BR112020014469A2 - materiais e métodos para tratamento de infecções bacterianas em plantas - Google Patents

Abstract

São fornecidas composições e métodos para aumentar a imunidade, saúde, crescimento e produtividade das plantas. Em particular, a presente invenção se refere ao tratamento e/ou prevenção de infecções bacterianas patogênicas de plantas usando micróbios e/ou seus subprodutos de crescimento. Especificamente, a presente invenção pode ser usada para tratar e/ou prevenir a doença de esverdeamento cítrico e a doença do cancro de plantas cítricas. Em certas modalidades, os subprodutos do crescimento são biotensoativos e/ou enzimas.

Description

MATERIAIS E MÉTODOS PARA TRATAMENTO DE INFECÇÕES BACTERIANAS EM PLANTAS REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001]Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório norte-americano, número de série 62/617.422, depositado em 15 de janeiro de 2018, que é incorporado aqui por referência na sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002]No setor agrícola, certos problemas comuns continuam a prejudicar a capacidade dos agricultores de maximizar o rendimento da produção, mantendo os custos baixos. Isso inclui, entre outras, infecções e infestações causadas por bactérias, fungos e outras pragas e patógenos; os altos custos de fertilizantes e herbicidas químicos, incluindo seus impactos ambientais e à saúde; e a dificuldade das plantas em absorver eficientemente nutrientes e água de diferentes tipos de solo.

[0003]Na produção de plantas cítricas, a infecção generalizada de plantas cítricas por patógenos como a doença de esverdeamento cítrico e a doença do cancro cítrico levou a dificuldades significativas para os cultivadores de plantas cítricas. Tanto quanto culturas inteiras foram perdidas por essas infecções bacterianas, elevando a um declínio na produção e aumento no preço de produtos cítricos em todo o mundo.

[0004]A doença de esverdeamento cítrico, também conhecida como Huanglongbing (HLB) ou doença do dragão amarelo, é uma infecção incurável causada pela bactéria Gram-negativa Candidatus Liberibacter asiaticus. Esta doença causou devastação em milhões de acres de culturas cítricas nos Estados Unidos da América e em outras partes do mundo. A doença é transmitida por um inseto infectado pela doença, o psilídeo cítrico asiático, e coloca em risco o futuro das plantas cítricas da América. As árvores infectadas produzem frutas verdes, deformadas e amargas, o que as torna inadequadas para venda como frutas frescas ou suco. A maioria das árvores infectadas morre dentro de alguns anos, pois a doença é incurável.

[0005]A doença do cancro cítrico é causada pela bactéria Gram-negativa Xanthomonas axonopodis. Uma infecção que causa lesões nas folhas, caules e frutos de árvores cítricas. Esta doença não é prejudicial aos seres humanos, mas pode ter efeitos significativos na vitalidade e capacidade de produção de pomares de plantas cítricas inteiros. A doença faz com que as folhas e os frutos caiam prematuramente e, embora seja seguro comer, geralmente não será vendido devido à sua aparência desagradável.

[0006]Os produtores têm contado bastante com o uso de produtos químicos sintéticos e fertilizantes químicos para aumentar o rendimento das culturas e proteger as culturas da seca e das doenças. No entanto, quando usadas em excesso ou aplicadas de maneira inadequada, essas substâncias podem escorrer para as águas superficiais, penetrar nas águas subterrâneas e evaporar no ar. Como fontes de poluição do ar e da água, o uso responsável dessas substâncias é um imperativo ecológico e comercial. Mesmo quando usado adequadamente, o excesso de dependência e o uso a longo prazo de certos fertilizantes químicos, pesticidas e antibióticos alteram de maneira prejudicial os ecossistemas do solo, reduzem a tolerância ao estresse, aumentam a resistência a pragas e impedem o crescimento e a vitalidade das plantas.

[0007]Além disso, antibióticos como a oxitetraciclina e a estreptomicina foram aprovados para uso em culturas cítricas, por exemplo, na Flórida, que foi particularmente afetada pelos efeitos da doença de esverdeamento cítrico. Esses antibióticos podem tratar a doença, ou seja, reduzir os sintomas, mas não são uma cura. Eles já foram usados nas fazendas de maçã e pêra do país, mas a quantidade que é necessária para lidar com a safra de laranja da Flórida muito grande é muito maior do que a de outras culturas. O uso de antibióticos em quantidades tão grandes é preocupante para alguns que acreditam que essas substâncias se infiltrarão em produtos de frutas cultivados para consumo e/ou contribuirão para a resistência a antibióticos.

[0008]Para atender às necessidades globais de métodos sustentáveis de produção de alimentos e consumíveis, micróbios como bactérias, leveduras e fungos, bem como seus subprodutos, estão se tornando cada vez mais úteis em muitos contextos, incluindo agricultura e horticultura, pecuária, silvicultura e remediação de solos, águas e outros recursos naturais. Por exemplo, os agricultores estão adotando o uso de agentes biológicos, como micróbios vivos, produtos biológicos derivados desses micróbios e combinações dos mesmos, como biopesticidas e biofertilizantes. Em particular, os biotensoativos produzidos por micro-organismos são agentes especialmente úteis em aplicações agrícolas.

[0009]Esses agentes biológicos têm vantagens importantes sobre outros pesticidas e fertilizantes convencionais. As vantagens incluem: 1) são menos prejudiciais em comparação com produtos químicos convencionais; 2) são mais eficientes e específicos; 3) frequentemente se biodegradam rapidamente, elevando a menos poluição ambiental. Os custos econômicos e os impactos adversos à saúde e ao meio ambiente dos métodos atuais de produção agrícola continuam a onerar a sustentabilidade e os esforços de produzir alimentos e outros produtos de consumo à base de culturas.

[00010]Assim, há uma necessidade contínua de métodos aprimorados, não tóxicos e ecológicos para melhorar a produção agrícola a baixo custo. Em particular, há uma necessidade de produtos para combater certas infecções bacterianas patogênicas e generalizadas em plantas cítricas, como o esverdeamento e o cancro cítrico, tudo isso sem comprometer o ambiente em que são usados ou os seres vivos que os produzem e consomem.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00011]A presente invenção fornece micróbios, bem como subprodutos de seu crescimento, como biotensoativos. A presente invenção também fornece métodos de uso desses micróbios e seus subprodutos, bem como métodos e sistemas para produzi-los. Vantajosamente, os produtos e métodos à base de micróbios da presente invenção são ecológicos e econômicos.

[00012]Em modalidades preferidas, a presente invenção fornece composições pesticidas e métodos para seu uso. Vantajosamente, as composições pesticidas podem aumentar a imunidade, a saúde, o crescimento e o rendimento geral das plantas cultivadas, por exemplo, prevenindo e/ou tratando uma infecção bacteriana.

[00013]Especificamente, a presente invenção fornece tratamento e/ou prevenção de patógenos bacterianos que infectam culturas cítricas, tais como, por exemplo, Candidatus Liberibacter asiaticus (doença de esverdeamento cítrico) e Xanthomonas axonopodis (doença de cancro cítrico). Vantajosamente, a presente invenção reduz significativamente a concentração de antibióticos necessários para esse tratamento.

[00014]Em uma modalidade, a presente invenção fornece composição pesticida compreendendo um ou mais micro- organismos benéficos e/ou subprodutos do crescimento microbiano. Também são fornecidos métodos de cultivo da composição pesticida. De preferência, a composição pesticida é formulada para ser adequada para aplicação na folhagem e/ou fruto de plantas cítricas.

[00015]A composição pode compreender, por exemplo, os um ou mais micro-organismos benéficos, juntamente com quaisquer produtos de fermentação. Em algumas modalidades, os subprodutos incluem subprodutos de crescimento microbiano, incluindo, por exemplo, biotensoativos, enzimas e/ou outros metabólitos.

[00016]Em uma modalidade, a composição pesticida controla bactérias patogênicas de plantas. Em uma modalidade, a composição pesticida controla pragas que podem atuar como vetores ou veículos para bactérias patogênicas, como insetos.

[00017]Em certas modalidades, a presente invenção utiliza um micro-organismo produtor de bioquímico que é tolerante aos antibióticos. Em uma modalidade, o micro- organismo benéfico é uma levedura, como, por exemplo, Starmerella bombicola, Wickerhamomyces anomalus, Pseudozyma aphidis ou Pichia spp.

[00018]Em algumas modalidades, o micro-organismo benéfico é uma bactéria não patogênica para as plantas, como, por exemplo, Bacillus amyloliquefaciens, Pseudomonas chlororaphis ou Rhodococcus erythropolis.

[00019]Esses micróbios produzem subprodutos do crescimento que são ativos contra, por exemplo, pragas de bactérias, insetos e/ou nemátodos.

[00020]Em algumas modalidades, o subproduto de crescimento da composição em questão é um biotensoativo. Os biotensoativos de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, glicolipídios de baixo peso molecular, lipídios de celobiose, lipopeptídeos, flavolipídios, fosfolipídios e polímeros de alto peso molecular, como lipoproteínas, complexos de lipopolissacarídeos e proteínas e/ou complexos de polissacarídeos, proteínas e ácidos graxos.

[00021]Em uma modalidade, o biotensoativo é um glicolipídio, como, por exemplo, soforolipídios (SLP), lipídios de trealose ou lipídios de manosileritritol (MEL). Em uma modalidade, o biotensoativo é um lipopeptídeo, tal como surfactina, liquenisina ou atrofactina.

[00022]Em algumas modalidades, o subproduto do crescimento é uma enzima, como uma amilase, uma enzima hidrolítica e/ou uma protease. Em modalidades exemplares, a enzima pode ser quitinase ou beta-glucanase.

[00023]Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais subprodutos de crescimento microbiano separados do micro-organismo que os produziu. Os subprodutos do crescimento podem estar na forma purificada ou não purificada.

[00024]Em certas modalidades preferidas, o micro- organismo benéfico é cultivado em um meio compreendendo baixas concentrações de antibióticos (por exemplo, cerca de 200 ppm ou menos). Por conseguinte, em algumas modalidades, o produto à base de micróbios pode compreender quantidades residuais de substâncias antibióticas, aumentando assim as capacidades pesticidas da composição.

[00025]Em uma modalidade, a composição compreende ainda uma ou mais substâncias aderentes, que permitem que a composição permaneça nas superfícies da vegetação da planta por longos períodos de tempo. As substâncias aderentes podem incluir polímeros ou polissacarídeos carregados, como, por exemplo, goma xantana, goma guar, levana, xilinano, goma welan, goma gelana, curdlana e/ou pululano.

[00026]A composição pode ainda compreender outros componentes ativos ou inativos aceitáveis, tais como, por exemplo, sais, solventes, biotensoativos purificados adicionais e/ou enzimas e/ou agentes quelantes.

[00027]Em certas modalidades, as composições da presente invenção têm vantagens sobre, por exemplo, apenas metabólitos microbianos purificados. Essas vantagens podem incluir, por exemplo, altas concentrações de manoproteína como parte da superfície externa de uma parede celular de levedura, a presença de uma variedade de subprodutos de crescimento microbiano na cultura, como biotensoativos, enzimas, solventes e/ou outros metabólitos, e a presença de antibióticos residuais na cultura.

[00028]Em certas modalidades, são fornecidos métodos para o cultivo da composição pesticida da presente invenção, em que um micro-organismo benéfico é cultivado sob condições favoráveis ao crescimento e produção de um ou mais subprodutos do crescimento pesticida. Em algumas modalidades, o micro-organismo benéfico é cultivado em um meio compreendendo baixas concentrações de antibióticos, como, por exemplo, estreptomicina, eritromicina e/ou oxitetraciclina. A presença de antibióticos na cultura pode, em algumas modalidades, induzir o micro-organismo a produzir subprodutos do crescimento que são ativos contra, por exemplo, pragas bacterianas.

[00029]Opcionalmente, se uma composição sem micróbios for desejada, o método pode ainda compreender extrair e purificar um subproduto de crescimento do meio de fermentação em que foi produzido, usando métodos conhecidos na técnica.

[00030]A composição pesticida da presente invenção pode ser obtida através de processos de cultivo que variam de pequena a grande escala. Esses processos de cultivo incluem, mas não estão limitados a, cultivo/fermentação submersa, fermentação em estado sólido (SSF), fermentação em leito fluidizado e combinações dos mesmos.

[00031]Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para melhorar a imunidade, a saúde, o crescimento e/ou a produtividade da planta, tratando e/ou prevenindo uma infecção bacteriana na planta, em que uma composição pesticida da presente invenção é aplicada à planta e/ou ao seu ambiente circundante. Em modalidades preferidas, a planta é uma planta cítrica.

[00032]Em uma modalidade específica, a composição pesticida é contatada com a folhagem e/ou fruto da planta. A composição pesticida também pode ser contatada com o solo em que a planta cresce, as sementes da planta antes ou no momento do plantio, ou com qualquer outra parte da planta e/ou seu ambiente circundante.

[00033]A composição pesticida pode ser aplicada isoladamente ou em combinação com outros compostos para melhorar eficientemente a imunidade, a saúde e o crescimento das plantas. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição compreende ainda e/ou é aplicada ao lado de componentes adicionais, como herbicidas, fertilizantes, pesticidas, antibióticos e/ou corretivos de solo. Outros elementos adicionais podem incluir, por exemplo, nutrientes, tais como magnésio, fosfato, nitrogênio, potássio, selênio, cálcio, enxofre, ferro, cobre e zinco. Os materiais e as quantidades exatos dos mesmos podem ser determinados por uma pessoa versada na técnica de cultivo de plantas.

[00034]Os produtos à base de micróbios da presente invenção podem ser usados em uma variedade de configurações únicas devido, por exemplo, à capacidade de fornecer com eficiência: uma nova mistura de células, esporos e/ou micélios com subprodutos de fermentação ativos e metabólitos microbianos; composições com uma alta densidade de células, incluindo células vegetativas, esporos e/ou micélios; produtos à base de micróbios a curto prazo; e produtos à base de micróbios em locais remotos.

[00035]Vantajosamente, a presente invenção pode servir como um substituto “verde” para outros métodos que liberam grandes quantidades de compostos inorgânicos no ambiente. Além disso, as composições e métodos utilizam componentes que são biodegradáveis e toxicologicamente seguros.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00036]A presente invenção fornece micróbios, bem como subprodutos de seu crescimento, como biotensoativos. A presente invenção também fornece métodos de uso desses micróbios e seus subprodutos, bem como métodos e sistemas para produzi-los. Vantajosamente, os produtos e métodos à base de micróbios da presente invenção são ecológicos, não tóxicos e econômicos.

[00037]Em modalidades preferidas, a presente invenção fornece composições pesticidas e métodos para seu uso. Vantajosamente, as composições pesticidas podem melhorar a saúde, o crescimento e o rendimento geral das plantas cultivadas, por exemplo, prevenindo e/ou tratando uma infecção bacteriana. Especificamente, a presente invenção fornece tratamento e/ou prevenção de patógenos bacterianos que infectam culturas cítricas, tais como, por exemplo, Candidatus Liberibacter asiaticus (doença de esverdeamento cítrico) e Xanthomonas axonopodis (doença de cancro cítrico). Vantajosamente, a presente invenção reduz significativamente a concentração de antibióticos necessários para esse tratamento.

[00038]Em uma modalidade, a presente invenção fornece composições de pesticidas compreendendo um ou mais micro- organismos e/ou subprodutos do crescimento microbiano. Também são fornecidos métodos para cultivar a composição. De preferência, o produto à base de micróbios é formulado para ser adequado para aplicação na folhagem e/ou fruto de plantas cítricas. Definições Selecionadas

[00039]Como aqui utilizado, referência a uma "composição à base de micróbios" significa uma composição que compreende componentes que foram produzidos como resultado do crescimento de micro-organismos ou outras culturas de células (por exemplo, a composição pesticida da presente invenção). Assim, a composição à base de micróbios pode compreender os próprios micróbios e/ou subprodutos do crescimento microbiano. Os micróbios podem estar no estado vegetativo, na forma de esporos, na forma micelial, em qualquer outra forma de propágulo ou em uma mistura destes. Os micróbios podem ser planctônicos ou na forma de biofilme, ou uma mistura de ambos. Os subprodutos do crescimento podem ser, por exemplo, metabólitos, componentes da membrana celular, proteínas expressas e/ou outros componentes celulares. Os micróbios podem estar intactos ou lisados. Em algumas modalidades, os micróbios estão presentes, com o meio em que foram cultivados, na composição à base de micróbios. As células podem estar presentes, por exemplo, em uma concentração de 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013 UFC/mililitro da composição ou mais. Em algumas modalidades, a composição compreende subprodutos de crescimento que foram separados dos micróbios que os produziram.

[00040]A presente invenção fornece ainda "produtos à base de micróbios", que são produtos que devem ser aplicados na prática para alcançar o resultado desejado. O produto à base de micróbios pode ser simplesmente a composição à base de micróbios colhida no processo de cultivo de micróbios. Alternativamente, o produto à base de micróbios pode ter componentes removidos ou pode compreender outros ingredientes que foram adicionados. Esses ingredientes adicionais podem incluir, por exemplo, estabilizadores, tampões, veículos apropriados, como água, soluções salinas ou qualquer outro veículo apropriado, nutrientes adicionados para apoiar o crescimento microbiano adicional, melhoradores de crescimento não nutritivos e/ou agentes que facilitam o rastreamento dos micróbios e/ou da composição no ambiente em que é aplicado. O produto à base de micróbios também pode compreender misturas de composições à base de micróbios. O produto à base de micróbios também pode compreender um ou mais componentes de uma composição à base de micróbios que foram processados de alguma maneira, tais como, mas não limitados a, filtragem, centrifugação, lise, secagem, purificação e similares.

[00041]Como usado aqui, "colhido" se refere à remoção de parte ou toda a composição à base de micróbios de um vaso de crescimento.

[00042]Como usado aqui, um "biofilme" é um agregado complexo de micro-organismos, em que as células aderem umas às outras e produzem substâncias extracelulares que envolvem as células. Os biofilmes também podem aderir às superfícies. As células dos biofilmes são fisiologicamente distintas das células planctônicas do mesmo organismo, que são células únicas que podem flutuar ou nadar em meio líquido.

[00043]Como aqui utilizado, uma molécula de ácido nucleico polinucleotídeo, polipeptídeo, proteína ou composto orgânico "isolado" ou "purificado", como uma molécula pequena (por exemplo, as descritas abaixo), está substancialmente livre de outros compostos, como material celular, com o qual é associado na natureza. Um polinucleotídeo purificado ou isolado (ácido ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA)) está livre dos genes ou sequências que o flanqueiam em seu estado natural. Um polipeptídeo purificado ou isolado está livre dos aminoácidos ou sequências que o flanqueiam em seu estado natural. Uma cepa "isolada" no contexto de uma cepa microbiana significa que a cepa é removida do ambiente em que existe na natureza. Assim, a cepa isolada pode existir como, por exemplo, uma cultura biologicamente pura, ou como esporos (ou outras formas da cepa) em associação com um veículo.

[00044]Conforme usado aqui, uma "cultura biologicamente pura" é aquela que foi isolada dos materiais aos quais está associada na natureza. Em uma modalidade preferida, a cultura foi isolada de todas as outras células vivas. Em outras modalidades preferidas, a cultura biologicamente pura tem características de vantagens em comparação com uma cultura do mesmo micróbio que existe na natureza. As características vantajosas podem ser, por exemplo, maior produção de um ou mais subprodutos de seu crescimento.

[00045]Em certas modalidades, os compostos purificados são pelo menos 60% em peso (peso seco) do composto de interesse. Preferencialmente, a preparação é de pelo menos 75%, mais preferencialmente de pelo menos 90% e mais preferencialmente de pelo menos 99% em peso do composto de interesse. Por exemplo, um composto purificado é aquele que possui pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% ou 100% (p/p) do composto desejado em peso. A pureza é medida por qualquer método padrão apropriado, por exemplo, por cromatografia em coluna, cromatografia em camada fina ou análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

[00046]Um "metabólito" se refere a qualquer substância produzida pelo metabolismo ou necessária para participar de um processo metabólico específico. Um metabolito pode ser um composto orgânico que é um material de partida (por exemplo, glicose), um intermediário (por exemplo, acetil- CoA) ou um produto final (por exemplo, n-butanol) do metabolismo. Exemplos de metabólitos incluem, mas não estão limitados a, biopolímeros, enzimas, ácidos, solventes, álcoois, proteínas, vitaminas, minerais, micro-elementos, aminoácidos e biotensoativos.

[00047]Como usado aqui, "modular" é intercambiável com modificar (por exemplo, aumentar ou diminuir). Tais alterações são detectadas por métodos conhecidos da técnica padrão, como os aqui descritos.

[00048]As faixas aqui fornecidas são entendidas como atalhos para todos os valores dentro do intervalo. Por exemplo, entende-se que um intervalo de 1 a 20 inclui qualquer número, combinação de números ou subintervalo do grupo que consiste em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, bem como todos os valores decimais intermediários entre os números inteiros acima mencionados, como, por exemplo, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8 e 1,9. Com relação aos subintervalos,

“subintervalos agrupados” que se estendem a partir de qualquer ponto final do intervalo são especificamente contemplados. Por exemplo, um subintervalo agrupado de um intervalo exemplar de 1 a 50 pode compreender 1 a 10, 1 a 20, 1 a 30 e 1 a 40 em uma direção ou 50 a 40, 50 a 30, 50 a 20 e 50 a 10 na outra direção.

[00049]Conforme usado aqui, "reduz" se refere a uma alteração negativa de pelo menos 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 100%.

[00050]Conforme usado aqui, "referência" se refere a uma condição padrão ou de controle.

[00051]Como usado aqui, "tensoativo" se refere a um composto que reduz a tensão superficial (ou tensão interfacial) entre dois líquidos ou entre um líquido e um sólido. Os tensoativos atuam como detergentes, agentes umectantes, emulsificantes, agentes espumantes e dispersantes. Um "biotensoativo" é um tensoativo produzido por um organismo vivo.

[00052]Conforme usado aqui, "agricultura" significa o cultivo e melhoramento de plantas, algas e/ou fungos para alimentos, fibras, biocombustíveis, medicamentos, cosméticos, suplementos, finalidades ornamentais e outros usos. De acordo com a invenção, a agricultura também pode incluir horticultura, paisagismo, jardinagem, conservação de plantas, pomar e arboricultura. Além disso, na agricultura está o cuidado, monitoramento e manutenção do solo.

[00053]Conforme usado aqui, "aprimoramento" significa melhorar ou aumentar. Por exemplo, melhor saúde das plantas significa melhorar a capacidade da planta crescer e prosperar, e a capacidade da planta de sobreviver a doenças, secas e/ou superaquecimento. Crescimento aprimorado da planta significa aumentar o tamanho e/ou massa de uma planta ou melhorar a capacidade da planta de atingir o tamanho e/ou a massa desejada. Rendimentos aprimorados significam melhorar os produtos finais produzidos pelas plantas em uma colheita, por exemplo, aumentando o número de frutas por planta, aumentando o tamanho das frutas e/ou melhorando a qualidade das frutas (por exemplo, sabor, textura).

[00054]Conforme usado aqui, "imunidade" em referência a uma planta significa a resistência adquirida sistêmica (SAR) da planta. SAR é a capacidade da planta de reconhecer gatilhos, assinaturas e/ou padrões associados à exposição patogênica e responder adequadamente (por exemplo, através da indução de genes) para afastar e/ou se recuperar do patógeno.

[00055]Conforme usado aqui, "tratamento" em referência a uma praga ou patógeno significa erradicar, aprimorar, reduzir, melhorar ou reverter um grau, sinal ou sintoma do mesmo. O tratamento pode incluir, mas não requer, uma cura completa, o que significa que o tratamento também pode incluir erradicação, aprimoramento, redução, melhoria ou reversão parcial.

[00056]Conforme usado aqui, "prevenção" significa evitar, atrasar, impedir ou minimizar o início ou a progressão de uma ocorrência ou situação. A prevenção pode incluir, mas não exige, prevenção absoluta ou completa, o que significa que a ocorrência ou situação ainda pode se desenvolver posteriormente e/ou com uma gravidade menor do que seria sem medidas preventivas. A prevenção pode incluir a redução da gravidade do início de uma ocorrência ou situação e/ou a inibição da progressão para uma mais grave.

[00057]Conforme usado aqui, o termo "controlar" usado em referência a uma praga significa matar, desativar, imobilizar ou reduzir o número de populações de uma praga ou, de outro modo, tornar a praga substancialmente incapaz de causar danos.

[00058]Como usado aqui, uma "praga" é qualquer organismo, exceto um humano, que é destrutivo, nocivo e/ou prejudicial para os seres humanos ou para as preocupações humanas (por exemplo, agricultura). As pragas podem causar e/ou transportar agentes que causam infecções, infestações e/ou doenças. As pragas podem ser organismos unicelulares ou multicelulares, incluindo, entre outros, vírus, fungos, bactérias, parasitas, artrópodes e/ou nemátodos.

[00059]Conforme usado aqui, um "corretivo do solo" ou um "condicionador de solo" é qualquer composto, material ou combinação de compostos ou materiais que são adicionados ao solo para aprimorar as propriedades do solo e/ou rizosfera. Os corretivos do solo podem incluir matéria orgânica e inorgânica e podem incluir, por exemplo, fertilizantes, pesticidas e/ou herbicidas. O solo rico em nutrientes e bem drenado é essencial para o crescimento e a saúde das plantas e, portanto, os corretivos do solo podem ser usados para melhorar o crescimento e a saúde das plantas, alterando o teor de nutrientes e a umidade do solo. Os corretivos do solo também podem ser usados para melhorar muitas qualidades diferentes do solo, incluindo, entre outras, a estrutura do solo (por exemplo, impedindo a compactação); melhorar a concentração de nutrientes e as capacidades de armazenamento; melhorar a retenção de água em solos secos; e melhorar a drenagem em solos alagados.

[00060]O termo transitório "compreendendo", que é sinônimo de "incluindo" ou "contendo", é inclusivo ou aberto e não exclui elementos adicionais não especificados ou etapas do método. Por outro lado, a frase de transição "consistindo em" exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado na reivindicação. A frase de transição "consistindo essencialmente em" limita o escopo de uma reivindicação aos materiais ou etapas especificados "e àqueles que não afetam materialmente as características básicas e novas" da invenção reivindicada.

[00061]A menos que seja especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, como usado aqui, o termo "ou" é entendido como inclusivo. A menos que seja especificamente declarado ou óbvio no contexto, como usado aqui, os termos "um", "uma" e "o/a" são entendidos como singulares ou plurais.

[00062]A menos que seja especificamente declarado ou óbvio do contexto, como usado aqui, o termo "cerca de" é entendido como dentro de uma faixa de tolerância normal na técnica, por exemplo, dentro de 2 desvios padrão da média. Cerca de pode ser entendido como dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% do valor declarado.

[00063]A citação de uma lista de grupos químicos em qualquer definição de uma variável aqui inclui definições dessa variável como qualquer grupo único ou combinação de grupos listados. A citação de uma modalidade para uma variável ou aspecto aqui inclui essa modalidade como qualquer modalidade única ou em combinação com quaisquer outras modalidades ou porções das mesmas. Todas as referências aqui citadas são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Composições

[00064]Em modalidades preferidas, a presente invenção fornece composições pesticidas e métodos para seu uso. Vantajosamente, as composições pesticidas podem aumentar a imunidade, a saúde, o crescimento e o rendimento geral das plantas cultivadas, por exemplo, prevenindo e/ou tratando uma infecção bacteriana.

[00065]Especificamente, a presente invenção fornece tratamento e/ou prevenção de patógenos bacterianos que infectam culturas cítricas, tais como, por exemplo, Candidatus Liberibacter asiaticus (doença de esverdeamento cítrico) e Xanthomonas axonopodis (doença de cancro cítrico). Vantajosamente, a presente invenção reduz significativamente a concentração de antibióticos necessários para esse tratamento.

[00066]Vantajosamente, as composições à base de micróbios produzidas de acordo com a presente invenção não são tóxicas (ou seja, a toxicidade por ingestão é superior a 5 g/kg) e podem ser aplicadas em altas concentrações sem causar irritação, por exemplo, na pele ou no trato digestivo. Assim, a presente invenção é particularmente útil quando a aplicação das composições à base de micróbios ocorre na presença de organismos vivos, como agricultores e produtores.

[00067]Em uma modalidade, a composição pode compreender, por exemplo, os um ou mais micro-organismos benéficos, juntamente com quaisquer produtos de fermentação. Em algumas modalidades, os subprodutos incluem subprodutos de crescimento microbiano, incluindo, por exemplo, biotensoativos, enzimas e/ou outros metabólitos.

[00068]Em uma modalidade, a composição pesticida controla bactérias patogênicas de plantas. Em uma modalidade, a composição pesticida controla pragas que podem atuar como vetores ou veículos para bactérias patogênicas, como insetos.

[00069]Em certas modalidades, a presente invenção utiliza um micro-organismo produtor de agente bioquímico que é tolerante aos antibióticos. Em uma modalidade, o micro-organismo benéfico é uma levedura, como, por exemplo, Starmerella bombicola, Wickerhamomyces anomalus, Pseudozyma aphidis ou Pichia spp.

[00070]Em algumas modalidades, o micro-organismo benéfico é uma bactéria não patogênica para as plantas, como, por exemplo, Bacillus amyloliquefaciens, Pseudomonas chlororaphis ou Rhodococcus erythropolis.

[00071]Esses micróbios produzem subprodutos do crescimento que são ativos contra, por exemplo, pragas de bactérias, insetos e/ou nemátodos.

[00072]Em algumas modalidades, o subproduto de crescimento da composição em questão é um biotensoativo. Os biotensoativos são um grupo estruturalmente diverso de substâncias tensoativas produzidas por micro-organismos. Os biotensoativos são biodegradáveis e podem ser eficientemente produzidos, de acordo com a presente invenção, utilizando organismos selecionados em substratos renováveis. A maioria dos organismos produtores de biotensoativo produz biotensoativos em resposta à presença de uma fonte de hidrocarboneto (por exemplo, óleos, açúcar, glicerol, etc.) nos meios de cultivo. Outros componentes do meio, como a concentração de ferro, também podem afetar significativamente a produção de biotensoativo.

[00073]Os biotensoativos microbianos são produzidos por uma variedade de micro-organismos, como bactérias, fungos e leveduras. Micro-organismos produtores de biotensoativos exemplares incluem Starmerella spp. (por exemplo, S. bombicola), Pseudomonas spp. (por exemplo, P. aeruginosa, P. putida, P. florescens, P. fragi, P. syringae); Flavobacterium spp.; Bacillus spp. (por exemplo, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. pumillus, B. cereus, B. licheniformis); Wickerhamomyces spp. (por exemplo, W. anomalus); Candida spp. (por exemplo, C. albicans, C. rugosa, C. tropicalis, C. lipolytica, C. torulopsis); Saccharomyces (por exemplo, S. cerevisiae); Pseudozyma spp. (por exemplo, P. aphidis); Rhodococcus spp. (por exemplo, R. erythropolis); Arthrobacter spp.; Campylobacter spp.; Cornybacterium spp.; Pichia spp. (por exemplo, P. guilliermondii, P. occidentalis); assim como outros.

[00074]Biotensoativos são anfifílicos. Eles consistem em duas partes: um grupo polar (hidrofílico) e um grupo não polar (hidrofóbico). Devido à sua estrutura anfifílica, os biotensoativos microbianos reduzem a tensão superficial e interfacial entre as moléculas de líquidos, sólidos e gases. Essa dinâmica pode ser usada para facilitar a saúde das plantas, aumentar a produtividade, gerenciar a aeração do solo e utilizar com responsabilidade os recursos hídricos disponíveis.

[00075]Além disso, os biotensoativos aumentam a área da superfície de substâncias hidrofóbicas insolúveis em água, aumentam a biodisponibilidade da água de tais substâncias. Os biotensoativos se acumulam nas interfaces, reduzindo assim a tensão interfacial e elevando à formação de estruturas micelares agregadas em solução. A capacidade dos biotensoativos para formar poros e desestabilizar as membranas biológicas permite a sua utilização como, por exemplo, agentes antibacterianos e antifúngicos.

[00076]Além disso, os biotensoativos são biodegradáveis, apresentam baixa toxicidade, são eficazes na solubilização e degradação de compostos insolúveis no solo e podem ser produzidos economicamente usando recursos renováveis de baixo custo. Eles podem inibir a adesão microbiana a uma variedade de superfícies, impedir a formação de biofilmes e podem ter poderosas propriedades emulsificantes e desemulsificantes. Além disso, os biotensoativos também podem ser usados para obter molhabilidade e obter distribuição uniforme de fertilizantes, nutrientes e água no solo.

[00077]De acordo com a presente invenção, os biotensoativos podem incluir, por exemplo, glicolipídios de baixo peso molecular, lipídios de celobiose, lipopeptídeos, flavolipídios, fosfolípidos e polímeros de alto peso molecular, como lipoproteínas, complexos de proteínas e lipopolissacarídeos e/ou complexos de polissacarídeos, proteínas e ácidos graxos.

[00078]A cadeia de hidrocarbonetos de um ácido graxo atua como a porção lipofílica comum de uma molécula de biotensoativo, enquanto a parte hidrofílica é formada por grupos éster ou álcool de lipídios neutros, pelo grupo carboxilato de ácidos graxos ou aminoácidos (ou peptídeos), ácido orgânico no caso de flavolipídios ou, no caso de glicolipídios, pelo carboidrato.

[00079]Em uma modalidade, os biotensoativos de acordo com as composições em questão compreendem glicolipídios e/ou biotensoativos do tipo glicolipídico, tais como, por exemplo, ramnolipídios (RLP), soforolipídios (SLP), lipídios de trealose ou lipossulfonitritol (MEL). Em uma modalidade, os biotensoativos compreendem lipopeptídeos e/ou biotensoativos do tipo lipopeptídeo, tais como, por exemplo, surfactina, iturina, fengicina, atrofactina, viscosina e/ou liquenisina. Em uma modalidade, os biotensoativos compreendem biotensoativos poliméricos, tais como, por exemplo, emulsan, lipomanan, alasan e/ou liposan.

[00080]Em certas modalidades preferidas, o biotensoativo é um glicolípido selecionado de soforolípidos (SLP), lípidos de trealose e lípidos de manosileritritol (MEL); e/ou o biotensoativo é um lipopeptídeo, tal como surfactina, liquenisina ou afrofactina.

[00081]Em uma modalidade exemplar, o biotensoativo é um soforolípido. Existem pelo menos oito soforolipídios estruturalmente diferentes. A composição química de um SLP é formada por uma soforose e um ácido graxo ou um grupo éster. As estruturas de macrolactona e ácido livre são acetiladas em várias extensões na posição hidroxila primária do anel da soforose. O principal componente de um soforolipídio é o ácido 17-hidroxioctadecanoico e sua lactona correspondente. Além disso, ácidos graxos C-18 insaturados de ácido oleico podem ser transferidos inalterados para soforolipídios.

[00082]Em algumas modalidades, a composição pesticida pode compreender cerca de 10 ppm a cerca de 10.000 ppm de biotensoativo, ou cerca de 100 ppm a cerca de 5.000 ppm, ou cerca de 200 a cerca de 1.000 ppm, ou cerca de 300 ppm a cerca de 800 ppm, ou cerca de 500 ppm.

[00083]Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos 0,01 g/L a 5,0 g/L, ou pelo menos 0,05 g/L a 1,0 g/L, ou pelo menos 0,1 g/L a 0,5 g/L de biotensoativo no produto final.

[00084]Em algumas modalidades, o subproduto do crescimento é uma enzima. As enzimas são tipicamente divididas em seis classes: oxidoredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases. Cada classe é dividida em subclasses e por ação. As subclasses específicas de enzimas de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, proteases, amilases, glicosidases, celulases, glucosidases, glucanases, galactosidases, manosidases, sucrases, dextranases, hidrolases, metiltransferases, fosforilases, desidrogenases (por exemplo, glicose desidrogenase, álcool desidrogenase), oxigenases (por exemplo, alcano-oxigenases, metano-mono- oxigenases, dioxigenases), hidroxilases, esterases, lipases, ligninases, mananases, oxidases, lacases, tirosinases, enzimas do citocromo P450, peroxidases (por exemplo, cloroperoxidase e outras haloperoxidases), e lactases. Em modalidades exemplares, a enzima pode ser quitinase ou beta-glucanase.

[00085]Em certas modalidades, a composição pesticida pode compreender os subprodutos da fermentação que contêm uma cultura viva e/ou inativa e/ou os metabólitos microbianos produzidos pelo micro-organismo e/ou quaisquer nutrientes residuais. O produto da fermentação pode ser usado diretamente, com ou sem extração ou purificação. Se desejado, a extração e a purificação podem ser facilmente alcançadas usando métodos ou técnicas padrão de extração e/ou purificação descritos na literatura.

[00086]Em uma modalidade, a composição pode compreender o meio em que os micróbios foram cultivados. A composição pode ser, por exemplo, pelo menos, em peso, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 100% de meio de crescimento. A quantidade de biomassa na composição, em peso, pode estar, por exemplo, em qualquer lugar de 0% a 100%, incluindo todas as porcentagens entre elas.

[00087]Os micro-organismos podem estar na forma ativa ou inativa, ou na forma de células vegetativas, esporos reprodutivos, micélios, hifas, conídios ou qualquer outra forma de propágulo microbiano. A composição também pode conter uma combinação de qualquer uma dessas formas microbianas.

[00088]Em uma modalidade, quando uma combinação de cepas de micro-organismos é incluída na composição, as diferentes cepas de micróbio são crescidas separadamente e depois misturadas para produzir a composição.

[00089]Em uma modalidade, a composição não compreende micro-organismos vivos. Em uma modalidade, a composição não compreende micro-organismos, vivos ou inativos.

[00090]Em uma modalidade, a composição compreende um ou mais subprodutos de crescimento microbiano separados do micro-organismo que os produziu. Os subprodutos do crescimento podem estar na forma purificada ou não purificada.

[00091]Em certas modalidades preferidas, o micro- organismo benéfico é cultivado em um meio que compreende baixas concentrações de antibióticos (por exemplo, cerca de 200 ppm ou menos), como, por exemplo, estreptomicina, eritromicina e/ou oxitetraciclina. A presença de antibióticos na cultura pode, em algumas modalidades, induzir o micro-organismo a produzir subprodutos do crescimento que são ativos contra, por exemplo, pragas bacterianas. Além disso, em algumas modalidades, a composição pesticida pode compreender quantidades residuais de substâncias antibióticas, aumentando assim as capacidades pesticidas da composição.

[00092]Por exemplo, os micro-organismos podem ser cultivados em um meio compreendendo antibióticos, como, por exemplo, estreptomicina, eritromicina e/ou oxitetraciclina, em quantidades de 0 a 200 ppm, preferencialmente de 5 a 150 ppm, mais preferencialmente de 10 a 100 ppm.

[00093]A composição pode ainda compreender outros componentes ativos ou inativos aceitáveis. Em algumas modalidades, quando, por exemplo, a composição é usada para suplementar outros tratamentos com antibióticos, aditivos podem ser incluídos para ajudar a melhorar os efeitos pesticidas do tratamento e diminuir a quantidade de antibióticos necessários.

[00094]Em algumas modalidades, os aditivos podem incluir um ou mais sais, como cloreto de sódio. O(s) sal(is) pode(m) ser adicionado(s) em concentrações de, por exemplo, 0,1 a 20 g/L, ou 1 a 15 g/L, ou 5 a 10 g/L.

[00095]Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um ou mais solventes, como etanol, álcool isopropílico e/ou propanol. O(s) solvente(s) pode(m) ser adicionado(s) em concentrações de, por exemplo, 0,1 a 10 g/L, ou 0,5 a 8 g/L, ou 1 a 5 g/L.

[00096]Em algumas modalidades, os aditivos podem incluir biotensoativos purificados adicionais, preferencialmente SLP a uma concentração de, por exemplo, 10 a 200 ppm ou 20 a 100 ppm.

[00097]Em algumas modalidades, os aditivos podem incluir um ou mais agentes quelantes. Como aqui utilizado, "agente quelante" ou "quelante" significa um agente ativo capaz de remover um íon metálico de um sistema, por exemplo, formando um complexo para que o íon metálico não possa participar ou catalisar prontamente a formação de radicais de oxigênio. Vantajosamente, o agente quelante pode aumentar a eficácia de um biotensoativo antimicrobiano modificando as paredes celulares de, por exemplo, bactérias Gram-negativas, para serem mais suscetíveis ao tratamento de tensoativos. Consequentemente, a capacidade de permear bactérias Gram-negativas amplia o espectro das capacidades de tratamento para a presente invenção.

[00098]Exemplos de agentes quelantes adequados para a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, ácido dimercaptosuccínico (DMSA), ácido 2,3- dimercaptopropanossulfônico (DMPS), ácido alfa lipoico (ALA), dissulfeto de tiamina-tetra-hidrofurfurila (TTFD), penicilamina, ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA) e ácido cítrico. Em modalidades preferidas, o agente quelante é EDTA em concentração de 0,1 a 1,0% (v/v).

[00099]Em uma modalidade, a composição compreende ainda uma ou mais substâncias aderentes, que permitem que a composição permaneça nas superfícies da vegetação da planta por longos períodos de tempo. As substâncias aderentes podem incluir polímeros ou polissacarídeos carregados, como, por exemplo, goma xantana, goma guar, levana, xilinano, goma welan, goma gelana, curdlana e/ou pululano.

[000100]Em certas modalidades, goma xantana de grau comercial é usada como aderente. A concentração da goma deve ser selecionada com base no conteúdo da goma no produto comercial. Se a goma xantana for altamente pura, 0,001% (p/v - goma xantana/solução) é suficiente.

[000101]Em certas modalidades, as composições da presente invenção têm vantagens sobre, por exemplo, apenas metabólitos microbianos purificados. Essas vantagens podem incluir, por exemplo, altas concentrações de manoproteína como parte da superfície externa de uma parede celular de levedura, a presença de uma variedade de subprodutos de crescimento microbiano na cultura, como biotensoativos, enzimas, solventes e/ou outros metabólitos, e a presença de antibióticos residuais na cultura. Crescimento de micróbios

[000102]A presente invenção fornece métodos para o cultivo de micro-organismos e produção de metabólitos microbianos e/ou outros subprodutos do crescimento microbiano. Em uma modalidade, a presente invenção fornece materiais e métodos para a produção de biomassa (por exemplo, material celular viável), metabólitos extracelulares (por exemplo, pequenas moléculas e proteínas excretadas), nutrientes residuais e/ou componentes intracelulares (por exemplo, enzimas e outras proteínas).

[000103]A presente invenção utiliza processos de cultivo que são adequados para o cultivo de micro- organismos e produção de metabólitos microbianos em uma escala desejada. Esses processos de cultivo incluem, mas não estão limitados a, cultivo/fermentação submersa, fermentação em estado sólido (SSF) e modificações, híbridos e/ou combinações dos mesmos. Como usado aqui, "fermentação" se refere ao cultivo ou crescimento de células sob condições controladas. O crescimento pode ser aeróbico ou anaeróbico.

[000104]Os métodos podem ser executados em um processo em lote, em um processo quase contínuo ou em um processo contínuo.

[000105]O vaso de crescimento usado para o cultivo de micro-organismos pode ser qualquer fermentador ou reator de cultivo para uso industrial. Em uma modalidade, o vaso pode ter controles/sensores funcionais ou pode ser conectado a controles/sensores funcionais para medir fatores importantes no processo de cultivo, como pH, oxigênio, pressão, temperatura, potência do eixo do agitador, umidade, viscosidade e/ou densidade microbiana e/ou concentração de metabólitos.

[000106]Em uma modalidade adicional, o vaso também pode ser capaz de monitorar o crescimento de micro-organismos dentro do vaso (por exemplo, medição do número de células e fases de crescimento). Alternativamente, uma amostra diária pode ser retirada do recipiente e submetida à enumeração por técnicas conhecidas na técnica, como a técnica de diluição em placas. A diluição em placas é uma técnica simples usada para estimar o número de micróbios em uma amostra. A técnica também pode fornecer um índice pelo qual diferentes ambientes ou tratamentos podem ser comparados.

[000107]Em uma modalidade, o método inclui suplementar o cultivo com uma fonte de nitrogênio. A fonte de nitrogênio pode ser, por exemplo, nitrato de potássio, nitrato de amônio, sulfato de amônio, fosfato de amônio, amônia, ureia e/ou cloreto de amônio. Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas independentemente ou em uma combinação de duas ou mais.

[000108]O método pode fornecer oxigenação para a cultura em crescimento. Uma modalidade utiliza câmera lenta do ar para remover o ar contendo baixo oxigênio e introduzir o ar oxigenado. No caso de fermentação submersa, o ar oxigenado pode ser suplementado diariamente com ar ambiente através de mecanismos incluindo impulsores para agitação mecânica do líquido e aspersores de ar para fornecer bolhas de gás ao líquido para dissolução de oxigênio no líquido.

[000109]O método pode ainda compreender a suplementação do cultivo com uma fonte de carbono. A fonte de carbono é tipicamente um carboidrato, como glicose, sacarose, lactose, frutose, trealose, manose, manitol e/ou maltose; ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido propiônico, ácido málico, ácido malônico e/ou ácido pirúvico; álcoois como etanol, isopropil, propanol, butanol, pentanol, hexanol, isobutanol e/ou glicerol; gorduras e óleos como óleo de soja, óleo de farelo de arroz, óleo de canola, azeite, óleo de milho,

óleo de gergelim e/ou óleo de linhaça; etc. Essas fontes de carbono podem ser usadas independentemente ou em uma combinação de duas ou mais.

[000110]Em uma modalidade, o método compreende o uso de duas fontes de carbono, uma das quais é um óleo saturado selecionado entre canola, vegetais, milho, coco, azeitona ou qualquer outro óleo adequado para uso, por exemplo, na culinária.

[000111]Em uma modalidade, os micro-organismos podem ser cultivados em um substrato sólido ou semi-sólido, como, por exemplo, milho, trigo, soja, grão de bico, feijão, aveia, macarrão, arroz e/ou farinhas ou refeições de qualquer um destes ou outras substâncias similares.

[000112]Em uma modalidade, fatores de crescimento e nutrientes vestigiais para micro-organismos são incluídos no meio. Isso é particularmente preferido no cultivo de micróbios que são incapazes de produzir todas as vitaminas necessárias. Nutrientes inorgânicos, incluindo oligoelementos como ferro, zinco, cobre, manganês, molibdênio e/ou cobalto também podem ser incluídos no meio. Além disso, fontes de vitaminas, aminoácidos essenciais e microelementos podem ser incluídos, por exemplo, na forma de farinhas ou refeições, como farinha de milho, ou na forma de extratos, como extrato de levedura, extrato de batata, extrato de carne bovina, extrato de soja, extrato de casca de banana e similares, ou em formas purificadas. Também podem ser incluídos aminoácidos como, por exemplo, aqueles úteis para a biossíntese de proteínas.

[000113]Em uma modalidade, sais inorgânicos também podem ser incluídos. Os sais inorgânicos utilizáveis podem ser di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, hidrogenofosfato dissódico, sulfato de magnésio, cloreto de magnésio, sulfato de ferro, cloreto de ferro, sulfato de manganês, cloreto de manganês, sulfato de zinco, cloreto de chumbo, sulfato de cobre, cloreto de cálcio, carbonato de cálcio, cloreto de sódio e/ou carbonato de sódio. Estes sais inorgânicos podem ser utilizados independentemente ou em uma combinação de dois ou mais.

[000114]Em algumas modalidades, o método para cultivo pode ainda compreender a adição de ácidos e/ou agentes antimicrobianos adicionais no meio líquido antes e/ou durante o processo de cultivo. Agentes antimicrobianos ou antibióticos são utilizados para proteger a cultura contra contaminação e podem estar presentes no produto final em baixas concentrações, a fim de auxiliar no tratamento e/ou prevenção de infecção bacteriana nas plantas nas quais é aplicada. Por exemplo, os micro-organismos podem ser cultivados em um meio compreendendo antibióticos, como, por exemplo, estreptomicina, eritromicina e/ou oxitetraciclina, em quantidades de 0 a 200 ppm, preferencialmente de 5 a 150 ppm, mais preferencialmente de 10 a 100 ppm.

[000115]Além disso, agentes antiespuma também podem ser adicionados para impedir a formação e/ou acúmulo de espuma quando o gás é produzido durante o cultivo.

[000116]O pH da mistura deve ser adequado para o micro- organismo de interesse. Tampões e reguladores de pH, como carbonatos e fosfatos, podem ser usados para estabilizar o pH próximo a um valor preferido. Quando íons metálicos estão presentes em altas concentrações, pode ser necessário o uso de um agente quelante no meio líquido.

[000117]Os micróbios podem ser cultivados na forma planctônica ou como biofilme. No caso do biofilme, o vaso pode ter um substrato sobre o qual os micróbios podem ser cultivados no estado de biofilme. O sistema também pode ter, por exemplo, a capacidade de aplicar estímulos (como tensão de cisalhamento) que incentivam e/ou melhoram as características de crescimento do biofilme.

[000118]Em uma modalidade, o método para o cultivo de micro-organismos é realizado a cerca de 5°C a cerca de 100°C, preferencialmente, 15 a 60°C, mais preferencialmente, 25 a 50°C. Em outra modalidade, o cultivo pode ser realizado continuamente a uma temperatura constante. Em outra modalidade, o cultivo pode estar sujeito a mudanças de temperatura.

[000119]Em uma modalidade, o equipamento usado no método e processo de cultivo é estéril. O equipamento de cultivo, como o reator/vaso, pode ser separado, mas conectado a, uma unidade de esterilização, por exemplo, um autoclave. O equipamento de cultivo também pode ter uma unidade de esterilização que esteriliza in situ antes de iniciar a inoculação. O ar pode ser esterilizado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o ar ambiente pode passar por pelo menos um filtro antes de ser introduzido no vaso. Em outras modalidades, o meio pode ser pasteurizado ou, opcionalmente, nenhum calor adicionado, onde o uso de baixa atividade de água e baixo pH pode ser explorado para controlar o crescimento bacteriano indesejável.

[000120]Em uma modalidade, a presente invenção fornece métodos de produção de um subproduto de crescimento microbiano cultivando uma cepa de micróbios da presente invenção em condições apropriadas para o crescimento e produção do subproduto de crescimento. Em uma modalidade, o subproduto do crescimento é um biotensoativo, enzima ou outro metabólito. O conteúdo do subproduto de crescimento no meio produzido pelo método pode ser, por exemplo, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%.

[000121]No caso de fermentação submersa, o teor de biomassa do caldo de fermentação pode ser, por exemplo, de 5 g/l a 180 g/l ou mais. Em uma modalidade, o teor de sólidos do caldo é de 10 g/l a 150 g/l.

[000122]No caso de fermentação no estado sólido ou versões modificadas da mesma, a concentração celular pode ser, por exemplo, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012 ou 1 x 1013 células ou esporos por grama de produto final.

[000123]O subproduto do crescimento microbiano produzido por micro-organismos de interesse pode ser retido nos micro-organismos ou secretado no meio de crescimento. Em outra modalidade, o método para a produção de subproduto de crescimento microbiano pode ainda compreender etapas de concentração e purificação do subproduto de crescimento microbiano de interesse. Em uma modalidade adicional, o meio pode conter compostos que estabilizam a atividade do subproduto do crescimento microbiano.

[000124]Em uma modalidade, toda a composição de cultivo microbiano é removida após a conclusão do cultivo (por exemplo, após alcançar uma densidade celular desejada ou densidade de um metabólito especificado). Neste procedimento de lote, um lote totalmente novo é iniciado após a colheita do primeiro lote.

[000125]Em outra modalidade, apenas uma porção do produto de fermentação é removida a qualquer momento. Nesta modalidade, a biomassa com células viáveis permanece no vaso como um inoculante para um novo lote de cultivo. A composição que é removida pode ser um meio isento de micróbios ou conter células, esporos, micélios, conídios ou outros propágulos microbianos. Dessa maneira, um sistema quase contínuo é criado.

[000126]Vantajosamente, os métodos de cultivo não requerem equipamentos complicados ou alto consumo de energia. Os micro-organismos de interesse podem ser cultivados em pequena ou grande escala no local e utilizados, mesmo sendo ainda misturados com seus meios. Da mesma forma, os metabólitos microbianos também podem ser produzidos em grandes quantidades no local de necessidade. Cepas microbianas

[000127]Os micro-organismos que podem ser cultivados de acordo com os métodos em questão podem ser, por exemplo, bactérias, leveduras e/ou fungos. Esses micro-organismos podem ser micro-organismos naturais ou geneticamente modificados. Por exemplo, os micro-organismos podem ser transformados com genes específicos para exibir características específicas. Os micro-organismos também podem ser mutantes de uma cepa desejada. Como usado aqui, "mutante" significa uma cepa, variante genética ou subtipo de um micro-organismo de referência, em que o mutante possui uma ou mais variações genéticas (por exemplo, uma mutação pontual, mutação com troca de sentido, mutação sem sentido, exclusão, duplicação, mutação ou repetição de quadros expansão) em comparação com o micro-organismo de referência. Os procedimentos para produzir mutantes são bem conhecidos na técnica microbiológica. Por exemplo, a mutagênese por UV e a nitrosoguanidina são amplamente utilizadas para esse fim.

[000128]Em algumas modalidades, o micro-organismo é um fungo, incluindo leveduras e bolores. Exemplos de fungos adequados para uso de acordo com a presente invenção incluem, entre outros, Acaulospora, Aspergillus, Aureobasidium (por exemplo, A. pullulans), Blakeslea, Candida (por exemplo, C. albicans, C. apicola), Debaryomyces (por exemplo, D. hansenii), Entomophthora, Fusarium, Hanseniaspora (por exemplo, H. uvarum), Hansenula, Issatchenkia, Kluyveromyces, Mortierella, Mucor (por exemplo, M. piriformis), Penicillium, Phythium, Phycomyces, Pichia (por exemplo, P. anomala, P. guielliermondii, P. occidentalis, P. kudriavzevii), Pseudozyma (por exemplo, P. aphidis), Rhizopus, Saccharomyces (S. cerevisiae, S. boulardii sequela, S. torula), Starmerella (por exemplo, S. bombicola), Torulopsis, Thraustochytrium, Trichoderma (por exemplo, T. reesei, T. harzianum, T. virens), Ustilago (por exemplo, U. maydis), Wickerhamomyces (por exemplo, W. anomalus), Williopsis, Zygosaccharomyces (por exemplo, Z. bailii).

[000129]Em uma modalidade, o micro-organismo é uma levedura caracterizada por sua secreção de "toxinas assassinas" ou proteínas ou glicoproteínas tóxicas, às quais a própria levedura é imune. Essas exotoxinas são capazes de matar outras cepas de leveduras, fungos ou bactérias. As leveduras assassinas podem incluir, entre outras, Wickerhamomyces, Pichia, Hansenula, Saccharomyces, Hanseniaspora, Ustilago, Debaryomyces, Candida, Cryptococcus, Kluyveromyces, Torulopsis, Williopsis, Zygosaccharomyces e outros.

[000130]Em algumas modalidades, os micro-organismos são bactérias, incluindo bactérias Gram-positivas e Gram- negativas. As bactérias adequadas para utilização de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, Acinetobacter (por exemplo, A. calcoaceticus, A. venetianus); Agrobacterium (por exemplo, A. radiobacter), Azotobacter (A. vinelandii, A. chroococcum), Azospirillum (por exemplo, A. brasiliensis), Bacillus (por exemplo, B. amyloliquefaciens, B. firmus, B. laterosporus, B. licheniformis, B megaterium, B. mucilaginosus, B. subtilis, B. coagulans), Chlorobiaceae spp., Dyadobacter fermenters, Frankia spp., Frateuria (por exemplo, F. aurantia), Klebsiella spp., Microbacterium (por exemplo, M. laevaniformans), Pantoea (por exemplo, P. agglomerans), Pseudomonas (por exemplo, P. aeruginosa, P. chlororaphis, P. chlororaphis subsp. aureofaciens (Kluyver), P. putida), Rhizobium spp., Rhodospirillum (por exemplo, R. rubrum), Sphingomonas (por exemplo, S. paucimobilis) e/ou Xanthomonas spp.

[000131]Em certas modalidades, a presente invenção utiliza um micro-organismo produtor de agente bioquímico que é tolerante aos antibióticos. A tolerância a antibióticos pode ser alcançada, por exemplo, cultivando o micro-organismo em um meio compreendendo baixas concentrações (por exemplo, 200 ppm ou menos) de um antibiótico.

[000132]Em modalidades preferidas, o micro-organismo produtor de bioquímico produz bioquímicos, tais como biotensoativos e/ou enzimas com atividade antibacteriana ou de outra forma pesticida (por exemplo, contra insetos e/ou nemátodos).

[000133]Em uma modalidade, o micro-organismo benéfico é uma levedura, como, por exemplo, Starmerella bombicola, Wickerhamomyces anomalus, Pseudozyma aphidis ou Pichia spp. (por exemplo, P. guilliermondii (ou Meyerozyma guilliermondii), P. kudriavzevii ou P. occidentalis).

[000134]Em algumas modalidades, o micro-organismo benéfico é uma bactéria não patogênica para as plantas, como, por exemplo, Bacillus amyloliquefaciens, Pseudomonas chlororaphis ou Rhodococcus erythropolis.

[000135]Outras cepas microbianas podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção, incluindo, por exemplo, quaisquer outras cepas capazes de produzir biotensoativos e outras enzimas e/ou metabólitos úteis no tratamento de patógenos bacterianos em plantas. Preparação de produtos à base de micróbios

[000136]Um produto à base de micróbios da presente invenção é simplesmente o meio de fermentação que contém o micro-organismo e/ou os subprodutos de crescimento microbiano produzidos pelo micro-organismo e/ou quaisquer nutrientes residuais e/ou antibióticos. O produto da fermentação pode ser usado diretamente sem extração ou purificação. Se desejado, a extração e a purificação podem ser facilmente alcançadas usando métodos ou técnicas padrão de extração e/ou purificação descritos na literatura.

[000137]As composições à base de micróbios podem ser usadas sem mais estabilização, preservação e armazenamento. Vantajosamente, o uso direto dessas composições à base de micróbios preserva uma alta viabilidade dos micro- organismos, reduz a possibilidade de contaminação por agentes estranhos e micro-organismos indesejáveis e mantém a atividade dos subprodutos do crescimento microbiano.

[000138]Os micro-organismos nos produtos à base de micróbios podem estar em uma forma ativa ou inativa, ou na forma de células vegetativas, esporos reprodutivos, micélios, conídios ou qualquer outra forma de propágulo microbiano. Os produtos à base de micróbios também podem conter uma combinação de qualquer uma dessas formas de micro-organismo.

[000139]O produto à base de micróbios pode compreender um meio no qual os micróbios foram cultivados. O produto pode ser, por exemplo, pelo menos, em peso, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 100% de meio de crescimento. A quantidade de biomassa no produto, em peso, pode estar, por exemplo, entre 0% e 100%, incluindo todas as porcentagens entre elas.

[000140]Os subprodutos do crescimento microbiano podem ser separados dos micro-organismos e/ou meio e utilizados na forma purificada ou não purificada.

[000141]Os micróbios e/ou produtos de fermentação resultantes do crescimento microbiano podem ser removidos do vaso de crescimento e transferidos por, por exemplo, tubulação para uso imediato.

[000142]Em outras modalidades, a composição pode ser colocada em recipientes de tamanho apropriado, elevando em consideração, por exemplo, o uso pretendido, o método de aplicação contemplado, o tamanho do tanque de fermentação e qualquer modo de transporte da instalação de crescimento de micróbios para a local de uso. Assim, os recipientes nos quais a composição à base de micróbios é colocada podem ser, por exemplo, de 1 galão a 1.000 galões ou mais. Em outras modalidades, os contêineres são 2 galões, 5 galões, 25 galões ou maiores.

[000143]Opcionalmente, a composição pode ser armazenada antes do uso. O tempo de armazenamento é preferencialmente curto. Assim, o tempo de armazenamento pode ser inferior a 60 dias, 45 dias, 30 dias, 20 dias, 15 dias, 10 dias, 7 dias, 5 dias, 3 dias, 2 dias, 1 dia ou 12 horas. Em uma modalidade preferida, se células vivas estiverem presentes no produto, o produto é armazenado a uma temperatura baixa, como, por exemplo, menos de 20°C, 15°C, 10°C ou 5°C.

[000144]Após a colheita da composição à base de micróbios a partir dos vasos de crescimento, outros componentes podem ser adicionados à medida que o produto colhido é colocado em recipientes e/ou canalizado (ou transportado para uso). Os aditivos podem ser, por exemplo, tampões, veículos, outras composições à base de micróbios produzidos na mesma ou em diferentes instalações, agentes quelantes, aderentes, modificadores de viscosidade, conservantes, nutrientes para crescimento seletivo de micróbios benéficos, agentes de rastreamento, solventes, biocidas, antibióticos, tensoativos (incluindo biotensoativos purificados ou em bruto), agentes emulsificantes, lubrificantes, agentes de controle de solubilidade, agentes de ajuste de pH, estabilizadores, agentes resistentes à luz ultravioleta e outros ingredientes específicos para o uso pretendido.

[000145]Em certas modalidades, o produto à base de micróbios compreende um veículo. O veículo pode ser qualquer veículo adequado conhecido na técnica que permita que a composição seja entregue às plantas e/ou solo alvo.

[000146]Em uma modalidade, o produto à base de micróbios pode compreender agentes tampão incluindo orgânicos e aminoácidos ou seus sais. Os tampões adequados incluem, por exemplo, citrato, gluconato, tartarato, malato, acetato, lactato, oxalato, aspartato, malonato, glucoheptonato, piruvato, galactarato, glucarato, tartaronato, glutamato, glicina, lisina, glutamina, metionina, cisteína, arginina e uma mistura dos mesmos. Ácidos fosfóricos e fosforosos ou seus sais também podem ser utilizados. Tampões sintéticos são adequados para serem usados, mas é preferível usar tampões naturais, como compostos orgânicos e aminoácidos ou seus sais listados acima.

[000147]Em uma modalidade, o produto à base de micróbios pode compreender agentes de ajuste de pH, incluindo, por exemplo, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, carbonato ou bicarbonato de potássio, ácido clorídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico ou uma mistura dos mesmos.

[000148]Em uma modalidade, componentes adicionais, tais como uma preparação aquosa de um sal como ácido poliprótico, como bicarbonato ou carbonato de sódio, sulfato de sódio, fosfato de sódio, cloreto de sódio, bifosfato de sódio, podem ser incluídos na formulação.

[000149]Em uma modalidade, os prebióticos podem ser adicionados ao produto à base de micróbios para melhorar o crescimento microbiano benéfico. Os prebióticos adequados incluem, por exemplo, extrato de alga marinha, ácido fúlvico, ácido fumárico, quitina (ou derivados da quitina), humato e/ou ácido húmico.

[000150]Em uma modalidade exemplar, os produtos à base de micróbios compreendem ainda um ou mais dentre: um sal (por exemplo, cloreto de sódio), um solvente (por exemplo, etanol), um agente quelante (por exemplo, EDTA) e SLP purificado, além de antibióticos residuais do meio de cultivo.

[000151]Em uma modalidade, o produto à base de micróbios é formulado para aplicação no solo, sementes, plantas inteiras ou partes de plantas (incluindo, mas não limitado a, raízes, tubérculos, caules, flores e folhas). Em modalidades preferidas, o produto à base de micróbios é formulado para aplicação em biomassa acima do solo, como frutas e folhas.

[000152]Em certas modalidades, o produto à base de micróbios é formulado como, por exemplo, líquido, suspensões líquidas, emulsões, pós secos por congelamento ou pulverização, grânulos, peletes, géis, poeira, pó molhável, pó escoável, microcápsulas, óleos ou aerossóis. Em modalidades preferidas, a composição é formulada como um líquido, um líquido concentrado ou como pó ou grânulos secos que podem ser misturados com água e outros componentes para formar um produto líquido. Para melhorar ou estabilizar os efeitos da composição, ela pode ser misturada com adjuvantes adequados e depois usada como tal ou após diluição, se necessário.

[000153]Em uma modalidade, quando o produto é formulado como um grânulo ou pó seco, glicose e glicerina podem ser adicionadas para servir como um osmótico durante o armazenamento e o transporte. Em uma modalidade, o melaço pode ser incluído. Métodos de tratamento de uma infecção bacteriana de plantas

[000154]Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para melhorar a imunidade, saúde, crescimento e/ou produtividade das plantas, por exemplo, tratando e/ou prevenindo uma infecção bacteriana na planta, em que uma composição pesticida da presente invenção é aplicada à planta e/ou seu ambiente circundante. Em modalidades preferidas, a planta é uma planta cítrica.

[000155]Em algumas modalidades, a composição pesticida compreende um ou mais micro-organismos e/ou seu sub/produtos de crescimento. Em algumas modalidades, a composição pesticida não compreende micro-organismos vivos.

[000156]Em algumas modalidades, a composição pesticida não compreende micro-organismos, sejam vivos ou inativos. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição pesticida compreende subprodutos do crescimento microbiano, como biotensoativos e/ou enzimas, sem micro-organismos.

[000157]Em uma modalidade, o produto à base de micróbios é cultivado com baixas concentrações de antibióticos. Por exemplo, estreptomicina, eritromicina e/ou oxitetraciclina, podem estar presentes no meio de cultura em quantidades de 0 a 200 ppm, de 5 a 150 ppm ou de 10 a 100 ppm. Assim, o produto à base de micróbios pode compreender concentrações residuais de substâncias antibióticas quando aplicado a uma planta, cultura ou ambiente.

[000158]Como usado aqui, "aplicar" uma composição ou produto se refere ao contato de uma composição ou produto com um alvo ou local, de modo que a composição ou o produto possa ter um efeito nesse alvo ou local. O efeito pode ser devido, por exemplo, ao crescimento microbiano e/ou à ação de um metabólito, enzima, biotensoativo ou outro subproduto do crescimento.

[000159]A aplicação pode incluir o contato do produto à base de micróbio diretamente com uma planta, parte da planta e/ou o ambiente circundante da planta (por exemplo, o solo). O produto micróbio pode ser aplicado como um tratamento de sementes (por exemplo, revestimento de sementes), na superfície de uma planta (por exemplo, na superfície das folhas, frutas, flores ou raízes) e/ou na superfície do solo. Pode ser, por exemplo, pulverizado, derramado, espalhado e/ou transmitido por uma planta, cultura ou campo. Também pode ser, por exemplo, cultivada no solo, injetada no solo, administrada via encharcamento do solo e/ou administrada através de um sistema de irrigação.

[000160]Em uma modalidade, a composição pesticida é aplicada à folhagem e/ou fruto da planta.

[000161]Em uma modalidade, a composição pode ser aplicada eficientemente por meio de um sistema de irrigação por pivô central ou com um spray sobre o sulco das sementes.

[000162]Em uma modalidade, a composição pode ser aplicada à superfície do solo sem incorporação mecânica, onde a irrigação por chuva, aspersão, inundação ou gotejamento ativa a composição e permite que a composição se infiltre nas raízes das plantas.

[000163]As plantas e/ou seus ambientes podem ser tratados a qualquer momento durante o processo de cultivo da planta. Por exemplo, o produto à base de micróbios pode ser aplicado ao solo antes, simultaneamente ou após o tempo em que as sementes são plantadas no solo. Também pode ser aplicado em qualquer momento posterior durante o desenvolvimento e crescimento da planta, inclusive quando a planta estiver florescendo, frutificando e durante e/ou após a abscisão das folhas.

[000164]Em certas modalidades, a planta que recebe tratamento é saudável. Em outras modalidades de método, a planta é afetada por uma doença ou sintomas de doenças de plantas. A doença é preferencialmente uma doença bacteriana.

[000165]Exemplos de infecções bacterianas que afetam plantas, contra as quais a presente invenção é útil, incluem, mas não se limitam a, Pseudomonas (por exemplo, P. savastanoi, Pseudomonas syringae pathovars); Ralstonia solanacearum; Agrobacterium (por exemplo, A. tumefaciens); Xanthomonas (por exemplo, X. oryzae pv. Oryzae; X. pathovars campestris; X. axonopodis pathovars); Erwinia (por exemplo, E. amylovora); Xylella (por exemplo, X. fastidiosa); Dickeya (por exemplo, D. dadantii e D. solani); Pectobacterium (por exemplo, P. carotovorum e P. atrosepticum); Clavibacter (por exemplo, C. michiganensis e C. sepedonicus); Candidatus Liberibacter asiaticus; Pantoea; Ralstonia; Burkholderia; Acidovorax; Streptomyces; Espiroplasma; Fitoplasma; huanglongbing (HLB, doença do esverdeamento cítrico); doença do cancro cítrico, doença das manchas bacterianas das plantas cítricas, clorose variegada das plantas cítricas, apodrecimento dos alimentos e raízes das plantas cítricas, doença das plantas cítricas e manchas pretas.

[000166]Em modalidades preferidas, os métodos são utilizados para tratar a doença de esverdeamento cítrico (Candidatus Liberibacter asiaticus) e/ou doença do cancro cítrico (X. axonopodis).

[000167]Em uma modalidade, o método controla as próprias bactérias patogênicas. Em uma modalidade, o método funciona melhorando a saúde imunológica das plantas para aumentar a capacidade de combater infecções.

[000168]Em algumas modalidades, os métodos são usados para tratar pragas que atuam como vetores ou veículos para pragas bacterianas. Assim, os métodos em questão podem impedir a propagação de bactérias patogênicas de plantas, controlando essas pragas transportadoras.

[000169]Em certas doenças de plantas causadas por bactérias patogênicas de plantas (especialmente naquelas que causam pintas, cancros, manchas, galhas ou apodrecimento), as bactérias podem formar lesões nas plantas hospedeiras que produzem gotículas ou massas de exsudados pegajosos. Os exsudados bacterianos são liberados através das lesões, por exemplo, rachaduras ou feridas na área infectada, ou através de aberturas naturais na área infectada da planta. A bactéria pode então ser espalhada por, por exemplo, vento, equipamento agrícola e/ou vetores de doenças, como insetos, por exemplo, moscas, pulgões, formigas, besouros, moscas brancas, abelhas, etc., e/ou nemátodos.

[000170]As bactérias podem grudar nas pernas, corpos e peças bucais dessas pragas. A bactéria também pode crescer dentro do sistema digestivo e na hemolinfa de pragas. Quando os insetos se deslocam para outras partes da planta ou para outras plantas hospedeiras suscetíveis, elas carregam as bactérias.

[000171]Em uma modalidade específica, a praga do vetor é um psilídeo, como o psilídeo cítrico asiático ou psilídeo cítrico africano, ambos vetores conhecidos da doença de esverdeamento cítrico. Em algumas modalidades, o vetor está em qualquer estágio do desenvolvimento em seu ciclo de vida, incluindo os estágios larval e/ou ninfa.

[000172]Em algumas modalidades, a presente invenção é útil para o tratamento de pragas de vetores devido à sua capacidade de sufocar as pragas. Por exemplo, muitos insetos respiram através de aberturas externas em seus corpos, chamadas espiráculo. Ao penetrar e, em alguns casos, bloquear esses espiráculos, as composições pesticidas da presente invenção impedem a troca gasosa necessária para a praga sobreviver.

[000173]Além de tratar e/ou prevenir infecções bacterianas, a presente invenção pode ser usada para melhorar a saúde, o crescimento e o rendimento de plantas e/ou culturas em, por exemplo, agricultura, horticultura, estufas, paisagismo e similares.

[000174]Em certas modalidades, os métodos e composições de acordo com a presente invenção reduzem os danos a uma planta causados por pragas, em comparação com uma planta não tratada, em até 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%,

70%, 80% ou 90% ou mais.

[000175]Em uma modalidade, os métodos e as composições de acordo com a presente invenção aumentam o rendimento da colheita em pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou mais em comparação com uma colheita não tratada.

[000176]Em outra modalidade, os métodos e as composições de acordo com a presente invenção podem aumentar a biomassa vegetal em pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% ou mais em comparação com uma planta não tratada.

[000177]O produto à base de micróbios também pode ser aplicado de modo a promover a colonização das raízes e/ou rizosfera, bem como o sistema vascular da planta, a fim de promover a saúde e a vitalidade das plantas. Assim, micróbios fixadores de nutrientes, como rizóbio e/ou micorrizas, podem ser promovidos, bem como outros endógenos (já presentes no solo), bem como exógenos, micróbios ou seus subprodutos que promovem o crescimento, a saúde e/ou a produção. O produto à base de micróbios também pode suportar o sistema vascular de uma planta, por exemplo, entrando e colonizando o referido sistema vascular e contribuindo com metabólitos e nutrientes importantes para a saúde e a produtividade da planta.

[000178]Em uma modalidade, o método pode ser usado para aumentar a penetração de moléculas benéficas através das camadas externas das células vegetais, por exemplo, células-raiz.

[000179]A presente invenção também pode ser usada para melhorar uma ou mais qualidades do solo, melhorando assim o desempenho dos solos para fins agrícolas, domésticos e de jardinagem.

[000180]A presente invenção pode ser usada para melhorar qualquer número de qualidades em qualquer tipo de solo, por exemplo, argila, arenoso, siltoso, turfoso, calcário, solo argiloso e/ou combinações dos mesmos. Além disso, os métodos e composições podem ser utilizados para melhorar a qualidade de solos secos, alagados, porosos, empobrecidos, compactados e/ou combinações dos mesmos.

[000181]Em uma modalidade, o método pode ser usado para melhorar a drenagem e/ou dispersão de água em solos alagados. Em uma modalidade, o método pode ser usado para melhorar a retenção de água em solo seco.

[000182]Em uma modalidade, o método pode ser usado para melhorar a retenção de nutrientes em solos porosos e/ou empobrecidos.

[000183]Em certas modalidades, a composição pode ser usada para aumentar a eficácia de outros compostos, por exemplo, aumentando a penetração de um composto de droga (por exemplo, um antibiótico) em uma planta ou praga.

[000184]Os produtos à base de micróbios também podem ser usados para suplementar outros tratamentos, por exemplo, tratamentos com antibióticos. Vantajosamente, a presente invenção ajuda a reduzir a quantidade de antibióticos que devem ser administrados a uma cultura ou planta para ser eficaz no tratamento e/ou prevenção de infecções bacterianas.

[000185]De acordo com os métodos em questão, a composição pesticida pode ser aplicada isoladamente ou em combinação com outros compostos para controlar pragas e/ou para melhorar eficientemente a imunidade, saúde e crescimento das plantas. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição compreende ainda, e/ou é aplicada juntamente com herbicidas comerciais e/ou naturais, fertilizantes, pesticidas, antibióticos e/ou corretivos do solo.

[000186]Em algumas modalidades, o tratamento é aprimorado com um ou mais de: uma substância aderente, como goma xantana, um sal, como cloreto de sódio, um solvente, como etanol, um biotensoativo purificado, como SLP, e/ou um agente quelante, como EDTA.

[000187]Em uma modalidade, a composição pode ser misturada e/ou aplicada com um fertilizante comercial, como o Miracle-Gro® de Scott, ou outra fonte de nutrientes (por exemplo, macronutrientes nitrogênio-fósforo-potássio (NPK)). Outros componentes adicionais que podem ser incluídos são macronutrientes e/ou micronutrientes, como magnésio, fosfato, nitrogênio, potássio, selênio, cálcio, enxofre, ferro, cobre e zinco e/ou prebióticos, como extrato de alga marinha, ácido fúlvico, ácido fumárico, quitina (ou derivados da quitina), humato e/ou ácido húmico. Os materiais e as quantidades exatos dos mesmos podem ser personalizados para uma determinada cultura ou planta com base nas suas necessidades e podem ser determinados por um produtor ou um cientista agrícola.

[000188]A composição também pode ser usada em combinação com outros sistemas de gerenciamento de culturas. Em uma modalidade, a composição pode opcionalmente compreender ou ser aplicada com pesticidas e/ou repelentes naturais e/ou químicos, como, por exemplo,

azoxistrobina, ipconazol, metalaxil, trifloxistrobina, clothiandin, VOTiVO, tiametoxam, ciantaniliprole, fludioxonil, tioxazafeno, glicolipídios, lipopeptídeos, DEET, terra de diatomáceas, citronela, óleos essenciais, óleos minerais, extrato de alho, extrato de pimentão e/ou qualquer pesticida comercial e/ou caseiro conhecido que seja compatível com a combinação de micro-organismos sendo aplicados.

[000189]Os métodos podem ainda compreender a adição de materiais para melhorar o crescimento de micróbios benéficos e/ou crescimento de plantas durante a aplicação (por exemplo, adição de prebióticos ou outros nutrientes). Outros materiais adicionais podem incluir, por exemplo, nutrientes como magnésio, fosfato, nitrogênio, potássio, selênio, cálcio, enxofre, ferro, cobre e zinco. Os materiais exatos e as quantidades destes podem ser determinados por uma pessoa versada na técnica de cultivo de plantas. Plantas alvo

[000190]A presente invenção pode ser útil na prevenção e/ou tratamento de infecções bacterianas que causam doenças nas plantas.

[000191]Conforme usado aqui, o termo “planta” inclui, mas não se limita a, quaisquer espécies de madeira, ornamentais ou decorativas, culturas ou cereais, frutas ou vegetais, plantas frutíferas ou vegetais, flor ou árvore, macroalga ou microalga, fitoplâncton e algas fotossintéticas (por exemplo, algas verdes Chlamydomonas reinhardtii). Também se refere a uma planta unicelular (por exemplo, microalgas) e a uma pluralidade de células vegetais que são amplamente diferenciadas em uma colônia (por exemplo, volvox) ou uma estrutura que está presente em qualquer estágio do desenvolvimento de uma planta. Tais estruturas incluem, entre outras, um fruto, uma semente, uma parte aérea, um caule, uma folha, uma pétala de flor etc.

[000192]Além disso, a planta pode estar sozinha, por exemplo, em um jardim, ou pode ser uma das muitas plantas, por exemplo, como parte de um pomar ou colheita agrícola.

[000193]O termo "tecido vegetal" inclui tecidos diferenciados e indiferenciados de plantas, incluindo aqueles presentes nas raízes, brotos, folhas, pólen, sementes e tumores, bem como células em cultura (por exemplo, células únicas, protoplastos, embriões, calos, etc.). O tecido vegetal pode estar em planta, em cultura de órgãos, cultura de tecidos ou cultura de células. O termo "parte da planta", conforme aqui utilizado, refere-se a uma estrutura ou tecido de planta.

[000194]Em algumas modalidades, as plantas são plantas de colheita. Conforme usado aqui, "plantas de colheita" se refere a qualquer espécie de planta ou alga comestível por seres humanos ou usada como alimento para animais ou peixes ou animais marinhos, ou consumida por seres humanos ou usada por seres humanos (por exemplo, pesticidas naturais) ou vista por seres humanos (por exemplo, flores, árvores) ou qualquer planta ou alga, ou parte dela, usada na indústria, comércio ou educação.

[000195]Em modalidades preferidas específicas, a planta é uma planta cítrica. Exemplos de plantas cítricas de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, laranjeiras; limoeiros, tílias e/ou árvores da toranja. Outros exemplos incluem Citrus maxima (Pomelo), Citrus medica (Cidreira), Citrus micrantha (Papeda), Citrus reticulata (Mandarina), Citrus paradisi (toranja), Citrus japonica (kumquat), Citrus australasica (Australian Finger Lime), Citrus australis (Limão australiano redondo), Citrus glauca (limão australiano do deserto), Citrus garrawayae (limão branco do monte), Citrus gracilis (limão Kakadu ou limão Humpty Doo), Citrus inodora (limão do rio Russel), Citrus warburgiana (limão selvagem da Nova Guiné), Citrus wintersii (limão do rio Brown), Citrus halimii (limau kadangsa, limau kedut kera), Citrus indica (laranja silvestre indiana), Citrus macroptera e Citrus latipes, Citrus x aurantiifolia (limão chave), Citrus x aurantium (laranja amarga), Citrus x latifolia (lima da pérsia), Citrus x limon (limão), Citrus x limonia (limão-cravo), Citrus x sinensis (laranja doce), Citrus x tangerina (tangerina), limão imperial, tangelo, orangelo, tangor, kinnow, kiyomi, Minneola tangelo, oroblanco, ugli, mão de Buda, cidra, laranja-camomila, laranja-sangue, calamondina, clementina, limão Meyer e yuzu.

[000196]Em algumas modalidades, a planta é um parente de uma planta cítrica, como jasmim laranja, limeberry e laranja trifoliada (Citrus trifolata).

[000197]Outros exemplos de plantas para as quais a invenção é útil incluem, entre outros, cereais e gramíneas (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveia, arroz, milho, sorgo, milho), beterraba (por exemplo, beterraba açucarada ou forrageira); culturas de leguminosas (por exemplo, feijão, lentilha, ervilha ou soja); oleaginosas (por exemplo, colza, mostarda, papoilas, azeitonas, girassóis, coco, mamona, cacau ou nozes); cucurbitáceas (por exemplo, abóboras, pepinos ou melão); plantas de fibra (por exemplo, algodão, linho, cânhamo ou juta); Lauraceae (por exemplo, abacate, canela ou cânfora); e também amêndoa, maçã, aspargo, frutas vermelhas, banana, repolho, cacau, cenoura, mandioca, cereja, pimentão, plantas cítricas, coco, café, milho, algodão, berinjela, uva, lúpulo, leguminosa, alface, manga, azeitona, cebola, palmito, pera, pêssego, ameixa, amendoim, pimenta, batata, colza, arroz, borracha, soja, morango, cana-de-açúcar, girassol, batata doce, chá, tabaco, tomate, noz, inhame, frutas venenosas, frutas de caroço, frutas moles, ervas, especiarias, espinafre, plantas medicinais, família de bananeira, plantas de látex, flores cortadas e ornamentais e quaisquer parentes dos mesmos. Produção local de produtos à base de micróbios

[000198]Em certas modalidades da presente invenção, uma instalação de crescimento de micróbios produz micro- organismos frescos de alta densidade e/ou subprodutos de crescimento microbiano de interesse em uma escala desejada. A instalação de crescimento de micróbios pode estar localizada no ou próximo ao local da aplicação. A instalação produz composições à base de micróbios de alta densidade em cultivo em lote, quase contínuo ou contínuo.

[000199]As instalações de crescimento de micróbios da presente invenção podem estar localizadas no local onde o produto à base de micróbios será usado (por exemplo, um bosque de plantas cítricas). Por exemplo, a instalação de crescimento de micróbios pode ser menor que 300, 250, 200,

150, 100, 75, 50, 25, 15, 10, 5, 3 ou 1 milha a partir do local de uso.

[000200]Como o produto à base de micróbios pode ser gerado localmente, sem recorrer aos processos de estabilização, preservação, armazenamento e transporte de micro-organismos da produção microbiana convencional, uma densidade muito maior de micro-organismos pode ser gerada, exigindo assim um volume menor do produto à base de micróbios para uso na aplicação no local ou que permita aplicações microbianas de densidade muito maior, quando necessário, para alcançar a eficácia desejada. Isso permite um biorreator em escala reduzida (por exemplo, vaso de fermentação menor, suprimentos menores de material de partida, nutrientes e agentes de controle de pH), o que torna o sistema eficiente e pode eliminar a necessidade de estabilizar as células ou separá-las do meio de cultura. A geração local do produto à base de micróbios também facilita a inclusão do meio de crescimento no produto, quando desejado. O meio pode conter agentes produzidos durante a fermentação que são particularmente adequados para uso local.

[000201]Culturas de micróbios robustas e de alta densidade produzidas localmente são mais eficazes no campo do que aquelas que permanecem na cadeia de suprimentos há algum tempo. Os produtos à base de micróbios da presente invenção são particularmente vantajosos em comparação com produtos tradicionais em que as células foram separadas dos metabólitos presentes no meio de crescimento da fermentação. Os tempos reduzidos de transporte permitem a produção e entrega de novos lotes de micróbios e/ou seus metabólitos no tempo e no volume exigidos pela demanda local.

[000202]As instalações de crescimento de micróbios da presente invenção produzem composições frescas à base de micróbios, compreendendo os próprios micróbios, metabólitos microbianos e/ou outros componentes do meio em que os micróbios são cultivados. Se desejado, as composições podem ter uma alta densidade de células vegetativas ou propágulos, ou uma mistura de células vegetativas e propágulos.

[000203]Em uma modalidade, a instalação de crescimento de micróbios está localizada em ou próximo a um local onde os produtos à base de micróbios serão usados (por exemplo, um bosque de plantas cítricas), por exemplo, dentro de 300 milhas (480 km), 200 milhas (321 km) ou mesmo dentro de 100 milhas (160 km). Vantajosamente, isso permite que as composições sejam adaptadas para uso em um local especificado. A fórmula e a potência das composições à base de micróbios podem ser personalizadas para condições locais específicas no momento da aplicação, como, por exemplo, que tipo de solo, planta e/ou cultura estão sendo tratados; que estação, clima e/ou época do ano é quando uma composição está sendo aplicada; e qual modo e/ou taxa de aplicação está sendo utilizada.

[000204]Vantajosamente, as instalações de crescimento de micróbios distribuídos fornecem uma solução para o problema atual de depender de produtores industriais de grande porte cuja qualidade do produto sofre devido a atrasos no processamento ascendente, gargalos na cadeia de suprimentos, armazenamento inadequado e outras contingências que inibem a entrega e aplicação oportunas de, por exemplo, um produto viável, de alta contagem de células e o meio e os metabólitos associados nos quais as células são originalmente cultivadas.

[000205]Além disso, produzindo uma composição localmente, a formulação e a potência podem ser ajustadas em tempo real para um local específico e as condições presentes no momento da aplicação. Isso fornece vantagens sobre composições pré-fabricadas em um local central e, por exemplo, definem proporções e formulações que podem não ser ideais para um determinado local.

[000206]As instalações de crescimento de micróbios oferecem versatilidade de fabricação por sua capacidade de adaptar os produtos à base de micróbios para melhorar as sinergias com as geografias de destino. Vantajosamente, em modalidades preferidas, os sistemas da presente invenção aproveitam o poder de micro-organismos locais naturais e seus subprodutos metabólicos para melhorar a saúde das plantas, o crescimento radicular e a produtividade.

[000207]O tempo de cultivo para os vasos individuais pode ser, por exemplo, de 1 a 7 dias ou mais. O produto de cultivo pode ser colhido de várias maneiras diferentes.

[000208]A produção e entrega local dentro de, por exemplo, 24 horas de fermentação resultam em composições puras de alta densidade celular e custos de transporte substancialmente mais baixos. Dadas as perspectivas de avanço rápido no desenvolvimento de inoculantes microbianos mais eficazes e poderosos, os consumidores se beneficiarão muito dessa capacidade de fornecer rapidamente produtos à base de micróbios.

EXEMPLOS

[000209]Uma maior compreensão da presente invenção e de suas muitas vantagens pode ser obtida a partir dos exemplos a seguir, dados como ilustração. Os exemplos a seguir são ilustrativos de alguns dos métodos, aplicações, modalidades e variantes da presente invenção. Eles não devem ser considerados como limitativos da invenção. Numerosas alterações e modificações podem ser feitas com relação à invenção. EXEMPLO 1 - PREPARAÇÃO DOS SOFOROLIPÍDIOS

[000210]Uma mistura natural de soforolipídios foi sintetizada por fermentação de S. bombicola em meio de fermentação contendo 10 a 100 ppm de estreptomicina, eritromicina e/ou oxitetraciclina, 100 g/L de glicose, 10 g/L de extrato de levedura, 1 g/L de ureia e 100 ml/L de óleo de canola em água. Até 200 ppm de SLP também podem ser usados para complementar a cultura.

[000211]A levedura e o meio de cultura foram incubados a pH 3,0 a 3,5 sob condições aeróbicas e por um período de tempo suficiente para o acúmulo inicial de biomassa (tipicamente cerca de 24 horas a cerca de 48 horas). A temperatura foi mantida entre 22°C e 28°C e a concentração de oxigênio dissolvido foi mantida entre 15% e 30% (de 100% de ar ambiente). Uma vez alcançado o acúmulo inicial de biomassa, o pH foi ajustado para 5,5 e o processo continuou.

[000212]Quando a cultura acidificou para pH 3,5, o processo de fermentação continuou, mantendo o pH estável nesse nível até que a acumulação suficiente de SLP fosse alcançada no meio. Após 72 horas de fermentação, os soforolipídios precipitaram como uma camada viscosa marrom no fundo do vaso de fermentação.

[000213]As SLPs foram posteriormente recuperadas do meio de fermentação para serem usadas com ou sem a biomassa celular (dependendo das áreas e tipos de aplicação). A camada de soforolipídio foi diluída para uma concentração de SLP de 0,05 a 0,5 g/L para uso na produção de produtos à base de micróbios. Vantajosamente, o caldo soforolipídio também contém algumas células de levedura residuais e quantidades vestigiais de metabólitos e componentes do meio. EXEMPLO 2 - PREPARAÇÃO DO PRODUTO DE TRATAMENTO DE MEL

[000214]Os sistemas de assunto podem ser utilizados para produzir lipídios de manosileritritol (MELs) em escala industrial e sem contaminação da cultura de produção.

[000215]Uma cultura de sementes de Pseudozyma aphidis foi produzida a um pH de 6,2. O meio para cultivar a cultura de sementes foi composto por (g/L): Glicose, 50g NH4NO3, 1g KH2PO4, 0,5g K2HPO4, 0,5g MgSO4, 0,2 g Extrato de levedura, 1g

[000216]A cultura de sementes foi rodada a 100 rpm por dois dias a 30°C. Foi então usado como inoculante para a produção de MEL no reator de tanque único.

[000217]O meio para produção de MEL a pH 6,2 compreendeu (g/L ou mL/L): NaNO3, 2g

KH2P43, 0,2g MgSO4, 0,2 g Extrato de levedura, 1g H2O, 920 mL Óleo de canola, 80 mL (autoclavado separadamente).

[000218]O volume do meio foi ajustado para o volume desejado, menos o volume de óleo de canola. O meio também pode ser suplementado com 10 a 100 ppm de estreptomicina, eritromicina e/ou oxitetraciclina, ou até 200 ppm de soforolipídio puro.

[000219]A levedura e o meio de cultura foram incubados sob condições aeróbicas e por um período de tempo suficiente para o acúmulo inicial de biomassa (tipicamente cerca de 24 horas a cerca de 48 horas). A temperatura de cultivo foi de 27 a 30°C, com taxa de agitação de 300 a 500 rpm, DO a 5 a 30% (ou de 15 a 20%) e circulação de ar a 1 V/Vm.

[000220]Após dois dias de fermentação, foram adicionados 40 g/L de eritritol em H2O. O processo de fermentação continuou, mantendo o pH estável até a acumulação suficiente de MELs ser alcançada no meio. O tempo total de fermentação foi de 15 dias.

[000221]A concentração total de MEL que pode ser produzida varia de 50 a 100 g/L. A temperatura pode então ser aumentada para 70 a 90 °C se a inativação das células de levedura for desejada. A camada oleosa (MELs) é então coletada e pode ser preparada como um produto à base de micróbios para uma variedade de usos, incluindo os métodos da presente invenção.

Claims (21)

REIVINDICAÇÕES EMENDADAS

1. Composição para tratamento e/ou prevenção de um patógeno bacteriano de planta, a composição caracterizada pelo fato de compreender um ou mais micro-organismos benéficos e/ou subprodutos do crescimento microbiano, uma ou mais substâncias aderentes, e pelo menos uma concentração de antibióticos de cerca de 200 ppm ou menos.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente cloreto de sódio, etanol e/ou um biotensoativo purificado.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o biotensoativo purificado é um soforolipídio (SLP).

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um antibiótico selecionado entre estreptomicina, eritromicina e oxitetraciclina.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os micro-organismos benéficos são leveduras, fungos e/ou bactérias.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os micro-organismos benéficos são cultivados em um meio compreendendo o antibiótico.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os micro-organismos benéficos são selecionados de Starmerella bombicola, Wickerhamomyces anomalus, Pseudozyma aphidis, Meyerozyma guilliermondii, Pichia occidentalis e Pichia kudriavzevii.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os micro-organismos benéficos são bactérias não patogênicas para as plantas selecionadas de Bacillus amyloliquefaciens, Pseudomonas chlororaphis e Rhodococcus erythropolis.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que os subprodutos do crescimento microbiano são biotensoativos e/ou enzimas.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que os biotensoativos são glicolipídios e/ou lipopeptídeos.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que os biotensoativos são selecionados de soforolipídios (SLP), lipídios de trealose, lipídios de manosileritritol (MEL), surfactina, liquenisina e atrofactina.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que as enzimas são quitinase e/ou beta-glucanase.

13. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de não conter micro-organismos vivos.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de não compreender micro-organismos vivos ou inativos.

15. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a substância aderente é goma xantana e/ou goma guar.

16. Método para melhorar a imunidade, saúde,

crescimento e/ou produtividade das plantas, caracterizado pelo fato de que uma composição conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 15 é aplicada à planta e/ou seu ambiente circundante.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a planta é uma planta cítrica.

18. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser utilizado para tratar e/ou prevenir uma infecção bacteriana na planta.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de ser usado para tratar e/ou prevenir a doença de esverdeamento cítrico e/ou doença de cancro de plantas cítricas.

20. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de ser usado para controlar uma praga que pode atuar como um vetor ou veículo para um patógeno bacteriano de planta.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a praga é psilídeo cítrico asiático ou psilídeo cítrico africano.