CN105695551B - 一种制备去氢表雄酮的生物方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种去氢表雄酮的生物制备方法。其包括使用具有序列1的酮还原酶将式(Ⅱ)的双键移位中间体A的3‑位酮羰基选择性不对称地还原。
Description
技术领域
本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种去氢表雄酮的生 物制备方法。
背景技术
许多甾体化合物具有重要的生物活性及多种生理功能,去氢表雄酮(DHEA) 就是这样一个甾体类药物。值得关注的是：此化合物的应用非常广泛，作为性 激素前体，具有抗衰老及蛋白同化作用。主要功能有：1.辅助治疗疾病，目前 已经应用于治疗系统性红斑狼疮，抗过敏/哮喘等；2.改善性功能,提高性欲； 3.调节免疫系统功能,提高肌体免疫力；4.增强体能,改善情绪和睡眠,提高记忆 力；5.延缓衰老,保持青春活力。正由于它如此广泛的用途，其在临床上应用是 当前研究的一大热点。生产去氢表雄酮的方法主要有：天然产物提取，化学法 合成等。由于天然产物提取存在效率低下，成本高等缺点。目前工业化生产的 主要是化学法：但是此类方法一般都存在步骤比较长，反应条件比较苛刻，对 环境不友好等缺点。比如：
中国专利申请号201110085711.X，公开号102212099A的专利文献报道路 线如下：
此方法以醋酸妊娠双烯醇酮为原料经过肟化反应，贝克曼重排反应，水解反应 等三步化学反应最终以70％左右的总收率得到目标产物去氢表雄酮。该工艺路 线需要使用大量的易制毒试剂醋酐和丙酮，并且会产生大量的废水，对环境非 常不友好。另外，此路线的总收率只有70％，原子经济性较差。
中国专利申请号201210038094.2，公开号102603841 A的专利文献报道路 线如下：
此方法以甾体雄烯二酮为原料经过酯化反应，缩酮反应(保护羰基)，还原反 应，水解反应(脱保护)等四步化学反应最终以80％左右的总收率得到目标产 物去氢表雄酮。该方法第一步酯化反应对温度以及溶剂的量比较敏感，不易控 制。另外此方法，需要对底物进行保护，脱保护两步反应，非常不经济。
中国专利申请号201480029546.8，公开号105339382A的专利文献报道了使 用具有特定序列的酮还原酶选择性地将还原为此方 法相对于化学合成方法具有更高的选择性和环境友好性，但是作为酶促反应而 言，其底物浓度不高(60g/L左右)，反应时间过长(4-24小时)，所需辅酶 种类较多，因此，该方法在工业生产方面成本较高。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种简单易行的合成去氢表雄酮的生 物方法。该方法操作简单，条件温和，对环境友好，并且大幅度降低了生产的 成本，适合大规模的工业化生产。
一方面，本申请提供制备式(Ⅰ)的去氢表雄酮(DHEA)的方法，
其包括使用序列1所示核苷酸序列编码的酮还原酶将式(Ⅱ)的3-位酮羰 基选择性不对称地还原，
该反应进一步包括添加NAD+作为辅酶，
该反应进一步包括添加葡萄糖脱氢酶作为辅酶来循环使用NAD+。
另一方面，本申请提供制备式(Ⅱ)的方法，
其包括以下步骤：使用叔丁醇钾和叔丁醇将式(Ⅲ)的甾体雄烯二酮异构 化
本发明的反应式如下：
用于上述立体选择性还原的酮还原酶包括但不限于具有与序列1相对应的 氨基酸序列的酶。具有序列的酶与序列相对应或与序列1至少约80％、81％、 82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％相同。
本发明的优点：
1.以廉价易得的起始物甾体雄烯二酮出发通过在碱性条件下双键移位，得到 中间体。再利用酮还原酶对中间体的3-位酮羰基选择性不对称还原，最终能以 85％的总收率得到目标产物。
2.此反应路线不会产生原料的浪费，未反应的原料和中间体都能回收利用。
3.此反应路线生物转化步骤能在底物浓度50-800克/升浓度下进行，优选 120-600克/升，并且反应在2小时之内都能完成，有利于实现产业化。
4.含酮还原酶ADH046和葡萄糖脱氢酶GDH103的重组大肠杆菌透性细胞 可以直接用于制备去氢表雄酮，简化了生物酶粉的制备，同时利用重组细胞内 生NAD+再生体系免去了外源添加价格昂贵的辅酶NAD+，大大降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以 下实施例。
实施例1：构建质粒pET30a-ADH046及生产菌株 pET30a-ADH046/BL21(DE3)。
根据序列1，基因合成ADH046基因片段，基因两端引入酶切位点NdeI和 HindIII，连入pUC57载体(苏州泓迅生物技术有限公司)获得质粒 pUC57-ADH046。将基因进行NdeI/HindIII双酶切，回收后的片段与NdeI/HindIII 双酶切的质粒pET30a一起通过T4DNA连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5a 完成重组质粒pET30a-ADH046的构建。将重组质粒pET30a-ADH046转入大肠 杆菌BL21(DE3)中获得重组菌株pET30a-ADH046/BL21(DE3)。
实施例2：制备ADH046冻干粉
将pET30a-ADH046/BL21(DE3)单菌落接种到4ml液体LB培养基，37℃振 荡培养过夜，取过夜培养基以1％接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振 荡培养至OD600值达到0.4-0.6，加入终浓度1mM IPTG于25℃振荡培养过夜。 结束后离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用5ml 10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0) 重悬细胞，于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心(8,000rpm，30min)，收 集上清液冷冻干燥，获得ADH046的冻干粉。
实施例3：构建质粒pET30a-GDH103及生产菌株 pET30a-GDH103/BL21(DE3)。
以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)基因组为模板，设计引物GDH103_NdeI_F:AACATATGTATCCGGATTTAAA和GDH103_HindIII_R: TTAAGCTTTTAACCGCGTCCTGCCTGGA，通过PCR从基因组上扩增葡萄糖 脱氢酶基因GDH103，NdeI/HindIII双酶切，回收后的片段与NdeI/HindIII双酶 切的质粒pET30a一起通过T4DNA连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5a完 成重组质粒pET30a-GDH103的构建。将重组质粒pET30a-GDH103转入大肠杆 菌BL21(DE3)中获得重组菌株pET30a-GDH103/BL21(DE3)。
实施例4：制备GDH103冻干粉
将pET30a-GDH103/BL21(DE3)单菌落接种到4ml液体LB培养基，37℃振 荡培养过夜，取过夜培养基以1％接种量转接于50ml液体LB培养基，37℃振 荡培养至OD600值达到0.4-0.6，加入终浓度1mM IPTG于25℃振荡培养过夜。 结束后离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用5ml 10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.0) 重悬细胞，于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心(8,000rpm，30min)，收 集上清液冷冻干燥，获得GDH103的冻干粉。
实施例5：构建质粒pET30a-ADH046-GDH103及生产菌株 pET30a-ADH046-GDH103/BL21(DE3)。
以pET30a-GDH103为模板，设计引物GDH103_HimdIII_F:CCCAAGCTTAAGGAGATATACTTATGTATCCGGATTTAAAAGG和GDH103_XhoI_R:CCGCTCGAGTTAACCGCGTCCTGCCTGGAATG，PCR获得GDH103基因， HIndIII/XhoI双酶切，回收后的片段与HIndIII/XhoI双酶切的质粒 pET30a-ADH046一起通过T4DNA连接酶进行连接，并转化大肠杆菌DH5a完 成重组质粒pET30a-ADH046-GDH103的构建。将重组质粒 pET30a-ADH046-GDH103转入大肠杆菌BL21(DE3)中获得重组菌株 pET30a-ADH046-GDH103/BL21(DE3)。
实施例6：制备ADH046、GDH103混合冻干粉
将pET30a-ADH046-GDH103/BL21(DE3)单菌落接种到4ml液体LB培养 基，37℃振荡培养过夜，取过夜培养基以1％接种量转接于50ml液体LB培养 基，37℃振荡培养至OD600值达到0.4-0.6，加入终浓度1mM IPTG于25℃振 荡培养过夜。结束后离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用5ml 10mmol/L 磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，于冰浴中超声波破碎细胞，将破碎液离心(8,000 rpm，30min)，收集上清液冷冻干燥，获得ADH046、GDH103混合冻干粉。
实施例7：制备含ADH046和GDH103的重组大肠杆菌透性细胞
将pET30a-ADH046-GDH103/BL21(DE3)单菌落接种到4ml液体LB培养 基，37℃振荡培养过夜，取过夜培养基以1％接种量转接于50ml液体LB培养 基，37℃振荡培养至OD600值达到0.4-0.6，加入终浓度1mM IPTG于25℃振 荡培养过夜。结束后离心收集细胞(4,000rpm，10min)，用10ml 100mmol/L 磷酸缓冲液(pH7.0)重悬细胞，添加1％(50uL)的甲苯用于增加大肠杆菌的 膜透性，重悬细胞可以直接用于生物转化。
实施例8：制备双键移位中间体A
取叔丁醇225毫升于500毫升三颈瓶中，在氮气保护下加入叔丁醇钾29克， 搅拌10-15分钟，使其溶解。氮气保护下将原料甾体雄烯二酮30克加入至三颈 瓶中，反应1.5小时。在氮气氛围下将20克冰醋酸溶于600毫升水中，在20-25℃ 下将三颈瓶中的反应液加入其中，搅拌30分钟，析出固体，抽滤，用水洗涤滤 饼，干燥称重。产品重量：27.3克，收率91％，HPLC纯度97％。母液通过乙 酸乙酯萃取回收约2克原料与产品的混合物，回收率占投料量的7％。
实施例9：制备去氢表雄酮
在50毫升的三颈瓶中加10.5毫升去离子水，分别称取ADH046酶粉72毫 克，辅酶GDH103 36毫克以及NAD+3毫克溶解在上述去离子水中。在搅拌的 同时向反应瓶中依次加入pH＝6.5的PBS(0.4mol/L)缓冲溶液7.5毫升,葡萄 糖6.8克，双键移位中间体A 3.6克，最后加入2-甲基四氢呋喃12毫升。控制 反应温度在35℃，继续搅拌，用1mol/L NaOH溶液滴定，使反应的pH保持在 6.4-6.6之间，取样检测。1-2小时后，HPLC检测转化率>99％，加入等体积乙酸 乙酯搅拌30分钟，过滤，滤液分液取有机相，水相用等体积乙酸乙酯萃取2次， 合并有机相并用无水硫酸钠干燥，脱溶得到粗产品。粗品用丙酮-水的混合溶剂 重结晶得到纯品约3.25克，收率90％，HPLC纯度>98％。母液浓缩蒸干回收0.27 克，回收率占投料量的7.5％。
实施例10：制备去氢表雄酮
在50毫升的三颈瓶中加10.5毫升去离子水，分别称取ADH046酶粉200 毫克，辅酶GDH103 100毫克以及NAD+8毫克溶解在上述去离子水中。在搅 拌的同时向反应瓶中依次加入pH＝6.5的PBS(0.4mol/L)缓冲溶液7.5毫升,葡 萄糖18克，双键移位中间体A 10.8克，最后加入2-甲基四氢呋喃12毫升。控 制反应温度在35℃，继续搅拌，用1mol/L NaOH溶液滴定，使反应的pH保持 在6.4-6.6之间，取样检测。1-2小时后，HPLC检测转化率>99％，加入等体积 乙酸乙酯搅拌30分钟，过滤，滤液分液取有机相，水相用等体积乙酸乙酯萃取 2次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，脱溶得到粗产品。粗品用丙酮-水的混 合溶剂重结晶得到纯品约9.65克，收率89％，HPLC纯度>98％。母液浓缩蒸干 回收0.6克，回收率占投料量的5.5％。
实施例11：制备去氢表雄酮
在50毫升的三颈瓶中加10.5毫升去离子水，分别称取ADH046酶粉500 毫克，辅酶GDH103 250毫克以及NAD+20毫克溶解在上述去离子水中。在 搅拌的同时向反应瓶中依次加入pH＝6.5的PBS(0.4mol/L)缓冲溶液7.5毫升, 葡萄糖45克，双键移位中间体A 25.2克，最后加入2-甲基四氢呋喃12毫升。 控制反应温度在35℃，继续搅拌，用1mol/L NaOH溶液滴定，使反应的pH保 持在6.4-6.6之间，取样检测。1-2小时后，HPLC检测转化率>99％，加入等体 积乙酸乙酯搅拌30分钟，过滤，滤液分液取有机相，水相用等体积乙酸乙酯萃 取2次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，脱溶得到粗产品。粗品用丙酮-水的 混合溶剂重结晶得到纯品约22.67克，收率90％，HPLC纯度>98％。母液浓缩 蒸干回收1.9克，回收率占投料量的7.5％。
实施例12：ADH046、GDH103混合冻干粉制备去氢表雄酮
在50毫升的三颈瓶中加10.5毫升去离子水，分别称取ADH046、GDH103 混合冻干粉72毫克和辅酶NAD+3毫克溶解在上述去离子水中。在搅拌的同时 向反应瓶中依次加入pH＝6.5的PBS(0.4mol/L)缓冲溶液7.5毫升,葡萄糖6.8 克，双键移位中间体A 3.6克，最后加入2-甲基四氢呋喃12毫升。控制反应温 度在35℃，继续搅拌，用1mol/L NaOH溶液滴定，使反应的pH保持在6.4-6.6 之间，取样检测。1-2小时后，HPLC检测转化率>99％，加入等体积乙酸乙酯搅 拌30分钟，过滤，滤液分液取有机相，水相用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并 有机相并用无水硫酸钠干燥，脱溶得到粗产品。粗品用丙酮-水的混合溶剂重结 晶得到纯品约3.17克，收率88％，HPLC纯度>98％。母液浓缩蒸干回收0.8克， 回收率占投料量的7.4％。
实施例13：ADH046、GDH103混合冻干粉制备去氢表雄酮
在50毫升的三颈瓶中加10.5毫升去离子水，分别称取ADH046、GDH103 混合冻干粉500毫克和辅酶NAD+20毫克溶解在上述去离子水中。在搅拌的同 时向反应瓶中依次加入pH＝6.5的PBS(0.4mol/L)缓冲溶液7.5毫升,葡萄糖 45克，双键移位中间体A 25.2克，最后加入2-甲基四氢呋喃12毫升。控制反 应温度在35℃，继续搅拌，用1mol/L NaOH溶液滴定，使反应的pH保持在6.4-6.6 之间，取样检测。1-2小时后，HPLC检测转化率>99％，加入等体积乙酸乙酯搅 拌30分钟，过滤，滤液分液取有机相，水相用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并 有机相并用无水硫酸钠干燥，脱溶得到粗产品。粗品用丙酮-水的混合溶剂重结 晶得到纯品约22.7克，收率90％，HPLC纯度>98％。母液浓缩蒸干回收1.8克， 回收率占投料量的7.1％。
实施例14：ADH046和GDH103的重组大肠杆菌透性细胞直接用于制备去 氢表雄酮
取上述实施例7中的静态细胞重悬液30mL，在搅拌的同时向细胞液加入葡 萄糖6.8克，双键移位中间体A 3.6克。控制反应温度在35℃，继续搅拌，用1mol/L NaOH溶液滴定，使反应的pH保持在6.4-6.6之间，取样检测。1-2小时后，HPLC 检测转化率>99％，加入等体积乙酸乙酯搅拌30分钟，过滤，滤液分液-取有机 相，水相用等体积乙酸乙酯萃取2次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥，脱溶 得到粗产品。粗品用丙酮-水的混合溶剂重结晶得到纯品约3.35克，收率93％， HPLC纯度>98％。母液浓缩蒸干回收0.18克，回收率占投料量的5％。
Claims (8)
1.制备式(Ⅰ)的去氢表雄酮的方法，
其包括使用序列1所示核苷酸序列编码的的酮还原酶将式(Ⅱ)的3-位酮羰基选择性不对称地还原，
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，加入NAD+作为辅酶。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，加入葡萄糖脱氢酶作为辅酶来循环使用NAD+。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶来源于枯草芽孢杆菌。
5.如权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶是以酶粉的形式加入。
6.如权利要求1、3-4任一项所述的制备方法，其特征在于，所述酶是以培养菌株的透性细胞形式加入，所述透性细胞是指具有增加的膜透性的细胞。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述培养菌株是重组大肠杆菌。
8.如权利要求1-4、7任一项所述的制备方法，其特征在于，酶促还原反应的底物浓度为50-800克/升。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20201106 Address after: 415000 workshop No.7, Jinshi small and Micro Enterprise Incubation Park, Changde City, Hunan Province Patentee after: HUNAN YINHANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: Xinghu Street Industrial Park of Suzhou city in Jiangsu province 215021 C13 No. 218 building 4 floor Patentee before: SUZHOU LEAD BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
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Denomination of invention: A biological method for the preparation of dehydroepiandrosterone Effective date of registration: 20210220 Granted publication date: 20190201 Pledgee: Changde finance finance Company limited by guarantee Pledgor: HUNAN YINHANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2021980001228 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20220914 Granted publication date: 20190201 Pledgee: Changde finance finance Company limited by guarantee Pledgor: HUNAN YINHANG BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2021980001228 |