KR20190095958A - 신규한 발효 시스템들 및 방법들 - Google Patents

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KR20190095958A
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션 파머
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로커스 아이피 컴퍼니 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 석유 및 가스 산업, 환경 정화 뿐만 아니라 다른 응용들에도 사용될 수 있는 미생물에 기반한 조성물들을 생산하기 위한 시스템들 및 장치들을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 미생물에 기반한 조성물들을 발효시키기 위한 생물학적 반응기들, 장비 및 물질들을 포함한다.

Description

신규한 발효 시스템들 및 방법들
본 출원은 2017년 1월 6일에 출원된, US 가출원 제 62/443,356호의 우선권을 주장하고, 그 전체가 참조에 의해 여기에 반영된다.
본 발명은 예를 들어, 석유 산업, 농업, 광업, 폐기물 처리 및 바이오정화기술(bioremediation)에 사용될 수 있는 미생물에 기반한 조성물들을 생성하기 위한 방법들 및 시스템들에 관한 것이다.
박테리아(bacteria), 효모(yeast) 및 균류(fungi)와 같은 미생물의 배양(cultivation)은 광범위한 유용한 바이오-제제들(bio-preparations)의 생산에 있어서 중요하다. 미생물은 예를 들어, 식품 산업들, 제약, 농업, 광업, 환경 정화, 및 폐기물 처리에 있어서, 중대한 역할을 하고 있다.
광범위한 산업들에서 미생물을 이용할 수 있는 엄청난 잠재력이 존재한다. 미생물에 기반한 생산물들(microbe-based products)의 상용화에 있어서 제한적인 인자는 번식체 밀도 당 비용이었는데, 이것은 특히 비용이 많이 들고 또한 이득을 보기에 충분한 접종원(inoculum)을 가지고 미생물적 생산물들을 대규모 작업들에 적용하는 것은 실행가능하지 않다.
미생물 배양의 2 가지 주요한 형태가 존재한다: 수중 배양 및 표면 배양. 박테리아, 효모 및 균류는 모두 표면 또는 수중 배양 방법들을 이용하여 성장될 수 있다. 배양 방법들 둘 다는 미생물의 성장을 위한 배지(nutrient medium)를 필요로 한다. 배지는, 액체 또는 고체 형태일 수 있는데, 통상적으로 탄소원, 질소원, 염들 및 적절한 부가 영양소들 및 미량요소들을 포함한다. pH 및 산소 레벨들은 주어진 미생물에 적절한 값들에서 유지된다.
미생물은, 더 쉽게 이용가능하게 되기만 한다면, 바람직하게 더 유효한 형태로, 예를 들어 석유 및 농업 분야에서, 매우 유익한 역할을 할 수 있는 잠재력을 가진다.
석유 및 천연 가스는 일반적으로 굴착 장치로 지칭되는 것을 이용하여 지구 표면에 시추함으로써 획득된다. 유정 또는 시추공은 드릴 비트를 이용해 지면에 큰 지름의 구멍(예.지름이 24-36 인치)을 천공함으로써 시작된다. 드릴 비트는 굴착 장치에 의해 회전되는, 드릴 파이프에 부착된다. 굴착 장치는 일반적으로 드릴 비트가 지하 수면 아래를 지나갈 때까지 큰 구멍을 뚫는 것을 계속한다. 다음으로, 금속재 라이너(또는 케이싱)가 큰 지름의 구멍 내에 배치되고 시멘트가 이 라이너 내부를 통해 펌핑된다. 이 시멘트가 라이너의 바닥에 도달할 때, 이것은 위쪽으로 흘러, 라이너와 주변 층 사이의 빈 공간을 채우고, 지하 수면을 격리시켜 후속 단계들에서 이 구멍으로 어떠한 천공 유체가 펌핑되든지 간에 이로부터 보호한다.
제1 케이싱이 접합(cement)된 후, 중간 크기의 비트가 지하층으로 더 깊이 천공하는 데 이용될 수 있다. 일반적으로 이후에 더 작은 케이싱 라이너 및 시멘트가 이어지는, 드릴 비트가 제거되는 하나 또는 그 이상의 정지 점들이 있다. 이 프로세스는 유정이 완료될 때까지 반복된다.
천공 프로세스 동안, 천공 유체들은 드릴 파이프를 통해 그리고 드릴 비트로부터 펌핑된다. 이 유체는 그후 드릴 파이프와 층(formation) 또는 케이싱 사이의 공간으로 다시 흐른다. 천공 유체는 천공 절삭물들을 제거하고, 하향공 압력(downhole pressures)을 조절하고, 시추공을 윤활시키고, 또한 시추공에서 마찰을 야기시키는 물질들을 세정하기 위해 작동한다.
유정이 천공된 후, 일반적으로 생산 라이너(또는 케이싱)가 배치되고 그후 유정이 뚫린다(예. 폭발물들이 석유 함유 층 내의 특정 지점들에서 생산 라이너에 구멍을 내는 데 사용된다). 그후 석유는 층의 자연 압력 하에서 또는 기계 장비, 수공법(water flooding), 또는 다른 수단을 통해 유도되는 압력을 이용해, 유정으로부터 흐르기 시작한다. 원유가 유정을 통해 흐를 때, 원유 내의 물질들은 종종 생산 라이너들의 표면들에 쌓여, 흐름을 감소시키고, 때때로 생산을 전부 중단시키기조차 한다.
다양한 화학물질들 및 장비가 이 문제를 방지하고 해결하기 위해 이용되지만, 개선된 생산물들 및 방법들에 대한 요구가 있다. 특히, 더 환경친화적이고, 덜 유해하고 또한 개선된 효율성을 가지는, 생산물들 및 방법들에 대한 요구가 있다.
농업 분야에서, 농부들은 생산량을 증가시키고 병균들, 해충들, 및 질병들로부터 농작물을 보호하기 위해 합성 화합들 및 화학 비료들의 사용에 상당히 의존해 오고 있지만; 하지만, 과용하거나 또는 부적절하게 적용된 때, 이 물질들은 유출, 침출 및 증발을 통해, 대기 및 수질 오염원이 될 수 있다. 적절하게 사용된 때조차도, 소정의 화학 비료들 및 농약들에의 과의존 및 장기적 사용은 토양 생태계를 유해하게 변경하고, 스트레스 내성을 감소시키고, 내충성을 증가시키고, 식물 및 동물 성장 및 활력을 방해한다.
증가하고 있는 규제는 화학물질의 이용가능성 및 용도를 통제할 것을 지시하고, 환경에 최소한의 피해를 끼치면서 생산되는, 잔여물이 없고, 지속가능하게 재배되는 식품에 대한 소비자 요구들은, 산업에 영향을 미치고 있고 또한 무수한 도전과제들을 어떻게 해결할지에 관한 사고의 진화를 야기시키고 있다. 더 안전한 농약들(pesticides) 및 대체 해충 억제 전략들(alternate pest control strategies)에 대한 요구가 증가하고 있다. 화학물질의 대규모 배제는 지금 가능하지 않지만, 농부들은 점점 더 통합 영양 관리 및 통합 해충 관리 프로그램(Integrated Nutrient Management and Integrated Pest Management programs)의 실행가능한 구성요소들로서 생물학적 방법들의 이용을 수용하고 있다.
예를 들어, 최근 수년 동안, 선충류(nematodes)의 생물학적 방제가 큰 관심을 끌었다. 이 방법은 살아 있는 미생물들, 이 미생물들로부터 유도되는 바이오-생산물들, 및 이들의 조합과 같은, 농약으로서 생물학적 제제(biological agents)를 이용한다. 이 생물학적 농약들은 다른 종래의 농약들에 비해 중요한 장점들을 가진다. 예를 들어, 이들은 종래의 화학적 농약들에 비하여 덜 해롭다. 이들은 더 효과적이고 더 명확하다. 이들은 종종 빠르게 생분해되어, 환경 오염이 덜하게 된다.
생물농약 및 다른 생물학적 제제의 사용은 생산, 이송, 관리, 가격책정 및 효능에 있어서의 어려움으로 크게 제한되어 왔다. 예를 들어, 많은 미생물들은 성장시켜서 이어서 유용할 만큼 충분한 양으로 농업 및 임업 생산 시스템들에 적용하기 어렵다. 이 문제는 유통 전에 처리(processing), 제조(formulating), 저장 및 안정화(stabillizing)로 인해 생존능력(viability) 및/또는 활동성(activity)에 있어서의 손실에 의해 악하된다. 나아가, 일단 적용되면, 생물학적 생산물들은 예를 들어, 불충분한 초기 세포 밀도들, 특정 위치에 존재하는 미생물총과 효과적으로 경쟁할 수 없는 무능(inability), 및 미생물이 번성하거나 또는 생존할 수 없는 토양 및/또는 다른 환경적 조건들에의 도입을 포함하는 여러 가지 이유들로 잘 자라지 않을 수 있다.
미생물에 기반한 조성물들(Microbe-based compositions)은 농업 분야, 석유 및 가스 산업, 뿐만 아니라 많은 다른 분야들에서 직면하고 있는 상기에서 언급된 문제들의 일부를 해결하는 데 도움을 줄 수 있다. 따라서, 미생물들(microorganisms) 및 미생물적 대사산물들(microbial metabolites)의 대량 생산을 위한 더 효과적인 배양 방법들에 대한 요구가 있다.
본 발명은 석유 및 가스 산업, 농업, 헬스케어 및 환경 정화 뿐만 아니라 다양한 다른 응용 분야들에 사용될 수 있는, 미생물에 기반한 조성물들을 생산하기 위한 물질들, 방법들 및 시스템들을 제공한다. 상세하게, 본 발명은 미생물 성장 부산물들(microbial growth by-products)의 생산 및 미생물의 효과적인 배양을 위한 물질들, 방법들 및 시스템들을 제공한다.
본 발명의 실시예들은 신규하고, 저비용인 발효 방법들 및 시스템들을 제공한다. 보다 상세하게, 본 발명은 발효를 위한 생물학적 반응기들(biological reactors)을 제공한다. 상세한 실시예들에 있어서, 이 시스템들은 효모 및/또는 다른 미생물에 기반한 조성물들을 성장시키는 데 이용된다. 다른 상세한 실시예들에 있어서, 이 시스템들은 스타르메렐라 봄비콜라(Starmerella bombicola) 효모 조성물들의 생산을 위해 이용될 수 있다.
이 시스템들은 효모, 균류 및 박테리아를 성장시키는 데 이용될 수 있다. 몇몇의 실시예들에 있어서, 이 시스템들은 예를 들어, 스타르메렐라 봄비콜라(Starmerella bombicola), 위케르하모미세스 아노말루스(Wickerhamomyces anomalus), 및/또는 슈도지마 어피디스(Pseudozyma aphidis) 효모를 포함하는, 효모에 기반한 조성물들의 생산을 위해 이용될 수 있다. 몇몇의 실시예들에 있어서, 이 시스템들은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및/또는 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis)를 포함하는 조성물들을 포함하는, 박테리아에 기반한 조성물들의 생산을 위해 이용될 수 있다.
상세한 실시예에 있어서, 본 발명의 시스템은 튜빙(tubing)에 의해 서로 연결되어 있는 적어도 2 개의 탱크들을 포함한다. 이 멀티-탱크 반응기에 있어서, 펌프는 미생물 배양체(microbial culture)를 하나의 탱크로부터 다른 탱크로 튜빙을 통해 강제한다. 바람직한 실시예들에 있어서, 튜빙은 탱크들의 상단에, 또는 그 근처에 설치된다. 배양체가 튜빙을 통해 이동할 때, 이것은 예를 들어 공기 압축기에 의해 유체 흐름 내로 넣어진 공기에 의해 산소가 공급될 수 있다. 이것은 배양체를 혼합하고 산소를 공급한다. 탱크들의 바닥 근처에는, 각각의 탱크 내에서 배양체 레벨들을 조절(balance)하기 위해 다른 튜브가 2 개의 탱크들을 연결한다. 이 튜빙은 공기 보충에 이용되기 위해 다른 도입구를 가질 수 있다. 그러므로, 이 튜빙은 추가적인 혼합 및 통기(aeration)를 제공할 수 있다. 추가적으로, 양 탱크들 모두에 개별적인 살포 시스템들(sparging systems)이 보충될 수 있다.
접종(inoculation)은 탱크들 중 하나 또는 둘 다에서 발생할 수 있고 접종원(inoculum)은 상기에서 언급된 튜빙 시스템들을 통해 양 탱크들에서 혼합된다. 멀티-탱크 시스템의 바람직한 실시예에 있어서, 펌프 또는 펌프들은 발효의 프로세스 전반에 걸쳐서 연속적으로 작동한다. 흐름 속도는, 예를 들어 분당 10 내지 20내지 200 갤론일 수 있다. 상세한 실시예들에 있어서, 전체 배양체 교환은 매 5 내지 10 분마다 탱크들 사이에서 발생한다.
유리하게도, 본 발명의 시스템들은 의도된 용도에 따라 크기조정될 수 있다. 예를 들어, 탱크들은 크기에 있어서 수 갤론부터 수만 갤론까지 다양할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 본 발명은 본 시스템을 이용해 오염 없이 미생물들을 배양하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예들에 있어서, 배양하는 방법들은 예를 들어 연동 펌프를 이용해 수분 및 영양 성분들을 포함하는 배지를 본 시스템들에 추가하는 단계; 이 시스템에 생존가능한 미생물(viable microorganism)을 접종하는 단계; 및 선택적으로, 이 시스템에 항균제(antimicrobial agent)를 추가하는 단계를 포함한다. 이 항균제는, 예를 들어 항생제(antibiotic) 또는 소포로리피드(sophorolipid)일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 본 발명은 추가적으로 적어도 한 종류의 미생물 및/또는 본 발명의 발효 시스템을 이용해 성장된 이 미생물에 의해 생산되는 적어도 하나의 미생물적 대사산물을 포함하는 조성물을 포함한다. 조성물 내의 미생물들은 활성의 또는 불활성의 형태일 수 있다. 조성물은 또한 건조된 형태 또는 액체 형태일 수 있다.
유리하게도, 본 발명의 방법 및 장비는 미생물 및 그들의 대사산물들을 대량으로 생산하는 자본 및 노동 비용을 감소시킨다. 나아가, 본 발명의 배양 프로세스는 배양 완료 후 미생물을 농축할 필요를 감소 또는 제거한다. 본 발명은 배지 단위 당 미생물 생산물들의 수율을 실질적으로 증가시킬 뿐만 아니라 생산을 단순화시키고 휴대성(portability)을 제공하는 배양 방법을 제공한다.
휴대성은 미생물에 기반한 조성물들이 의도된 이용 장소에서 또는 그 근처에서 생산될 수 있기 때문에 중요한 비용 절감으로 귀결될 수 있다. 이것은 원한다면, 최종 조성물이 현지에서 공급되는 물질들을 이용해 현장에서 제조될 수 있고, 이로써 운송 비용을 감소시킬 수 있음을 의미한다. 나아가, 조성물들은 적용시 생존가능한 미생물들을 포함할 수 있는데, 이것은 생산 효율성을 증가시킬 수 있다.
따라서, 소정의 실시예들에 있어서, 본 발명의 시스템들은 자연적으로 발생하는 국소 미생물들(naturally-occurring local microorganisms) 및 이들의 대사 부산물들의 힘을 이용한다. 국소 미생물 개체군들의 사용은, 이에 한정되지는 않지만, 원격 위치들을 포함하여, 환경 정화 (기름 유출의 경우에서와 같이), 축산업, 양식업, 임업, 목초지 관리, 잔디 관리, 원예 관상용 생산, 폐기물 처분 및 처리, 광업, 원유 회수(oil recovery), 및 인간의 건강을 포함하는 환경들에서 유리할 수 있다.
본 발명에 의해 생산되는 조성물들은 또한 미생물에 의해 강화된 원유 회수와 같은, 광범위한 석유 산업 응용 분야들에 이용될 수 있다. 이 응용 분야들은, 이에 한정되지는 않지만, 원유 회수의 강화, 석유 및 가스 정들(wells)의 시뮬레이션, 파라핀, 아스팔텐 및 막대, 튜빙, 라이너들, 탱크들 및 펌프들과 같은 장비로부터의 조각들과 같은 오염물들 및/또는 장애물들의 제거; 석유 및 가스 생산 및 이송 장비의 부식의 방지; 원유 및 천연 가스 내의 H2S 농도의 감소; 원유의 점도에 있어서의 감소; 무거운 원유 및 아스팔텐의 더 가벼운 탄화수소 조각들로의 개선, 탱크들, 흐름라인들 및 파이프라인들의 세정; 선택적 및 비선택적 막힘(plugging)으로 인한 수공법 동안 석유의 이동성의 향상; 및 유체 파쇄(fracturing fluids)를 포함한다.
석유 및 가스 응용 분야들에 사용될 때, 본 발명의 시스템들은 미생물에 기반한 유전 조성물들의 비용을 낮추는 데 이용될 수 있고 또한 고분자들, 용제들, 파쇄 모래 및 비즈, 유화제들, 계면활성제들, 및 업계에 알려진 다른 물질들과 같은, 다른 화학적 강화제들(chemical enhancers)과 조합되어 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 2개-탱크 시스템을 보여준다.
도 2는 예시적인 탱크 측정치들을 포함하는, 본 발명의 일 실시예에 따른 2개-탱크 시스템의 측면도를 보여준다.
본 발명은 석유 및 가스 산업, 양식업, 농업, 환경 정화, 인간 건강 뿐만 아니라 다양한 다른 응용 분야들에 사용될 수 있는, 미생물에 기반한 조성물들을 생산하기 위한 물질들, 방법들 및 시스템들을 제공한다. 보다 상세하게, 바람직한 실시예들에 있어서 본 발명은 효모에 기반한 및/또는 다른 미생물에 기반한 조성물들을 발효시키기 위한 생물학적 반응기들을 제공한다.
본 발명의 실시예들은 또한 신규한, 저비용의 발효 방법들 및 시스템들을 제공한다. 이 시스템들은 효모, 균류 및 박테리아 및/또는 이들의 성장 부산물들을 배양하는 데 이용될 수 있다. 소정의 실시예들에 있어서, 이 시스템들은, 예를 들어 스타르메렐라 봄비콜라, 위케르하모미세스 아노말루스, 및/또는 슈도지마 어피디스 효모를 포함하는, 효모에 기반한 조성물들의 생산을 위해 이용될 수 있다. 몇몇의 실시예들에 있어서, 이 시스템들은 바실러스 서브틸리스 및/또는 바실러스 리체니포르미스를 포함하는 조성물들을 포함하는, 박테리아에 기반한 조성물들의 생산을 위해 이용될 수 있다.
효모가 배양되는 바람직한 일 실시예에 있어서, 최종 조성물은 이하의 유리한 특성들 중 하나 또는 그 이상을 가질 수 있다: 효모의 세포벽의 일부로서 만노단백질 및 베타-글루칸의 고농도; 및 배양체 내의 생계면활성제들(biosurfactants) 및 다른 미생물적 대사산물들의 존재(예. 젖산 및 에탄올 등).
선택된 정의들
여기서 사용되는 바와 같이, "미생물에 기반한 조성물(microbe-based composition)"은 미생물들 또는 다른 세포 배양체들의 성장의 결과로서 생산된 성분들을 포함하는 조성물을 의미한다. 이로써, 미생물에 기반한 조성물은 미생물 그 자체 및/또는 미생물적 성장의 부산물들(by-products of growth)을 포함할 수 있다. 미생물은 식물 상태, 포자 형태, 균사 형태, 다른 번식 형태, 또는 이들의 혼합일 수 있다. 미생물은 플랑크톤 또는 생물막 형태, 또는 이 둘의 혼합일 수 있다. 성장의 부산물들은, 예를 들어 대사산물들, 세포막 성분들, 발현된 단백질들, 및/또는 다른 세포 성분들일 수 있다. 미생물은 손상되지 않고 온전하거나 또는 용해 분리되었을 수 있다. 바람직한 실시예들에 있어서, 미생물은 이들이 성장되었던 브로스(broth)와 함께, 미생물에 기반한 조성물들 내에 존재한다. 세포들은, 예를 들어 조성물의 밀리리터당 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 또는 1 x 1011의 농도 또는 더 많은 번식체에 존재할 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이, 번식체는 세포들, 포자들, 균사체들, 싹들 및 종자들을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 이로부터 새로운 및/또는 성숙한 유기체가 성장할 수 있는 미생물의 어떤 부분이다.
본 발명은 "미생물에 기반한 생산물들"을 더 제공하는데, 이 생산물들은 원하는 결과를 달성하기 위해 실제로 적용되어야 하는 생산물들이다. 미생물에 기반한 생산물은 단지 미생물 배양 프로세스로부터 수확된 미생물에 기반한 조성물일 수 있다. 대안적으로, 미생물에 기반한 생산물은 첨가된 추가적인 성분들을 포함할 수 있다. 이 첨가적인 성분들은, 예를 들어, 안정화제들, 완충제들, 물, 염 용액들, 또는 다른 적절한 담체(carrier)와 같은, 적절한 담체들, 추가적인 미생물적 성장을 지원하기 위해 첨가된 영양성분들, 식물 호르몬과 같은 비-영양적인 성장 증진제들, 및/또는 적용되는 환경에서 미생물들 및/또는 조성물의 추적을 용이하게 해주는 제제들을 포함할 수 있다. 미생물에 기반한 생산물은 또한 미생물에 기반한 조성물들의 혼합물들을 포함할 수 있다. 미생물에 기반한 생산물은 또한 이에 한정되지는 않지만 여과(filtering), 원심분리(centrifugation), 용해(lysing), 건조(drying), 정제(purification) 등과 같은 어떠한 방식으로 처리된 미생물에 기반한 조성물의 하나 또는 그 이상의 성분들을 포함할 수 있다.
여기서 사용되는 바와 같이, "수확된(harvested)"은 성장 용기로부터 미생물에 기반한 조성물 전부 또는 일부를 제거하는 것을 지칭한다.
여기서 사용되는 바와 같이, "생물막(biofilm)"은 박테리아와 같은, 미생물의 복합적인 집합체인데, 이때 세포들은 서로 붙어 있다. 생물막들 내의 세포들은 생리학적으로 동일한 유기체인 플랑크톤 세포들과 구별되는데, 이 플랑크톤 세포들은 액체 매질에서 부유하거나 또는 헤엄칠 수 있는 단세포들이다.
여기서 사용되는 바와 같이, 주요 유기체에 의해 발생되는 활동성을 참조하여 사용되는 "방제(control)"라는 용어는 해충들의 죽임, 불능 또는 운동억제 또는 그렇지 않다면 해충들이 실질적으로 해를 야기시킬 수 없도록 하는 행위까지 확장된다.
여기서 사용되는 바와 같이, "분리된(isolated)" 또는 정제된(purified)" 핵산 분자(nucleic acid molecule), 폴리뉴클레오티드(polynucleotide), 폴리펩타이드(polypeptide), 단백질 또는 소분자와 같은 유기화합물(organic compound)(예. 이하에서 설명되는 것들)은, 실질적으로 본래 연관되어 있는, 세포 물질과 같은, 다른 화합물들로부터 자유롭다. 여기서 사용되는 바와 같이, 미생물 종의 맥락에서 "분리된"은 종이 본래 존재하는 환경으로부터 제거된 것을 의미한다. 그러므로 분리된 종은 예를 들어 생물학적으로 순수한 배양체로서, 또는 담체와 연관된 포자(또는 종의 다른 형태들)로서 존재할 수 있다.
소정의 실시예들에 있어서, 정제된 화합물들은 관심 화합물의 중량(건조 중량)의 적어도 60%이다. 바람직하게, 제조(preparation)는 관심 화합물의 중량의, 적어도 75%, 보다 바람직하게는 적어도 90%이고, 가장 바람직하게는 적어도 99%이다. 예를 들어, 정제된 화합물은 원하는 화합물의 중량의 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99%, 또는 100% (w/w) 중 하나이다. 순도는 적절한 표준 방법에 의해, 예를 들어 칼럼 크로마토그래피(column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 또는 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC) 분석에 의해, 측정된다. 정제된 또는 분리된 폴리뉴클레오타이드(리보핵산(RNA) 또는 디옥시리보핵산(DNA))에는 자연적으로 발생하는 상태로 배치되는 유전자 또는 서열이 없다. 정제된 또는 분리된 폴리펩타이드에는 자연적으로 발생하는 상태로 배치되는 아미노산들 또는 서열들이 없다.
"대사산물(metabolite)"은 신진대사에 의해 생산되는 물질 또는 특정 신진대사 프로세스에 가담하는 데 필요한 물질을 지칭한다. 대사산물은 신진대사의 시작 물질(예. 글루코스), 중간(예. 아세틸-CoA), 또는 최종 생산물(예. n-부탄올)인 유기화합물일 수 있다. 대사산물들의 예들은, 효소들, 독소들, 산들, 용매들, 알콜들, 단백질들, 비타민들, 미네랄들, 미량요소들, 아미노산들, 및 생계면활성제들을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
여기서 사용되는 바와 같이, "계면활성제(surfactant)"는 2 개의 액체들 사이에서 또는 액체와 고체 사이에서 표면 장력(또는 계면 장력)을 낮춰주는 화합물을 지칭한다. 계면활성제들은 세제, 습윤제, 유화제, 발포제, 및 분산제(dispersants)로서 작용한다. "생계면활성제(biosurfactant)"는 살아 있는 유기체에 의해 생성되는 계면활성제이다.
발효 시스템 설계 및 작동
상세한 일 실시예에 있어서, 본 발명의 시스템은 튜빙에 의해 서로 연결되어 있는 적어도 2 개의 탱크들을 포함한다. 펌프는 미생물 배양체를 하나의 탱크로부터 다른 탱크로 튜빙을 통해 강제한다. 바람직한 실시예들에 있어서, 튜빙은 탱크들의 상단에, 또는 그 근처에 설치된다. 펌프는 제1 튜브(또는 호스 또는 파이프)를 통해 제1 탱크에 연결되는 입구, 및 제2 튜브를 통해 제2 탱크에 연결되는 출구를 가질 수 있다.
하나 또는 그 이상의 공기 압축기들이 통기를 위해 포함될 수 있고 또한 각각의 공기 압축기는, 선택적으로 오염을 방지하기 위한 공기 필터를 가질 수 있다. 공기 압축기들은 하나 또는 그 이상의 가스 주입기들(gas injectors), 거품기들(bubblers), 및/또는 살포기들(spargers)에 연결될 수 있다. 가스 주입기들은, 예를 들어 반응기의 탱크들 및/또는 튜브들 모두에 및/또는 어느 하나에 위치될 수 있다. 거품기들 및/또는 살포기들은 탱크들 모두에 및/또는 어느 하나에 위치될 수 있다. 배양체가 튜빙을 통해 이동할 때, 이것은 예를 들어 공기 압축기에 의해 유체 흐름 내로 넣어진 공기에 의해 산소가 공급될 수 있다. 이것은 배양체를 혼합하고 산소를 공급한다.
탱크들의 바닥 근처에는, 제3 튜브(또는 호스 또는 파이프)가 제2 탱크로부터 제1 탱크로 연결될 수 있다. 제3 튜브는 제2 탱크로부터 제1 탱크로 정수압(hydrostatic pressure) 하에서 액체가 흐르도록 허용한다. 이 튜빙은 각각의 탱크 내에서 배양체 레벨들을 조절하기 위해 2 개의 탱크들을 연결한다. 이 튜빙은 공기 보충에 이용되기 위해 다른 도입구를 가질 수 있다. 그러므로, 이 튜빙은 추가적인 혼합 및 통기를 제공할 수 있다. 이 시스템은 제1 펌프 흐름 속도를 제어하기에 적절한 제1 펌프의 출력 상에 흐름 제어 밸브를 포함할 수 있다. 제1 펌프는 또한 가변 주파수 모터를 이용해 제어될 수 있어 흐름 속도들은 전기 주파수에 있어서의 변화들을 통해 적절하게 조정될 수 있게 된다.
2 개의 탱크들 상단 근처의 튜빙은 바람직하게 탱크의 상단 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 및 1%에 있는 지점에서 각각의 탱크에 연결된다. 2 개의 탱크들 바닥에 더 가까운 튜빙은 바람직하게 탱크의 바닥의 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2%, 및 1%에 있는 지점에서 각각의 탱크에 연결된다.
이 시스템의 펌프 및/또는 펌프들은 예를 들어, 30 내지 0.10에 퍼져 있는, 재순환 비(recycle ratio, 시간 당 펌핑되는 부피/ 반응기 액체의 전체 부피)를 설정하기에 적절하도록 크기가 정해질 수 있다. 펌프는 원심 펌프(centrifugal pump)일 수 있다. 시스템은 제1 탱크 및 제2 탱크 입구들 및 출구들 상에 하나 또는 그 이상의 블록 밸브들(흐름을 정지시키는 데 이용되는 포괄적인 밸브)을 포함할 수 있다. 호스는 반응기에서 배수하고 의도된 사용 장소로 조성물을 펌핑하기 위해 제1 펌프(또는 반응기에 연결되는 제2 펌프)에 연결될 수 있다. 노즐은 호스의 끝단에 위치되고 또한 조성물을 분사하기에 적절할 수 있다.
이 시스템의 바람직한 실시예들에 있어서, 펌프 또는 펌프들은 발효의 프로세스 전반에 걸쳐서 연속적으로 작동한다. 흐름 속도는, 예를 들어 분당 10 내지 20 내지 200 갤론일 수 있다. 상세한 실시예들에 있어서, 전체 배양체 교환은 매 5 내지 10 분마다 탱크들 사이에서 발생한다.
시스템은 예를 들어, 발효 프로세스의 시각적 감시를 위해 튜브들 및/또는 탱크들 모두 및/또는 어느 하나에 하나 또는 그 이상의 검사 유리창들(sight glasses)을 포함할 수 있다. 나아가, 튜브들 모두 및/또는 어느 하나는 역류를 방지하기 위한 체크-밸브를 가질 수 있다.
하나 또는 그 이상의 환기구들(또는 압력 방출 밸브들(PSV들))은 탱크들 모두 및/또는 어느 하나에 위치될 수 있다. 환기구들(vents) 또는 PSV들은 가스들이 밖으로 흐르도록 허용할 수 있지만, 공기가 안으로 들어오는 것을 허용하지는 않는다(예. 밸브는 반응기의 내부 가스 압력이 1.2 atm 이상일 때 열릴 수 있고 또한 내부 가스 압력이 1.1 atm 이하로 떨어질 때 닫힐 수 있다).
본 발명에 따라 사용되는 탱크들은 산업용 발효조 또는 배양 반응기일 수 있다. 이 탱크들은, 예를 들어 유리, 고분자들, 금속들, 금속합금들, 및 이들의 조합들로 만들어질 수 있다. 탱크들은, 예를 들어 5 리터 내지 2,000 리터 이상일 수 있다. 통상적으로, 용기들은 10 내지 1,500 리터, 바람직하게는 100 내지 1,000 리터, 보다 바람직하게는 250 내지 750 리터, 300 내지 600 리터, 또는 400 내지 550 리터일 것이다.
미생물 성장 전에, 탱크들은 소독(disinfected) 또는 살균될(sterilized) 수 있다. 일 실시예에 있어서, 발효 매질(fermentation medium), 공기, 및 배양 프로세스 및 이 방법에 사용되는 장비는 살균된다. 반응기/용기와 같은 배양 장비는 살균 유닛, 예를 들어 고압멸균기(autoclave)로부터 별개로 분리되어 있지만, 이에 연결될 수 있다. 배양 장비는 또한 예를 들어, 찜기(steamer)를 이용하여, 접종을 시작하기 전에 현장에서 살균시키는 살균 유닛을 가질 수 있다. 공기는 업계에서 알려진 방법들에 의해 살균될 수 있다. 예를 들어, 외기(ambient air)는 용기로 공급되기 전에 적어도 하나의 필터를 지나갈 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 매질은 저온으로 또는 선택적으로 추가되는 열 없이 저온살균될 수 있는데, 이때 낮은 수분 활성 및 낮은 pH의 사용은 박테리아의 성장을 방제하도록 이용될 수 있다.
이 시스템은 (연속적인 반응기에 반대로서) 뱃치 반응기(batch reactor)로서 이용될 수 있다. 유리하게도, 시스템은 그 의도된 용도에 따라 크기가 정해질 수 있다. 예를 들어, 생물학적 정화와 같은, 작은 응용들에 있어서, 시스템은 50 갤론 정도로 또는 이보다 훨씬 작을 수도 있다. 미생물적으로 강화된 원유 회수와 같이, 큰 부피의 조성물이 필요한 응용들에 있어서, 이 시스템은 20,000 또는 이보다 더 많은 갤론의 생산물을 생산하도록 크기가 정해질 수 있다.
이 시스템은 온도 제어들을 포함할 수 있다. 이 시스템은 절연될 수 있어 저온 환경에서 발효 프로세스가 적절한 온도를 유지할 수 있다. 유리섬유(fiberglass), 실리카 에어로졸(silica aerogel), 세라믹 섬유 단열재(ceramic fiber insulation) 등을 포함하여, 업계에 알려진 절연 물질들 중 어느 것이라도 적용될 수 있다. 절연체는 이 시스템의 탱크들 및/또는 튜브들 모두 및/또는 어느 하나를 둘러쌀 수 있다.
이 시스템은 또한 적절한 발효 온도의 유지를 보장하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 이 시스템의 외부는 낮 동안 시스템 온도가 올라가는 것을 방지하도록 반사적일 수 있다. 나아가, 예를 들어 냉각 재킷 및 냉각 열 교환기 중 하나 또는 그 이상을 포함하는, 냉각 시스템이 추가될 수 있다. 냉각수는 열을 외기와 교환할 수 있고 또한 냉각 시스템을 통해 재순환될 수 있다. 열 교환기 및/또는 냉각 재킷은 시스템의 탱크들 및/또는 튜브들 모두 및/또는 어느 하나를 둘러싸거나 또는 그 안에 설치될 수 있다. 극한 환경의 경우, 이 시스템은 반응기, 반응기를 둘러싸는 재킷, 또는 튜브들에 연결되는 열 교환기들 안에 냉장 및 냉각 코일들을 포함할 수 있다.
이 시스템은 전기 히터를 사용할 수 있다. 하지만, 열이 필요한 더 큰 응용들의 경우, 증기 또는 탄화수소 연료가 사용될 수 있다. 증기 입구 및/또는 증기 원은 증기 주입기, 증기 재킷, 및 증기 열 교환기 중 하나 또는 그 이상에 연결될 수 있다. 증기 재킷은 시스템의 탱크들 모두 및/또는 어느 하나를 둘러쌀 수 있다. 이에 더하여, 증기는 시스템의 탱크들 및/또는 튜브들 모두 및/또는 어느 하나로 직접 주입될 수 있다. 증기 열 교환기는 반응기 내부에 배치될 수 있고, 증기는 열 교환기의 튜브들 안에 응축되어, 그후 배출될 수 있다. 증기 열 교환기는 반응기로 물 또는 증기를 혼합하지 않는 닫힌 시스템일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 탱크들은 pH, 산소, 압력, 온도, 교반기 축 동력, 습도, 점도 및/또는 미생물 밀도 및/또는 대사산물 농도와 같은, 배양 프로세스에 있어서 중요 인자들을 측정하기 위해 기능적인 제어들/센서들을 가지거나 또는 기능적인 제어들/센서들에 연결될 수 있다.
온도계가 포함될 수 있고 온도계는 수동 또는 자동일 수 있다. 온도계는 바람직하게 반응기의 탱크들 모두 및/또는 어느 하나에 배치될 수 있다. 자동 온도계는 발효 프로세스 전반에 걸쳐 온도를 제어하기 위해 열 및 냉각 원들을 적절하게 관리할 수 있다. 원하는 온도는 현장에서 프로그램되거나 또는 시스템이 발효 장소에 납품되기 전에 미리 프로그램될 수 있다. 온도 측정치들은 그후 상기에서 논의된 가열 및 냉각 시스템들을 자동으로 제어하는 데 이용될 수 있다.
pH 조정은 자동 수단에 의해 달성될 수 있고 또는 수동으로 수행될 수 있다. 자동 pH 조정은 pH 탐침(probe) 및 pH 측정치들에 따라, pH 조정 물질들을 적절하게 제공하기 위한 전자 장치를 포함할 수 있다. pH 탐침은 바람직하게 반응기의 탱크들 모두 및/또는 어느 하나에 배치된다. pH는 사용자에 의해 특정 값으로 설정될 수 있거나 또는 발효 프로세스 전반에 걸쳐 이에 따라 pH를 변경하도록 미리 프로그램될 수 있다. pH 조정이 수동으로 수행되어야 한다면, 업계에 알려진 pH 측정 도구들이 수동 검사를 위해 시스템에 포함될 수 있다.
pH 및 온도를 측정하고 조정하기 위한 컴퓨터 시스템은 반응기들의 각각의 탱크에 대한 발효 변수들을 감시하고 제어하는 데 이용될 수 있다. 컴퓨터는 예를 들어, 온도계 및 pH 탐침에 연결될 수 있다. 온도 및 pH를 감시 및 제어하는 것에 더하여, 각각의 용기는 또한 예를 들어 용존 산소, 교반, 발포, 미생물 배양체의 순도, 원하는 대사산물의 생산 등을 감시 및 제어하는 능력을 가질 수 있다. 시스템들은 예를 들어 태블릿, 스마트폰, 또는 무선으로 데이터를 송수신할 수 있는 다른 이동가능한 컴퓨팅 장치를 이용하여, 이 변수들의 원격 감시를 위해 더 조정될 수 있다.
다른 일 실시예에 있어서, 탱크들은 또한 용기 내부의 미생물의 성장을 감시할 수 있다(예. 세포 수 및 성장기의 측정). 대안적으로, 매일 샘플이 용기로부터 취해지고 또한 희석 도포 기술(dilution plating technique)과 같이, 업계에 알려진 기술들에 의해 열거될 수 있다. 희석 도포는 샘플 내의 박테리아의 개수를 예측하는 데 사용되는 단순한 기술이다. 이 기술은 또한 상이한 환경들 또는 처리들이 비교될 수 있는 지수(index)를 제공할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 발효 시스템은 원하는 미생물 종의 적절한 양을 포함하는, 미생물 생산물의 현장 생산을 위해 제공될 수 있는 이동가능한 또는 휴대가능한 생물반응기이다. 미생물 생산물은 박테리아의 안정성, 보존, 저장 및 종래의 생산물의 이송 프로세스들에의 의존 없이, 적용 장소에서 생성되기 때문에, 살아있는 미생물의 훨씬 더 높은 밀도가 생성될 수 있고, 이로써, 현장 적용에 사용되기 위한 미생물 조성물의 훨씬 더 작은 부피가 필요하게 된다. 이것은 시스템에 이동성 및 휴대성을 제공하는, 축소된 생물반응기를 허용한다(예. 더 작은 발효 탱크들, 더 작은 시작 물질, 영양성분들, pH 제어 제제들, 및 소포제들의 공급기들 등).
이 시스템은 (탱크들, 흐름 루프들, 펌프들 등을 포함하는) 장치 구성요소들을 지지하기 위한 프레임을 포함할 수 있다. 이 시스템은 장치를 움직이기 위한 휠들 뿐만 아니라 장치를 조작할 때 조종, 밀고 당기기 위한 핸들을 포함할 수 있다.
이 시스템은 하나 또는 그 이상의 화물 트레일러들 및/또는 세미-트레일러들의 뒤에 구성될 수 있다. 즉, 이 시스템은 휴대가능하게 설계될 수 있다(즉, 이 시스템은 픽업 트럭, 평상형 트레일러(flatbed trailer), 또는 세미-트레일러 상에서 이송되기에 적절할 수 있다).
미생물들
본 발명의 방법들 및 시스템들에 따라 성장되는 미생물들은, 예를 들어 박테리아, 효모 및/또는 균류일 수 있다. 이 미생물들은 천연이거나, 또는 유전학적으로 변형된 미생물들일 수 있다. 예를 들어, 미생물들은 특정 특성을 발현하기 위해 특정 유전자들로 변환될 수 있다. 미생물들은 또한 원하는 종의 돌연변이들일 수 있다. 돌연변이를 만드는 절차는 미생물학 분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 자외선 및 니트로소구아니딘(nitrosoguanidine)이 이 목적을 위해 광범위하게 사용된다.
미생물들 및 본 발명에 따라 생성되는 이들의 성장 생산물들은 예를 들어, 바이오살충제, 생계면활성제, 에탄올, 영양 화합물들, 인슐린과 같은 치료용 단백질들, 백신과 같은 유용한 화합물들, 및 다른 생물고분자들을 포함하는, 유용한 생산물들의 막대한 집합체들을 생성하는 데 이용될 수 있다. 이러한 미생물 공장들로서 이용되는 미생물들은 천연이거나, 변형되거나 또는 재조합될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 미생물들은 효모 또는 균류이다. 본 발명에 따른 용도에 적절한 효모 및 균류 종들은 칸디다(Candida), 사카로미세스(Saccharomyces) (S. 세레비시아(S. cerevisiae), S. 불라디이 세퀘라(S. boulardii sequela), S. 토룰라(S. torula)), 이살켄키아(Issalchenkia), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 위케르하모미세스(Wickerhamomyces) (예, W. 아노말루스(W. anomalus)), 스타르메렐라(Starmerella)(예, S. 봄비콜라(S. bombicola)), 미코리자(Mycorrhiza), 모르티에렐라(Mortierella), 피코미세스(Phycomyces), 블라케스레아(Blakeslea), 트라우스토키트리움(Thraustochytrium), 피티움(Phythium), 엔토모프토라(Entomophthora), 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans), 슈도지마 아피디스(Pseudozyma aphidis), 푸사리움 베네날룸(Fusarium venenalum), 아스페르길루스(Aspergillus), 트리코데르마(Trichoderma) (예, T. 리세이(T. reesei), T. 하르지아눔(T. harzianum), T. 하마툼(T. hamatum), T. 비리데(T. viride)), 리조푸스 종들( Rhizopus spp.), 균근(Mycorrhiza) (예, 글로무스 종들(Glomus spp.), 아카우로스포라 종들(Acaulospora spp.), 내생균근균(vesicular-arbuscular mycorrhizae)(VAM), 수지상체균근(arbuscular mycorrhizae)(AM)), 내장성 균류(endophytic fungi)(예, 피리포르미스 인디카(Piriformis indica)), 킬러 효모(killer yeastm) 중 어떠한 종, 및 이들의 조합을 포함한다.
일 실시예에 있어서, 효모는 킬러 효모이다. 여기서 사용되는 바와 같이, "킬러 효모(killer yest)"는 종 그 자체는 면역성이 있는, 독소 단백질들 또는 당단백들의 분비를 특징으로 하는 효모 종(strain)을 의미한다. 킬러 효모들에 의해 분비되는 외독소들(exotoxins)은 다른 효모, 균류 또는 박테리아 종들을 죽일 수 있다. 예를 들어, 킬러 효모에 의해 제어될 수 있는 미생물들은 푸사륨(Fusarium) 및 다른 사상 균류를 포함한다. 본 발명에 따른 킬러 효모들의 예들은 안전하게 식품 및 발효 산업, 예를 들어 맥주, 와인 및 제빵에 이용될 수 있는 것들; 이러한 생산 프로세스들을 오염시킬 수 있는 다른 미생물들을 방제하는 데 이용될 수 있는 것들; 식품 보존을 위한 생물적 방제(biocontrol)에 이용될 수 있는 것들; 인간들 및 식물들 모두의 진균 감염의 처치를 위해 이용될 수 있는 것들, 및 재조합 DNA 기술에 이용될 수 있는 것들이다. 이러한 효모들은 위케르하모미세스(Wickerhamomyces), 피키아(Pichia)(예, P. 아노말라(P. anomala), P. 귀엘리에몬디이(P. guielliermondii), P. 쿠드리아브제비이(P. kudriavzevii)), 한세눌라(Hansenula), 사카로미세스(Saccharomyces), 한세니아스포라(Hanseniaspora), (예, H.우바룸(H. uvarum)), 우스틸라고 마이디스(Ustilago maydis), 데바리오미세스 한세니이(Debaryomyces hansenii), 칸디다(Candida), 크립토코쿠스(Cryptococcus), 클루이베로미세스(Kluyveromyces), 토룰롭시스(Torulopsis), 우스틸라고(Ustilago), 윌리옵시스(Williopsis), 자이고사카로미세스(Zygosaccharomyces)(예, Z. 바일리이(Z. bailii)) 및 기타를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 미생물은 피키아 아노말라(Pichia anomala)(위케르하모미세스 아노말루스)(Wickerhamomyces anomalus), 피키아 귀엘리에르몬디이(Pichia guielliermondii), 및 피키아 쿠드리아브제비이(Pichia kudriavzevii)로부터 선택되는 피키아 효모(Pichia yest)와 같은, 킬러 효모이다. 피키아 아노말라(Pichia anomala)는, 특히 다양한 용매들, 효소들, 킬러 독소들 뿐만 아니라 소포로리피드 생계면활성제들(sophorolipid biosurfactants)의 유효한 생산자이다.
일 실시예에 있어서, 미생물 종은 스타르메렐라 계통(clade)으로부터 선택된다. 본 발명에 따라 유용한 스타르메렐라 미생물 배양체, 스타르메렐라 봄비콜라는 ATCC(American Type Culture Collection), 10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209 USA로부터 획득될 수 있다. 예치에는 수탁 번호가 ATCC No.22214로 할당되었다.
이 시스템은 또한 원유 회수를 강화하고 파라핀 분해를 수행할 수 있는 하나 또는 그 이상의 효모 종들을 사용할 수 있다. 예를 들어, 스타르메렐라 (칸디다) 봄비콜라(Starmerella (Candida) bombicola), 칸디다 아피콜라(Candida apicola), 칸디다 바티스타(Candida batistae), 칸디다 플로리콜라(Candida floricola), 칸디다 리오도센시스(ida riodocensis), 칸디다 스텔레이트(Candida stellate), 칸디다 쿠오이(Candida kuoi), 칸디다 종(Candida sp.) NRRL Y-27208, 로도토룰라 보고리엔시스 종(Rhodotorula bogoriensis sp.), 위케르하미엘라 도메릭키아(Wickerhamiella domericqiae), 뿐만 아니라 스타르메렐라 계통의 소포로리피드를 생산하는 다른 종들이 있다. 상세한 실시예에 있어서, 효모 종은 ATCC 22214 및 그 돌연변이들이다.
일 실시예에 있어서, 미생물은 슈도지마 아피디스 종이다. 이 미생물은 만노실에리트리톨 지질(mannosylerythritol lipid) 생계면활성제들의 유효한 생산자이다.
일 실시예에 있어서, 미생물들은 그램 양성(gram-positive) 및 그램 음성(gram-negative) 박테리아를 포함하는, 박테리아이다. 이 박테리아는, 예를 들어 바실러스(Bacillus)(예, B. 서브틸리스(B. subtilis), B. 리체니포르미스(B. licheniformis), B. 피르무스(B. firmus), B. 라테로스포루스(B. laterosporus), B. 메가테리움(B. megaterium), B. 아밀로리퀴파시엔스(B. amyloliquifaciens)), 클로스트리디움(Clostridium) (C. 부티리슘(C. butyricum), C. 티로부티리슘(C. tyrobutyricum), C. 아세토부티리슘(C. acetobutyricum), 클로스트리디움 NIPER 7(Clostridium NIPER 7), 및 C. 베이어린키이(C. beijerinckii)), 아조박터(Azobacter)(A. 비넬란디이(A. vinelandii), A. 크로오코큠(A. chroococcum)), 슈도모나스(Pseudomonas)(P. 클로로라피스 아종 아우레오파시엔스(P. chlororaphis subsp. aureofaciens)(클루이베르(Kluyver)), P. 아에루지노사(P. aeruginosa)), 아조스피릴륨 브라실리엔시스(Azospirillum brasiliensis), 랄스로니아 에울로파( Ralslonia eulropha), 로도스피릴륨 루브룸(Rhodospirillum rubrum), 스핀고모나스(Sphingomonas)(예, S. 파우시모빌리스(S.paucimobilis)), 스트렙토미세스( Streptomyces)(예, S. 그리세오크로모게네스(S. griseochromogenes), S. 쿠리세우스(S. qriseus), S. 카카오이(S.cacaoi), S. 아우레우스(S. aureus), 및 S. 카수가에니스(S. kasugaenis)), 스트렙토베르티실륨(Streptoverticillium)(예, S. 리모파시엔스(S. rimofaciens)), 랄스로니아(Ralslonia)(예, R. 에울로파(R. eulropha)), 로도스프릴륨(Rhodospirillum)(예, R. 루브룸(R. rubrum)), 산토모나스( Xanthomonas)(예, X. 캄페스트리스(X. campestris)), 에르위니아(Erwinia)(예, E. 카로토보라(E. carotovora)), 대장균(Escherichia coli), 리죠븀(Rhizobium)(예, R. 자포니슘(R. japonicum), 시노리조븀 메릴로티(Sinorhizobium meliloti), 시노리조븀 프레디이(Sinorhizobium fredii), R. 레구미노사륨 비오바르 트리폴리(R. leguminosarum biovar trifolii), 및 R. 에틸리(R. etli)), 브라디리조븀(Bradyrhizobium)(예, B. 자파니슘(B. japanicum), 및 B. 파라스포니아(B. parasponia)), 아스로박터(Arthrobacter)(예, A. 라디오박터(A. radiobacter)), 아조모나스(Azomonas), 데르시아(Derxia), 베이어린키아(Beijerinckia), 노카르디아(Nocardia), 클렙시엘라(Klebsiella), 클라비박터(Clavibacter)(예, C. 자일 아종. 자일( C. xyli subsp. xyli) 및 C. 자일 아종 시노돈티스(C. xyli subsp. cynodontis)), 시아노박테리아(Cyanobacteria), 판도에아(Pantoea)(예, P. 아글로메란스(P. agglomerans)), 및 이들의 조합들일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
일 실시예에 있어서, 미생물은 예를 들어 B. 서브틸리스 변종 로커스(B. subtilis var. locuses) B1 또는 B2와 같은, B. 서브틸리스 종인데, 이것은 예를 들어 표면활성물질 및 다른 생계면활성제들 뿐만 아니라 생체 고분자들의 유효한 생산자들이다. 여기에 개시된 교시들과 일치하는 만큼 국제 공개공보 WO 2017/044953 A1의 상세한 설명이 참조에 의해 반영된다. 다른 실시예에 있어서, 미생물들은 바실러스 리체니포르미스 종인데, 이것은 레반(levan)과 같이, 생계면활성제들 뿐만 아니라 생체 고분자들의 유효한 생산자이다.
일 실시예에 있어서, 미생물은 비병원성의 슈도모나스 종이다. 바람직하게, 이 종은 람노리피드(rhamnolipid) 생계면활성제들의 생산자이다.
예를 들어, 상당한 양의 당지질-생계면활성제들을 축적할 수 있는 종들을 포함하는 다른 미생물 종들은, 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 본 발명에 따라 유용한 다른 미생물 부산물들은 만노단백질, 베타-글루칸 및 생체 유화 및 표면/계면 장력-감소 특성들을 가지는 다른 대사산물들을 포함한다.
일 실시예에 있어서, 한 종류의 미생물이 하나의 용기 내에서 성장된다. 대안적인 실시예들에 있어서, 성장 또는 최종 생산물에 악영향을 끼치지 않고 함께 성장될 수 있는, 복수의 미생물들은, 하나의 용기 내에서 성장될 수 있다. 예를 들어, 하나의 용기 안에 동시에 성장되는 2 내지 3 또는 그 이상의 다른 미생물들이 있을 수 있다.
본 발효 시스템들을 이용한 배양 방법들
본 발명은 신규한 생체 반응기들을 이용한 미생물들의 효과적인 생산을 위한 방법들 및 시스템들을 제공한다. 이 시스템은 담수(freshwater)가 지역원으로부터 공급되고 본 방법들에 따라 살균될 수 있을 것으로 기대되긴 하지만, 예를 들어 장비, 살균 공급기들, 및 배지 성분들을 포함하여, 발효(또는 배양) 프로세스에 필요한 물질들 모두를 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 이 시스템에는 생존가능한 미생물들의 접종이 제공된다. 바람직하게, 이 미생물들은 예를 들어 생계면활성제들, 효소들, 용매들, 생체고분자들, 산들, 및/또는 다른 유용한 대사산물들을 축적할 수 있는, 생화학적으로 생산되는 미생물들이다. 특히 바람직한 실시예들에 있어서, 미생물들은 여기에 열거된 것들에 한정되지 않고 이를 포함하는, 생화학적으로 생산되는 효모(킬러 효모들을 포함하는), 균류 및/또는 박테리아이다.
일 실시예에 있어서, 이 시스템에는 배지가 제공된다. 배지는 예를 들어, 탄소원, 지질원, 질소원, 및/또는 미량영양소원과 같은, 영양 원들을 포함할 수 있다. 탄소원, 지질원, 질소원, 및/또는 미량영양소원 각각은 발효 프로세스 동안 적절한 때에 반응기에 첨가될 수 있는, 개별적인 패키지로 제공될 수 있다. 패키지들 각각은 특정 지점들에서(예를 들어, 효모, pH, 및/또는 영양 레벨들이 특정 농도 이상 또는 이하가 될 때) 또는 특정 시간에(예를 들어, 10 시간, 20 시간, 30 시간, 40 시간 후 등) 부가될 수 있는 수 개의 작은 패키지들(sub-packages)을 포함할 수 있다.
발효 전에 탱크들은 오염을 방지하기 위해 과산화수소수(예. 2.0% 내지 4.0% 과산화수소; 이것은 예를 들어 80-90°C에서 열수 헹굼(hot water rinse) 전 또는 후에 수행될 수 있다.)를 이용해 세척될 수 있다. 이에 더하여, 또는 대안적으로, 탱크들은 상용 소독제, 표백제 및/또는 열수 또는 증기 헹굼(steam rinse)을 이용해 세척될 수 있다. 시스템은 표백제 및 과산화수소의 농축된 형태들을 가지고 있는데, 이것은 이후에 사용 전에 발효 장소에서 희석될 수 있다. 예를 들어, 과산화수소는 농축된 형태로 제공되어 선헹굼 오염제거를 위해 2.0% 내지 4.0% 과산화수소(중량 또는 부피에 의해)를 제조하기 위해 희석될 수 있다.
상세한 일 실시예에 있어서, 배양 방법은 발효 전에 본 발효 반응기들을 살균하는 것을 포함한다. 반응기(예. 탱크들, 포트들, 살포기들 및 혼합 시스템들을 포함하여)의 내부 표면들은 먼저 상용 소독제로 세척되고; 그후 2% 내지 4% 과산화수소, 바람직하게는 3% 과산화수소로 김서리게 하고(fog)(또는 고분산 분사 시스템으로 분사되고), 그리고 마지막으로 대략 105°C 내지 대략 110°C 또는 그 이상의 온도에서 휴대가능한 찜기(steamer)로 찔 수 있다.
배지 성분들(예. 탄소원, 물, 지질원, 미량영양소원, 등) 또한 살균될 수 있다. 이것은 온도 오염제거 및/또는 (잠재적으로 이후에 HCL, H2SO4 등과 같은 산을 이용해 과산화수소를 중화시키는 것이 따라오는) 과산화물 오염제거를 이용해 달성될 수 있다.
상세한 일 실시예에 있어서, 배지에 사용되는 물은 인-라인 UV 물 살균기를 이용해 UV 살균되고, 예를 들어 0.1-마이크론 물 필터를 이용해 여과된다. 다른 실시예에 있어서, 모든 영양 및 다른 배지 성분들은 발효 전에 고압살균(autoclaved)될 수 있다.
추가적인 오염을 방지하기 위해, 본 시스템의 배지는 배양 프로세스 전 및/또는 중에 첨가되는, 추가적인 산들, 항생제들, 및/또는 항균제들을 포함할 수 있다. 하나 또는 그 이상의 항균제 물질들은 예를 들어, 스트렙토마이신, 옥시테트라사이클린, 소포로리피드들, 및 람노리피드들을 포함할 수 있다.
접종은 접종원이 튜빙 시스템들을 이용해 혼합되는 그 지점에서, 반응기 탱크들 모두 및/또는 어느 하나에서 발생할 수 있다. 전체 발효 시간은 10 내지 200 시간에, 바람직하게 20 내지 180 시간에 퍼져 있을 수 있다.
본 시스템들 및 방법들에서 사용되는 발효 온도는, 프로세스가 이 범위 외에서 작동할 수 있지만, 예를 들어 대략 25 내지 40°C일 수 있다. 일 실시예에 있어서, 미생물의 배양을 위한 방법은 대략 5°C 내지 대략 100°C, 바람직하게 15°C 내지 60°C, 보다 바람직하게 25°C 내지 50°C에서 실행된다. 다른 실시예에 있어서, 배양은 일정한 온도에서 연속적으로 수행될 수 있다. 다른 실시예에 있어서, 배양은 변하는 온도에 종속될 수 있다.
배지의 pH는 관심 있는 미생물에 대하여 적절해야 한다. 탄산염들 및 인산염들과 같이, 완충 염들, 및 pH 조절제들은, 최적 값 근처에서 pH를 안정화시키는 데 이용될 수 있다. 금속 이온들이 고농도로 존재할 때, 액체 매질에서 킬레이트제의 사용은 필요할 수 있다.
소정의 실시예들에 있어서, 미생물들은 대략 2.0 내지 대략 10.0의 pH 범위에서, 보다 상세하게는 대략 3.0 내지 대략 7.0의 pH 범위에서 (예를 들어, HCL, KOH, NaOH, H2SO4, 및/또는 H3PO4와 같은, 염기들, 산들, 및 완충제들을 이용해, 수동으로 또는 자동으로 pH를 조정함으로써) 발효될 수 있다. 본 발명은 또한 이 pH 범위 밖에서 실행될 수 있다.
발효는 제1 pH (예. 4.0 내지 4.5의 pH)에서 시작하여 오염을 피하는 것을 도울 뿐만 아니라 다른 원하는 결과들을 생성하기 위해 프로세스의 나머지에 대하여 이후에 제2 pH (예. 3.2 내지 3.5의 pH)로 변할 수 있다(제1 pH는 제2 pH보다 더 높거나 또는 더 낮을 수 있다). 몇몇의 실시예들에 있어서, pH는 원하는 바이오매스(biomass)의 축적이 달성된 후, 예를 들어 발효 시작 0 시간 내지 200 시간 후, 보다 상세하게는 12 내지 120 시간 후, 보다 상세하게는 24 내지 72 시간 후 제1 pH로부터 제2 pH로 조정된다.
일 실시예에 있어서, 배지의 습도 레벨은 관심 있는 미생물에 대하여 적절해야 한다. 다른 실시예에 있어서, 습도 레벨은 20 내지 90%, 바람직하게 30 내지 80%, 보다 바람직하게 40 내지 60%에 퍼져 있을 수 있다.
본 발명의 배양 프로세스들은 혐기, 호기, 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직하게, 프로세스는 호기이고, 발효 동안 포화도의 10 또는 15% 이상의 용존산소 농도를 유지하지만, 다른 실시예들에 있어서는 20% 내, 또는 또 다른 실시예들에 있어서는 30% 내를 유지한다.
유리하게도, 이 시스템은 예를 들어 저산소를 포함하는 공기를 제거하고 산소가 공급되는 공기의 도입을 위해 느린 공기 운동을 이용해, 성장하는 배양체에 쉬운 산소공급을 제공한다. 산소가 공급되는 공기는 매일과 같이, 주기적으로 공급되는 외기(ambient air)일 수 있다.
추가적으로, 소포제들(antifoaming agents)은 또한 배양 및 발효 동안 가스가 생성될 때 거품의 형성 및/또는 축적을 방지하기 위해 시스템에 부가될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 미생물에 기반한 조성물은 발효 후 추가적인 처리가 필요하지 않다(예. 효모, 대사산물들, 및 나머지 탄소원들은 소포로리피드들로부터 분리될 필요가 없다). 최종 생산물의 물리적 특성들(예. 점도, 밀도 등)은 또한 다양한 화학물질들 및 업계에 알려진 물질들을 이용해 조정될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 본 시스템에 이용되는 배지는, 미생물을 위한 보충 영양소들을 포함할 수 있다. 통상적으로, 이것들은 탄소원들, 단백질들, 지방들, 또는 지질들, 질소원들, 미량원소들, 및/또는 성장 인자들(예. 비타민들, pH 조절제들)을 포함한다. 영양소 농도, 습도 함량, pH, 등은 특정 미생물에 대하여 성장을 최적화하기 위해 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.
지질원은 중성지방을 포함하여, 유리지방산들 또는 염들 또는 에스테르들을 포함하는, 식물 또는 동물 기원의 오일들 또는 지방들을 포함할 수 있다. 지방산들의 예들은, 16 내지 18 탄소원자들을 포함하는 유리 및 에스테르화 지방산들, 소수성 탄소원들, 팜 오일, 동물 지방들, 코코넛 오일, 올레산, 콩기름, 해바라기유, 카놀라유, 스테아르산 및 팔미트산을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본 시스템의 배지는 탄소원을 더 포함할 수 있다. 탄소원은 통상적으로 포도당(glucose), 목당(xylose), 자당(sucrose), 젖당(lactose), 과당(fructose), 트레할로스(trehalose), 갈락토스(galactose), 만노스(mannose), 만나당(mannitol), 소르보스(sorbose), 리보스(ribose) 및 맥아당(maltose)과 같은, 탄수화물(carbohydrate); 아세트산(acetic acid), 푸마르산(fumaric acid), 구연산(citric acid), 프로피온산(propionic acid), 말산(malic acid), 말론산(malonic acid) 및 피루브산(pyruvic acid)과 같은 유기산들(organic acids); 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 부탄올(butanol), 펜탄올(pentanol), 헥산올(hexanol), 에리트리톨(erythritol), 이소부탄올(isobutanol), 자일리톨(xylitol), 및 글리세롤(glycerol)과 같은 알코올들(alcohols); 카놀라유(canola oil), 콩기름(soybean oil), 미강유(rice bran oil), 올리브유(olive oil), 옥수수기름(corn oil), 참기름(sesame oil), 및 아마씨유(linseed oil)와 같은 지방들 및 오일들; 등이다. 다른 탄소원들은 아르부틴(arbutin), 라피노스(raffinose), 글루콘산염(gluconate), 구연산염(citrate), 당밀(molasses), 가수분해된 녹말(hydrolyzed starch), 감자 추출물(potato extract), 콘시럽(corn syrup), 및 가수분해된 셀룰로스 물질(hydrolyzed cellulosic material)을 포함할 수 있다. 상기의 탄소원들은 독립적으로 또는 2 개 또는 그 이상의 조합으로 사용될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 미생물들을 위한 성장 인자들 및 미량영양소들은 시스템의 배지에 포함된다. 이것은 특히 성장하는 미생물들이 필요한 모든 비타민들을 생산할 수 없는 미생물들인 경우에 바람직하다. 철, 아연, 칼륨, 칼슘, 구리, 망간, 몰리브덴, 및 코발트와 같은, 미량원소들; 인산염으로부터의, 인; 및 다른 성장 자극 요소들을 포함하는, 무기 영양소들(Inorganic nutrients)은 본 시스템들의 배지에 포함될 수 있다. 나아가, 비타민들, 필수 아미노산들, 및 미량원소들의 원들은, 예를 들어 옥수수 가루와 같은, 고운 가루 또는 굵은 가루의 형태로, 또는 효모 추출물, 감자 추출물, 소고기 추출물, 콩 추출물, 바나나껍질 추출물 등과 같은, 추출물들의 형태로, 또는 정제된 형태로, 포함될 수 있다. 예를 들어, 단백질의 생합성(biosynthesis)에 유용한 것들과 같은, 예를 들어, L-알라닌(L-Alanine)과 같은, 아미노산들 또한, 포함될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 무기질 또는 미네랄 염들 또한 포함될 수 있다. 무기 염들은, 예를 들어, 인산이수소칼륨(potassium dihydrogen phosphate), 인산수소이칼륨(dipotassium hydrogen phosphate), 인산수소이나트륨(disodium hydrogen phosphate), 황산마그네슘(magnesium sulfate), 염화마그네슘(magnesium chloride), 황산철(iron sulfate), 염화철(iron chloride), 황산망간(manganese sulfate), 염화망간(manganese chloride), 황산아연(zinc sulfate), 염화납(lead chloride), 황산구리(copper sulfate), 염화칼슘(calcium chloride), 탄산칼슘(calcium carbonate), 탄산나트륨(sodium carbonate)일 수 있다. 이 무기 염들은 독립적으로 또는 2 개 또는 그 이상의 조합으로 이용될 수 있다.
본 시스템의 배지는 질소원을 더 포함할 수 있다. 이 질소원은, 예를 들어 질산칼륨(potassium nitrate), 질산암모늄(ammonium nitrate), 황산암모늄(ammonium sulfate), 인산암모늄(ammonium phosphate), 암모니아(ammonia), 요소(urea), 및 염화암모늄(ammonium chloride)과 같은, 무기질 형태, 또는 단백질들, 아미노산들, 효모 추출물들, 효모 가수분해물들(yeast autolysates), 옥수수 펩톤(corn peptone), 카제인 가수분해물(casein hydrolysate), 및 콩 단백질(soybean protein)과 같은, 유기질 형태일 수 있다. 이 질소원들은 독립적으로 또는 2 개 또는 그 이상의 조합으로 이용될 수 있다.
미생물들은 플랑크톤 형태로 또는 생물막으로서 성장될 수 있다. 생물막의 경우에 있어서, 용기는 그 안에 미생물들이 생물막 상태로 성장될 수 있는 기질(substrate)을 가질 수 있다. 시스템은 또한, 예를 들어, 생물막 성장 특성을 촉진하거나 및/또는 향상시키는 (전단 응력(shear stress)과 같은) 자극을 적용하는 능력을 가질 수 있다.
미생물에 기반한 생산물들의 제조
본 발명의 미생물에 기반한 생산물들은 미생물들 및/또는 미생물 성장 부산물들 및 선택적으로, 성장 배지 및/또는 예를 들어, 물, 담체, 보조제들(adjuvants), 영양소들, 점도조절제들(viscosity modifiers), 및 다른 활성제들(active agents)과 같은, 첨가 성분들을 포함하는 생산물들을 포함한다.
본 발명의 미생물에 기반한 생산물들 중 하나는 미생물 및/또는 미생물 및/또는 다른 잔여 영양소들에 의해 생성되는 미생물 성장 부산물들을 포함하는 단순히 발효 배지이다. 발효의 생산물은 추출 또는 정제 없이 직접 이용될 수 있다. 원한다면, 추출 및 정제는 표준 추출 방법들 또는 당업자에게 알려진 기술들을 이용해 쉽게 달성될 수 있다.
미생물에 기반한 생산물들에 있어서의 미생물들은 활성 또는 불활성 형태, 및/또는 식물 세포들, 포자들, 균사체들, 분생자(conidia)의 형태 및/또는 다른 미생물 번식 형태일 수 있다. 미생물에 기반한 생산물들은 추가적인 안정화, 보존, 및 저장 없이 이용될 수 있다. 유리하게도, 이러한 미생물에 기반한 생산물들의 직접 이용은 미생물들의 높은 생존능력을 보전하고, 외래 약품들(foreign agents) 및 원하지 않는 미생물들로부터의 오염 가능성을 감소시키고, 또한 미생물적 성장의 부산물들의 활성을 유지시킨다.
미생물들 및/또는 미생물적 성장으로부터 기인한 배지는 성장 용기로부터 제거되어 예를 들어 즉시 사용을 위한 파이핑을 통해 전달될 수 있다.
일 실시예들에 있어서, 조성물(미생물들, 배지, 또는 미생물들 및 배지)는 예를 들어 용도, 고려된 적용 방법, 발효 탱크의 크기, 및 미생물 성장 설비로부터 사용 위치로의 이송 모드를 고려하여, 적절한 크기의 용기들 내에 배치될 수 있다. 그러므로, 미생물에 기반한 조성물이 배치되는 용기들은 예를 들어, 1 갤론 내지 1,000 갤론 이상일 수 있다. 다른 실시예들에 있어서 용기들은 2 갤론, 5 갤론, 25 갤론, 또는 이보다 더 크다.
성장 용기들로부터 미생물에 기반한 조성물을 수확할 때, 수확되는 생산물이 용기들 내에 배치되거나 및/또는 파이프로 수송(또는 그렇지 않다면 사용을 위해 이송)되기 때문에 추가적인 성분들이 첨가될 수 있다. 첨가제들은, 예를 들어 완충제들, 담체들, 동일한 또는 상이한 설비에서 생산되는 다른 미생물에 기반한 조성물들, 점도조절제들, 보존제들, 미생물 성장을 위한 영양소들, 식물 성장을 위한 영양소들, 미량원소들, 농약들, 제초제들, 동물 사료, 식품 생산물들 및 특정 용도를 위한 다른 성분들일 수 있다.
유리하게도, 본 발명에 따르면, 미생물에 기반한 생산물들은 미생물들이 성장되었던 브로스를 포함할 수 있다. 생산물은, 예를 들어 적어도, 중량에 의해, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100% 브로스일 수 있다. 생산물 내의 바이오매스의 양은, 중량에 의해, 예를 들어 그 사이의 모든 백분율을 포함하여, 0% 내지 100% 중 어디든 될 수 있다.
선택적으로, 생산물은 사용 전에 저장될 수 있다. 저장 시간은 짧은 것이 바람직하다. 그러므로, 저장 시간은 60일, 45일, 30일, 20일, 15일, 10일, 7일, 5일, 3일, 2일, 1일, 또는 12 시간보다 짧을 수 있다. 바람직한 일 실시예에 있어서, 살아 있는 세포들이 생산물 내에 존재한다면, 생산물은 예를 들어 20°C, 15°C, 10°C, 또는 5°C 보다 낮은, 서늘한 온도에 저장된다. 한편, 생계면활성제 조성물은 통상적으로 주변 온도(ambient temperatures)에 저장될 수 있다.
본 발명의 미생물에 기반한 생산물들은, 예를 들어 미생물 접종원들(microbial inoculants), 생물농약들(biopesticides), 영양원들(nutrient sources), 치료제들(remediation agents), 건강 식품들(health products), 및/또는 생계면활성제들일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 배양 프로세스 후 획득되는 발효 생산물들(예. 미생물들 및/또는 대사산물들)은 통상적으로 높은 상업적 가치를 가진다. 미생물들을 포함하는 이러한 생산물들은 미생물들에 결핍된 생산물들보다는 강화된 영양 함량을 가진다. 미생물들은 배양 시스템, 배양 브로스 및/또는 배양 바이오매스 내에 존재할 수 있다. 배양 브로스 및/또는 바이오매스는 관심있는 생산물들을 생산하기 위해, 건조(예. 분무-건조)될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 배양 생산물들은 분무-건조된 바이오매스 생산물로서 준비될 수 있다. 바이오매스는 원심분리, 여과, 분리(separation), 디캔팅, 분리와 디캔팅의 조합, 한외여과(ultrafiltration) 또는 미세여과(microfiltration)와 같은, 알려진 방법들에 의해 분리될 수 있다. 바이오매스 배양 생산물들은 루먼 바이패스(rumen bypass)를 용이하게 하기 위해 추가적으로 처리될 수 있다. 바이오매스 생산물은 배지로부터 분리되어, 분무-건조되고 그리고 선택적으로 루먼 바이패스를 조절하기 위해 처리되어, 영양원으로서 공급되도록 첨가될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 배양 생산물들은 동물 사료로서 또는 인간을 위한 보조 식품으로서 이용될 수 있다. 배양 생산물들은 인지질(phospholipid), 비타민들(vitamins), 필수아미노산들(essential amino acids), 펩타이드들(peptides), 단백질들(proteins), 탄수화물들(carbohydrates), 스테롤들(sterols), 효소들(enzymes), 및 철, 구리, 아연, 망간, 코발트, 요오드, 셀레늄, 몰리브덴, 니켈, 불소, 바나듐, 주석 및 실리콘과 미량 미네랄들(trace minerals) 중 적어도 하나 또는 그 이상의 지방들, 지방산들, 지질들로 영양이 풍부할 수 있다. 펩타이드들은 적어도 하나의 필수아미노산을 포함할 수 있다.
일 실시예들에 있어서, 필수아미노산들은 배양 반응에 사용되는 해당 변형된 미생물 내부에 캡슐화된다. 필수아미노산들은 미생물에 의해 발현되는 이종 폴리펩타이드들(heterologous polypeptides)에 포함되어 있다. 원한다면, 이종 펩타이드들이 발현되어 적절한 미생물(예. 균류) 내의 봉입체들(inclusion bodies) 내에 저장된다.
일 실시예에 있어서, 배양 생산물들은 높은 영양 함량을 가진다. 그 결과, 배양 생산물들의 더 높은 백분율은 완전한 동물 사료에 사용될 수 있다. 일 실시예에 있어서, 사료 조성물은 사료의 15% 내지 사료의 100%에 퍼져 있는, 변형된 배양 생산물들을 포함한다.
본 발명은 추가적으로 바이오매스(예. 생존가능한 세포 물질), 새포 외 대사산물들(예. 크고 작은 분자들), 및/또는 세포 내 성분들(예. 효소들 및 다른 단백질들)의 생산을 위한 물질들 및 방법들을 제공한다. 본 발명의 미생물 및 미생물 성장 부산물들은 또한 광석(ore)과 같은, 기질의 변환을 위해 이용될 수 있고 이때 변환된 기질은 생산물이다.
본 발명은 추가적으로 미생물에 기반한 생산물들 뿐만 아니라, 예를 들어 개선된 생물적 환경 정화, 광업, 및 석유 및 가스 생산; 폐기물 처분 및 처리; 가축 및 다른 동물들의 건강 증진; 및 미생물에 기반한 생산물들 중 하나 또는 그 이상의 적용에 의한 식물들의 건강 및 생산성 향상을 포함하는 많은 환경들에서 유익한 결과를 달성하기 위해 이러한 생산물들의 이용을 제공한다.
상세한 실시예들에 있어서, 본 발명의 시스템들은 예를 들어 작물 활력을 촉진시키고; 작물 생산량을 향상시키고; 식물 면역 반응들을 향상시키고; 곤충, 해충 및 질병 저항성을 향상시키고; 곤충들, 선충류, 질병들 및 잡초들을 방제하고; 식물 영양을 개선시키고; 농업 및 임업 및 목초지 토양들의 영양 함량을 개선시키고; 및 개선되고 더 효과적인 물 이용을 장려함으로써, 농업 생산성을 개선하는, 과학에 기반한 해결책들을 제공한다.
일 실시예에 있어서, 본 발명은 여기에 개시된 조성물을 토양, 종자, 또는 식물 부분들에 적용함으로써 식물 건강을 개선하고 및/또는 작물 생산량을 증가시키는 방법을 제공한다. 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 여기에 설명되는 조성물의 복수의 적용들을 포함하는, 작물 또는 식물 생산량을 증가시키는 방법을 제공한다.
유리하게도, 이 방법은 생산량 증가가 달성되고 부작용들 및 추가 비용을 피하면서 선충류, 및 해충들에 의해 야기되는 이에 대응하는 질병들을 효과적으로 방제할 수 있다.
다른 실시예에 있어서, 미생물 성장 부산물들을 생산하기 위한 방법은 추가적으로 관심있는 부산물을 농축 및 정제하는 단계들을 포함할 수 있다.
일 실시예에 있어서, 본 발명은 적어도 한 종류의 미생물 및/또는 이 미생물에 의해 생산되는 적어도 하나의 미생물 성장 부산물을 포함하는 조성물을 추가적으로 제공한다. 조성물 내의 미생물들은 활성 또는 불활성 상태, 및/또는 식물 세포들, 포자들, 균사체, 분생자의 형태, 및/또는 다른 미생물적 번식 형태에 있을 수 있다. 조성물은 미생물들이 성장되었던 성장 모체를 포함하거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 조성물은 또한 건조된 형태 또는 액체 형태일 수 있다.
일 실시예에 있어서, 조성물은 농업에 적절하다. 예를 들어, 조성물은 토양, 식물들, 및 종자들을 처리하는 데 이용될 수 있다. 조성물은 또한 농약으로서 이용될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 본 발명은 추가적으로 지역적인 요구들에 따라 물질들 및 방법들을 커스터마이징하는 것을 제공한다. 예를 들어, 미생물들의 배양을 위한 방법은 지역적인 토양 또는 특정 유정 또는 오염 장소에 위치되는 이러한 미생물들을 성장시키는 데 이용될 수 있다. 상세한 실시예들에 있어서, 지역적인 토양들은 토종 성장 환경을 제공하기 위한 배양 방법에 있어서 고체 기질들로서 이용될 수 있다. 유리하게도, 이러한 미생물들은 지역적인 요구들에 유익하고 더 잘 적응할 수 있다.
본 발명에 따른 배양 방법은 실질적으로 배지 단위 당 미생물적 생산물들의 수율을 증가시킬 뿐만 아니라, 생산 작업의 단순성을 개선시킨다. 나아가, 배양 프로세스는 발효 완료 후 미생물들을 농축시킬 필요가 제거 또는 감소될 수 있다.
유리하게도, 이 방법은 복잡한 장비 또는 높은 에너지 소비가 필요치 않고, 이로써 미생물들 및 이들의 대사산물들을 대규모로 생산하는 자본 및 노동 비용을 감소시킨다.
미생물 성장 부산물들
본 발명의 방법들 및 시스템들은 예를 들어, 생계면활성제들, 효소들, 산들, 생체 고분자들, 용매들, 및/또는 다른 미생물 대사산물들과 같은, 유용한 미생물 성장 부산물들을 생산하는 데 이용될 수 있다. 상세한 실시예들에 있어서, 성장 부산물은 생계면활성제이다. 보다 더 상세하게, 성장 부산물은 표면활성물질(surfactin), 소포로리피드들(sophorolipids)(SLPs), 람노리피드들(rhamnolipids)(RLPs) 및 만노실에리트리톨 지질들(mannosylerythritol lipids) (MELs)로부터 선택되는 생계면활성제일 수 있다.
생계면활성제들은 미생물들에 의해 생산되는 구조적으로 다양한 표면-활성 물질들의 그룹이다. 생계면활성제들은 생분해가능하고 또한 재생가능한 기질들 상에서 선택된 유기체들을 이용해 쉽고 저렴하게 생산될 수 있다. 대부분의 생계면활성제를 생산하는 유기체들은 성장하는 배지 내의 탄화수소원(예. 오일들, 설탕, 글리세롤 등)의 존재에 반응하여 생계면활성제들을 생산한다. 철의 농도와 같은 다른 배지 성분들 또한 생계면활성제 생산에 크게 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 박테리아 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa)에 의한 RLP들의 생산은 암모니아보다는 질산염(nitrate)이 질소원으로서 이용되면 증가될 수 있다. 또한 철, 마그네슘, 나트륨, 및 칼륨의 농도; 탄소:인 비율; 및 교반(agitation)은 람노리피드 생산에 크게 영향을 미칠 수 있다.
모든 생계면활성제들은 양친성(amphiphiles)이다. 이들은 2 개의 부분들로 구성된다: 극성(친수성) 부분(moiety) 및 비극성(소수성) 기(group). 이들의 양친성 구조로 인해, 생계면활성제들은 친수성의 물에 용해되지 않는 물질들의 표면적을 증가시키고, 이러한 물질들의 물 생체이용률(water bioavailability)을 증가시키고, 또한 박테리아 세포 표면들의 특성들을 변경시킨다.
생계면활성제들은 낮은 분자 중량의 당지질들(예. 람노리피드들, 소포로리피드들, 만노실에리트리톨 리피드들), 지질펩타이드들(예. 표면활성물질), 플라보지질들(flavolipids), 인지질들(phospholipids), 및 지질단백질들(lipoproteins), 리포다당류-단백질 복합물들(lipopolysaccharide-protein complexes) 및 다당류-단백질-지방산 복합물들(polysaccharide-protein-fatty acid complexes)과 같은 높은 분자 중량의 고분자들을 포함한다. 생계면활성제 분자의 공통된 친유성 부분(moiety)은 지방산의 탄화수소 사슬인 한편, 친수성 부분은 중성 지질들의 에스테르 또는 알코올 기들에 의해, 지방산들 또는 아미노산들(또는 펩타이드들), 플라보지질들의 경우, 또는 당지질들의 경우에 있어서는 유기산의 카르복실 기에 의해, 탄수화물에 의해, 형성된다.
미생물 생계면활성제들은 박테리아, 균류 및 효모들과 같은 다양한 미생물들에 의해 생산된다. 예시적인 생계면활성제를 생산하는 미생물들은 슈도모나스 종들(Peudomonas species)(P. 에루지노사(P. aeruginosa), P. 푸티다(P. putida), P. 플로레센스(P. florescens), P. 프라기(P. fragi), P. 시린가에(P. syringae)); 플라보박테륨 종들(Flavobacterium spp.); 바실러스 종들(Bacillus spp.)(B. 서브틸리스(B. subtilis), B. 푸밀루스(B. pumillus), B. 세레우스(B. cereus), B. 리체니포르미스(B. licheniformis)); 위케르하모마이세스 종들(Wickerhamomyces spp.), 칸디다 종들(Candida spp.)(C. 알비칸스(C. albicans), C. 루고사(C. rugosa), C. 트로피칼리스(C. tropicalis), C. 리포리티카(C. lipolytica), C. 토룰롭시스(C. torulopsis)); 로도코쿠스 종들(Rhodococcus spp.); 아스로박터 종들(Arthrobacter spp.); 캄필로박터 종들(campylobacter spp.); 코르니박테륨 종들(cornybacterium spp.); 피키아 종들(Pichia spp.); 스타르메렐라 종들(Starmerella spp.); 등을 포함한다. 생계면활성제들은 업계에 알려져 있는 발효 프로세스들에 의해 획득될 수 있다.
예를 들어 상당한 양의 당지질-생계면활성제들을 축적할 수 있는 다른 균류 종들, 예를 들어 및/또는 상당한 양의 표면활성물질을 축적할 수 있는 박테리아 종들을 포함하는, 다른 미생물 종들이 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 본 발명에 따라 유용한 다른 대사산물들은 만노단백질, 베타-글루칸 및 생체-유화 및 표면/계면 장력-감소 특성을 가지는 다른 생화학물들을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 시스템들에 의해 생산되는 생계면활성제들은 표면활성물질 및 람노리피드들(RLP), 소포로리피드들(SLP), 트레할로스 리피드들 또는 만노실에리스리톨 리피드들(MEL)과 같은 당지질들을 포함한다. 특정한 실시예들에 있어서, 본 시스템은 SLP들 및/또는 MEL들을 대구모로 생산하는 데 이용된다.
소포로리피드들은 예를 들어 스타르메렐라 계통의 다양한 효모들에 의해 생산되는, 당지질 생계면활성제들이다. 연구되었던 스타르메렐라 계통의 효모들 중에서, 소포로리피드들의 최대 생산량은 칸디다 아피콜라 및 스타르메렐라 봄비콜라로 보고되었다. SLP들은 긴 사슬 하이드록시 지방산들에 연결되어 있는 이당류 소포로스로 구성된다. 이 SLP들은 17-L-하이드록시옥타데칸(17-L-hydroxyoctadecanoic) 또는 17-L-하이드록시-Δ9-옥타데칸(17-L-hydroxy-Δ9-octadecenoic) 산에 β-글리코시드 결합된(attached β-glycosidically), 부분적으로 아세틸화된 2-O-β-D-글루코피라노실-D-글루코피라노스 유닛(acetylated 2-O-β-D-glucopyranosyl-D-glucopyranose unit)이다. 하이드록시 지방산은 일반적으로 16 또는 18 탄소 원자들이 있고, 또한 하나 또는 그 이상의 불포화된 결합들을 포함할 수 있다. 지방산 카르복실기는 자유롭거나(산성 또는 개방형) 4"-위치에서 내부적으로 에스테르화될 수 있다(락톤 형태).
만노실에리스리톨 지질들은 다양한 효모 및 균류 종들에 의해 생산되는 생계면활성제들의 당지질 강(class)이다. 유효한 MEL 생산은 각각의 종들(species)에 의해 생산되는 MEL 구조들에서 커다란 가변성을 가지고, 슈도지마 속(genus)에 주로 한정된다. MEL들은 그들의 당 부분(sugar moiety) 또는 친수성 유닛으로서 4-O-b-D-만노피라노실-에리스리톨(4-O-b-D-mannopyranosyl-erythritol)을 포함한다. 만노피라노실의 C-4' 및 C-6' 위치들에서 아세틸화의 정도에 따라, MEL들은 MEL-A, MEL-B, MEL-C 및 MEL-D로 분류된다. MEL-A는 탈아세틸화된 화합물을 나타내지만, MEL-B 및 MEL-C는 각각 C-6' 및 C-4'에서 모노아세틸화되어 있다. 완전히 탈아세틸화된 구조는 MEL-D에 기인한다. 슈도지마 외에, 최근에 분리된 종, 우스틸라고 시타미네아(Ustilago scitaminea)는 사탕수수 즙으로부터 풍부한 MEL-B 생산을 보여주었다. MEL들은 유효한 국소 습윤제들로서 작동하고 또한 손상된 털을 회복시킬 수 있다. 나아가, 이 화합물들은 보호 및 치유 활동들을 보여주고, 섬유아세포들(fibroblasts) 및 유두 세포들(papilla cells)을 활성화시키고, 또한 천연 산화방지제들로서 작용한다.
SLP들 및 MEL들의 구조 및 조성으로 인해, 이 생계면활성제들은 탁월한 표면 및 계면 장력 감소 특성들 뿐만 아니라 다른 유익한 생화학적 특성들을 가지는데, 이것은 대규모 산업 및 농업적 용도와 같은 응용들에서, 및 화장품, 가전제품, 및 건강, 의료 및 제약 분야들을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다른 분야들에서, 유용할 수 있다.
생계면활성제들은 계면에서 축적되고, 이로써 계면 장력을 감소시키고 용액에서 응집된 미셀 구조들(aggregated micellular structures)의 형성으로 이어진다. 안전하고, 유효한 미생물 생계면활성제들은 액체들, 고체들 및 기체들의 분자들 사이의 표면 및 계면 장력들을 감소시킨다. 구멍들을 형성하고 생화학적 막들을 불안정하게 만드는 생계면활성제들의 능력은 항균, 항곰팡이, 및 용혈 제제들로서 이들이 이용되는 것을 허용한다. 낮은 독성 및 생분해성의 특성과 결합되면, 생계면활성제들은 미생물에 의해 강화된 석유 회수와 같이, 광범위한 석유 산업 응용들을 위해 석유 및 가스 산업에서의 사용에 유리하다. 이 응용들은, 이에 한정되지는 않지만, 석유-함유 층으로부터 원유 회수의 향상; (유정으로 석유의 흐름을 개선시키기 위해) 석유 및 가스 정들(wells)의 자극; 파라핀들, 아스팔텐들 및 막대들, 튜빙, 라이너들, 탱크들 및 펌프들과 같은 장비로부터의 조각들과 같은 오염물들 및/또는 장애물들의 제거; 석유 및 가스 생산 및 이송 장비의 부식의 방지; 원유 및 천연 가스 내의 H2S 농도의 감소; 원유의 점도에 있어서의 감소; 무거운 원유 및 아스팔텐의 더 가벼운 탄화수소 조각들로의 개선, 탱크들, 흐름라인들 및 파이프라인들의 세정; 선택적 및 비선택적 막힘으로 인한 수공법 동안 석유의 이동성의 향상; 및 유체 파쇄를 포함한다.
석유 및 가스 응용 분야들에 사용될 때, 본 발명의 시스템들은 미생물에 기반한 유전 조성물들의 비용을 낮추는 데 이용될 수 있고 또한 고분자들, 용제들, 파쇄 모래 및 비즈, 유화제들, 계면활성제들, 및 업계에 알려진 다른 물질들과 같은, 다른 화학적 강화제들과 조합되어 이용될 수 있다.
본 발명에 따라 생산된 생계면활성제들은 예를 들어 파이프들, 반응기들, 및 다른 기계 또는 표면들의 세정 뿐만 아니라 예를 들어 식물들 및/또는 그들의 주변 환경에 적용될 때, 해충 방제를 포함하는, 다른, 석유 회수 목적이 아닌 목적들을 위해 이용될 수 있다. 본 발명에 따라 생산되는 생계면활성제들 일부는 해충들의 조직들을 관통할 수 있고 보조제들의 이용 없이 소량으로도 효과적이기 때문에, 해충들을 방제하는 데 이용될 수 있다. 결정적인 미셀 농도 이상의 농도들에서, 생계면활성제들은 처리되는 물체들을 더 효과적으로 관통할 수 있음이 발견되었다.
해충들은 생물적 방지 제제로서 생계면활성제를 생산하는 유기체들을 이용해 또는 생계면활성제들 그 자체에 의해, 방제될 수 있다. 이에 더하여, 해충 방제는 생계면활성제를 생산하는 유기체들의 성장을 지원할 뿐만 아니라 생계면활성제 살충제들을 생산하기 위해 특정 기질들을 이용하는 것에 의해 달성될 수 있다. 유리하게도, 천연 생계면활성제들은 경쟁하는 유기체들의 성장을 방해하고 특정한 생계면활성제를 생산하는 유기체들의 성장을 증진시킬 수 있다.
이에 더하여, 이러한 생계면활성제들은 동물 및 인간 질병들을 치료하는 데 중요한 역할을 할 수 있다. 동물들은, 예를 들어 미생물 세포 덩어리가 있는 또는 없는, 및/또는 구리 또는 아연과 같은 다른 합성물들이 있는, 생계면활성제 용액에 적시거나 또는 담그는 것에 의해 치료될 수 있다.
본 발명에 따라 생산되는 조성물들은, 효모 세포벽의 외부 표면의 일부로서 만노단백질의 고농도(만노단백질은 80% 유화지수까지 도달할 수 있는 매우 효과적인 생물 유화제임); 효모 세포벽들 내의 생체 고분자 베타-글루칸(유화제)의 존재; 표면 및 계면 장력 모두를 감소시킬 수 있는 강력한 생계면활성제인, 배양체 내의 소포로리피드들의 존재; 및 배양체 내의 대사산물들(예. 젖산, 에탄올 등)의 존재를 포함하여, 전체 세포 배양체의 사용으로 인하여 단지 생계면활성제들의 사용에 비하여 장점들을 가진다. 이 조성물들은, 많은 다른 용도들 중에서, 생계면활성제들로서 작용할 수 있고 또한 표면/계면 장력 감소 특성을 가질 수 있다.
종래 기술에 따른 미생물 생계면활성제들의 배양은 복잡하고 시간 및 자원 소모가 크고, 복수 단계들을 필요로 하는 프로세스이다. 본 발명은 이 프로세스의 비용을 감소시키고 단순화한 장비, 장치들, 방법들 및 시스템들을 제공한다. 본 발명은 또한 신규한 조성물들 및 이 조성물들의 이용들을 제공한다.
예들
본 발명 및 많은 장점들은 예시로서 주어진, 이하의 예들로부터 더 잘 이해될 수 있다. 이하의 예들은 본 발명의 방법들, 적용들, 실시예들 및 변형들의 일부를 예로 들었다. 이들은 본 발명을 한정하는 것으로 고려되어서는 안된다. 많은 변화들 및 변형들이 본 발명에 대하여 수행될 수 있다.
예 1 - 멀티-탱크 발효 시스템
휴대가능하고 유통가능한 플라스틱 반응기는 도 1 및 도 2에 도시된 바와 같이 구축되었다. 이 반응기는 2 개의 탱크들 사이에서 질량 교환을 위한 2 개의 루프들을 갖는 2 개의 플라스틱 사각 탱크들을 가진다.
시스템의 상부에는 루프들 중 하나를 설명하는, 제1 탱크로부터 뽑아서 제2 탱크로 넣기 위한 펌핑 메카니즘이 구비되었다. 다른 루프는 탱크의 바닥에 있고 탱크들 내의 부피들을 동등하게 하기 위해 정수압에 의존한다.
탱크들로의 여과된 공기의 첨가는 거품기 속으로 퍼지는 살포 메카니즘에 의해 제어되었다. 살포를 위한 여과된 공기는 큰 부피의 물 펌핑 시스템을 통해 생성되었다. 탱크마다 2 개의 72 인치 거품기들이 있어. 시스템 당 전체 4 개로 귀결된다. 공기 압축기는 여과된 공기를 추가적인 통기를 위해 상부 및 바닥 루프들에 부가하는 데 이용되었다.
상부 루프에는 배양체의 탁도(turbidity), 색상(color), 농후(thickness) 및 다른 특성들을 보는 것을 허용하는, 검사 유리창이 구비되어 있다. 반응기는 세포 및 대사산물 생산을 위해 스타르메렐라 효모를 성장시키기 위해 750 내지 850 L의 작업 부피를 가진다(하지만, 크기 및 축척은 필요한 적용에 따라 다를 수 있다). 반응기는 특히 소규모 또는 대규모로 스타르메렐라 계통 효모의 양산에 적합하다.
배양체 생산 비용을 더 감소시키고 기술의 확장성을 보장하기 위해, 시스템은 전통적인 방법들을 이용해 살균되지 않았다. 대신, 2-3% 과산화수소로 내부 표면들의 처리 및 표백제 및 고압 열수를 이용한 헹굼이 포함되는, 빈 용기 소독 방법이 이용되었다. 추가적으로, 오염의 가능성을 감소시키기 위해, 배양체를 준비하는 데 이용된 물은 0.1-마이크론 필터를 통해 여과되었다.
배지 성분들은, 85-90o C에서 온도 오염제거되거나 또는 단지 온도 오염제거된, 오일을 제외하고, 3% 과산화수소에 용해되었다(건조 성분들 및 H2O 비율은 1:3 v/v).
발효 온도는 일반적으로 대략 23 내지 37o C 사이에, 바람직하게 대략 25 내지 30o C 사이에 있어야 한다.
pH는 대략 3 내지 5, 바람직하게는 대략 3.5 내지 대략 4.5 사이에 있어야 한다. 추가적으로, 오염 가능성을 더 감소시키기 위해, 배양 프로세스는 4.0-4.5의 pH에서 시작되었고 그후 3.2-3.5의 평균 pH에서 추가적으로 수행되었다.
이러한 배양 조건들 하에서, 산업적으로 유용한 바이오매스, 소포로리피드들 및 다른 대사산물들의 생산은 대략 60 내지 대략 120 시간의 발효로 달성되었다. 발효의 완료시, 배양체는 다양한 산업적 목적을 위해 적용될 수 있다.
예 2 - 멀티-탱크 반응기 내의 스타르메렐라 배양을 위한 배지 및 그 이용
20 - 100 gL-1 포도당, 0 - 50 gL-1 (이것은 예를 들어, 생산되는 생계면활성제의 원하는 양에 따라서, 변할 수 있다.) 카놀라유, 5 gL-1 효모 추출물, 4 gL-1 NH4Cl, 1 gL-1 KH2PO4.H2O, 0.1 gL-1 NaCl 및 0.5 gL-1 MgSO4.7H2O로 구성되는 배지가, 여과된 물 내에 준비되었다.
처음의 pH는 6N KOH로 대략 4.5로 조정되었다. 배양체는 대략 25o C에서 성장되었다. 배양 시간은 120 h까지였고 반응기 배양체의 pH는 1.0M NaOH의 첨가에 의해 매일 2번 대략 3.5로 조정되었다.
이 배양 조건들에서, 스타르메렐라 젖은 바이오매스의 양은 배양체 리터 당 100 그램까지 도달되었다.
예 3 - 항생제를 이용한 종자 배양체 제조
이하는 본 발명에 따른 증대된(scaled up) 미생물에 기반한 생산물들을 준비하기 위한 방법의 일 예이다. 종자 배양체(seed culture)가 준비되고 그후 본 시스템들에 이용되기 위해 증대될 수 있다. 증대는 예를 들어 드럼 믹서에 시약들을 첨가하고, 또한 배양체가 2일 또는 그 이상 동안 성장하도록 허용함으로써, 별도로 분리된 용기 내에서 발생할 수 있다. 종자 배양체가 믹서 내에서 적어도 2일 동안 성장하도록 허용된 후, 배양체는 소정의 수로 본 반응기 시스템들에 접종하기 위해 적절한 수의 부분들로 나눠질 수 있다.
배지 조성물
시약 중량(g/L)
효모 추출물 5
포도당 100
요소 1
스트렙토마이신(항생제) 0.1
옥시테트라사이클린(항생제) 0.01
셰이크 플라스크들(shake flasks)
4L 플라스크들 내에 항생제들 없이 2 리터의 배지 조성물이 준비되었다. 플라스크들은 그후 고압살균을 위해 준비되었다. 치즈 직포 조각(piece of cheese cloth), 다음에 청색 고압살균 종이 조각(blue autoclave paper)이 고무밴드를 이용해 플라스크들의 둘레에 고정되었다(치즈 직포 및 청색 종이는 직포 및 종이가 고무밴드가 그 둘레에 조각들을 고정하는 지점을 넘도록 충분히 커야 한다). 고압살균 주기는 20 분 동안 121o C에서 발생하고, 그후 플라스크들은 30o C 또는 그 이하까지 냉각되도록 허용되었다.
다음으로, 항생제들은 측량되어 비이커 또는 50 mL 원뿔형 관 내에 DI 물로 용해되었다. 우무 플레이트들(Agar plates)은 C. 봄비콜라 또는 S.봄비콜라로 라벨링되었다. 무균 기술을 실행하면서, 루프(1 내지 2 개의 루프들은 충분해야 한다)로 플레이트로부터 단일 균총들(colonies)이 선택되고, 플라스크들은 실험실 내의 후드 아래에서 접종되었다. 용해된 항생제들이 또한 플라스크들에 첨가되었다. 후드 아래에서 치즈 직포 및 고압살균 청색 종이를 제거 및 교체할 때, 플라스크 내부에 노출되었던 치즈 직포의 바닥을 건드리지 않도록 조심하였다.
일단 4L 플라스크들이 접종되면, 이들은 발효실 내의 셰이커들 내에 배치되었다. 셰이커들의 온도는 30o C로 설정되었다. 플라스크들은 종자 배양체의 이용 전에 적어도 2일 동안 발효되도록 허용되었다. 종자 배양체 접종의 샘플들은 접종이 깨끗하고 오염 없이 수행되었음을 보장하기 위해 사용 전에 후드 아래에서 행해졌다. 샘플들의 슬라이드들은 간단한 그램 염색을 이용해 생성되었다.
드럼 믹서를 이용한 증대
종자 배양체가 2일 동안 성장하도록 허용된 후, 종자 배양체는 반응기들을 접종하기 위해 흑색 드럼 믹서(black drum mixer) 내에서 증대되었다. 상기에서 열거된 시약들의 40L 뱃치를 위한 건조 성분들이 측량되었다. 항생제들도 측량되어 별도의 용기 내에 보관된다.
배지 성분들은, 그 부피가 40L 레벨을 초과하지 않았음을 보장하기 위해 40L 카보이 내에 용해되었다. 배지 40L가 믹서에 첨가되었고, 이어서 셰이커로부터 2L의 접종원 및 적절한 양의 용해된 항생제들이 이어진다. 배양체는 그후 부분들이 반응기들에 대하여 이송되기 전에 믹서 내에서 적어도 2일 동안 성장하도록 허용되었다. 각각의 큐비클(cubicles)로 분배되는 배양체의 양은 얼마나 많은 리터의 배양체가 생산되었는지 또한 시작되어야 하는 큐비클의 수에 따라 달라진다. 각각의 반응기에는 적어도 10L의 배양체가 주어졌다.
증대된 배양체는, 얼마나 많은 부피의 배양체가 반응기마다 필요한지에 따라, 20L 또는 40L 카보이들 내에서 드럼 펌프를 이용해 수확되었다. 배양체는 그후 동일한 펌프로 카보이들로부터 전달되고 반응기들은 접종되었다.
드럼 믹서의 세정
드럼 믹서로부터 모든 배양체들의 수확 후, 믹서는 온수(warm water)로 헹궈지는 배수구로 이동되어, 조심스럽게 생물막을 제거하였다. 철저한 헹굼 후, 70% IPA는 반응기를 살균하기 위해 이용되었다. 믹서는 건조되도록 허용되고, 또한 IPA 잔류물이 남아 있지 않을 때 다른 종자 배양체 뱃치가 시작될 수 있다.
예 3 - 항생제들을 포함하는 배지를 이용한 멀티-탱크 반응기의 작동
배지
시약 중량(g/L)
요소 1
효모 추출물 5
포도당 60
카놀라유 70 ml/L
스트렙토마이신(항생제) 0.1
옥시테트라사이클린(항생제) 0.01
멀티-탱크 반응기의 준비
2 개 탱크 반응기의 전체 부피는 750L였고, 이로써 상기의 시약들의 적절한 양이 결정되었고 측량되었다. 건조 성분들은 여과된 물을 이용해 통(barrel)에 용해되었다. 카놀라유는 용해 단계 동안 첨가되지 않았다. 항생제들은 별도로 보관되고, 큰 비이커 내에서 DI 물에 용해되었다.
다음으로 용해된 배지는 반응기에 첨가되었다. 반응기는 여과된 물로, 이어서 카놀라유에 의해, 전체 ~185 갤론까지 채워졌다. 최종 부피는 각각의 탱크에 있어서 100 갤론이었고, 이로써 전체 200 갤론과 같다.
시작 온도는 적어도 23o C 였지만, 30o C보다 더 높지는 않다. 일단 온도가 23 내지 30o C의 범위로 설정되면, 접종원이 믹서로부터, 이어서 용해된 항생제들이 첨가된다. 샘플들은 pH 및 DO%를 측정하기 위해 취해졌다. 배양체는 최소 ~3일 동안 성장하도록 허용되었고, 적어도 하루에 한번 pH, 온도, 및 DO%를 감시하였다. 일단 큐브가 수확을 위해 준비되었다면, 샘플은 pH를 측정하기 위해 취해졌다.
슬라이드가 만들어지고, 연속하는 희석 플레이트가 만들어지고 OD 측정이 품질 제어/보장을 위해 수행되었다. 일단 배양체의 품질이 보장되면, 배양체는 바닥 루프에 맞는 캠록(camlock) 및 2 개의 호스들의 세트들이 구비된 전달 펌프를 이용해 수확되었다.
배양체 뱃치의 품질이 용도에 맞지 않는 경우에 있어서는, 반응기의 2 개의 탱크들 사이에 표백제 반 통을 부어, 20 분 동안 앉도록 허용하고, 그후 빼냈다.
반응기의 세정
먼저, 반응기 탱크들이 헹궈졌다. 반응기는 벽으로부터 뽑아지고, 바닥 볼 밸브들은 닫히고, 바닥 루프 조립체는 캠록 부품을 연결해제하는 것에 의해 제거되었다. 바닥 루프를 벗길 때 너무 많은 배지가 흐르지 않도록 조심했다. 루프가 제거된 후, 팰럿 잭(palate jack)이 창고의 배수구를 향해 반응기를 옮길 때 이용되었다.
상부 루프는 그후 제거되었고, 바닥 루프 구성요소들은 열수로 헹궈졌다. 이 루프들 또는 그들의 구성요소들이 몹시 더럽다면, 소독약이 철저히 세척하는 데 사용되었다. 다음으로, 탱크들은 열수 및 배수구 근처의 창고의 호스 상의 분사 노즐을 이용해 헹궈졌다. 조심스럽게 탱크들 내부의 막을 제거하였다.
다음으로, 탱크들의 내부는 적어도 3-5 분 동안 3% 과산화수소(H2O2)로 김서려졌다. PPE 착용은 이 단계에서 중요하다.
주의: 오염이 관심거리라면, 반응기는 다시 그 이동 위치로 전송되고 탱크들은 0.5% 과산화수소 용액으로 채워진다. 반응기의 전체 부피는 대략 1100L여서, 10% 과산화수소 대략 55L가 필요했다. 바닥 루프는 재조립되고 유닛은 켜졌다. 반응기는 0.5% 과산화수소로 그 자체를 철저히 세척하기 위해 적어도 4 시간 허용되었다. 일단 적어도 2 시간이 지난 후 유닛은 꺼졌다. 바닥 루프 볼 밸브들은 닫히고 바닥 루프는 연결해제되었다. 팰럿 잭이 배수를 위해 배수구로 유닛을 옮기는 데 사용되었다.
그후 반응기는 여과된(바람직하게 뜨거운) 물로 철저히 헹궈지고, 다른 뱃치에 대하여 시작할 준비가 되었다.
예 4 - 파라핀 액화
실험은 파라핀 액화에 있어서 스타르메렐라 배양체의 효능을 보여주기 위해 수행되었다. 실험의 결과는 도 2에서 볼 수 있고, 배양체의 결과는 "Star3"으로 표시되어 있다.
(상용을 포함하여) 21 개의 미생물 및 화학 유화제 생산물들은 파라핀 분해 효능에 대하여 연구되었다. 25 mL의 작업 부피를 갖는 50 mL 팔콘 튜브들(Falcon tubes)이 실험에 사용되었다. 고체 파라핀은 유전(oilfield)으로부터 획득되었다. 4 그램의 고체 파라핀이 측량되었고 그후 각각의 팔콘 튜브에 첨가되었고 표 1로부터 각각의 액체 20 mL가 팔콘 튜브들에 첨가되었다. 팔콘 튜브들 모두는 그후 30 내지 40o C에서 ENVIRO GENE 인큐베이터 내에 수평으로 배치되었고 부드럽게 혼합되었다. 상이한 인큐베이션 시간들(1, 2, 또는 4일) 후, 튜브들은 수집되고 분석되었다.
3 개 세트의 실험들이 상이한 인큐베이션 시간들 및 상이한 온도들에서 수행되었다. 제1 세트 실험들은 30o C 에서 수행되었다. 이 세트의 실험들에 있어서, "Star3"은 (대략적으로 포화 레벨인) 대략 4g/L 소포로리피드를 갖는 S. 봄비콜라를 포함한다. "Star3" 처리는 튜브들 내의 완전한 분포를 보여주고, 또한 파라핀을 완전히 액체로 변환시키기 위한 단지 첨가제였지만, 파라핀은 (상용 Naxan을 포함하여) 모든 다른 테스트들에서 고체 형태로 남아 있다. 이 개념 입증 실험은 스타르메렐라 배양체가 파라핀 액화에 있어서, 다른 상용 화학물 및 생물학적 제제보다 탁월하기조차 한, 매우 효과적일 수 있음을 보여줬다.

Claims (29)

  1. 미생물에 기반한 조성물을 생성하기 위한 시스템에 있어서,
    제1 탱크 및 제2 탱크를 포함하는 반응기;
    제1 튜브를 통해 상기 제1 탱크에 연결되는 입력, 및 제2 튜브를 통해 상기 제2 탱크에 연결되는 출력을 갖는 펌프;
    상기 제2 탱크로부터 상기 제1 탱크까지 연결하는 제3 튜브를 포함하고,
    상기 제3 튜브는 상기 제2 탱크로부터 상기 제1 탱크까지 정수압 하에서 액체가 흐르는 것을 허용하기에 적절한, 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서, 하나 또는 그 이상의 송풍기들 또는 공기 압축기들을 더 포함하고, 상기 하나 또는 그 이상의 송풍기들 또는 압축기들은 하나 또는 그 이상의 가스 주입기들, 거품기들, 및/또는 살포기들에 연결되는, 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 반응기는 10 내지 40,000 갤론의 작동 부피를 갖는, 시스템.
  4. 제 1 항에 있어서, 시스템 구성요소들을 지지하기 위한 프레임을 더 포함하는, 시스템.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 시스템을 조종하기 위한 휠들 및 핸들들을 더 포함하는, 시스템.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 시스템은 화물 트레일러, 및/또는 세미-트레일러의 뒤쪽에 구성되고, 및/또는 상기 시스템은 휴대가능한, 시스템.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 하나 또는 그 이상의 펌프들은, 분당 200 갤론까지 또는 30 내지 0.1의 범위의 재순환 비를 설립할 수 있는, 시스템.
  8. 오염 없이 미생물을 배양하기 위한 방법에 있어서,
    물 및 영양 성분들을 포함하는 배지를 연동 펌프를 이용해 제 1 항의 시스템에 첨가하는 단계;
    상기 시스템에 생존가능한 미생물을 접종하는 단계; 및
    선택적으로, 상기 시스템에 항균제를 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 미생물은 효모인, 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 미생물은 스타르메렐라 봄비콜라(Starmerella bombicola)인, 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 미생물은 슈도지마 어피디스(Pseudozyma aphidis)인, 방법.
  12. 제 8 항에 있어서, 제 1 항의 시스템은 상기 미생물을 배양하기 전에 살균되는, 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 살균은
    상용 소독제로 상기 반응기의 내부 표면들을 세정하고;
    3% 과산화수소수로 상기 반응기의 내부를 김서리게 하고; 및
    105°C 내지 110°C의 온도에서 물로 상기 반응기의 내부를 찌는 것을 포함하는, 방법.
  14. 제 8 항에 있어서, 상기 배지는 상기 시스템에 첨가되기 전에 오염제거되는, 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 오염제거는
    상기 배지 성분들을 고압살균하고;
    0.1-마이크론 물 필터를 이용해 물을 필터링하고; 및
    물을 UV 살균하는 것에 의해 달성되는, 방법.
  16. 제 8 항에 있어서, 상기 영양 성분들은 하나 또는 그 이상의 당질원들, 하나 또는 그 이상의 지방질원들, 하나 또는 그 이상의 무기 염들, 하나 또는 그 이상의 미량영양소원들, 및 하나 또는 그 이상의 질소원들을 포함하는, 방법.
  17. 제 8 항에 있어서, 상기 항균제는 항생제 또는 순수한 형태의 소포로리피드(sophorolipid)인, 방법.
  18. 미생물 및/또는 하나 또는 그 이상의 상기 미생물의 성장의 생산물들을 포함하는 조성물.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 미생물은 효모인, 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 미생물은 스타르메렐라 봄비콜라(Starmerella bombicola)인, 조성물.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 미생물은 슈도지마 어피디스(Pseudozyma aphidis)인, 조성물.
  22. 제 20 항에 있어서, 상기 성장 부산물은 생계면활성제인, 조성물.
  23. 제 20 항에 있어서, 상기 생계면활성제는 소포로리피드인, 조성물.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 생계면활성제는 만노실에리트리톨 지질(mannosylerythritol lipid)인, 조성물.
  25. 석유-함유 층으로부터 회수할 수 있는 석유의 양을 향상시키기 위한 방법에 있어서, 상기 석유-함유 층에 제 18 항의 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 방법.
  26. 오일 웰로드(oil well rod), 튜빙 및/또는 케이싱을 세척하기 위한 방법에 있어서, 상기 오일 웰로드, 튜빙 및 케이싱 구조들에 제 18 항의 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 방법.
  27. 식물 성장, 수율, 및/또는 건강을 개선하기 위한 방법에 있어서, 상기 식물 또는 그 환경에 제 18 항의 조성물을 적용하는 것을 포함하는, 방법.
  28. 동물의 해충을 방제하기 위한 방법에 있어서, 제 18 항의 조성물로 상기 해충을 줄이는 것을 포함하는, 방법.
  29. 동물을 사육하기 위한 방법에 있어서, 제 18 항의 조성물을 동물의 사료 및/또는 식수원에 추가하는 것을 포함하는, 방법.
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