CN110168072A - 新发酵系统和方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于生产基于微生物的组合物的系统和器械，所述组合物可用于石油和天然气工业、环境清理、以及其它应用。更具体地说，本发明包括用于发酵基于微生物的组合物的生物反应器、设备、以及材料。

Description

新发酵系统和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2017年1月6日提交的美国临时申请序列号No.62/443,356的权益，其全文通过引用结合于此。

技术领域

本发明涉及用于生产基于微生物的组合物的方法和系统，所述基于微生物的组合物可用于例如石油工业、农业、矿业、废物处理和生物修复。

背景技术

微生物如细菌、酵母和真菌的培养对于生产各种有用的生物制剂很重要。微生物在例如食品工业、制药、农业、矿业、环境修复和废物管理方面起着至关重要的作用。

在广泛的行业中使用微生物存在巨大的潜力。基于微生物的产品商业化的限制因素是每个繁殖体密度的成本，其中将微生物产品应用于具有足够接种物的大规模操作以观其益是特别昂贵并且不可行的。

存在微生物培养的两种主要形式：深层培养和表面培养。使用表面或深层培养的任何一种方法都可以生长细菌、酵母和真菌。这两种培养方法均需要微生物生长的营养培养基。该培养基，既可以是液体形式也可以是固体形式，通常包括碳源、氮源、盐和适当的附加营养素和微量营养素。pH和含氧量维持在适合给定微生物的值。

微生物有潜力在例如石油和农业产业中发挥极其有益的作用，只要它们可以更容易获得，并且优选以更有效的形式获得。

使用通常被称为钻机的装备钻入地表以获取石油和天然气。使用钻头在地面钻出大直径井眼(例如，直径24-36英寸)来形成井或者钻孔。该钻头附着在钻管上，钻管由钻机旋转。该钻机通常继续钻大井眼直到钻头钻到水位线以下。接下来，金属衬套(或套管)放置在大直径井眼中，并且通过衬套内部泵送水泥。当水泥到达衬套底部，其向上流动，填满衬套与周围地层之间的空隙，在随后的步骤中将水位隔离并保护其免受任何沿井眼向下泵送的钻井液的侵扰。

在第一套管被注入水泥之后，中等型号的钻头可用于深入钻探地下地层。在之后，通常在钻头被移除处会有一个或多个停止点，其后是更小的套管衬套和水泥。在井打完之前一直重复这个过程。

在钻井过程中，钻井液通过钻管泵送并从钻头泵出。该液体接下来流回钻管和地层或套管之间的空间内。钻井液清除掉钻井碎屑、平衡井下压力、润滑钻孔、并且还用来清洗钻孔内的引起摩擦的物质。

在井钻完之后，通常设置生产衬套(或套管)并且随之对井进行穿孔(例如，使用炸药在含油地层的特定点爆破生产衬套)。接下来，在地层的自然压力下或使用机械装备、注水开采、或其它方式引发的压力下，石油开始流出油井。因为原油流经油井，原油中的物质时常会在生产衬套表面上储积，导致流动变慢，并且有时甚至使得生产全部停止。

利用各种不同的化学制品和装备来防止并修复上述问题，然而，仍需要改进的产品和方法。特别地，需要更加环保、毒性更小、并且效果更好的产品和方法。

在农业中，农民严重依赖合成化学品和化学肥料以提高产量并且保护作物免受病原体、害虫和疾病的侵害；然而，如果使用过量或使用不当，这些物质可通过径流、浸滤和蒸发成为空气和水污染物。即使恰当使用，过度依赖和长期使用某种化学肥料和杀虫剂会有害得改变土壤生态系统、降低抗逆性、增加害虫抗药性、并且阻碍动植物生长和活力。

管理化学品供应和使用的法规要求越来越高，并且消费者对无残留、可持续生长并对环境危害最小的食品的需求正在影响着整个行业并引发了关于如何应对无数挑战的思想演变。对于更安全的杀虫剂和可替代害虫控制策略的需求正在增加。虽然目前大规模淘汰化学品是不可行的，农民逐渐地将生物措施作为综合营养管理和综合虫害管理计划的可行组成部分。

例如，近些年，线虫的生物防治引起了极大的兴趣。该方法使用生物制剂作为杀虫剂，诸如活微生物、由这些微生物衍生的生物产品、以及它们的组合。这些生物杀虫剂较之传统杀虫剂有着重要优势。例如，与传统化学杀虫剂相比，它们的危害较小，更加有效并且具有特效。它们通常能快速降解，并导致较小的环境污染。

由于生产困难、运输复杂、管理不便、价格和效力方面的因素，生物杀虫剂和其它生物制剂的使用极大受限。例如，许多微生物难以生长并且随后以充足的量用于农业和林业生产系统以便使用。由于分配之前的加工、形成、存储、和稳定化导致的生存能力和/或活性的损失，这个问题变得更加严重。另外，一经应用，生物产品可能由于许多原因不能茁壮成长，包括例如初始细胞密度不足、不能在特定位置与现有微生物群有效竞争、以及被引入微生物不能繁殖甚至存活的土壤和/或其它环境条件。

基于微生物的组合物可帮助解决农业、石油天然气工业、以及很多其它工业面临的上述问题中的一些问题。因此，需要大量生产微生物和微生物代谢物的更有效的培养方法。

发明内容

本发明提供用于生产基于微生物的组合物的材料、方法和系统，所述基于微生物的组合物可用于石油和天然气工业、农业、卫生保健以及环境清理、以及各种其它应用。特别地，本发明提供有效培养微生物和生产微生物生长副产物的材料、方法和系统。

本发明的实施例提供了新型的、廉价的发酵方法和系统。更特别地，本发明提供了用于发酵的生物反应器。在特定的实施例中，所述系统用于生长酵素和/或其它基于微生物的组合物。在某些特定的实施例中，所述系统可被用于生产球拟假丝酵母组合物。

所述系统可用来生长酵母、真菌和细菌。在某些实施例中，所述系统可用于生产基于酵母的组合物，包括例如，包括球拟假丝酵母(Starmerella bombicola)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomyces anomalus)、和/或蚜虫拟酵母(Pseudozyma aphidis)酵母的组合物。在一些实施例中，所述系统可用于生产基于细菌的组合物，包括例如包括枯草芽孢杆菌和/或地衣芽孢杆菌的组合物。

在特定的实施例中，本发明的系统包括由导管彼此连接的至少两个罐。在该多罐反应器中，泵迫使微生物培养物通过导管从一个罐到另一个罐。在优选实施例中，该导管安装在罐的顶部或顶部附近。当培养物在导管中移动时，它会被由例如空气压缩机推入液流中的空气氧化。这样会混合并氧化培养物。在罐底部附近，另一个管连接两个罐以平衡每个罐中的培养物水平。该导管可具有另外一个输入部以促进空气补给。因此，该导管可以提供额外的混合和通风。另外，两个罐均可被增补个体喷射系统。

接种可在一个或两个罐中发生并且接种物在两个罐中通过上述导管系统进行混合。在多罐系统的优选实施例中，泵(一个或多个)在整个发酵过程中持续运转。流量可以例如从10到20到200加仑每分钟。在特定实施例中，每隔5到10分钟在罐之间进行一次完整培养物交换。

有利地，本发明的系统可根据预期用途进行缩放。例如，罐的尺寸可以从几加仑到几万加仑。

在一个实施例中，本发明提供了使用本系统无污染培养微生物的方法。在某些实施例中，培养方法包括使用例如蠕动泵将包括水和营养成分的培养基添加至本系统中；用活微生物接种所述系统；并且将抗菌剂可选地添加至培养基。该抗菌剂可以是例如抗生素或槐糖脂。

在一个实施例中，本发明还提供了一种组合物，其包括至少一种类型的微生物和/或至少一种使用本发明的发酵系统生长的微生物产生的微生物代谢物。该组合物中的微生物可以是活性或非活性形式。该组合物还可以是干燥形式或液体形式。

有利地，本发明的方法和装备大规模地降低了生产微生物以及其代谢物的劳资成本。另外，本发明的培养过程降低或消除了培养完成后浓缩有机体的需要。本发明提供了一种培养方法，该方法不仅显著提高了每单位营养培养基的微生物产品产量，而且还简化了生产并促进了便携性。

便携性会导致显著的成本节约，因为基于微生物的组合物会在预期用途地点处或附近生产。这就意味着，如果需要，可使用本地来源的材料在现场制造最终的组合物，从而降低运输成本。另外，该组合物在施用时可包括活微生物，这样可提高产品效力。

因此，在某些实施例中，本发明的系统利用天然发生的本地微生物及其代谢副产物的能量。在以下环境中使用本地微生物群体是有利的，所述环境包括但不限于，环境修复(诸如在漏油状况下)、畜牧业、水产业、林业、牧场管理、草皮管理、园艺观赏生产、废物处置及处理、矿业、采油、以及人类健康，包括远程位置中的上述环境。

本发明生产的组合物还可以用于各种石油工业应用，诸如微生物强化采油。这些应用包括但不限于提高原油采收率；刺激油气井(以提高石油进入井孔的流量)；去除污染物和/或障碍物，如石蜡、沥青质以及来自杆、导管、衬套、罐和泵的积垢；防止油气生产和运输装备的腐蚀；降低原油和天然气中H₂S的浓度；降低原油粘度；将重质原油和沥青质升级为较轻的烃馏分；清洗罐、出油管和管道；通过选择性和非选择性堵塞，提高注水开采中石油的流动性；和压裂液。

在用于石油和天然气应用时，本发明的系统可用来降低基于微生物的油田组合物的成本并可与其它化学增强剂结合使用，所述化学增强剂如聚合物、溶剂、压裂砂珠、乳化剂、表面活性剂、以及本领域已知的材料。

附图说明

图1示出了根据本发明一个实施例的两罐系统。

图2示出了根据本发明一个实施例的两罐系统的侧视图，包括示例性罐测量。

具体实施方式

本发明提供了用于生产基于微生物的组合物的材料、方法和系统，所述组合物可用于石油和天然气工业、水产业、农业、人类健康、以及其它应用。更具体地说，本发明在优选实施例中提供了用于发酵基于酵母和/或其它基于微生物的组合物的生物反应器。

本发明的实施例还提供了新型的、廉价的发酵方法和系统。所述系统可用于培养酵母、真菌和细菌和/或它们的生长副产物。在某些实施例中，所述系统可被用于生产基于酵母的组合物，包括例如含有球拟假丝酵母、异常威克汉姆酵母、和/或蚜虫拟酵母的组合物。在某些实施例中，所述系统可被用于生产基于细菌的组合物，包括例如含有枯草芽孢杆菌和/或地衣芽孢杆菌的组合物。

在培养酵母的优选实施例中，生产的组合物可具有一个或多个以下有利的性能：作为酵母细胞壁一部分的高浓度甘露糖蛋白和β-葡聚糖；以及培养基中生物表面活性剂和其它微生物代谢物(例如，乳酸和乙醇等)的存在。

挑选的定义

如本文所用，“基于微生物的组合物”是指包含由微生物生长或其它细胞培养物生长产生的成分的组合物。因此，基于微生物的组合物可包括微生物本身和/或微生物生长的副产物。微生物可以是植物生长状态、孢子形式、菌丝体形式、任何其它形式的繁殖体、或其混合物。微生物可以是浮游的或者是生物膜形式，或两者的混合形式。生长副产物可以是，例如代谢物、细胞膜成分、表达蛋白、和/或其它细胞成分。微生物可以是完整的或溶解的。在优选实施例中，微生物和它们在其中生长的液体培养液，存在于基于微生物的组合物中。细胞可以以例如1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰、或1×10¹¹或每毫升组合物多个繁殖体的浓度存在。如本文所用，繁殖体是微生物的任何部分，新的和/或成熟的生物可以从微生物中发育，其包括但不限于细胞、孢子、菌丝体、芽和种子。

本发明进一步提供了“基于微生物的产品”，这些产品是将要被实际应用以达到预期结果的产品。该基于微生物的产品可以仅仅是从微生物培养过程收获的基于微生物的组合物。可选地，基于微生物的产品可包括已添加的更多的成分。这些额外成分可包括，例如，稳定剂、缓冲剂、合适的载体，如水、盐溶液、或任何其它合适的载体、支持进一步微生物生长的添加的营养物、非营养生长增强剂，例如植物激素、和/或有助于追踪微生物和/或其施用环境中的组合物的试剂。基于微生物的产品还可以包括基于微生物的组合物的混合物。基于微生物的产品还可以包括基于微生物的组合物的一种或多种成分，其已经以某种方式加工，诸如但不限于过滤、离心分离、溶解、干燥、纯化等。

如本文所用，“收获”指的是从生长器皿中移除基于微生物的组合物的一些或全部。

如本文所用，“生物膜”是微生物的复杂聚合，诸如细菌，其中细胞彼此粘附。生物膜中的细胞在生理上不同于同一有机体的浮游细胞，它们是可在液体培养液中漂浮或游泳的单细胞。

如本文所用，用于提及微生物产生的活性的术语“防治”延伸至杀死、致残或固定害虫或以其它方式使害虫基本上不能造成伤害的行为。

如本文所用，“单独的”或“纯化的”核酸分子、多核苷酸、多肽、蛋白质或诸如小分子(例如，下文将描述的小分子)的有机化合物基本上不含其它化合物，其它化合物诸如是微孔材料，可通过微孔材料与自然界关联。如本文所用，文中提及“单独的”微生物菌株指的是该菌株从其在自然界存在的环境中移除。因此，该单独菌株可作为例如生物纯培养物存在或作为与载体关联的孢子(或该菌株的其它形式)存在。

在某些实施例中，纯化化合物为目标化合物的至少60％重量(干重)。优选的，制备物为目标化合物重量的至少75％、更优选至少90％、最优选至少99％。例如，纯化化合物为占期望化合物重量的至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％、或100％(w/w)的化合物。纯度由任何恰当的标准方法测量，例如，柱色谱法、薄层色谱、或高效液相色谱(HPLC)分析。纯化的或单独的多核苷酸(核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA))没有其天然存在状态下位于其侧面的基因或序列。纯化的或单独的多肽没有其天然存在状态下位于其侧面的氨基酸或序列。

“代谢物”是指代谢产生的任何物质或参与特定代谢过程所必需的物质。代谢物可以是代谢的起始材料(例如，葡萄糖)、中间物(例如，乙酰辅酶A)、或终产物(例如，正丁醇)的有机化合物。代谢物的实例包括但不限于，酶、毒素、酸、溶剂、醇类、蛋白质、维生素、矿物、微量营养素、氨基酸、以及生物表面活性剂。

如本文所用，“表面活性剂”是指降低两种液体之间或液体和固体之间的表面张力(或界面张力)的化合物。表面活性剂用作洗涤剂、润湿剂、乳化剂、发泡剂、和发散剂。“生物表面活性剂”是由活的有机体产生的表面活性剂。

发酵系统设计和操作

在特定的实施例中，本发明的系统包括由导管彼此连接的至少两个罐。泵迫使微生物培养物通过导管从一个罐到另一个罐。在优选实施例中，该导管安装在罐的顶部或顶部附近。泵可以具有经由第一导管(或软管或管道)连接至第一罐的输入部和经由第二导管连接至第二罐的输出部。

可以包括一个或多个空气压缩机用于通风，并且每个空气压缩机可以可选地具有防止污染的空气过滤器。空气压缩机可被连接至一个或多个气体喷射器、起泡器、和/或喷射器。气体喷射器可位于例如任意和/或反应器的所有导管和/或罐中。起泡器和/或喷射器可位于例如任意和/或所有罐中。当培养物在导管中移动时，培养物会被由例如空气压缩机推入液流中的空气氧合。这样会混合并氧合培养物。

在罐底部附近，第三导管(或软管或管道)可以从第二罐连接至第一罐。第三导管允许液体在液体静压力下从第二罐流动至第一罐。该导管连接两个罐以平衡每个罐中的培养物水平。该导管可具有另外一个输入部以促进空气补给。因此，该导管可以提供额外的混合和通风。系统可包括第一泵输出部处的流量控制阀，其适于控制第一泵流量。该第一泵还可以使用变频电极进行控制以便通过电频率的变化适当调节流量。

两个罐顶部附近的导管优选在一个点处连接至每个罐，所述点在罐顶部的50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％、和1％。离两个罐底部更近的导管优选在一个点处连接至每个罐，所述点在罐底部的50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％、和1％。

系统的泵(一个或多个)的尺寸可适于建立例如30到0.10范围内的循环比(每小时泵送的体积/反应器液体的总体积)。泵可以是离心泵。系统可包括第一罐输入部和第二罐输出部处的一个或多个断流阀(或用来停止流动的通用阀)。软管可连接至第一泵(或连接至反应器的第二泵)以对反应器进行排放并将组合物泵送到预期用途的地点。喷嘴可位于软管的端部并适于喷射组合物。

在系统的优选实施例中，泵(一个或多个)在整个发酵过程中持续运转。流量可以例如从10到20到200加仑/分钟。在特定实施例中，每隔5到10分钟在罐之间进行一次完整培养物交换。

系统可包括例如任意和/或所有导管中和/或罐上的一个或多个观察镜，以视觉监测发酵过程。另外，任意和/或所有导管可具有防止回流的止回阀。

一个或多个通风孔(或减压阀(PSV))可位于任意和/或所有罐上。通风口或PSV可允许气体流出，但不允许空气流入(例如，阀可以在反应器内部气体压力上升至1.2atm以上时打开并且当内部气体压力下降至1.1atm以下时关闭)。

根据本发明使用的罐可以是用作工业用途的任意发酵罐或培养反应器。这些罐可以例如由玻璃、聚合物、金属、合金、以及其组合制成。罐的容积可以例如从5升到2,000升或更多。通常，容器的容积将从10到1,500升，并且优选从100到1,000升，并且更优选从250到750升、从300到600升、或从400到550升。

在微生物生长之前，罐可被消毒或灭菌。在一个实施例中，对发酵培养基、空气、以及在该方法和培养过程中使用的装备进行灭菌处理。培养装备如反应器/容器可与灭菌器件分离但是连接至该灭菌器件，例如高压灭菌器。培养装备还可以具有在接种开始之前就地灭菌的灭菌器件，例如，使用汽蒸器。空气可由本领域已知的方法进行灭菌。例如，环境空气可在增补进容器之前通过至少一个过滤器。在其它实施例中，培养基可进行巴斯消毒或可选地不添加任何热量，其中可以利用低活性水和低pH来控制细菌生长。

系统可用作间歇反应器(和持续反应器相对)。有利地，本发明的系统可根据预期用途进行缩放。对于小的应用，诸如例如生物修复，系统可以小至50加仑或更小。对于需要大容积的组合物的应用，诸如微生物强化采油，系统可放大至生产20,000或更多加仑的产品。

系统可包括温度控制器。系统可被绝缘，因此发酵过程可以在低温环境下保持适当的温度。本领域已知的任何绝缘材料都可以应用，包括玻璃纤维、二氧化硅气凝胶、陶瓷纤维绝缘体等。绝缘体可包围系统的任意和/或所有导管和/或罐。

系统还可以适于确保维持适当的发酵温度。例如，系统外部是可反射性的，以避免白天系统温度升高。另外，冷却系统可被添加，其包括例如一个或多个冷却套管和冷却热交换器。冷却水可与环境空气交换热量并通过冷却系统再循环。热交换器和/或冷却套管可包围或被安装在系统的任意和/或所有导管和/或罐的内部。对于极端环境，系统可包括反应器内的制冷和冷却线圈、围绕反应器的套管、或连接至导管的热交换器。

系统可使用电热器。然而，对于需要热量的较大的应用，可使用蒸汽或碳氢燃料。蒸汽输入部和/或蒸汽源可连接至一个或多个蒸汽喷射器、蒸汽套管、以及蒸汽热交换器。蒸汽套管可包围系统的任意和/或所有罐。蒸汽热交换器可以放置在反应器内部，蒸汽可在热交换器的导管内凝结，然后排出。蒸汽热交换器可以是不把水或蒸汽混合到反应器内的封闭系统。

在一个实施例中，罐具有功能控制器/传感器或可被连接至功能控制器/传感器以测量培养过程中的重要因素，诸如pH、氧、压力、温度、搅拌轴功率、湿度、粘度和/或微生物密度和/或代谢物浓度。

可包括温度计并且该温度计可以是手动的或自动的。温度计可优选放置在反应器的任意和/或所有罐上。自动温度计可恰当地管理热量和冷却源以在整个发酵过程中控制温度。在系统被输送至发酵地点之前，可现场编程或预编程所需温度。然后可以使用温度测量来自动控制上述加热和冷却系统。

pH调节可由自动方式完成或可手动完成。自动pH调节可包括pH探针和电子器件，以根据pH测量值适当地分配pH调节物质。pH探针优选放置在反应器的任意和/或所有罐上。pH可由用户设定到特定数字或可被预编程以在整个发酵过程中相应地改变pH。如果pH调节手动完成，系统中可包含本领域已知的pH测量工具以进行手动测试。

可使用测量并调节pH和温度的计算机系统为反应器的每个罐监测和控制发酵参数。计算机可连接至例如温度计和pH探针。除了检测和控制温度和pH之外，每个容器还可以具有检测和控制例如溶解氧、搅拌、发泡、微生物培养物纯度、所需代谢物的生产等的能力。系统可进一步适于远程检测这些参数，例如使用平板电脑、智能手机、或其它能够无线发送和接收数据的移动计算装置。

在另一个实施例中，罐还能够监测容器内部微生物的生长(例如，测量细胞数和生长期)。可选地，可从容器取出每日样品，并由本领域已知技术，例如稀释电镀计数，进行计数。稀释电镀是用来估算样品中细胞数的简单技术。该技术还可以提供可对不同环境和处理进行比较的指标。

在一个实施例中，发酵系统是移动或便携式生物反应器，其可用于微生物产品包括恰当量的期望微生物菌株的现场生产。因为微生物产品是在应用现场生成，不依赖于常规生产的细菌稳定化、保存、存储和运输过程，可以生成更高密度的活微生物，从而需要更小体积的微生物组合物以用于现场应用。这允许使用促进系统移动性和便携性的缩小的生物反应器(例如，更小的发酵罐、较少的供给起始材料、营养素、pH控制剂、以及消泡剂等)。

系统可包括支撑设备部件(包括罐、流动回路、泵等)的框架。系统可包括移动该设备的轮子，以及在操控设备时用于转向、推拉的把手。

系统可配置在一个或多个卡车拖车和/或半拖车的后面。也就是说，系统可被设计为轻便的(即，系统可适于在小货车、平板拖车、或半拖车上运输)。

微生物

根据本发明的系统和方法生长的微生物可以是例如细菌、酵母和/或真菌。这些微生物可以是天然的、或转基因的微生物。例如，微生物可以用特定基因转化以显示出特定的特征。微生物还可以是期望菌株的突变体。制作突变体的程序在微生物领域被熟知。例如，紫外线和亚硝基胍广泛用于此目的。

根据本发明生产的微生物及其生长产物可用于生产大量有用的产品，包括例如生物杀虫剂、生物表面活性剂、乙醇、营养化合物、治疗性蛋白质如胰岛素、可用作疫苗的化合物、以及其它生物聚合物。用作这些微生物工厂的微生物可以是天然的、突变的、或重组的。

在一个实施例中，微生物为酵母或真菌。适于根据本发明使用的酵母和真菌物种包括念珠菌、酵母(酿酒酵母、布拉氏酵母菌系列、圆酵母)、伊萨酵母(Issalchenkia)、克鲁维酵母、毕赤酵母、威克汉姆酵母(例如，异常威克汉姆酵母)、球拟酵母(例如，球拟假丝酵母)、菌根、被孢霉菌、须霉菌、布拉霉菌、破囊壶菌、腐霉菌、虫霉菌、出芽短梗霉菌、蚜虫拟酵母、镰孢霉菌、曲霉菌、木霉菌(瑞氏木霉菌、哈茨木霉菌、绿色木霉菌、钩状木霉菌)、根霉菌、菌根(例如球囊霉、无梗囊霉、泡囊丛枝菌根(VAM)、丛枝菌根(AM)、内生真菌(例如，梨形目))、嗜杀酵母的任意菌株、及其组合。

在一个实施例中，酵母为嗜杀酵母。如本文所用，“嗜杀酵母”指的是一种酵母菌株，其特征在于其毒性蛋白质或糖蛋白的分泌，菌株本身对毒性蛋白质或糖蛋白免疫。嗜杀酵母分泌的外毒素能够杀死酵母、真菌、或细菌的其它菌株。例如，可被嗜杀酵母防治的微生物包括镰胞菌和其它丝状真菌。根据本发明的嗜杀酵母的实例包括可以安全用于食物和例如啤酒、白酒、以及面包制作的发酵工业的嗜杀酵母；可用于防治可能污染该生产过程的其它微生物的嗜杀酵母；用于食物保存生物防除的嗜杀酵母；用于治疗人类和植物体内真菌感染的嗜杀酵母；以及可用在DNA重组技术中的嗜杀酵母。这样的酵母可包括但不限于威克汉姆酵母、毕赤酵母(例如异常毕赤酵母、季也蒙毕赤酵母、库德里阿兹威氏毕赤酵母)、汉逊酵母、酿酒酵母菌(Saccharomyces)、孢汉逊酵母(例如，葡萄有孢汉逊酵母)、玉米黑粉菌、汉逊德巴利酵母、念珠菌、隐球酵母、克鲁维酵母菌、球拟酵母、黑粉菌、拟威尔酵母、接合酵母属(例如，拜氏接合酵母)以及其它酵母。

在一个实施例中，微生物是嗜杀酵母，诸如选自异常毕赤酵母(异常威克汉姆酵母)、季也蒙毕赤酵母和库德里阿兹威氏毕赤酵母的毕赤酵母。特别地，异常毕赤酵母是各种溶剂、酶、嗜杀毒素以及槐糖脂生物表面活性剂的有效生产者。

在一个实施例中，微生物菌株选自球拟酵母分化体。根据本发明有用的球拟酵母微生物培养物、球拟假产酵母，可以从美国弗吉尼亚州20110-2209，马纳萨斯，10801大学街道，美国模式培养物集存库(ATCC)中获取。该保藏库已向寄存处指定了登记号ATCCNo.22214。

系统还可以利用能够增强采油和进行石蜡降解的酵母的一个或多个菌株，例如球拟假丝酵母(念珠菌)、丘陵假丝酵母(Candida apicola)、巴蒂斯塔念珠菌(Candidabatistae)、栖花念珠菌(Candida floricola)、河流念珠菌(Candida riodocensis)、星状念珠菌(Candida stellate)、钜念珠菌(Candida kuoi)、念珠菌种NRRL Y-27208、茂物红酵母(Rhodotorula bogoriensis)种、拟威克酵母、以及任何其它球拟酵母分化体的槐糖脂生产菌株。在特定实施例中，酵母菌株为ATCC 22214或其突变体。

在一个实施例中，微生物是蚜虫拟酵母菌株。该微生物是甘露糖赤藓糖醇脂生物表面活性剂的有效生产者。

在一个实施例中，微生物是细菌，其包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。这些细菌可以是但不限于例如芽孢杆菌(例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌、巨大芽胞杆菌、解淀粉芽孢杆菌)、梭菌(丁酸梭菌、酪丁酸梭菌、乙酰丁酸梭菌、NIPER 7梭菌，以及拜氏梭菌)、固氮菌(棕色固氮菌、绯红色固氮菌)、假单胞菌(绿针假单胞菌子物种、产金色菌种(克吕沃尔菌)、铜绿假单胞菌)、巴西固氮螺菌、富养罗尔斯通氏菌、深红红螺菌、鞘氨醇单胞菌(例如，少动鞘氨醇单胞菌)、链霉菌属(例如，灰色链霉菌、云杉链霉菌、可可链霉菌、金黄色链霉菌以及春日霉素)、链轮丝菌(例如，生裂链轮丝菌)、罗尔斯通氏菌属(例如，富养罗尔斯通氏菌)、红螺菌(例如，深红红螺菌)、黄单胞菌(例如，野生黄单胞菌)、欧文氏菌(例如，胡萝卜软腐欧文氏菌)、埃希氏菌(大肠埃希氏菌)、根瘤菌(例如，大豆根瘤菌、苜蓿根瘤菌、费氏中华根瘤菌、豆科三叶草根瘤菌、菜豆根瘤菌)、慢生根瘤菌(例如大豆慢生根瘤菌、山黄麻慢生根瘤菌)、节杆菌(例如，放射性细菌节杆菌)、氮单胞菌、德克斯氏菌、拜叶林克氏菌、诺卡氏菌、克雷白氏杆菌、棒形杆菌(如甘蔗宿根矮化病菌亚种和木质棍状杆菌犬齿亚种)、蓝细菌、泛生菌(例如，成团泛菌)、以及上述组合。

在一个实施例中，微生物是枯草芽孢杆菌的菌株，比如，枯草芽孢杆菌亚种位点B1或B2，它们是例如脂肽或其它生物表面活性剂以及生物聚合物的有效生产者。本说明书通过引用并入国际公开号WO 2017/044953 A1，其与本文公开的教导一致。在另一个实施例中，微生物是地衣芽孢杆菌菌株，其为生物表面活性剂以及生物聚合物如果聚糖的有效生产者。

在一个实施例中，微生物是假单胞菌的非致病性菌株。优选地，该菌株是鼠李糖脂生物表面活性剂的生产者。

可按照本发明使用包括例如能够累积大量的例如糖脂类-生物表面活性剂的菌株的其它微生物菌株。根据本发明可用的其它微生物副产物包括具有生物乳化和减小表面/界面张力性能的甘露糖蛋白、β-葡聚糖和其它代谢物。

在一个实施例中，单一类型的微生物在容器中生长。在替代实施例中，多种微生物可在单个容器中生长，其可以一起生长并且对生长或所得产物没有有害影响。可能同时有2到3种不同的微生物在单个容器中生长。

使用本发酵系统的培养方法

本发明提供了使用新的生物反应器有效生产微生物的方法和系统。即使预计淡水可以从本地来源提供并根据本方法灭菌，所述系统可包括所有发酵(或培养)过程必须的材料，包括例如装备、灭菌物料、以及培养基成分。

在一个实施例中，所述系统具有活微生物的接种物。优选地，微生物是生物化学生产微生物，其能够累积例如生物表面活性剂、酶、溶剂、生物聚合物、酸、和/或其它有用的代谢物。在特别优选的实施例中，微生物是生物化学生产酵母(包括嗜杀酵母)、真菌、和/或细菌，包括但不限于此处列出的这些。

在一个实施例中，系统设置有培养基。该培养基包括营养素源例如碳源、脂质源、氮源、和/或微量营养素源。所述碳源、脂质源、氮源、和/或微量营养素源的每一个可设置在单独的包装中，该包装可以在发酵过程中的适当时间添加至反应器。每个包装可包括若干可在发酵过程中的特定点(例如，在发酵时，pH和/或营养素水平升至或降至特定浓度以上或以下)或时间(例如，10小时、20小时、30小时、40小时等以后)添加的子包装。

发酵前，罐可被过氧化氢溶液(例如，2.0％到4.0％的过氧化氢；这可以在例如80-90℃的热水冲洗之前或之后)清洗以防止污染。另外，或可替换地，罐可用商业消毒剂、漂白剂和/或热说或蒸汽冲洗进行清洗。所述系统可以含有浓缩形式的漂白剂和过氧化氢，其随后可在使用前在发酵地点稀释。例如，过氧化氢可以以浓缩形式提供并稀释以配置2.0％到4.0％的过氧化氢(按重量或体积)，用于预冲洗净化。

在特定实施例中，培养方法包括在发酵前对本发酵反应器进行灭菌。反应器内表面(包括例如罐、端口、喷射器和混合系统)可首先用商业消毒剂清洗；接下来用2.0％到4.0％的过氧化氢，优选3％的过氧化氢进行雾化(或用高度弥散的喷雾系统进行喷雾)；并且最终用便携式汽蒸器在约105℃到约110℃或更高的温度进行汽蒸。

培养基成分(例如，碳源、水、脂质源、微量营养素等)还可以被灭菌。可使用温度净化和/或过氧化氢净化(可能紧接着使用诸如HCl、H₂SO₄等的酸进行中和)完成灭菌。

在特定实施例中，培养基中使用的水使用在线UV水灭菌器进行UV灭菌并使用例如0.1-微米滤水器进行过滤。在另一个实施例中，在发酵之前可对所有营养或其它培养基成分进行高压蒸汽处理。

为进一步防止污染，系统的培养基可包括在培养过程之前，和/或在培养过程中添加的额外的酸、抗生素、和/或抗菌剂。所述一个或多个抗生素物质可包括例如链霉素、氧四环素、槐糖脂、以及鼠李糖脂。

接种可在任一和/或所有反应器罐中进行，接种物通过导管系统在此进行混合。总的发酵时间范围在10到200小时，优选20到180小时。

本系统和方法中利用的发酵温度可以例如从25到40℃，即使过程可在该范围之外操作。在一个实施例中，培养微生物的方法可在约5℃到约100℃实施，优选15℃到60℃，更优选25到50℃。在另一个实施例中，培养可在恒温下连续实施。在另一个实施例中，培养可能会受到温度变化的影响。

培养基的pH应该适于目标微生物。缓冲盐和pH调节器，诸如碳酸盐和磷酸盐可用于将pH稳固在最优值附近。当存在高浓度金属离子时，有必要在液体培养基中使用络合剂。

在某些实施例中，微生物可在从约2.0到约10.0的pH范围内，并且更优选在从约3.0到约7.0的pH范围内发酵(适于基、酸、和缓冲器手动或自动调节pH；例如HCl、KOH、NaOH、H₂SO₄,、和/或H₃PO₄)。本发明还可以在该pH范围之外实施。

发酵可以在第一pH(例如4.0到4.5的pH)开始并且稍后改变成第二pH(例如3.2到3.5的pH)以进行剩余过程帮助避免污染以及生产其它期望产品(第一pH既可以高于也可以低于第二pH)。在某些实施例中，在完成期望的生物质累积之后例如从发酵开始之后0小时到200小时之后，更优选从12小时到120小时之后，更有选从24小时到72小时之后，pH从第一pH调整到第二pH。

在一个实施例中，培养基的湿度水平应当适于目标微生物。在另一个实施例中，该湿度水平的范围可从20％到90％、优选从30到80％、更优选从40到60％。

本发明的培养过程可以是无氧的、有氧的、或其组合。优选地，该过程是有氧过程，在发酵过程中将溶解氧浓度保持在10或15％饱和度以上，但是在某些实施例中在20％以内，或在某些实施例中在30％以内。

有利地，本系统提供生长培养物的便利氧化，例如用空气缓慢移动移除低含氧量的空气并补充氧化空气。氧化空气可以是定期补充如每天补充的环境空气。

此外，当在培养和发酵过程中生产气体时，还可以将消泡剂添加到系统中以防止泡沫的形成和/或累积。

在一个实施例中，在发酵后不需要对基于微生物的组合物进行进一步的处理(即，酵母、代谢物、以及剩余的碳源不需要和槐糖脂分离)。还可以使用本领域已知的各种化学制品和材料对最终产品的物理性能进行调整。

在一个实施例中，本系统中使用的培养基可含有微生物的补充营养素。通常，这些补充营养素包括碳源、蛋白质、脂肪、或脂类、氮源、微量营养素、和/或生长因子(例如，维生素、pH调节器)。对本领域技术人员显而易见的是，可以调节营养物浓度、水分含量、pH等以优化特定微生物的生长。

脂质源可包含植物或动物来源的油或脂肪，其含有游离脂肪酸或其盐或其酯，包括甘油三酯。脂肪酸的实例包括但不限于游离或酯化脂肪酸，该游离或酯化脂肪酸包括16到18个碳原子、疏水碳源、棕榈油、动物脂肪、椰子油、油酸、大豆油、向日葵油、菜籽油、硬脂酸和棕榈酸。

本系统的培养基可还包括碳源。碳源通常为碳水化合物，如葡萄糖、半乳糖，甘露糖，甘露糖醇，山梨糖，核糖和麦芽糖；有机酸，如乙酸，富马酸，柠檬酸，丙酸，苹果酸，丙二酸和丙酮酸；醇类如乙醇，丙醇，丁醇，戊醇，己醇，赤藓糖醇，异丁醇，木糖醇和甘油；油菜籽油，豆油，米糠油，橄榄油，玉米油，芝麻油和亚麻籽油等油脂；其它碳源可包括熊果苷，棉子糖，葡萄糖酸盐，柠檬酸盐，糖蜜，水解淀粉，马铃薯提取物，玉米糖浆和水解纤维素材料。上述碳源可以单独使用，也可以两种或两种以上组合使用。

在一个实施例中，系统的培养基中包括微生物的生长因子和微量营养素。这在微生物无法生产所有需要的维生素时尤为优选。无机营养素包括微量营养素，如铁，锌，钾，钙，铜，锰，钼和钴；磷，如磷酸盐；并且本系统的培养基中可包括其它刺激成分。此外，可以例如以面粉或膳食的形式如玉米粉，或以提取物的形式如酵母提取物、马铃薯提取物、牛肉提取物、大豆提取物、香蕉皮提取物等，或以纯化形式包括维生素、必需氨基酸和微量营养素的来源。还可以包括氨基酸诸如例如可用于蛋白质生物合成的氨基酸，例如L-丙氨酸。

在一个实施例中，还可以包括无机或矿物盐。无机盐可以例如是磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，磷酸氢二钠，硫酸镁，氯化镁，硫酸铁，氯化铁，硫酸锰，氯化锰，硫酸锌，氯化铅，硫酸铜，氯化钙，碳酸钙，碳酸钠。这些无机盐可以单独使用，也可以两种或两种以上组合使用。

本系统的培养基可还包括氮源。该氮源可以是例如无机形式如硝酸钾，硝酸铵，硫酸铵，磷酸铵，氨，尿素和氯化铵，或有机形式如蛋白质，氨基酸，酵母提取物，酵母自溶物，玉米蛋白胨，酪蛋白水解物，和大豆蛋白。这些氮源可以单独使用，也可以两种或两种以上组合使用。

微生物可以以浮游形式或作为生物膜生长。如果作为生物膜，容器内可具有基质，微生物可以在基质上以生物膜状态生长。所述系统还可以具有例如施加刺激(诸如剪应力)的能力，该刺激激励和/或改善生物膜生长特征。

基于微生物的产品的制备

本发明的基于微生物的产品包括含有该微生物和/或微生物生长副产物和可选的，生长培养基和/或额外成分诸如例如水、载体、助剂、营养素、粘度调节剂以及其它活性剂的产品。

本发明的一个基于微生物的产品仅仅是发酵培养基，其包含微生物和/或由该微生物生产的微生物生长副产物和/或任何残留营养素。无需提取或纯化，发酵的产品可直接使用。如果需要，可用本领域技术人员已知的标准提取方法或技术进行提取或纯化。

基于微生物的产品中的微生物可以是活性或钝性形式和/或以营养细胞、孢子、菌丝体、分生孢子和/或任何其它形式的微生物繁殖体存在。无需进一步稳固、保存和存储，基于微生物的产品可以直接使用。有利地，直接使用这些基于微生物的产品保留了微生物的高活力、减少了来自外来物质和不良物生物的污染，并维持了微生物生长的副产物的活性。

可以从生长容器移除由微生物生长生产的微生物和/或培养基，并通过例如管路转移以供立即使用。

在另一个实施例中，考虑到例如预期用途、预期施用方法、发酵罐的大小、以及从微生物生长设施到使用地点的任何运输方式，可以将组合物(微生物、培养基或微生物和培养基)放入适当大小的装载箱中。因此，放入基于微生物的组合物的装载箱可以例如从1加仑到1,000加仑或更大。在其它的实施例中，装载箱为2加仑、5加仑、25加仑或更大。

一经从生长容器中收获基于微生物的组合物，就可以添加其它的成分，因为收获的产品被放入装载箱和/或经管道输送(或以其它方式运输使用)。添加剂可以是例如缓冲器、载体、相同或不同设施生产的基于微生物的组合物、粘度调节剂、防腐剂、微生物生长营养素、植物生长营养素、追踪剂、杀虫剂、除草剂、动物饲料、食物产品和其它特定用途的成分。

有利地，按照本发明，基于微生物的产品可包括微生物生长的液体培养基。该产品可以例如至少为液体培养基重量的1％、5％、10％、25％、50％、75％、或100％。产品中生物质的量，可以是例如任何从0％到100％的重量，包括其间的所有百分比。

可替换地，产品可在使用前被存储。存储时间优选较短。因此，存储时间可少于60天、45天、30天、20天、15天、10天、7天、5天、3天、2天、1天、或12小时。在优选的实施例中，如果产品中存在活细胞，产品在低温储存诸如例如低于20℃、15℃、10℃、或5℃。另一方面，生物表面活性剂组合物通常可以在环境温度下储存。

本发明的基于微生物的产品可以是例如微生物接种剂、生物杀虫剂、营养素源、补救剂、保健品和/或生物表面活性剂。

在一个实施例中，培养过程之后获取的发酵产品(例如微生物和/或代谢物)通常具有很高的商业价值。相比缺乏微生物的产品，这些含有微生物的产品具有更多的营养成分。微生物可存在于培养系统、培养液体培养基和/或培养生物质中。培养液体培养基和/或生物质可被干燥(例如，喷雾干燥)以生产目标产品。

在一个实施例中，培养产品可被制备为喷雾干燥的生物质产品。该生物质可用已知方法如离心分离、过滤、分离、倾析、分离和倾析的组合、超滤或微滤进行分离。可进一步处理生物质培养产品以促进瘤胃旁路。生物质产品可从培养基中分离、进行喷雾干燥、并且可选地进行处理以调节瘤胃旁路，并作为营养源添加到饲料中。

在一个实施例中，培养产品可用作动物饲料或人类的食品补充剂。培养产品可富含至少一种或多种脂肪、脂肪酸、脂质如磷脂、维生素、必需氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、甾醇、酶和微量矿物质如铁、铜、锌、锰、钴、碘、硒、钼、镍、氟、钒、锡和硅。肽可含有至少一种必需氨基酸。

在另外的实施例中，必需氨基酸包封在用于培养反应器的改良微生物内部。该必需氨基酸包含在由微生物表达的异源多肽中。如果需要，异源多肽表达并存储在合适的微生物(例如，真菌)的包涵体中。

在一个实施例中，培养产品营养成分的含量高。因此，可以在完整的动物饲料中使用更高百分比的培养产品。在一个实施例中，饲料组合物包含改良的培养产品，其范围为饲料的15％至饲料的100％。

本发明进一步提供用于生产生物质(例如，活的微孔材料)、细胞外代谢物(例如，小分子和大分子)、和/或细胞内成分(例如，酶和其它蛋白质)的材料和方法。本发明的微生物和微生物生长副产物还可用于转化基质，如矿石，其中转化的基质为产品。

本发明进一步提供了基于微生物的产品、以及使用这些产品在很多环境中取得有益成果，这些环境包括例如改善的生物修复、矿业、以及石油和天然气生产；废物处置及处理；增强牲畜和其它动物的健康；通过应用一种或多种基于微生物的产品而增强植物的健康和生产力。

在特定实施例中，本发明的系统提供了基于科学的提高农业生产力的解决方案，其通过以下方式进行，例如促进农作物活力；提高农作物产量；增强植物免疫反应；增强对昆虫、害虫和疾病的抵抗力；防治昆虫、线虫、疾病和杂草；改善植物营养；改善农艺和林地和草场土壤的营养成分含量；以及促进改善的和更有效的用水。

在一个实施例中，本发明提供了将本文公开的组合物施加到土壤、种子或植株部分来改善植物健康和/或提高农作物产量的方法。在另一个实施例中，本发明提供了提高农作物或植物产量的方法，其包含多次施用本文描述的组合物。

有利地，该方法可以在提高产量并避免副作用和额外费用的同时，有效防治线虫，以及由害虫引起的相关疾病。

在另一个实施例中，用于生产微生物生长副产物的方法还包括浓缩和纯化目标副产物的步骤。

在一个实施例中，本发明进一步提供组合物，其包括所述微生物生产的至少一种类型的微生物和/或至少一种微生物生长副产物。组合物中的微生物可以是活性或钝性形式和/或以营养细胞、孢子、菌丝体、分生孢子和/或任何其它形式的微生物繁殖体存在。组合物可以包含或不包含微生物生长其中的生长基质。组合物也可以是干燥形式或液体形式。

在一个实施例中，组合物适合于农业。例如，该组合物可被用于处理土壤、植物和种子。该组合物还可以用作杀虫剂。

在一个实施例中，本发明根据本土需求进一步提供定制材料和方法。例如，培养微生物的方法可用于栽培位于本地土壤中或特定油井或污染地点处的微生物。在特定实施例中，本地土壤可被用作培养方法中的固体基质以提供本地生长环境。有利地，这些微生物可以是有益的并且更适应本土需求。

根据本发明的培养方法不仅大幅提高了每单位营养培养基中的微生物产品产量，也增强了生产操作的简便性。此外，培养过程可消除或降低最终发酵后对微生物进行浓缩的需求。

有利地，该方法不需要复杂装备或高能量消耗，并因此大幅度降低了生产微生物及其代谢物的劳资成本。

微生物生长副产物

本发明的方法和系统可用于生产有用的微生物生长副产物，诸如例如，生物表面活性剂、酶、酸、生物聚合物、溶剂、和/或其它微生物代谢物。在特定实施例中，生长副产物为生物表面活性剂。更具体地说，生长副产物可以是选自脂肽、槐糖脂(SLP)、鼠李糖脂(RLP)和甘露糖赤藓糖醇脂(MEL)的生物表面活性剂。

生物表面活性剂是由微生物生产的结构不同的一组表面活性物质。生物表面活性剂可生物降解并且可使用选定有机体在可再生基质上简易并廉价的生产。大部分生物表面活性剂生产的有机体响应于生长介质中烃源(例如，油、糖、甘油等)的存在而生产生物表面活性剂。其它介质成分如铁的浓度也可以显著影响生物表面活性剂的生产。例如，如果使用硝酸盐作为氮源而不是氨源，由细菌铜绿假单孢菌产生的RLP会增加。同样地，铁、镁、钠和钾的浓度；碳磷比；以及搅拌；可以极大地影响鼠李糖脂的生产。

所有的生物表面活性剂都是两亲物。它们由两部分组成：极性(亲水)部分和非极性(疏水)基团。由于其两亲结构，生物表面活性剂增加了疏水性不溶于水物质的表面积、增加了这些物质的水生物利用度、并且改变的细菌细胞表面的性能。

生物表面活性剂包括低分子量糖脂(例如，鼠李糖脂、槐糖脂、甘露糖基三醇脂质)，脂肽(例如，表面活性素)，黄素脂，磷脂和高分子量聚合物，例如脂蛋白、脂多糖-蛋白质复合物和多糖-蛋白质-脂肪酸复合物。生物表面活性剂分子的常见亲脂部分是脂肪酸的烃链，而亲水部分，在黄素脂的情况下，由中性脂质的酯或醇基团、脂肪酸或氨基酸(或肽)的羧酸盐基团、有机酸形成，或在糖脂的情况下，由碳水化合物形成。

微生物生物表面活性剂由诸如细菌、真菌和酵母的各种微生物生产。示例性生物表面活性剂生产的微生物包括假单孢菌种类(铜绿假单胞菌、恶臭假单孢菌、荧光假单孢菌、脆弱假单孢菌、丁香假单孢菌)；黄杆菌属种类；芽孢杆菌种类(枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌)；威克汉姆酵母种类；念珠菌种(白色念珠菌、褶皱假丝酵母、热带念珠菌、解脂假丝酵母、白色球拟酵母)；红球霉属种类；节杆细菌种类；弯曲杆菌种类；棒形杆菌种类；毕赤酵母种类；球拟酵母种类；等等。生物表明活性剂可由本领域已知的发酵过程获取。

根据本发明可使用其它微生物菌株，包括，例如可以累积大量例如糖脂-生物表明活性剂的其它真菌菌株，和/或可以累积大量例如脂肽的细菌菌株。根据本发明的其它可用代谢物包括具有生物乳化和降低表面/界面张力性能的甘露糖蛋白、β-葡聚糖和其它生化药剂。

在本发明的一个实施例中，本系统生产的生物表面活性剂包括脂肽和糖脂，诸如鼠李糖脂(RLP)、槐糖脂(SLP)、海藻糖脂或甘露糖赤藓糖醇脂(MEL)。在特定实施例中，本系统用于大规模生产SLP和/或MEL。

槐糖脂是由例如各种球拟酵母分化体的酵母生产的糖脂类生物表面活性剂。在审查过的球拟酵母分化体的酵母中，已报道槐糖脂的最大产量来自念珠菌apicola和球拟假丝酵母。SLP由与长链羟基脂肪酸连接的二糖槐糖组成。这些SLP是部分乙酰化的2-O-β-D-吡喃葡萄糖基-D-吡喃葡萄糖单元，其连接β-葡萄糖苷酸到17-L-羟基十八烷酸或17-L-羟基-Δ9-十八碳烯酸。羟基脂肪酸通常为16或18个碳原子，并可含有一个或多个不饱和键。脂肪酸羧基可以是游离的(酸性或开放形式)或在4″位(内酯形式)内部酯化。

甘露糖赤藓糖醇脂质是由各种酵母和真菌菌株生产的糖脂类生物表面活性剂。有效的MEL生产主要限于假酶类，在每个物种产生的MEL结构中具有显著的可变性。MEL含有作为其糖部分或亲水单元的4-O-b-D-吡喃甘露糖基-赤藓糖醇。根据甘露吡喃糖基中C-4'和C-6'位置的乙酰化程度，MEL分类为MEL-A，MEL-B，MEL-C和MEL-D。MEL-A代表二乙酰化化合物，而MEL-B和MEL-C分别在C-6'和C-4'单乙酰化。完全脱乙酰化的结构归因于MEL-D。在南极酵母之外，已显示最近分离的菌株，甘蔗黑穗病菌，具有来自甘蔗汁的丰富的MEL-B产出。MEL作为有效的局部保湿剂，可以修复受损的头发。此外，已显示这些化合物具有保护和愈合活性，可激活纤维母细胞和乳头细胞，并起到天然抗氧化剂的作用。

由于SLP和MEL的结构和组成，这些生物表面活性剂具有极好的降低表面和界面张力的性能，以及其它有益的生化特性，可用于如大规模工业和农业用途等应用，以及其它领域，包括但不限于化妆品，日用品以及健康，医疗和制药领域。

生物表面活性剂在界面处积聚，因此降低了界面张力并导致在溶液中形成聚集的微孔结构。安全有效的微生物生物表面活性剂可降低液体、固体和气体分子之间的表面和界面张力。生物表面活性剂具有形成孔并使生物膜不稳定的能力，这使得它们可以用作抗细菌剂，抗真菌剂和溶血剂。结合低毒性和生物降解性的特征，生物表面活性剂有利于在石油和天然气工业中用于各种石油工业应用，例如微生物强化油采收。这些应用包括但不限于从含油地层中提高原油采收率；刺激油气井(改善油井进入井孔的流量)；从杆，导管，衬套，罐和泵等装备中去除污染物和/或障碍物，如石蜡、沥青质和积垢；防止石油天然气生产和运输装备的腐蚀；降低原油和天然气中的硫化氢浓度；降低原油粘度；将重质原油和沥青质升级为较轻的烃馏分；清洗罐、出油管和管道；通过选择性和非选择性堵塞提高水驱油的流动性；和压裂液。

当在石油天然气应用中使用时，本发明的系统可用于降低基于微生物的油田成分的成本并且可以和其它化学增强剂如聚合物、溶剂、压裂砂珠以及玻璃粉、乳化剂、表面活性剂、以及其它本领域已知的材料一起使用。

根据本发明生产的生物表面活性剂可用作其它非油回收目的，包括例如清洗管道、反应器、和其它机器或表面，以及例如当应用于植物和/或它们周围的环境时防治害虫。根据本发明生产的一些生物表面活性剂可用于防治害虫，因为它们能够穿透害虫组织并且在不使用助剂的情况下低量使用有效。已经发现，在高于临界胶束浓度的浓度下，生物表面活性剂能够更有效地渗透到处理过的物体中。

可使用生产生物表面活性剂的有机体作为生物防除剂或由生物表面活性剂本身来防治害虫。另外，使用特定基底来支持生产生物表面活性剂的有机体的生长并生产生物表面活性剂杀虫剂，以此来实现害虫防治。有利地，天然生物表面活性剂能够抑制竞争有机体的生长并增强特定生物表面活性剂生产的有机体的生长。

此外，这些生物表面活性剂可在治疗动物和人类疾病方面起到重要作用。动物可以通过例如在生物表面活性剂溶液中单独浸渍或浸泡，溶液中含或不含微生物细胞团，和/或在其它化合物如铜或锌的存在下进行治疗。

由于使用完整的细胞培养物，根据本发明生产的组合物具有优于单独的生命表面活性剂的优点，包括：作为酵母细胞壁外表面的一部分的高浓度的甘露糖蛋白(甘露糖蛋白是能够达到高达80％乳化指数的高效生物乳化剂)；酵母细胞壁中存在生物聚合物β-葡聚糖(乳化剂)；培养物中存在槐糖脂，这是一种能够降低表面和界面张力的强效生物表面活性剂；在培养物中存在代谢物(例如乳酸，乙醇等)。在许多其它用途中，这些组合物可用作生物表面活性剂并且可具有降低表面/界面张力的性能。

根据先前技术的微生物生物表面活性剂的培养是复杂的、耗资耗时的过程，其需要很多阶段。本发明提供了简化和降低该过程成本的装备、设备、方法和系统。本发明还提供了新的组合物和这些组合物的用途。

实施例

从以下通过举例说明给出的实施例可以更好地理解本发明及其许多优点。以下实施例说明了本发明的一些方法、应用、实施方案和变体。它们不被认为是对本发明的限制。可以对本发明进行许多改变和修改。

实施例1-多罐发酵系统

图1和图2示出了便携式和可分配的塑料反应器。反应器具有两个塑料方形罐，其具有用来在两个罐之间进行质量交换的两个环路。

系统的顶部装备有从第一罐拉出并存储到第二罐的泵送机构，这是环路中的一个。另一个环路在罐的底部并且依靠液体静压力均衡罐内的容积。

将过滤空气添加至罐由通过起泡器运行的喷洒机构控制。用于喷射的过滤空气经由高容量水生泵送系统产生。每个罐有两个72英寸的起泡器，因此每个系统中总共有四个该起泡器。还使用空气压缩机将过滤空气添加至顶部和底部环路中以进行额外的通风。

顶部环路装备有观察玻璃以观察培养物的浊度、颜色、厚度和其它特征。反应器具有750-850L的工作容量以生长细胞的球拟酵母酵母和代谢物产物(然而，大小和规模可根据所需应用而变化)。该反应器特别适用于小规模或大规模地生产球拟酵母分化体酵母。

为进一步降低培养物生产成本并确保技术的可扩展性，系统未使用传统方法进行灭菌。相反，使用空容器卫生方法灭菌，包括用2-3％过氧化氢处理内表面并用漂白剂和高压热水冲洗。另外，为减少污染的可能性，用于制备培养物的水通过0.1-微米过滤器过滤。

培养基成分在85-90℃下进行温度净化或溶解在3％过氧化氢中(干燥成分和H₂O的比为1:3v/v)，除油之外，油仅经过温度净化。

发酵温度通常应该在约23到37℃之间，并且优选在约25到30℃之间。

pH应该从3到5，并且优选在约3.5到约4.5之间。另外，为了进一步降低污染的可能性，培养过程在pH 4.0-4.5下开始，然后在3.2-3.5的平均pH下进一步进行。

在这些培养条件下，经过约60到120小时的发酵完成了工业上有用的生物质、槐糖脂和其它代谢物的生产。发酵完成后，培养物接下来可用于各种工业目的。

实施例2-培养基及其在多罐反应器中用于球拟酵母培养

在过滤水中制备培养基，该培养基由以下成分组成：20-100gL^-1葡萄糖、0-50gL^-1(其例如根据待生产的期望量的生物表面活性剂可变化)菜籽油、5gL^-1酵母提取物、4gL^{- 1}NH₄Cl、1gL^-1KH₂PO₄.H₂O、0.1gL^-1NaCl和0.5gL^-1MgSO₄.7H₂O。

用6N KOH将初始pH调节至约4.5。培养物在约25℃生长。培养时间长达120小时，每天两次通过加入1.0M NaOH将反应器培养物的pH调节至约3.5。

在这些培养条件下，球拟酵母湿生物质达到每升培养物100克。

实施例3-使用抗生素制备菌种培养物

以下是根据本发明制备按比例放大的基于微生物的产品的方法的一个示例。可以制备菌种培养物，然后按比例放大以用于本系统。放大可以在单独的容器中进行，例如，通过将试剂添加到圆筒式混合器中，并使培养物生长2天或更多天。在菌种培养物在混合器中生长至少2天后，可将培养物分成适当数量的部分用于接种许多反应器系统。

培养基成分

试剂	重量(g/L)
		酵母提取物	5
葡萄糖	100
		尿素	1
链霉素(抗生素)	0.1
		氧四环素(抗生素)	0.01

摇晃烧瓶

在4L烧瓶中制备两升不含抗生素的培养基组合物。然后将烧瓶准备好进行高压灭菌。使用橡皮筋将一块纱布，随后是一片蓝色高压灭菌纸固定到烧瓶的边缘(纱布和蓝纸必须足够大，以使布和纸延伸到橡皮筋将它们固定到边缘的位置之外)。高压灭菌循环在121℃下进行20分钟，然后让烧瓶冷却至30℃或更低。

接下来，称量抗生素并用去离子水在烧杯或50mL圆锥管中将其溶解。琼脂平板用假丝酵母或球拟假丝酵母标记。从具有环路(一个或两个环路应该足够)的板中选择单菌落，实施无菌技术，并且在实验室防护罩下接种烧瓶。还将溶解的抗生素加入烧瓶中。当在防护罩下取下并更换纱布和高压灭菌蓝纸时，要注意不要接触暴露在烧瓶内部的纱布的底部。

4L烧瓶在接种后被置于发酵室中的振荡器中。振荡器的温度设定为30℃。在使用菌种培养物之前使烧瓶发酵至少2天。使用前在防护罩下取出菌种培养物接种物的样品以确保接种物是纯的并且没有污染。使用简单的革兰氏染色制备样品的载玻片。

使用圆筒式混合器进行放大

在使菌种培养物生长2天后，将其在黑色圆筒式混合器中放大以接种反应器。称出用于40L批量的上述试剂的干燥成分。称出抗生素并将其保存在单独的装载箱中。

培养基成分在40L的酸瓶(carboy)中溶解，确保体积不超过40L的水平。将40L培养基加入混合器中，随后加入来自振荡器的2L接种物和适量的溶解的抗生素。然后在部分被转移出反应器之前，使培养物在混合器中生长至少2天。分配到每个隔室的培养物的量取决于生产了多少升培养物和待启动的隔室数量。分给每个反应器至少10L培养物。

根据每个反应器需要的培养物的体积，在20L或40L的酸瓶中使用回转泵收获按比例放大的培养物。然后用相同的回转泵将培养物转移出酸瓶并接种反应器。

清洗圆筒式混合器

在从圆筒式混合器收获出所有培养物之后，该混合器移至用热水冲洗过的排放部，注意除去任何生物膜。在彻底冲洗后，用70％IPA对反应器进行灭菌。使混合器干燥，并且当没有剩余IPA残留物时，可以开始另一批菌种培养物。

实施例3-使用含有抗生素的培养基操作多罐反应器

培养基

试剂	重量(g/L)
		尿素	1
酵母提取物	5
		葡萄糖	60
菜籽油	70ml/L
		链霉素(抗生素)	0.1
氧四环素(抗生素)	0.01

制备多罐反应器

双罐反应器的总体积是750L，因此确定并称出上述试剂的适当量。使用过滤水将干燥成分溶解在桶中。在溶解步骤中不加入菜籽油。将抗生素分开，并在大烧杯中溶解于去离子水中。

接下来，将溶解的培养基加入反应器。用过滤水将反应器填充至约总量185加仑，随后加入菜籽油。每罐的最终体积为100加仑，因此总计等于200加仑。

初始温度至少为23℃但不高于30℃。一旦温度建立在23到30℃的范围内，就从混合器加入接种物，随后加入溶解的抗生素。取样以测量pH和DO％。使培养物至少生长约3天，每天至少监测一次pH、温度和DO％。一旦储藏柜准备好进行收获，就取样测量pH。

制备载玻片，制备连续稀释板，并进行OD测量以进行质量控制/保证。还测量DO和温度。一旦确保了培养物的质量，使用底部环路处的凸轮锁紧装置和配备有两组软管的输送泵来收获培养物。

如果培养物批量的质量没有匹配好以供使用，在反应器两罐之间倒入半瓶漂白剂，停留20分钟，然后被排出。

清洗反应器

首先，将反应器罐冲洗干净。将反应器从壁上拔下，关闭两个底部球阀，并且断开凸轮锁紧装置以移除底部环路装置。注意在底部环路时不要洒出太多的培养基。移除环路后，使用托盘车(palate jack)将反应器转移到保藏库的排放部中。

然后移除顶部环路并用热水冲洗底部环路组件。如果这些环路或其组件极度肮脏，使用消毒剂对其进行彻底清洗。接下来，用热水和保藏库中的靠近排放部的软管上的喷嘴将罐冲洗干净。移除罐内的任何膜时需要小心。

接下来，用3％过氧化氢(H₂O₂)将罐内部雾化至少3-5分钟。这一步穿上PPE至关重要。

注意：如果考虑到污染，则将反应器转移回其运行位置，并且罐中装满0.5％过氧化氢溶液。反应器的总体积约为1100L，因此需要约55L的10％过氧化氢。重新组装底部环路并打开器件。允许反应器至少用4小时用0.5％过氧化氢彻底清洗自身。2小时过去后，该器件就会关闭。底部回路球阀被关闭，并且底部环路断开。使用托盘车将器件转移至排放部进行排放。

然后用过滤(优选热的)水彻底冲洗反应器，并准备开始另一批量。

实施例4-石蜡液化

进行实验以显示球拟酵母培养物对石蜡液化的功效。实验结果如图2所示，培养物结果标记为“Star3”。

研究了二十一(21)种微生物和化学乳化产物(包括商品)的石蜡降解功效。实验中使用五十(50)mL工作体积为25mL的福尔肯管。从油田获取固体石蜡。称量四(4.0)克固体石蜡然后加入每个福尔肯管中，并将表1中的20mL的每种液体加入到福尔肯管中。然后将所有福尔肯管水平放置在30℃至40℃的ENVIRO GENE培养箱中并轻轻混合。在不同的孵育时间(1、2或4天)后，收集并分析导管。

在不同接种时间和不同温度下进行三(3)组实验。第一组实验在30℃进行。在该组实验中，“Star3”包括具有约4g/L槐糖脂(其大致为饱和度水平)的球拟假丝酵母。“Star3”处理显示在导管内完全扩散，并且是完全将石蜡转化为液体的唯一添加剂，然而石蜡在所有其它测试(包括商业Naxan)中保持固体形式。这一概念验证实验表明，球拟酵母培养物对石蜡的液化非常有效，甚至优于其它市场上可买到的化学品和生物制品。

Claims (29)

1.一种用于生产基于微生物的组合物的系统，所述系统包括：

反应器，其包括第一罐和第二罐；

泵，其具有通过第一管连接至第一罐的输入部，以及通过第二管连接至第二罐的输出部；

第三管，其从第二罐连接至第一罐，其中所述第三管适于允许液体在液体静压力下从第二罐流至第一罐。

2.根据权利要求1所述的系统，其还包括一个或多个鼓风机或空气压缩机，其中所述一个或多个鼓风机或压缩机连接至一个或多个气体喷射器、起泡器、和/或喷洒器。

3.根据权利要求1所述的系统，其中反应器的工作容积为10到40,000加仑。

4.根据权利要求1所述的系统，其还包括用于支撑系统部件的框架。

5.根据权利要求1所述的系统，其还包括用于操纵所述系统的轮子和把手。

6.根据权利要求1所述的系统，其中所述系统配置在卡车拖车和/或半拖车的背面，和/或其中所述系统是便携式的。

7.根据权利要求1所述的系统，其中所述一个或多个泵能够建立30到0.1、或高达200加仑每分钟的循环比。

8.一种用于培养无污染微生物的方法，其中所述方法包括：

将包括水和营养成分的培养基添加至使用蠕动泵的权利要求1的系统中；

用活微生物接种所述系统；且

将抗菌剂可选地添加至所述系统。

9.根据权利要求8所述的方法，其中微生物为酵母。

10.根据权利要求9所述的方法，其中微生物为球拟假丝酵母。

11.根据权利要求9所述的方法，其中微生物为蚜虫拟酵母。

12.根据权利要求8所述的方法，其中在培养微生物之前对权利要求1所述的系统进行灭菌。

13.根据权利要求12所述的方法，其中灭菌包括：

用商业消毒剂清洗反应器的内表面；

用3％过氧化氢溶液雾化反应器内部；以及

用温度105℃到110℃的水对反应器内部进行汽蒸。

14.根据权利要求8所述的方法，其中培养基在被添加至系统之前被净化。

15.根据权利要求14所述的方法，其中净化通过以下途径完成：

对培养基成分进行高压灭菌；

使用0.1-微米滤水器对水进行过滤；以及

对水进行UV灭菌。

16.根据权利要求8所述的方法，其中营养成分包括一个或多个碳水化合物源、一个或多个脂质源、一个或多个矿物盐、一个或多个微量营养素源、以及一个或多个氮源。

17.根据权利要求8所述的方法，其中抗菌剂为抗生素或纯净形态的槐糖脂。

18.一种包括微生物和/或所述微生物生长的一个或多个产物的组合物。

19.根据权利要求18所述的组合物，其中微生物为酵母。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中微生物为球拟假丝酵母。

21.根据权利要求19所述的组合物，其中微生物为蚜虫拟酵母。

22.根据权利要求20所述的组合物，其中生长副产物为生物表面活性剂。

23.根据权利要求22所述的组合物，其中生物表面活性剂为槐糖脂。

24.根据权利要求22所述的组合物，其中生物表面活性剂为甘露糖赤藓糖醇脂。

25.一种用于增加从含油地层可回收的油量的方法，其中所述方法包括将权利要求18所述的组合物应用到所述含油地层。

26.一种用于清洗油井杆、导管和/或套管的方法，其中所述方法包括将权利要求18所述的组合物应用于所述油井杆、导管和/或套管。

27.一种用于促进植物生长、产量、和/或健康的方法，其中所述方法包括将权利要求18所述的组合物应用于所述植物或所述植物的环境。

28.一种防治动物害虫的方法，其中所述方法包括用权利要求18所述的组合物接触害虫。

29.一种饲养动物的方法，其中所述方法包括将权利要求18所述的组合物添加至所述动物的食物和/或饮用水源中。