BR112019016530A2

BR112019016530A2 - Dispositivo portátil e métodos para a produção eficiente de micróbios

Info

Publication number: BR112019016530A2
Application number: BR112019016530-4A
Authority: BR
Inventors: Farmer Sean; Alibek Ken; Dixon Tyler
Original assignee: Locus Ip Company, Llc
Priority date: 2017-02-10
Filing date: 2018-02-12
Publication date: 2020-03-31
Also published as: US20200002660A1; AU2018219368A1; JP2020507323A; CA3052977A1; EP3580324A1; WO2018148656A1; EA201991886A1; CO2019008681A2; PH12019501830A1; SG11201907300TA; ZA201905305B; CL2019002261A1; KR20190108645A; CN110494545A; IL268582A; CR20190415A; PE20191633A1; MX2019009574A; EP3580324A4

Abstract

a presente invenção refere-se a dispositivos e métodos para a produção de composições à base de micróbios que podem ser usadas na indústria de óleo e gás, na limpeza ambiental, bem como em outras aplicações. os dispositivos e os métodos podem produzir culturas de leveduras submersas escaláveis para a inoculação de sistemas de fermentação no local de maior faixa. um dispositivo pode incluir um cilindro rotativo montado em uma armação de suporte e um motor conectado ao cilindro e que faz com que o cilindro gire.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ’’DISPOSITIVO PORTÁTIL E MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO EFICIENTE DE MICRÓBIOS”.

REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS [001] O presente pedido de patente reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório U.S. n°. de série 62/457.445, depositado em 10 de fevereiro de 2017, o qual é incorporado no presente documento a título de referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras, tabelas e desenhos.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção refere-se a dispositivos e métodos para a produção de composições à base de micróbios que podem ser usadas, por exemplo, na indústria de óleos, na agricultura, na aquacultura, na mineração, no tratamento de resíduos e na biorremediação.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [003] O cultivo de micro-organismos, tais como bactérias, leveduras e fungos, é importante para a produção de uma ampla variedade de biopreparados úteis. Os micro-organismos desempenham papéis cruciais, por exemplo, nas indústrias de alimentos, nos produtos farmacêuticos, na agricultura, na mineração, na remediaçâo ambiental e no gerenciamento de resíduos.

[004] Há um enorme potencial para o uso de fungos em uma ampla gama de indústrias. O fator de restrição na comercialização de produtos à base de fungos tem sido o custo por densidade do propágulo, onde é particularmente caro e impraticável a aplicação de produtos fungais às operações de larga escala a concentrações suficientes para ver os benefícios.

[005] Há duas formas principais de cultivo de micro-organismos:

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2/30 cultivo submerso e cultivo de superfície. As bactérias, as leveduras e os fungos podem ser todos cultivados ao usar um ou outro método. Ambos os métodos de cultivo requerem um meio nutriente para o crescimento dos micro-organismos. O meio nutriente, que pode estar em uma forma líquida ou sólida, inclui tipicamente uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, sais e nutrientes e os microelementos adicionais apropriados. O pH e os níveis de oxigênio são mantidos em valores apropriados para um determinado micro-organismo.

[006] A agricultura e a indústria de óleo são duas indústrias nas quais os micróbios podem desempenhar papéis altamente benéficos se eles puderem se tomar mais prontamente disponíveis, e de preferência em uma forma mais ativa.

[007] Uma vez que o óleo cru flui através de um poço, as substâncias no óleo cru frequentemente sâo coletadas nas superfícies das linhas de produção, causando uma redução no fluxo e até mesmo paralisando a produção como um todo. Uma variedade de produtos químicos e equipamentos diferentes são utilizados para inibir ou impedir e remediar esse problema, mas há uma necessidade quanto a produtos e métodos melhores, especialmente métodos mais ambientalmente amigáveis que tenham uma melhor eficácia e uma toxicidade reduzida. [008] A fim de impulsionar rendimentos e proteger as plantações contra patógenos, pragas e doenças, os fazendeiros confiam bastante no uso de produtos químicos sintéticos e fertilizantes químicos; no entanto, quando são usadas em excesso ou aplicadas de maneira inadequada, essas substâncias podem escapar na água da superfície, lixiviar na água subterrânea, e evaporar no ar. Mesmo quando usados corretamente, a superdependência e o uso a longo prazo de determinados fertilizantes químicos e pesticidas alteram de maneira nociva o ecossistema do solo, reduzem a tolerância ao stress, aumentam a resistência das pragas, e impedem o crescimento e a

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3/30 vitalidade de plantas e animais.

[009] Embora a eliminação por atacado dos produtos químicos não seja praticável neste momento, os fazendeiros estão cada vez mais adotando o uso de medidas biológicas como componentes viáveis de Gerenciamento de Nutriente Integrado e de Programas de Gerenciamento de Pragas Integrado. Por exemplo, nos anos recentes, o controle biológico dos nematoides gerou um grande interesse. Esse método utiliza agentes biológicos tais como micróbios vivos, bloprodutos derivados desses micróbios, e as combinações dos mesmos como pesticidas. Esses pesticidas biológicos têm vantagens importantes em relação a outros pesticidas convencionais. Por exemplo, eles são menos prejudiciais em comparação aos pesticidas químicos convencionais. Eles são mais eficientes e específicos. Eles normalmente biodegradam rapidamente, conduzindo a uma menor poluição ambiental.

[0010] O uso de biopesticidas e outros agentes biológicos tem sido bastante limitado por dificuldades na produção, no transporte, na administração, na fixação do preço e na eficácia. Por exemplo, muitos micróbios são difíceis de cultivar e ser aplicados subsequentemente aos sistemas agrícolas e de produção de óleo em quantidades suficientes para que sejam úteis. Este problema é exacerbado por perdas na viabilidade e/ou na atividade devido ao processamento; à formulação; à armazenagem; à estabilização antes da distribuição; à esporulação de células vegetativas como meio de estabilização; ao transporte e à aplicação.

[0011] As composições à base de micróbios podem ajudar a satisfazer essas necessidades se métodos mais eficientes de cultivo para a produção em massa de micro-organismos e metabolites microbianas estiverem disponíveis.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

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4/30 [0012] A presente invenção provê dispositivos e métodos para a produção de composições à base de micróbios que podem ser usadas na indústria de óleo e gás, na agricultura, na biorremediação, na aquacultura e em muitas outras aplicações. Especificamente, a presente invenção provê métodos e materiais para o cultivo eficiente de micro-organismos e a produção de subprodutos de crescimento microbiano. A presente invenção também provê dispositivos para tal cultivo e produção.

[0013] Mais especificamente, a presente invenção provê um dispositivo de fermentação que pode ser usado e transportado a um custo baixo sem requer treinamento ou habilidade especiais. Em modalidades específicas, o dispositivo e os métodos são usados para cultivar os inóculos de leveduras es fungos, que podem então ser usados em sistemas de fermentação maiores. Em determinadas modalidades, o dispositivo e os métodos são usados para a produção de inóculos de leveduras de Starmerelía bombicola.

[0014] Em uma modalidade, o dispositivo da presente invenção compreende um cilindro rotativo suportado por uma armação, a qual pode ter as rodas. A rotação do cilindro é obtida mediante o uso de um motor (por exemplo, um motor elétrico) conectado a uma fonte de alimentação (por exemplo, o dispositivo pode ter uma batería ou um cabo de energia para conectar a uma fonte de alimentação externa). O cilindro também pode ser conectado a um sistema de aeração, por exemplo, um sistema de aeração que compreende uma bomba de ar. Isto serve para fornecer ar à superfície da cultura dentro do cilindro e também pode servir como um meio para regular a temperatura interna. [0015] Defletores podem ser fixados à superfície interna do cilindro, para ajudar na agitação e na aeração da cultura. Enquanto o cilindro gira, a cuitura é misturada no mesmo e oxigenada peio ar ambiente, bem como pelo ar fornecido pelo sistema de aeração.

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5/30 [0016] Em modalidades preferidas, o dispositivo opera continuamente durante todo o processo de cultivo. O dispositivo pode ser operado tanto tempo quanto for necessário para produzir um volume suficiente da cultura, dependendo da espécie particular do microorganismo que está sendo produzido. Por exemplo, o dispositivo de misturação pode ser operado continuamente por 1, 2, 3, 4, 5 ou mais dias (ou qualquer porção dos mesmos).

[0017] Vantajosamente, o dispositivo pode ser eficazmente auto esterilizado. Por exemplo, os micro-organismos cultivados dentro do dispositivo de misturação podem ser as cepas que produzem metabólitos ou subprodutos microbicidas, tais como biotensoativos. Desse modo, a própria cultura do micróbio pode prover o controle de micro-organismos indesejados dentro do cilindro, simultaneamente com o cultivo de micro-organismos desejados.

[0018] Em modalidades preferidas, a presente invenção provê métodos de cultivo que simplificam a produção e facilitam a portabilidade de composições e produtos à base de micróbios úteis. Os métodos provêm o cultivo submerso das composições de micróbios apropriadas para a inoculação de sistemas de fermentação em larga escala.

[0019] O inóculo produzido pelo presente dispositivo e método pode ser usado para inocular um sistema de fermentação presente no local para a produção de grandes quantidades de composições à base de micróbios. Em modalidades preferidas, o presente dispositivo e os métodos também podem ser usados no local, de maneira tal que a cultura do inóculo pode ser transferida diretamente do dispositivo ao sistema de fermentação no local.

[0020] Vantajosamente, a presente invenção reduz os custos de capital e de mão de obra da produção de micro-organismos e seus metabólitos. Além disso, o processo de cultivo da presente invenção

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6/30 reduz ou elimina a necessidade de concentrar ou então processar os micróbios depois de ter sido completado o cultivo.

[0021] A portabilidade pode resultar em economias de custo significativas, uma vez que os inóculos para as composições à base de micróbios podem ser produzidos em, ou perto do sítio de inoculaçâo pretendido. Vantajosamente, o inóculo pode ser produzido no local ao usar materiais encontrados no local caso desejado, desse modo reduzindo os obstáculos de logística e os custos de transporte e envio. Além disso, os produtos finais produzidos com a escalação de inóculos podem incluir micróbios viáveis no momento da aplicação.

[0022] As composições produzidas pela presente invenção podem ser usadas para a inoculaçâo ode sistemas de fermentação em larga escala para o uso em uma ampla variedade de aplicações da indústria de petróleo. Essas aplicações incluem, mas sem ficar a elas limitadas, um realce na recuperação de óleo cru; uma redução na viscosidade do óleo; a remoção de parafina das hastes, da tubulação, das forrações e das bombas; a inibição ou a prevenção da corrosão do equipamento de petróleo; o fraturamento de líquidos; a redução da concentração de HzS no óleo cru extraído; bem como a limpeza do tanque, da linha de fluxo e da tubulação.

BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA [0023] Figura 1 mostra um dispositivo de acordo com uma modalidade da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0024] A presente invenção provê dispositivos e métodos para a produção de composições à base de micróbios que podem ser usadas na indústria de óleo e gás, na agricultura, na biorremediação, na aquacultura e em muitas outras aplicações. Especificamente, a presente invenção provê métodos e materiais para o cultivo eficiente de micro-organismos e a produção de subprodutos de crescimento

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7/30 microbiano. A presente invenção também provê dispositivos para tal cultivo e produção.

[0025] Mais especificamente, a presente invenção provê um dispositivo de fermentação móvel que possa ser usado e transportado a baixo custo sem requerer um treinamento ou uma habilidade especial. [0026] Em modalidades específicas, o dispositivo e os métodos são usados para a produção de inóculos de leveduras e fungos. Em determinadas modalidades, o dispositivo e os métodos são usados para a produção de inóculos de leveduras de Starmerella bombícola.

[0027] Em uma modalidade, o dispositivo da presente invenção compreende um cilindro rotativo suportado por uma armação. A armação pode ter rodas para facilitar o movimento, embora isto não seja necessário. Por exemplo, o dispositivo pode incluir duas rodas em um lado sem nenhuma roda no outro lado de modo que o dispositivo possa ser inclinado para o transporte ao usar as rodas e estabilizado para permanecer no lugar (tal como mostrado na Figura 1). Alternativamente, o dispositivo pode incluir três ou mais rodas. A rotação do cilindro é obtida ao usar um motor. O motor pode ser movido, por exemplo, a eletricidade ou gás. De preferência, o motor é um motor elétrico que pode ser conectado a uma fonte de alimentação. Por exemplo, o dispositivo pode incluir uma bateria como uma fonte de alimentação, ou o dispositivo pode derivar a energia de uma fonte externa (por exemplo, através de um cabo de força ou através da transferência de energia sem fio).

[0028] O cilindro também pode ser conectado a um sistema de aeração que compreende, por exemplo, uma bomba de ar. Isto serve para fornecer ar à superfície da cultura dentro do cilindro e também pode servir como um meio para regular a temperatura interna.

[0029] Defletores podem ser fixados à superfície interna do cilindro, para ajudar na agitação e na aeração da cultura. Enquanto o cilindro

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8/30 gira, a cultura é misturada no mesmo e oxigenada pelo ar ambiente, bem como pelo ar fornecido pelo sistema de aeração.

[0030] Em modalidades preferidas, o dispositivo opera continuamente durante todo o processo de cultivo. O dispositivo pode ser operado tanto tempo quanto seja necessário para produzir um volume suficiente de cultura, dependendo da espécie particular do micro-organismo que está sendo produzido. Por exemplo, o dispositivo de misturação pode ser operado continuamente por 1,2, 3, 4, 5 ou mais dias (ou qualquer porção dos mesmos).

[0031] O dispositivo da presente invenção pode ser escalado dependendo do uso pretendido. Por exemplo, o cilindro pode variar no volume de alguns litros a várias centenas de litros ou mais.

[0032] Vantajosamente, o dispositivo pode ser eficazmente auto esterilizado. Por exemplo, os micro-organismos cultivados dentro do dispositivo de misturação podem ser cepas que produzem metabólitos ou subprodutos microbicidas, tais como biotensoativos. Desse modo, a própria cultura de micróbios pode prover o controle de micro-organismos indesejados dentro do cilindro, simultaneamente com o cultivo de microorganismos desejados. Alternativa, ou adicionalmente, o dispositivo pode ser esterilizado com meios externos, por exemplo, um agente esterilizante tal como o peróxido de hidrogênio.

[0033] Em modalidades preferidas, a presente invenção provê métodos de cultivo que simplificam a produção e facilitam a portabilidade de composições e produtos à base de micróbios úteis. Os métodos provêm o cultivo submerso das composições de micróbios apropriadas para a inoculação de sistemas de fermentação em larga escala.

[0034] Em determinadas modalidades, o método compreende a adição ao cilindro do dispositivo de fermentação de pelo menos um tipo de micro-organismo e, opcionalmente, nutrientes para os micro

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9/30 organismos; e a operação do dispositivo de misturação até uma quantidade suficiente de inóculo ser produzida. Os nutrientes podem incluir, por exemplo, uma ou mais fontes de carbono, proteínas, gorduras, fontes de nitrogênio, elementos de traço, e/ou fatores de crescimento (por exemplo, vitaminas, reguladores do pH).

[0035] O inóculo produzido pelo presente método pode ser usado para inocular um sistema de fermentação presente no local para a produção de grandes quantidades de composições à base de micróbios. Em modalidades preferidas, o presente dispositivo e métodos podem ser usados no local de maneira tal que a cultura do inóculo pode ser transferida diretamente do dispositivo a um sistema de fermentação no local em maior escala.

[0036] Em uma modalidade, a presente invenção também provê uma composição de inóculo que compreende pelo menos um tipo de micro-organismo e/ou pelo menos um metabolite microbiano produzidos pelo micro-organismo que foi cultivado ao usar o dispositivo da presente invenção. Os micro-organismos na composição podem estar em uma forma ativa ou inativa. A composição também pode estar em uma forma seca ou em uma forma líquida.

[0037] Vantajosamente, a presente invenção reduz os custos de capital e de mão de obra de produção de micro-organismos e seus metabolites. Além disso, o processo de cultivo da presente invenção reduz ou elimina a necessidade de concentração ou então de processamento dos micróbios depois de ser completado o cultivo.

[0038] A portabilidade pode resultar em economias de custo significativas, uma vez que os inóculos para as composições à base de micróbios podem ser produzidos em, ou perto do local de inoculação pretendido. Vantajosamente, o inóculo pode ser produzido no local ao usar materiais encontrados no local caso desejado, desse modo reduzindo os obstáculos de logística e os custos de transporte e de

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10/30 envio. Além disso, os produtos finais produzidos pela escalação de inóculos podem incluir micróbios viáveis no momento da aplicação, o que pode aumentar a eficácia do produto.

[0039] Desse modo, em determinadas modalidades, a presente invenção aproveita a energia de micro-organismos locais d ocorrência natural e seus subprodutos metabólicos. O uso de populações microbianas locais pode ser vantajoso em situações incluindo, mas sem ficar a elas limitadas, a remediação ambiental (tal como no caso de um vazamento de óleo), a criação de animais, a aquacultura, o florestamento, o gerenciamento de pasto, o gerenciamento da turfa, a produção ornamental horticultural, a eliminação e o tratamento de resíduos, a mineração, a recuperação de óleo e a saúde humana, inclusive em locais remotos.

[0040] As composições produzidas pela presente invenção podem ser usadas para inocular sistemas de fermentação em larga escala para o uso em uma ampla variedade de aplicações da indústria de petróleo. Estas aplicações incluem, mas sem ficar a elas limitadas, o realce na recuperação de óleo cru; a redução na viscosidade do óleo; a remoção de parafina das hastes, da tubulação, das forrações e das bombas; a inibição ou prevenção da corrosão do equipamento de petróleo; o fraturamento de líquidos; a redução da concentração de H2S no óleo cru extraído; bem como a limpeza do tanque, da linha de fluxo e da tubulação.

Definições Selecionadas [0041] Tal como usado no presente documento, composição à base de micróbios significa uma composição que compreende componentes que foram produzidos como resultado do crescimento de micro-organismos ou outras culturas de células. Desse modo, a composição à base de micróbios pode compreender os próprios micróbios e/ou os subprodutos do crescimento microbiano. As células

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11/30 podem estar em um estado vegetativo ou na forma de esporos, ou uma mistura de ambos. As células podem ser planctônicas ou em uma forma de biopelícula, ou uma mistura de ambas. Os subprodutos do crescimento podem ser, por exemplo, metabolites, componentes da membrana da célula, proteínas expressas, e/ou outros componentes celulares. As células podem ser intactas ou Usadas. Em modalidades preferidas, as células estão no estado vegetativo e estão presentes, com o caldo no qual foram cultivadas, na composição à base de micróbios. As células podem estar presentes, por exemplo, a uma concentração de 1 x 10⁴, 1 x 10⁵, 1 x 10®, 1 x 10⁷, 1 x 10⁸, 1 x 10⁹, 1 x 10¹°, ou 1 x 10¹¹ ou mais células por mililitro da composição.

[0042] A presente invenção também provê produtos à base de micróbios ou produtos de cultivo, que são os produtos que devem ser aplicados na prática para obter um resultado desejado. O produto à base de micróbios pode ser simplesmente a composição à base de micróbios colhida do processo de cultivo de micróbios. Alternativamente, o produto à base de micróbios pode compreender outros ingredientes que são adicionados. Esses ingredientes adicionais podem incluir, por exemplo, tampões, veículos apropriados, tais como a água, nutrientes adicionados para suportar mais crescimento microbiano e/ou agentes que facilitam o rastreamento dos micróbios e/ou da composição no ambiente em que é aplicada. O produto à base de micróbios também pode compreender misturas de composições à base de micróbios. O produto à base de micróbios também pode compreender um ou mais componentes de uma composição à base de micróbios que foram processados de alguma maneira tal como, mas sem ficar a elas limitada, a filtração, a centrifugação, a Use, a secagem, a purificação, e outras ainda.

[0043] O termo Inóculo é englobado dentro do termo produto à base de micróbios. Tal como usado no presente documento, o inóculo

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12/30 significa um produto à base de micróbios que pode ser usado, por exemplo, como uma cultura de sementes para inocular um sistema ou um processo de fermentação de maior escala. O inóculo pode ser escalado em tal sistema de fermentação para produzir quantidades desejadas de composições e produtos à base de micróbios.

[0044] Tal como usado no presente documento, sistema de fermentação no local refere-se a um sistema usado para a produção de composições e/ou produtos à base de micróbios em ou perto do local de aplicação dessas composições e/ou produtos à base de micróbios. [0045] Tal como usado no presente documento, colhida refere-se à remoção de uma parte ou toda a composição à base de micróbios de um vaso de crescimento.

[0046] Tal como usado no presente documento, o termo controle usado em referência à atividade produzida pelos biotensoativos (ou um outro agente ativo) ou micro-organismos produtores de biotensoativos estende ao ato de matar, incapacitar ou imobilizar as pragas, ou então de tornar as pragas substancialmente incapazes de causar qualquer dano.

Desenho e Operação do Dispositivo de Misturação [0047] A FIGURA 1 ilustra um dispositivo de fermentação de acordo com uma modalidade da presente invenção. Com relação à FIGURA 1, o dispositivo 10 pode incluir um cilindro rotativo 100 suportado por uma armação 200. A armação 200 pode ter as rodas 300 para facilitar o movimento, embora isso não seja necessário. Por exemplo, o dispositivo pode incluir duas rodas 300 em um lado sem nenhuma roda no outro lado 400 de modo que o dispositivo possa ser inclinado para o transporte mediante o uso das rodas e estabilizado para permanecer no lugar. Alternativamente, o dispositivo pode incluir três ou mais rodas 300 (qualquer uma de maneira tal que todos os pontos de contato com o solo são as rodas, ou enquanto ainda inclui uma seção 400 sem

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13/30 nenhuma roda). As rodas 300 podem ter travas de roda para manter o dispositivo no lugar quando não estiver sendo transportado, em particular no caso em que todos os pontos de contato com o solo são as rodas. A rotação do cilindro 100 é obtida ao usar um motor. O motor pode ser movido, por exemplo, por eletricidade ou gás. De preferência, o motor é um motor elétrico que pode ser conectado a uma fonte de alimentação. Por exemplo, o dispositivo pode incluir uma batería como uma fonte de alimentação, ou o dispositivo podem derivar a energia de uma fonte externa (por exemplo, através de um cabo de força ou através de transferência de energia sem fio). O dispositivo 10 pode ser equipado com um meio para ajustar o ângulo do cilindro 100. Tal meio pode incluir, por exemplo, uma alavanca 500 e/ou uma dobradiça ou um outro suporte rotativo na armação 200.

[0048] Em uma modalidade, o cilindro 100 do dispositivo 10 é um cilindro rotativo fechável para conter, misturar e desenvolver um inóculo de cultura submerso. O cilindro pode ser feito, por exemplo, de vidro, um ou mais polímeros, um ou mais metais, uma ou mais ligas de metal e/ou as combinações dos mesmos.

[0049] O cilindro 100 pode ser montado em uma armação de suporte 200. A armação de suporte 200 pode ter as rodas 300, facilitando o transporte fácil de todo o dispositivo sem requerer habilidade, treinamento, custo, ou tempo extensos. As rodas 300 podem ser feitas, por exemplo, de um ou mais polímeros, borracha, ou qualquer material durável apropriado para o movimento através de uma variedade de paisagens, tais como aquelas encontradas em ambientes agrícolas e de extração de óleo. A armação 200 pode ser feita, por exemplo, de vidro, um ou mais polímeros, um ou mais metais, uma ou mais ligas de metal e/ou as combinações dos mesmos.

[0050] O cilindro é acoplado operavelmente com um motor, tal como um motor elétrico, o qual é conectado a uma fonte de alimentação. O

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14/30 motor permite que o cilindro gire continuamente a uma velocidade, por exemplo, de 10 a 30 rpm e com mais preferência de 15 a 25 rpm.

[0051] O cilindro também pode ser conectado a um sistema da aeração que compreende, por exemplo, uma bomba de ar. A bomba de ar fornece ar ao interior do cilindro, ventilando desse modo a superfície da cultura móvel dentro do cilindro. Enquanto o cilindro gira, a cultura é misturada no mesmo e oxigenada pelo ar fornecido pelo sistema de aeração. Em algumas modalidades, o ar pode ser aquecido ou resfriado para ajudar regular a temperatura interna do cilindro e do ambiente de cultura.

[0052] O ângulo do eixo do cilindro com respeito ao solo pode ser de 0^o a 90°. O ângulo é de preferência menor do que 90° a fim de aumentar a área de superfície do caldo da cultura dentro do cilindro. O ângulo pode ser horizontal (isto é, de 0*), ou perto da horizontal. O ângulo pode ser, por exemplo, de cerca de 5^oa cerca de 75°, ou de cerca de 10° a cerca de 60°. O dispositivo pode ser equipado com um meio para ajustar o ângulo.

[0053] Junto com a otimização do ângulo do eixo do cilindro, o formato do cilindro também é de preferência otimizado de maneira tal que uma área de superfície máxima de cultura seja exposta ao suprimento de ar durante o processo de cultivo. O cilindro pode ter um formado, por exemplo, de um cilindro, ou qualquer tipo de cilindro modificado, embora as modalidades não sejam limitadas a isso. Os cilindros modificados podem incluir cilindros afunilados, cilindros com um formato de lata, ou cilindros que têm um diâmetro maior no meio do que em uma ou outra extremidade.

[0054] Além disso, defletores podem estar presentes na superfície interna do cilindro para ajudar na agitação e na aeração apropriadas da cultura. De preferência, 3 a 4 defletores são uniformemente, ou então mais ou menos uniformemente espaçados em torno da circunferência

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15/30 interna do cilindro e alinhados de maneira tai que ficam paralelos ao eixo de rotação do cilindro. Alternativamente, os defletores podem ser dispostos de maneira tal que ficam perpendiculares ao eixo de rotação do cilindro.

[0055] Em modalidades preferidas, o dispositivo opera continuamente durante todo o processo de cultivo. O dispositivo pode ser operado tato tempo quanto seja necessário para produzir um volume suficiente de cultura, dependendo da espécie particular do micróbio que está sendo produzida. Por exemplo, o dispositivo de misturação pode ser operado continuamente por múltiplos dias. Em modalidades específicas, o dispositivo de misturação é operado continuamente por

1,2,3, 4, ou até 5 dias ou mais, ou qualquer porção dos mesmos.

[0056] Em uma modalidade, o dispositivo de misturação é um biorreator móvel ou portátil que pode ser empregado para a produção no local de um inóculo que inclui uma quantidade apropriada de uma cepa desejada do micro-organismo. A quantidade de inóculo líquido da cultura produzida pode ser, por exemplo, de 2 a 500 litros, de 5 a 250 litros, de 10 a 100 litros, de 15 a 75 litros, de 20 a 50 litros, ou de 35 a 40 litros. Devido ao fato que o inóculo é gerado no local de aplicação, sem recorrera processos de estabilização, preservação, armazenagem e transporte da produção convencionais, uma densidade muito mais elevada de micro-organismos vivos pode ser gerada, desse modo requerendo um volume muito menor da composição de microorganismo para o uso em um sistema de fermentação no local. Isto permite um biorreator de escala menor (por exemplo, tanques de fermentação menores, suprimentos menores de material de partida, nutrientes, agentes de controle do pH, e agente supressor de espuma, etc.) que facilita a mobilidade e a portabilidade do sistema.

[0057] O dispositivo da presente invenção pode ser escalado dependendo do uso pretendido. Por exemplo, o cilindro pode variar no

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16/30 volume de alguns litros a várias centenas de litros, dependendo de quanto inóculo será necessário para inocular um sistema de fermentação específico. O cilindro pode ser, por exemplo, de 1 litro a 5.000 litros ou mais. Tipicamente, o cilindro pode ser de 10 a 1.500 litros, de preferência de 50 a 500 litros, e com mais preferência de 100 a 200 litros.

[0058] Em uma modalidade, o dispositivo tem controles/sensores funcionais, ou pode ser conectado a controles/sensores funcionais para medir fatores importantes no processo de cultivo, tais como o pH, o oxigênio, a pressão, a temperatura, a potência do eixo do agitador, a umidade, a viscosidade, e/ou a densidade microbiana e/ou a concentração de metabólitos.

[0059] Em uma modalidade, o dispositivo tem seus próprios controles e sistemas de medição para pelo menos a temperatura e o pH. Além de monitorar e controlar a temperatura e o pH, o cilindro também pode ter a capacidade de monitorar e controlar, por exemplo, o oxigênio dissolvido, a agitação, a formação de espuma, a pureza de culturas microbianas, a produção de metabólitos desejados, e outros ainda.

[0060] Em uma modalidade adicional, o dispositivo também deve poder monitorar o crescimento de micro-organismos dentro do vaso (por exemplo, medição do número de células e das fases de crescimento). Alternativamente, uma amostra diária pode ser tomada do vaso e ser sujeitada à enumeração pelas técnicas conhecidas no estado da técnica, tais como a técnica de chapeamento com diluição. O chapeamento com diluição é uma técnica simples usada para estimar o número de bactérias em uma amostra. A técnica também pode fornecer um índice pelo qual ambientes ou tratamentos diferentes podem ser comparados.

[0061 ] Em uma modalidade, o meio de cultura, o ar e o equipamento

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17/30 usado no método e no processo de cultivo são esterilizados. O equipamento de cultivo tal como o reator/vaso pode ser separado de, mas conectado a, uma unidade de esterilização, por exemplo, uma autoclave. O equipamento de cultivo também pode ter uma unidade de esterilização que esteriliza in situ antes de começar a inoculação, por exemplo, ao usar vapor. O ar pode ser esterilizado por métodos conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, o ar ambiente pode passar através de pelo menos um filtro antes de ser suplementado no vaso. Em outras modalidades, o meio pode ser pasteurizado ou, opcionalmente, nenhum calor é adicionado de modo algum, onde o uso de baixa atividade da água e de um pH baixo pode ser explorado para controlar o crescimento bacteriano.

[0062] Antes do cultivo, o cilindro pode ser lavado com um agente esterilizante, tal como uma solução de peróxido de hidrogênio (por exemplo, peróxido de hidrogênio de 1,0% a 3,0%); isto pode ser feito antes ou depois de um enxague com água quente, por exemplo, a 80 a 90 graus Célsius para inibir ou impedir a contaminação. Os componentes do meio de cultura (por exemplo, a fonte de carbono, a água, a fonte de lipídeos, os micronutrientes, etc.) também podem ser descontaminados pela temperatura e/ou descontaminados por peróxido de hidrogênio (seguido potencialmente pela neutralização do peróxido de hidrogênio ao usar um ácido tal como HCI, H2SO4, etc.).

[0063] Vantajosamente, 0 dispositivo também pode ser auto esterilizado. Por exemplo, os micro-organismos escolhidos para 0 cultivo dentro do dispositivo de misturação podem ser cepas conhecidas para a produção de metabolites ou subprodutos microbicidas, tais como biotensoativos. Desse modo, a própria cultura de micróbios pode prover 0 controle de micro-organismos indesejados dentro do cilindro, simultaneamente com 0 cultivo de micro-organismos desejados.

[0064] A temperatura de cultivo utilizada de acordo com a presente

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18/30 invenção pode ser, por exemplo, de cerca de 25 a 40 graus Célsius, embora o processo possa operar fora desta faixa. O micróbio pode ser cultivado em uma faixa de pH de cerca de 2 a 10 e, mais especificamente, em uma faixa de pH de cerca de 3 a 5 (ao ajustar manual ou automaticamente o pH mediante o uso de bases, ácidos e tampões; por exemplo, HCI, KOH, NaOH, H3PO4). A invenção também pode ser praticada fora dessa faixa de pH.

[0065] O cultivo da levedura pode começar a um primeiro pH (por exemplo, um pH de 4,0 a 4,5) e mudar mais tarde para um segundo pH (por exemplo, um pH de 3,2 a 3,5) pelo restante do processo para ajudar a evitar a contaminação, bem como para produzir outros resultados desejáveis (0 primeiro pH pode ser mais elevado ou mais baixo do que 0 segundo pH). Os resultados preferidos podem ser obtidos ao manter a concentração de oxigênio dissolvido acima de 10, 15, 20, ou 25% de saturação durante 0 cultivo. Em uma modalidade, 0 inóculo não precisa ser processado mais após 0 cultivo (por exemplo, a levedura, os metabolites, e as fontes de carbono restantes não precisam ser separados dos soforolipídeos). As propriedades físicas (por exemplo, a viscosidade, a densidade, etc..) também podem ser ajustadas ao usar vários produtos químicos e materiais que são conhecidos no estado da técnica.

[0066] Uma ou mais substâncias microbicidas podem ser adicionadas ao meio de cultura (por exemplo, estreptomicina, oxitetraciclina, soforolipídeo e ramnolipídeo) para inibir ou impedir ainda mais a contaminação, antes, durante ou após a fermentação. Uma ou mais fontes orgânicas e inorgânicas de nitrogênio podem ser adicionadas ao meio (por exemplo, proteínas, aminoácidos, extratos de levedura, autolisados de levedura, amônia ou sais de amônio, ureia, peptona de milho, hidrolisado de caseína e proteína de soja). Micro-organismos

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19/30 [0067] Os micro-organismos cultivados de acordo com a presente invenção podem ser, por exemplo, bactérias, leveduras, fungos ou organismos multicelulares. Em modalidades preferidas, o microorganismo é uma levedura. Em modalidades particularmente preferidas, os micróbios são das cepas de Starmerella ciade.

[0068] Em uma modalidade, os micro-organismos são bactérias, incluindo bactérias gram-positivas e gram-negativas. Essas bactérias podem ser, mas sem ficar a elas limitadas, por exemplo, Escherichia coli, Rhizobium (por exemplo, Rhizobium japonicum, Sinorhizobium meiiioti, Sinorhizobium fredii, Rhizobium ieguminosarum biovar trifoiii, e Rhizobium etli), Bradyrhizobium (por exemplo, Bradyrhizobium japanicum, and B. parasponia), Baciiius (por exemplo, Bacillus subtilis, Bacillus firmus, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus amyioliquifaciens), Azobacter (por exemplo, Azobacter vinelandii, e Azobacter chroococcum), Arhrobacter (por exemplo, Agrobacterlum radiobacter), Pseudomonas (por exemplo, Pseudomonas chiororaphis subsp. aureofaciens (Kluyver)), Azospiriilium (por exemplo, Azospirillumbrasiliensis), Azomonas, Derxia, Beijerinckia, Nocardia, Klebsiella, Ciavibacter (por exemplo, C. xyli subsp. xyli e C. xyli subsp.

cyanobacteria, Pantoea

Sphingomonas (por

Streptomyces (por (por exemplo, Pantoea exemplo, Sphingomonas exemplo, Streptomyces cynodontls), agglomerans), paucimobilis), griseochromogenes, Streptomyces qriseus, Streptomyces cacaoi, Streptomyces aureus, e Streptomyces kasugaenis), Streptoverticilllum (por exemplo, Streptoverticilllum rimofaciens), Ralslonia (por exemplo, Ralslonia eulropha), Rhodospirilium (por exemplo, Rhodospiríllum rubrum), Xanthomonas (por exemplo, Xanthomonas campestris), Erwinia (por exemplo, Erwinia carotovora), Clostridium (por exemplo, Clostridium bravldaciens, e Clostridium malacusomaé), e as combinações das mesmas.

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20/30 [0069] Em uma modalidade, o micro-organismo é um fungo (incluindo leveduras), incluindo, mas sem ficar a eles limitado, por exemplo, Starmerella, Mycorrhiza (por exemplo, mycorrhizae vesiculararbuscuiar (VAM), mycorrhizae arbuscular (AM)), Mortierella, Phycomyces, Blakeslea, Thraustochytrium, Penicillium, Phythium, Entomophthora, Aureobasidíurn pulluians, F usaríum venenaium, Aspergillus, Tríchoderma (por exemplo, Tríchoderma reesei, T. harzianum, T. vinde e T. hamatum), Rhizopus spp, fungos endofíticos (por exemplo, Piriformis indica), Saccharomyces (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boulardii sequela e Saccharomyces torula), Debaromyces, issalchenkia, Kluyveromyces (por exemplo, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis), Pichia spp (por exemplo, Pichia pastoris), e as combinações dos mesmos.

[0070] Em uma modalidade, um único tipo de micróbio é desenvolvido no dispositivo de misturação. Em modalidade alternativas, múltiplos micróbios, que podem ser cultivados em conjunto sem efeitos nocivos no crescimento ou no produto resultante, podem ser cultivados em conjunto no dispositivo de misturação. Pode haver, por exemplo, 2 a 3 micróbios ou mais diferentes cultivados no dispositivo ao mesmo tempo.

Meio de Cultivo e Crescimento [0071] A presente invenção provê métodos para a produção eficiente de culturas de micróbios submersas escaláveis. O método pode incluir a provisão de todos os materiais necessários para o processo de cultivo submerso, embora se espere que água doce seja fornecida de uma fonte local.

[0072] Em uma modalidade, o método compreende a provisão de uma levedura viável, ou um outro micróbio, dentro do cilindro do dispositivo de misturação. Uma variedade de cepas pode ser incluída, as quais podem acumular quantidades significativas de glicolipídeos

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21/30 tensoativos. Mais especificamente, o método pode compreender a adição de uma ou mais cepas de fungos viáveis que podem controlar pragas, a biorremediação, realçar a recuperação de óleo e outras finalidades úteis, por exemplo, Starmerella (Candida) bombicola, Candida apicola, Candida batístae, Candida floncola, Candida, riodocensis, Candida stellate, Candida kuoi, Candida sp. NRRL Y-27208 Rhodotorula bogoriensis sp., Wickerhamiella domericqiae, bem como todas as outras cepas produtoras de soforolipídeos de Starmerella clade.

[0073] Em uma modalidade, o meio de cultura usado de acordo com a presente invenção pode conter nutrientes suplementares para o microorganismo. Tipicamente, estes incluem fontes de carbono, proteínas e/ou gorduras, fontes de nitrogênio, elementos de traço, e/ou fatores de crescimento (por exemplo, vitaminas, reguladores de pH). Será aparente a um elemento versado no estado da técnica que a concentração de nutrientes, o teor de umidade, o pH, e outros ainda, podem ser modulados de modo a otimizar o crescimento para um micróbio particular.

[0074] Cada uma dentre a fonte de carbono, a fonte de lipídeos, a fonte de nitrogênio e/ou da fonte de micronutrientes pode ser fornecida em um pacote individual que pode ser adicionado ao cilindro do dispositivo de misturação em momentos apropriados durante o processo de cultivo. Cada um dos pacotes pode incluir vários subpacotes que podem ser adicionados em pontos (por exemplo, quando os níveis de levedura, pH e/ou nutrientes ficam acima ou abaixo de uma concentração específica) ou momentos (por exemplo, depois de 10 horas, 20 horas, 30 horas, 40 horas, etc.) específicos durante o processo de cultivo.

[0075] A fonte de lipídeos pode incluir, por exemplo, óleos ou gorduras de origem vegetal ou animal que contêm ácidos graxos livres

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22/30 ou seus sais ou seus ésteres, incluindo triglicérides. Os exemplos de ácidos graxos incluem, mas sem ficar a eles limitados, ácidos graxos livres e esterificados que contêm de 16 a 18 átomos de carbono, fontes de carbono hidrofóbicas, óleo de palma, gorduras animais, óleo de coco, ácido oleico, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de canola, ácido esteárico e palmítico. Outras fontes de carbono podem incluir um ou mais açúcares tais como a glicose, a xilose, a manose, a sacarose, a galactose, o manitol, a sorbose, a ribose, a arbutina, a rafinose, o glicerol, o eritritol, o xilitol, o gluconato, o citrato, melaço, amido hidrolisado, xarope de milho, e material celulósico hidrolisado incluindo a glicose.

[0076] O método pode compreender a adição de uma ou mais fontes de micronutrientes, tais como potássio, magnésio, cálcio, zinco e manganês, de preferência como sais; fosforosos, tais como de fosfatos; e outros componentes estimulantes do crescimento. Uma ou mais fontes orgânicas e Inorgânicas de nitrogênio podem ser incluídas, tais como proteínas, aminoácidos, extratos de levedura, autolisados de levedura, amônia ou sais de amônio, ureia, peptona de milho, hidrolisado de caseína e proteína de soja.

[0077] O método pode compreender a adição de uma ou mais substâncias microbicidas para inibir ou impedir a contaminação durante o cultivo (por exemplo, estreptomicina, oxitetraciclina, soforolipídeo e ramnolipídeo). Além disso, o método pode incluir materiais de decontaminação pré-cultivo, tais como um alvejante e peróxido de hidrogênio. O alvejante e o peróxido de hidrogênio podem vir na forma concentrada e ser mais tarde diluídos no local de fermentação antes do uso. Por exemplo, o peróxido de hidrogênio pode ser provido na forma concentrada e ser diluído para formular peróxido de hidrogênio a 1,0% a 3,0% (em peso ou volume) para a descontaminação pré-enxague. [0078] O método também pode compreender a adição de uma ou

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23/30 mais substâncias de ajuste do pH, tais como bases, ácidos e tampões (por exemplo, HCI, KOH, NaOH, e/ou H3PO4, H2SO4, etc.). O ajuste do pH pode ser realizado por meios automáticos ou pode ser feito manualmente. O ajuste automático do pH pode incluir uma sonda de pH e um dispositivo eletrônico para aplicar apropriadamente as substâncias de ajuste do pH, dependendo das medições do pH. O pH pode ser ajustado a um número específico por um usuário, ou pode ser previamente programado para mudar 0 pH de modo correspondente durante todo 0 processo de cultivo. Se 0 ajuste do pH tiver que ser feito manualmente, as ferramentas de medição do pH conhecidas no estado da técnica podem ser usadas para os testes manuais.

[0079] Um sensor de temperatura, tal como um termômetro ou um termopar, pode ser usado para monitorar a temperatura, e 0 termômetro pode ser manual ou automático. Um termômetro automático pode controlar as fontes de calor e de resfriamento apropriadamente para controlar a temperatura durante todo 0 processo de cultivo.

[0080] Em uma modalidade, 0 método inclui a suplementaçâo do cultivo com uma fonte de nitrogênio. A fonte de nitrogênio pode estar, por exemplo, em uma forma inorgânica tal como 0 nitrato de potássio, 0 sulfato de amônio, 0 nitrato de amônio, 0 fosfato de amônio, a amônia, a ureia e 0 cloreto de amônio, ou uma forma orgânica, tais como proteínas e aminoácidos. Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas independentemente ou em uma combinação de duas ou mais.

[0081] O método também pode compreender a suplementaçâo do cultivo com uma fonte de carbono. A fonte de carbono é tipicamente um carboidrato, tal como a glicose, a sacarose, a lactose, a frutose, a trehalose, a manose, 0 manitol, e a maltose; ácidos orgânicos tais como 0 ácido acético, 0 ácido fumárico, 0 ácido cítrico, 0 ácido propiônico, 0 ácido málico, 0 ácido malônico e 0 ácido pirúvico; álcoois tais como 0 etanol, 0 propanol, 0 butanol, 0 pentanol, 0 hexanol, 0 isobutanol e 0

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24/30 glicerol; gorduras e óleos tais como o óleo de soja, óleo de farelo de arroz, azeite de oliva, óleo de milho, óleo de gergelim, e óleo de semente de linhaça; etc. Essas fontes de carbono podem ser usadas independentemente ou em uma combinação de duas ou mais.

[0082] Em uma modalidade, fatores de crescimento e nutrientes de traço para micro-organismos são incluídos no meio. Os nutrientes inorgânicos, incluindo elementos de traço tais como o ferro, o zinco, o cobre, o manganês, o molibdênio e o cobalto, também podem ser incluídos no meio.

[0083] Em uma modalidade, sais inorgânicos também podem ser incluídos. Os sais inorgânicos podem ser, por exemplo, o fosfato de potássio di-hidrogenado, o fosfato de dipotássio hidrogenado, o fosfato de dissódio hidrogenado, o sulfato de magnésio, o cloreto de magnésio, o sulfato de ferro, o cloreto de ferro, o sulfato de manganês, o cloreto de manganês, o sulfato de zinco, o cloreto de chumbo, o sulfato de cobre, o cloreto de cálcio, o carbonato de cálcio, o carbonato de sódio. Esses sais inorgânicos podem ser usados independentemente ou em uma combinação de dois ou mais.

[0084] Vantajosamente, o método provê a oxigenação fácil da cultura em desenvolvimento, por exemplo, com o movimento lento do ar para remover o ar contendo baixo teor de oxigênio e a introdução de ar oxigenado. O ar oxigenado pode ser ar ambiente suplementado periodicamente, tal como diariamente.

[0085] Em algumas modalidades, o método para o cultivo também pode compreender a adição de ácidos e/ou microbicidas adicionais no meio líquido antes e/ou durante do processo de cultivo. Os agentes ou os antibióticos microbicidas são usados para inibir ou impedir a contaminação da cultura. Além disso, agentes supressores de espuma também podem ser adicionados para inibir ou impedir a formação e/ou a acumulação de espuma quando o gás é produzido durante o cultivo e

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25/30 a fermentação.

[0086] Em uma modalidade, o método para o cultivo dos microorganismos é realizado de cerca de 5Ό a cerca de 1 00Ό, de preferência de 15°a 60Ό, com mais preferência de 25 a 50Ό. Em uma outra modalidade, o cultivo pode ser realizado continuamente a uma temperatura constante. Em uma outra modalidade, o cultivo pode ser sujeito a temperaturas variáveis.

[0087] Em uma modalidade, o nível de umidade da mistura deve ser apropriado para o micro-organismo de interesse. Por exemplo, o nível de umidade pode variar de 20% a 90%, de preferência de 30 a 80%, com mais preferência de 40 a 60%.

[0088] Em uma modalidade, o pH da mistura deve ser apropriado para o micro-organismo de interesse. Sais de tamponamento e reguladores do pH, tais como carbonatos e fosfatos, podem ser usados para estabilizar o pH perto de um valor ideal. Quando íons de metal estão presentes a altas concentrações, o uso de um agente de quelação no meio líquido pode ser necessário.

[0089] Os micróbios podem ser cultivados na forma planctônica ou como uma biopelícula. No caso da biopelícula, o vaso pode ter dentro do mesmo um substrato cobre o qual os micróbios podem ser cultivados em um estado de biopelícula. O sistema também pode ter, por exemplo, a capacidade de aplicar estímulos (tais como a tensão de cisalhamento) que incentiva e/ou melhora as características de crescimento da biopelícula.

Preparação de Produtos à Base de Micróbios [0090] Os produtos à base de micróbios da presente invenção incluem os produtos que compreendem os micróbios e/ou subprodutos de crescimento microbiano e, opcionalmente, o meio de crescimento e/ou ingredientes adicionais tais como, por exemplo, a água, veículos, adjuvantes, nutrientes, modificadores da viscosidade, e outros agentes

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26/30 ativos.

[0091] Os produtos à base de micróbios da presente invenção podem ser, por exemplo, inoculantes mícrobianos, biopesticidas, fontes de nutrientes, agentes de remediação, produtos da saúde, e/ou biotensoativos.

[0092] Um produto à base de micróbios da presente invenção é um inóculo que compreende o meio de cultura que contém o microorganismo e/ou subproduto de crescimento microbiano produzidos pelo micro-organismo e/ou por todos os nutrientes residuais. O produto do método de cultivo pode ser usado diretamente sem extração ou purificação. Caso desejado, a extração e a purificação podem ser facilmente efetuadas ao usar os métodos ou as técnicas padrão de extração conhecidos dos elementos versados na técnica.

[0093] Os micro-organismos no inóculo podem estar em uma forma ativa ou inativa. O inóculo pode ser usado sem estabilização, preservação, e armazenagem adicionais. Vantajosamente, o uso direto desses inóculos preserva uma viabilidade elevada dos microorganismos, reduz a possibilidade de contaminação de agentes estranhos e de micro-organismos indesejáveis, e mantém a atividade dos subprodutos de crescimento microbiano.

[0094] O inóculo pode ser removido do cilindro e ser transferido, por exemplo, através de uma pipeta para o uso imediato.

[0095] Vantajosamente, de acordo com a presente invenção, o inóculo pode compreender um caldo no qual os micróbios foram cultivados. O produto pode ter, por exemplo, pelo menos, em peso, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, ou 100% de caldo. A quantidade de biomassa no produto, em peso, pode ser, por exemplo, em qualquer lugar de 0% a 100% incluindo todas as porcentagens intermediárias.

[0096] A presente invenção também provê materiais e métodos para a produção de biomassa (por exemplo, material celular viável),

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27/30 metabólitos extracelulares (por exemplo, moléculas pequenas e grandes) e/ou componentes intracelulares (por exemplo, enzimas e outras proteínas). Os micróbios e os subprodutos de crescimento microbiano da presente invenção também podem ser usados para a transformação de um substrato, tal como um minério, em que o substrato transformado é o produto.

[0097] A presente invenção também provê produtos à base de micróbios, bem como os usos para esses produtos para obter resultados benéficos em muitos ajustes incluindo, por exemplo, a biorremediação e a mineração melhoradas: a eliminação e o tratamento de resíduos; o realce da saúde de animais domésticos e outros animais; e a promoção da saúde e da produtividade de plantas mediante a aplicação de um ou mais dos produtos à base de micróbios.

[0098] Em uma modalidade, a presente invenção provê um método para melhorar a saúde de plantas e/ou aumentar o rendimento da colheita ao escalar o produto à base de micróbios divulgado no presente documento, por exemplo, em um sistema de fermentação no local, e ao aplicar o produto escalado ao solo, à semente, ou a partes da planta. Em uma outra modalidade, a presente invenção provê um método para aumentar o rendimento da colheita ou da planta, o qual compreende aplicações múltiplas do produto escalado.

[0099] Em uma outra modalidade, o método para a produção de subprodutos de crescimento microbiano também pode compreender etapas de concentração e purificação do subproduto de interesse. [00100] Em uma modalidade, a composição é apropriada para a agricultura. Por exemplo, a composição pode ser escalada e usada para tratar o solo, as plantas e as sementes. A composição também pode ser usada como um pesticida.

[00101] Em uma modalidade, a presente invenção também provê customizações aos materiais e aos métodos de acordo com as

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28/30 necessidades locais. Por exemplo, o método para o cultivo de microorganismos pode ser usado para desenvolver os micro-organismos situados no solo local ou em um poço de óleo específico ou um local de poluição. Em modalidades específicas, os solos locais podem ser usados como substratos sólidos no método de cultivo para prover um ambiente de crescimento nativo. Vantajosamente, esses microorganismos podem ser benéficos e mais adaptáveis às necessidades locais.

EXEMPLOS [00102] Uma compreensão maior da presente invenção e de suas muitas vantagens pode ser obtida a partir dos exemplos a seguir, fornecidos a título de ilustração. Os exemplos a seguir são ilustrativos de alguns dos métodos, das aplicações, das modalidades e das variantes da presente invenção. Eles não devem ser considerados como limitadores da invenção. Numerosas mudanças e modificações podem ser feitas com respeito à invenção.

EXEMPLO 1 - DISPOSITIVO DE MISTURAÇÂO E CULTIVO, E MODOS DE OPERAÇÃO [00103] Um dispositivo de misturação portátil e distribuível foi construído tal como mostrado na Figura 1. O dispositivo tem um cilindro rotativo de plástico suportado por uma armação que tem rodas de borracha. Três a quatro defletores são fixados em torno da circunferência interna do cilindro.

[00104] A rotação do cilindro é impelida por um motor elétrico conectado a uma fonte de alimentação, permitindo que o cilindro gire a uma velocidade de 15 a 25 rpm. O cilindro tem um volume de trabalho de 100 litros (I) para cultivar a levedura de Starmerella para a produção de células e metabolites (no entanto, o tamanho e a faixa podem variar dependendo da aplicação requerida). O dispositivo é particularmente bem adequado para a cultura submersa dos inóculos de levedura de

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Starmerella clade que são apropriados para a inoculação de sistemas de fermentação no iocal em maior escala.

[00105] A fim de reduzir ainda mais o custo da produção da cultura e assegurar a escalabilidade da tecnologia, o sistema não precisa ser esterilizado ao usar métodos tradicionais. Ao invés disto, um método de sanitização de vaso vazio pode ser usado, o qual inclui a aplicação de uma corrente altamente pressurizada de vapor por 10 minutos às superfícies internas do cilindro, seguida pelo tratamento durante toda a noite das superfícies internas com 1 a 3% de peróxido de hidrogênio, de preferência 3% de peróxido de hidrogênio, enquanto o cilindro gira. Além disso, a fim de reduzir a possibilidade de contaminação, a água usada para a preparação da cultura pode ser filtrada através de um filtro de 0,1 micron.

Composição dos meios e cultivo nutrientes de culturas do Levedura [00106] O meio de cultura usado para produzir o inóculo de levedura compreendeu os componentes mostrados na Tabela 1.

Tabela 1. Componentes para o meio de cultura.

Reagente	Peso (g/l)
Extrato de levedura	5
Glicose	20
Fosfato de monopotássio	2
Fosfato de dipotássio	2
Sulfato de magnésio	0,5

Ό0107] Os componentes do meio de cultura foram esterilizados em 1 litro de peróxido de hidrogênio a 10% durante toda a noite. A composição estéril foi misturada então com água filtrada no cilindro do misturador.

[00108] A temperatura do cultivo era geralmente aproximadamente a temperatura ambiente, de 18 a 25 graus Célsius. O pH inicial do meio era de cerca de 5,5 a 6,0.

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30/30 [00109] Sob essas condições de cultivo, a produção industrialmente útil de biomassa, os soforolipídeos e outros metabolites são obtidos depois de cerca de 1 a cerca de 5 dias de cultivo, de preferência depois de um tempo de cultivo de cerca de 48 horas.

[00110] Com a conclusão do cultivo, a concentração final dos fermentos atingida é de cerca de 200 a 400 CFUs. A cultura pode então ser usada para inocular um sistema de fermentação, em que a cultura pode ser escalada para uma variedade de finalidades industriais.

[00111] Deve ser compreendido que os exemplos e as modalidades descritas no presente documento são para finalidades ilustrativas apenas, e que várias modificações ou mudanças à luz das mesmas serão sugeridas a elementos versados no estado da técnica e devem ser incluídas dentro do caráter e âmbito deste pedido de patente.

[00112] Todas as patentes, pedidos de patentes, pedidos provisórios e publicações mencionados ou citados no presente documento são incorporados a título de referência em sua totalidade, incluindo todas as figuras e tabelas, até a extensão em que não são inconsistentes com os ensinamentos explícitos deste relatório descritivo.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de cultivo de micro-organismos, caracterizado pelo fato de que compreende: a provisão de um dispositivo de fermentação que compreende:

uma armação de suporte;

um cilindro rotativo montado na armação de suporte; e um motor conectado ao cilindro, em que o motor faz com que o cilindro gire;

adicionar um micro-organismo ao cilindro do dispositivo de fermentação; e operar o dispositivo de fermentação, desse modo cultivando o micro-organismo.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que também compreende a adição dos nutrientes do cilindro para o micro-organismo ao cilindro.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de fermentação também compreende uma pluralidade de defletores em uma superfície interna do cilindro.
4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de fermentação também compreende um meio para ajustar um ângulo do cilindro.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que operação do dispositivo de fermentação compreende a operação do dispositivo continuamente por um período de tempo de pelo menos um dia
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que um volume do cilindro fica em uma faixa de 10 litros a 1.500 litros.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 6, caracterizado pelo fato de que também compreende:

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2/4 antes da adição do micro-organismo ao cilindro, a esterilização do cilindro in situ.
8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a esterilização do cilindro compreende a lavagem com peróxido de hidrogênio como um agente esterilizante.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo produz metabólitos ou subprodutos microbicidas, de maneira tal que o dispositivo de fermentação é autoesterilizado.
10. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é uma bactéria ou um fungo.
11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é uma bactéria e a bactéria é Escherichia coli, Rhizobium, Bradyrhizobium, Bacillus, Azobacter, Arhrobacter, Pseudomonas, Azospirillium, Azomonas, Derxia, Beijerinckia, Nocardia, klebsieiia, Ciavibacter, Cyanobacteria, Pantoea, Sphingomonas, Streptomyces, Streptoverticillium, Raisionia, Rhodospiríiium, Xanthomonas, Erwinia, ou Clostridium.
12. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é um fungo e o fungo é Starmerelia, Mycorrhiza, Mortierella, Phycomyces, Blakeslea, Thraustochytrium, Penicillium, Phythium, Entomophthora, Aureobasidium pullulans, F usarium venenalum, Aspergillus, Trichoderma, Rhizopus spp, fungo endofítico, Saccharomyces, Debaromyces, Issalchenkia, Kluyveromyces, ou Pichia spp.
13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo é um fungo Mycorrhizal ou um fungo Starmerelia.
14. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o micro-organismo cultivado pelo método como definido na

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3/4 reivindicação 1 e/ou pelo menos um subproduto de crescimento microbiano do dito micro-organismo.
15. Dispositivo de fermentação para cultivar microorganismos, caracterizado pelo fato de que compreende:

uma armação de suporte;

um cilindro rotativo montado na armação de suporte;

uma pluralidade de defletores em uma superfície interna do cilindro;

pelo menos uma roda unida a uma porção inferior da armação de suporte; e um motor conectado ao cilindro, em que o motor faz com que o cilindro gire.
16. Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o motor é um motor elétrico ou um motor movido a gás.
17. Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que também compreende uma batería à qual o motor é conectado.
18. Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o motor é configurado para ser conectado a uma fonte de alimentação externa durante a operação.
19. Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que compreende uma pluralidade de rodas na porção inferior da armação.
20. Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que também compreende um meio para ajustar um ângulo do cilindro.
21. Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o cilindro tem um formato de um cilindro ou de um cilindro modificado.

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22. Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que um volume do cilindro fica em uma faixa de 10 litros a 1.500 litros.
23. Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que também compreende um sensor de temperatura para medir a temperatura dentro do cilindro, e um sensor de pH para medir o pH dentro do cilindro.
24. Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de fermentação também compreende: um sensor de oxigênio para medir o oxigênio dissolvido dentro do cilindro; um sensor de agitação para medir a agitação dentro do cilindro; um sensor de formação de espuma para medir a formação de espuma dentro do cilindro; um sensor de cultura microbiana para medir a pureza de culturas microbianas dentro do cilindro; um sensor de metabólito para medir a produção de metabolites desejados dentro do cilindro; ou uma combinação dos mesmos.
25. Dispositivo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que também compreendendo uma unidade de esterilização para esterilizar o cilindro in situ.