabral JMS.Whole-cell biocatalysis in organic media.EnzymeMierob Technol 1998；23：483-500；[13]Wang Z,Zhao F,Chen D,Li D.Cloud point system as a tool to improve the efficiency of biotransformation.Enzyme Microb Technol 2005；36：589-594；[14]Singer Y,Shity H,Bar R.Microbial transformations in a cyclodextrin medium.Part 2.Reduction of androstenedione to testosterone by Saccharomyces cerevisiae.Appl Microbiol Biotechnol 1991；35：731-737；[15]Lo C-K,Pan C-P,Liu W-H.Production of testosterone from phytosterol using a single-step microbial transformation by a mutant of Mycobacterium sp.J Ind Microbiol Biotechnol 2002；28：280-283；[16]Cheng C,Ma J-H.Enantioselective synthesis of S-(-)-1-phenylethanol in Candida utilis semi-fed-batch cultures.ProcessBiochem 1996；31：119-124；[17]Crolla A,Kennedy KJ.Fed-batch production of citric acid by Candida lipolytica grown onn-paraffins.J Biotechnol 2004；110：73-84；[18]Ding S,Tan T.L-lactic acid production by Lactobacillus casei fermentation using different fed-batch feeding strategies.Process Biochem 2006；41：1451-1454；[19]Caravelli AH,Zaritzky NE.About the performance of Sphaerotilus natans to reduce hexavalent chromium in batch and continuous reactors.J Hazard Mater 2009；168：1346-1358；[20]Magnusson L,Cicek N,Sparling R,Levin D.Continuous hydrogen production during fermentation of α-cellulose by the thermophilic bacterium Clostridiumthermocellum.Biotechnol Bioeng 2009；102：759-766；[21]Radniecki TS,Semprini L,Dolan ME.Expression of merA,trxA,amoA,andhao in continuously cultured Nitrosomonas europaea cells exposed to cadmium sulfate additions.Biotechnol Bioeng 2009；104：1004-1011；[22]Chan E-C,Kuo J.Biotransformation of dicarboxylic acid by immobilized Cryptococcus cells.Enzyme Microb Technol 1997；20：585-589；[23]Domingues L,Lima N,Teixeira JA.Aspergillus niger β-galactosidase production by yeast in a continuous high cell density reactor.Process Biochem 2005；40：1151-1154.)
本發明的目的之一在於提供一種新穎的生物轉換系統與方法，可在短的反應時間內，達到改善產率、增加產物回收的目的。
根據上述的目的或其他目的，本發明實施例提供一種連續生物轉換方法，包含：連續提供活的生物催化劑細胞(biocatalyst cells)或生物催化劑生化分子(biocatalyst biomolecules)給予一具有複數個反應基質的生物反應器，以媒介基質使其轉換成所需的生物產品。
根據上述的目的或其他目的，本發明實施例提供一種連續 生物轉換方法，包含：以第一流量連續提供一包含複數個活酵母細胞的酵母溶液予至少一生物反應器；以第二流量連續提供一包含複數個反應基質的溶液予每個生物反應器，藉此酵母細胞媒介基質使其轉換成複數個微生物產物，形成一產物溶液；以及以第三流量自每個生物反應器導出包含微生物產物的產物溶液。
根據上述的目的或其他目的，本發明實施例提供一種連續生物轉換系統，包含：一第一槽，用於以一第一流量連續提供一包含複數個活酵母細胞的酵母溶液予至少一生物反應器；一第一儲槽，用於以一第二流量連續提供一包含複數個反應基質的溶液予每個生物反應器，藉此酵母細胞媒介基質使其轉換成複數個微生物產物，形成一產物溶液；以及一第一循環裝置，用於以一第三流量自每個生物反應器導出包含微生物產物的產物溶液至一收集站。
1‧‧‧以第一流量連續提供一包含複數個活酵母細胞的酵母溶液予至少一生物反應器
2‧‧‧以第二流量連續提供一包含複數個反應基質的溶液予每個生物反應器，藉此酵母細胞媒介基質使其轉換成複數個微生物產物，形成一產物溶液
3‧‧‧以第三流量自每個生物反應器導出包含微生物產物的產物溶液
10‧‧‧連續式生物轉換系統
11‧‧‧攪拌槽/細胞培養槽
12‧‧‧攪拌槽/生物轉換槽
13‧‧‧反應基質
14‧‧‧循環裝置
15‧‧‧培養介質
16‧‧‧循環裝置
17‧‧‧循環裝置
18‧‧‧收集站
19‧‧‧馬達
20‧‧‧pH電極
21‧‧‧控制器
22‧‧‧空氣入口
23‧‧‧循環裝置
圖1顯示根據本發明一實施例的連續式生物轉換方法；圖2顯示根據本發明一實施例的連續式生物轉換系統；圖3A至3D顯示根據本發明一實施例的連續式生物轉換系統或方法，在各種雌素酮的起始濃度與各種雌素酮的進料速度條件下所獲得的各種結果；圖4A至4D顯示根據本發明一實施例的連續式生物轉換系統用於還原雌素酮，在各種雌素酮的進料濃度與各種產物導出速率條件下所獲得的各種結果；以及 圖5顯示根據本發明一實施例的連續式生物轉換系統用於還原雌素酮，其雌素酮與β-雌二醇在反應槽與產物收集瓶內的平均濃度變化。
本發明的一些實施例將詳細描述如下。然而，除了如下描述外，本發明還可以廣泛地在其他的實施例施行，且本發明的範圍並不受實施例之限定，其以之後的專利範圍為準。在說明書的描述中，為了使讀者對本發明有較完整的了解，提供了許多特定細節；然而，本發明可能在省略部分或全部這些特定細節的前提下，仍可實施。此外，眾所周知的步驟或元件並未描述於細節中，以避免造成本發明不必要之限制。
本發明一實施例提供一種連續生物轉換的方法，包含：連續提供活的生物催化劑細胞(biocatalyst cells)或生物催化劑生化分子(biocatalyst biomolecules)給予一具有複數個反應基質的生物反應器，以媒介基質使其轉換成所需的生物產品。
圖1顯示根據本發明另一實施例的連續生物轉換的方法。此方法包含：步驟1，以第一流量連續提供一包含複數個活酵母細胞的酵母溶液予至少一生物反應器；步驟2，以第二流量連續提供一包含複數個反應基質的溶液予每個生物反應器，藉此酵母細胞媒介基質使其轉換成複數個微生物產物，形成一產物溶液；步驟3，以第三流量自每個生物反應器導出包含微生物產物的產物溶液，其中第三流量實質上等於第一流量與第二流量的總和。
另外，在圖1所述的方法中，酵母溶液可自一細胞培養槽進料，複數個培養介質可以第四流量輸送至細胞培養槽，酵母可在最初時間被起始接種(initially inoculated)在培養介質，以及可連續提供空氣給予上述細胞培養槽，以培養活的酵母細胞並形成酵母溶液。酵母細胞可包含釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，反應基質可包含雌素酮(estrone)或雄二酮(androstenedione)。
在本文中，「生化分子(biomolecules)」包含各種單細胞繁殖抗體(monoclonal antibodies)、多細胞繁殖抗體(polyclonal antibodies)、核酸(nucleic acids)、蛋白質(proteins)、酵素(enzymes)、脂質(lipid)、多醣(polysaccharides)、糖(sugars)、縮胺酸(peptides)、聚縮胺酸(polypeptides)、生物配位體(boiligands)等等。
於本文中，「生物反應器(bioreactor)」定義成可發生一生物轉換的一空間。生物反應器包含任何可使一溶液在一生物催化劑、生化分子或一酵母的存在下進行一接觸的任何裝置，例如攪拌槽(反應器)、流動床反應器(fluidized bed reactor)、批次反應器(batch reactor)、塞狀流反應器(plug flow reactor)、過濾器反應器(filter reactor)、薄膜過濾器反應器(membrane filter reactor)、或陶瓷過濾器反應器(ceramics filter reactor)。另外，也可合併前述的一或多種型態的反應器作為生物反應器。在一具有相當數量流動路徑可提供生物催化發生之所在的容器，也屬於本發明所定義的生物反應器。
以下描述根據本發明實施例的連續生物轉換系統，其為一連續式的細胞培養系統，包含兩個攪拌槽的串聯，用於在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的催化下連續將雌素酮(estrone)還原成 β-雌二醇(β-estradiol)。但本領域熟悉技藝人士知道，本發明所提供的系統也可用於製造其他微生物產物，例如睪丸素(testosterone)，也可以使用其他酵母與/或反應基質。
為驗證本發明實施例所提供系統的產率，兩個比較性的範例，包含「批次細胞培養」與「單一攪拌槽連續式細胞培養」亦一併提供。
培養介質-準備酵母溶液
原先生長在瓊脂斜面(agar slants)的酵母(本例為釀酒酵母)被接種(inoculated)到100mL的培養介質(incubation medium)。培養介質包含1.5g的磷酸二氫鉀(KH2PO4)、2.9g的磷酸一氫鉀(K2HPO4)、1.3g的硫酸氨[(NH4)2SO4]、1.8g的七水硫酸鎂(MgSO4．7H2O)、0.0175g的二水氯化鈣(CaCl2．2H2O)、0.1mL(1.25%,w/v)的硫酸鐵(FeSO4)、20.0g的D-(+)葡萄糖[D-(+)-glucose]與1.0L的蒸餾水。詳細的細胞培養程序，描述在文獻Cheng C,Tsai H-R.Yeast-mediated enantioselective synthesis of chiralR-(+)-andS-(-)-1-phenyl-1-butanol from prochiral phenyln-propyl ketone in hexane-water biphasic culture.J Chem Technol Biotechnol 2008；83：1479-1485，該文獻的全文併入本文，視為本案說明書的一部分。
比較例-批次細胞培養
本批次式比較例用於還原雌素酮(estrone)，所使用培養介質如前所述。酵母細胞被培養在一購自日本東京Eyela公司，型號M-100的迷你發酵器或一購自台灣台中Bio-Top公司，型號BTF-A3L的攪拌發酵槽。經過兩天的酵母細胞培養，將5.0mL的雌素酮乙醇溶液直接加入上述發酵器 或發酵槽以進行反應。反應控制在pH 5.0、30℃、攪拌速率150rpm、氣密(不與空氣接觸)。通常，反應時間是6天。每隔24小時將產物溶液濾出並分析。
比較例-單一攪拌槽連續式細胞培養
首先，在一攪拌槽，以前述相同的培養介質與方法培養活的釀酒酵母細胞，培養時間約2天。接著，將5.4mg的雌素酮溶於5.0mL的乙醇溶液直接加入上述攪拌槽以進行反應。接著，濃度為35mg/L的雌素酮以0.1mL/min或0.2mL/min的流量輸送至上述攪拌槽，並以相同的流量從攪拌槽導出產物溶液至一燒瓶。攪拌槽的反應條件控制在pH 5.0、30℃、攪拌速率150rpm、氣密(不與空氣接觸)。在反應的第一天，每隔8小時由燒瓶取樣、過濾、分析。在反應的第二天之後，每隔24小時由燒瓶取樣、過濾、分析。每次取樣使用一個新的燒瓶。
較佳實施例-雙攪拌槽連續式細胞培養
圖2顯示根據本發明實施例的連續式生物轉換系統10，其例示兩個串聯的攪拌槽11/12，用於還原estrone(雌素酮)。其中，攪拌槽11是用於細胞培養，而另一個攪拌槽12是用於生物轉換。兩個攪拌槽11/12皆配備有馬達19附攪拌葉，用於將攪拌槽11/12的內容物攪拌均勻，以及配備有一pH電極20，用於控制攪拌槽11/12的內容物的pH值，與配備有一控制器21，用於控制馬達19與pH電極20。在進行生物轉換之前，可進行一預處理程序。此預處理程序包含在兩個攪拌槽11/12，以前述相同的培養介質，與pH 7.0、30℃、攪拌速率150rpm、通空氣的條件下，培養酵母細胞。在預處理程序完成後，攪拌槽11的條件保持不變，而攪拌槽12的 條件將稍有變更。
接著，0mg或特定量的雌素酮(estrone)溶解於5.0mL的純乙醇後，被直接加入2L的攪拌槽12，其控制在pH 5.0、30℃、攪拌速率150rpm、氣密的條件。接著，已知數量的反應基質13，例如雌素酮(estrone)，利用一循環裝置14，例如一蠕動泵(LongerpumpTM,BT50-1J,Baoding,Hebei，中國大陸)，以流量0.1mL/min連續輸入至攪拌槽12。同時，新鮮的培養介質15透過另一個循環裝置16連續地添加至3L的攪拌槽11。空氣亦經由空氣入口22被連續提供至攪拌槽11(細胞培養槽11)以連續培養活的酵母細胞並在攪拌槽11內形成酵母溶液。具有活酵母細胞的酵母溶液，經由另一個循環裝置17，例如一兩通道蠕動泵(LongerpumpTM,BT100-2J)，以流量0.15mL/min連續輸送至攪拌槽12。
在攪拌槽12(生物轉換槽12)，酵母細胞(本例為釀酒酵母細胞)反應媒介基質(本例為雌素酮)使其轉換成所需的微生物產物(本例為β-雌二醇)，並在攪拌槽12內形成一產物溶液，其包含微生物產物、未作用的酵母細胞、未作用的培養介質等等，且其經由另一循環裝置23，例如蠕動泵(LongerpumpTM,BT50-1J)，以流量0.25mL/min連續導出至一收集站18，例如一收集燒瓶，藉此攪拌槽12的內容物體積可維持在1L。在反應期間，從攪拌槽12導出的產物溶液以HPLC測量。取樣時間與前述「單一攪拌槽連續式細胞培養」的實施例相同。
所需的微生物產物可利用一分離程序，例如過濾，自產物溶液中分離出來。注意在本發明另一實施例，尚包含將收集站18的產物 溶液分離出活的酵母細胞，並經由另一循環裝置(未圖示)將其回收至攪拌槽11。另外，在本發明另一實施例，可包含兩個或兩個以上並聯設置的(生物轉換)攪拌槽12，亦即，生物轉換槽12的數量不限。
測量細胞質量(cell mass)
根據前述的取樣週期，分別從單一攪拌槽連續式細胞培養系統與本發明較佳實施例的的生物轉換槽12，導出產物溶液，分析其細胞質量。另外，亦從本發明較佳實施例的細胞培養槽11，取樣酵母溶液作細胞質量分析。取樣的產物溶液或酵母溶液以微孔薄膜(micro-porous membrane)，例如混合纖維過濾膜(購自美國加州Advantec MFS公司，直徑47mm，微孔徑0.2μm)進行過濾。已過濾、留在薄膜上的細胞置入烘箱，以溫度大約50℃加熱約24hrs後可得乾燥細胞，扣掉薄膜重量後即為乾燥細胞質量淨重。
基質與微生物產品分析
在單一攪拌槽連續細胞培養系統比較例，根據前述取樣週期，自攪拌槽取出2mL的產物溶液作分析。在本發明實施例，根據相同取樣週期，從細胞培養槽11與收集站18取樣2mL的酵母溶液或產物溶液做分析。以具有聚偏二氟乙烯樹脂(polyvinylidene fluoride)薄膜的拋棄式針筒過濾器(Millex® HV，直徑13mm，孔徑0.45μm，麻薩諸塞州，美國)過濾酵母溶液或產物溶液。接著，濾出物以固相萃取(solid-phase extraction，萃取管為25mm×4mmLiChrospher® RP-18e ADS,Merck)結合高效液相層析儀(JASCO PU1580，日本東京，分析管為100mm×4.6mmChromolithTM Performance RP-18e column,Merck)以及 紫外光偵測器(Shimadzu SPD-10A，日本京都)做分析。對於雌激素的分析，在固相萃取管與分析管內的移動相皆是乙腈(acetonitrile)與水的混合，混合比例分別是1：9與1：3，而流量分別是0.5mL/min與3.0mL/min。
非鏡像異構物過剩值比(diastereomeric excess value,%d.e.)
由於17 β-雌二醇(17 β-estradiol)是雌素酮(estrone)的非鏡像異構物，因此用非鏡像異構物過剩值比評估生物轉換的立體選擇性，其計算公式如下：
批次細胞培養系統還原雌素酮的實驗結果
對於批次細胞培養系統，以還原雌素酮為例，試圖尋找最佳的製程參數。12.0mg的雌素酮(estrone)被置入發酵器並以前述的條件下進行反應，但是控制在不同的pH值，分別是4.0，5.0，6.0，與7.0。隨著反應時間增加，各pH條件下產物溶液的細胞質量皆逐漸減少。操作在pH5.0時獲得最大產率42.5%，因此之後的實驗皆控制在pH 5.0的條件下。產物溶液分析只發現β-雌二醇，顯示還原反應具有良好的立體選擇性。
另外，為尋找在可接受產率與非鏡像異構物過剩值比條件下的最佳起始反應基質濃度，分別以不同的反應基質(雌素酮)起始濃 度，包含2.7、5.4、12.0與135mg/L做實驗，實驗結果如表一所示。當基質的起始濃度為5.4mg/L，反應6天後，可得最大產率54.8%，最大累積產量是反應3天後的3.0mg。另外，β-雌二醇是唯一產物，因此非鏡像異構物過剩值比皆超過99%，表示酵母媒介具有良好的立體選擇性。
在所有實驗結果亦觀察到在反應最後一天，β-雌二醇的濃度會下降，原因可能是培養介質的消耗造成酵母細胞死亡與破裂，釋出的物質或酵素消耗雌素酮與β-雌二醇。由於十七β-羥基類固醇去氫酶是一種細胞內的酵素(intracellular enzyme)，且只有在活的細胞才能發生作用。因此在發酵期間，只有活的酵母細胞才能將雌素酮與還原 成所要的β-雌二醇。為了得到高產率，必須在短時間內提供大量活的酵母細胞。
單一攪拌槽連續式細胞培養的實驗結果
在單一攪拌槽連續式細胞培養的比較例，5.4mg的雌素酮於最初被加在攪拌槽，之後雌素酮以35mg/L的濃度與0.2或0.1mL/min的流量加入攪拌槽內，並以相同流量導出產物溶液。當導出流量為0.2mL/min，反應2天後的β-雌二醇累積產量為4.2mg，當導出流量為0.1mL/min，反應4天後的β-雌二醇累積產量為4.0mg。然而，單一攪拌槽連續式細胞培養系統的整體產率會低於34%，如表一所示，這是由於產物溶液的持續導出，大幅降低細胞質量所致。
雙攪拌槽連續式細胞培養系統的實驗結果
本發明較佳實施例所提供雙攪拌槽連續式細胞培養系統的目的，是為保持大量的活酵母細胞以還原雌素酮與降低基值抑制。由於在生物轉換反應期間，細胞活性與細胞質量會持續降低，為利用反應最初數天酵母細胞的活性較高，一些雌素酮於生物轉換開始時被添加在生物轉換槽內。圖3A至圖3D顯示不同的雌素酮起始添加量，與不同的雌素酮輸入濃度時之生物轉換結果。其中，圖3A顯示在細胞培養槽中隨時間變化的細胞濃度(亦即單位體積之細胞質量)變異；圖3B顯示在生物轉換槽中隨時間變化的細胞濃度變異；圖3C顯示β-雌二醇的產率；圖3D顯示β-雌二醇的累積產量。其中，各曲線的製程參數如下：◆，0mg的雌素酮起始濃度並連續輸入45mg/L的雌素酮；■，0mg的雌素酮起始濃度並連續輸入82.5mg/L的雌素酮；▲，4.0mg的雌素酮起始濃度並連續輸入45 mg/L的雌素酮；×，重複實驗的平均值，5.4mg的雌素酮起始濃度並連續輸入45mg/L的雌素酮；＊,6.8mg的雌素酮起始濃度並連續輸入45mg/L的雌素酮。
圖3A顯示，所有實驗中，即使新的培養介質被持續補充，細胞培養槽內的細胞濃度會逐漸減低，這是因為細胞的死亡與產物溶液的持續導出。圖3B顯示，與批次系統相較，連續提供活的酵母細胞予生物轉換槽，可改善細胞濃度的降低。圖3C與圖3D顯示，較適當的製程參數是，雌素酮起始添加量為5.4mg，並以45mg/L的濃度連續補充至生物轉換槽。
圖4A至圖4D顯示不同的雌素酮輸入濃度，與不同的產物溶液導出速率之生物轉換結果。其中，添加於生物轉換槽內的雌素酮起始量固定為5.4mg，之後持續補充的雌素酮的流量固定為0.1mL/min。其中，圖4A顯示在細胞培養槽中隨時間變化的細胞濃度變異；圖4B顯示在生物轉換槽中隨時間變化的細胞濃度變異；圖4C顯示β-雌二醇的產率；圖4D顯示β-雌二醇的累積產量。其中，各曲線的製程參數如下：◆，連續輸入25mg/L的雌素酮與產物溶液導出速率為0.2mL/min；■，連續輸入35mg/L的雌素酮與產物溶液導出速率為0.2mL/min；▲，連續輸入35mg/L的雌素酮與產物溶液導出速率為0.3mL/min；×，連續輸入35mg/L的雌素酮與產物溶液導出速率為0.25mL/min；＊，第一次實驗結果，連續輸入45mg/L的雌素酮與產物溶液導出速率為0.25mL/min；+，第二次實驗結果，連續輸入45mg/L的雌素酮與產物溶液導出速率為0.25mL/min；●，連續輸入50mg/L的雌素酮與產物溶液導出速率為0.25mL/min。
為決定連續輸入雌素酮的最佳濃度與產物溶液的最佳導出 速率，將雌素酮的輸入流量固定在0.1mL/min，變更雌素酮的輸入濃度從35mg/L至50mg/L，變更產物溶液的導出流量從0.2mL/min至0.3mL/min，以做比較。圖4A與圖4B顯示，於多數實驗中，在細胞培養槽予生物轉換槽內的細胞濃度會逐漸降低。圖4C顯示在反應第二天具有最佳產率65.5%。圖4D顯示在反應第三天時β-雌二醇的累積產量為12.3mg，在雌素酮的濃度45mg/L與產物導出流量0.25mL/min的條件下。本發明較佳實施例的產率54.8%，遠大於批次細胞培養系統在第5天的產率。另外，重複實驗的結果指出，在反應第二天具有高產率64.1%，在反應第三天時β-雌二醇的累積產量為13.5mg。表一亦列出β-雌二醇的平均產率與平均累積產量數據。
圖5顯示在生物轉換槽與收集站(例如一收集燒瓶)的雌素酮與β-雌二醇平均濃度，其製程參數與圖4相同且雌素酮的起始添加量為5.4mg，並以流量0.1min/L，濃度45mg/L的條件持續補充至生物轉換槽。其中圖5(a)表示生物轉換槽；圖5(b)表示收集燒瓶；符號■表示雌素酮(estrone)；◆表示β-雌二醇(β-estradiol)。
在生物轉換槽與收集燒瓶內的雌素酮濃度基本上保持穩定，且皆低於5.6mg/L，這表示本實驗系統具有低的基質抑制。當在生物轉換槽內的雌素酮濃度降低，也會有較高濃度的β-雌二醇產出。在反應第二天時，β-雌二醇在生物轉換槽(圖5a)與收集燒瓶(圖5b)內的濃度皆達到最大值。由於沒有α-雌二醇的產物被分析出來，表示本發明的系統與方法將雌素酮還原成β-雌二醇的立體選擇性極佳，非鏡像異構物過剩值比(%d.e.)超過99%。
以上，本發明實施例提供的連續生物轉換方法與系統可有效解決反應基質抑制與不明原因的反應基質與產物消耗，並從細胞培養槽提供更多的活酵母細胞給予生物轉換槽。在較佳實施例，本發明提供的系統與方法用於將雌素酮還原β-雌二醇的產率，與批次系統相較，前者具有更好的產率與多達4.3倍的產量。根據本發明實施例，酵母媒介雌素酮還原成β-雌二醇系統的立體選擇性超過99%。
上述之實施例僅係為說明本發明之技術思想及特點，其目的在使熟悉此技藝之人士能了解本發明之內容並據以實施，當不能以之限定本發明之專利範圍，即凡其他未脫離本發明所揭示精神所完成之各種等效改變或修飾都涵蓋在本發明所揭露的範圍內，均應包含在下述之申請專利範圍內。
1‧‧‧以第一流量連續提供一包含複數個活酵母細胞的酵母溶液予至少一生物反應器
2‧‧‧以第二流量連續提供一包含複數個反應基質的溶液予每個生物反應 器，藉此酵母細胞媒介基質使其轉換成複數個微生物產物，形成一產物溶液
3‧‧‧以第三流量自每個生物反應器導出包含微生物產物的產物溶液

Claims (7)

  1. 一種連續生物轉換系統，包含：至少一生物反應器，不通空氣；一細胞培養槽，透過一第一泵浦以一第一流量連續提供一包含複數個活酵母細胞的酵母溶液予該至少一生物反應器；一培養介質供應槽，透過一第二泵浦連續提供一培養介質至該細胞培養槽，酵母被起始接種在該培養介質，空氣被連續給予該細胞培養槽，以培養活的酵母細胞並形成該酵母溶液；一反應基質供應槽，透過一第三泵浦以一第二流量連續提供一包含複數個反應基質的溶液予每個該生物反應器，藉此於水相溶液中，酵母細胞媒介反應基質於不提供空氣下使其轉換成複數個微生物產物，形成一產物溶液；一收集容器，透過一第四泵浦以一第三流量自每個生物反應器導出包含微生物產物的產物溶液至該收集容器，該第三流量等於該第一流量與該第二流量的總和；其中該酵母細胞包含烘焙或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，該反應基質包含雌素酮，該微生物產物包含β-雌二醇，且該β-雌二醇的產率等於65%或超過65%。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的系統，其中雌素酮的還原具有一非鏡像異構物過剩值比(%d.e.)，該比率大於99%。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的系統，其中在該收集容器β-雌二醇從該產物溶液中被分離出來。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的系統，其中在該收集容器活的酵母細胞從該產物溶液中被分離出來。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的系統，其中β-雌二醇在該生物反應器與該收集容器的濃度，在生物轉換的第二天達到最大值。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的系統，其中該第一槽內溶液的溫度控制在30℃，每個該生物反應器內溶液的溫度控制在30℃。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的系統，其中該第一槽內溶液的pH值控制在7，每個該生物反應器內溶液的pH值控制在5。
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