BR112020006362A2 - produção em larga escala de produtos de trichoderma líquido e sólido - Google Patents

Abstract

A presente invenção provê um método de produção de fungos Trichoderma em escala industrial. Em modalidades específicas, a presente invenção provê métodos para produzir um produto à base de Trichoderma líquido e um produto à base de Trichoderma no estado sólido a partir da mesma cultura de sementes inicial e inoculante.

Description

PRODUÇÃO EM LARGA ESCALA DE PRODUTOS DE TRICHODERMA LÍQUIDO E SÓLIDO REFERÊNCIA CRUZADA A UM PEDIDO RELACIONADO

[001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório US N° 62/564,683, depositado em 28 de setembro de 2017, que é incorporado na presente invenção por referência na sua totalidade.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] Os fungos patogênicos do solo podem causar danos extensos às safras. Esses parasitas causam, por exemplo, tombamento, podridão das raízes, podridão da coroa e queima das pontas em uma ampla variedade de plantas hospedeiras. Os fungos patogênicos mais comuns desse tipo são as espécies Rhizoctonia, Pythium, Fusarium, Phytophotora, Sclerotia, Cercospora, Ralstonia, Fragaria, Rhizopus, Botrytis, Colletotrichum, Magnaporthe e muitos outros. As espécies Rhizoctonia, Pythium e Sclerotia têm faixas de hospedeiros extraordinariamente amplas e são capazes de atacar muitas safras comerciais comuns, tais como, feijão, tomate, algodão, amendoim, batata, alface e angiospermas ornamentais.

[003] Os métodos mais comuns de controle dessas espécies de fungos patogênicos envolvem a aplicação de agentes de controle químico; no entanto, esses produtos químicos podem ser caros e prejudiciais à saúde pública e ao meio ambiente. Adicionalmente, eles podem perturbar o microambiente das plantas, alterando, por exemplo, o ecossistema circundante.

[004] Uma alternativa ao uso de produtos químicos é o uso de agentes de controle biológico, que foram encontrados naturalmente no ecossistema. Por exemplo, certas espécies de fungos Trichoderma possuem propriedades antagônicas em relação a várias pragas. Vários desses fungos são úteis quando adicionados ao solo, onde podem se multiplicar e crescer em estreita associação com as raízes das plantas. Eles são capazes de proteger parcialmente as raízes da invasão por outros fungos patogênicos e outras pragas microbianas e animais, além de ajudar a estimular o crescimento das plantas.

[005] O Trichoderma pode estabelecer uma colonização forte e duradoura das superfícies radiculares, penetrando na epiderme e nas células subsuperficiais rasas. Essas associações raiz-microrganismo causam mudanças substanciais no proteoma e no metabolismo da planta. Eles produzem e/ou liberam uma variedade de compostos que induzem respostas de resistência localizadas ou sistêmicas, causando falta de patogenicidade para as plantas.

[006] Adicionalmente, as plantas são protegidas de inúmeras classes de patógenos de planta por respostas semelhantes à resistência sistêmica adquirida e resistência sistêmica induzida por rizobactérias. Trichoderma spp. pode efetivamente reduzir doenças causadas por alguns patógenos de planta no solo. Por exemplo, as espécies Trichoderma harzianum, Trichoderma hamatum, e Trichoderma viride têm atividade fungicida contra Sclerotium spp, Rhizoctonia, Solani, Pythium spp, Fusarium spp, Cercospora spp, Ralstonia spp, Fragaria spp, Rhizopus spp, Botrytis spp, Colletotrichum spp, Magnaporthe spp. e muitos outros. Além disso, algumas cepas de Trichoderma são capazes de suprimir efetivamente o crescimento de alguns patógenos virais e bacterianos de plantas e solo, além de produzir alguns efeitos nematicidas significativos.

[007] Além de proteger as plantas de patógenos e pragas, a colonização radicular por Trichoderma spp. frequentemente intensifica o crescimento e o desenvolvimento das raízes, a produtividade das culturas, a resistência a estresses abióticos e a biodisponibilidade de nutrientes.

[008] Apesar do potencial das cepas de Trichoderma serem eficazes para uso na intensificação da saúde das plantas, a falta de uma tecnologia de produção em larga escala altamente eficaz para esses organismos cria certos obstáculos à comercialização. O método mais comum para o desenvolvimento de Trichoderma é em meios sólidos tradicionais, e os métodos atuais são muito caros e impraticáveis para adaptação comercial. Por outro lado, os métodos para desenvolver Trichoderma em meio líquido, isto é, cultura submersa, são processos laboratoriais ou de pequena escala e não produzem Trichoderma nas quantidades necessárias para torná-los comercialmente viáveis (por exemplo, para tratamentos de centenas, milhares ou milhões de acres de culturas).

[009] A propagação de Trichoderma por um processo de cultura submersa em larga escala, ou uma combinação de estado submerso e sólido, seria mais adequada para produção comercial; no entanto, esses processos comerciais não são conhecidos em larga escala e com baixo custo. Assim, há uma necessidade de métodos melhorados de produção de fungos Trichoderma que possam ser escalonados para uso comercial.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] A presente invenção refere-se à produção em larga escala de produtos à base de micróbios líquidos e secos para aplicação comercial. Especificamente, são providos materiais e métodos para o cultivo eficiente de fungos, tal como Trichoderma, e/ou seus subprodutos de crescimento em larga escala. Também são providos métodos para usar esses produtos à base de micróbios. Vantajosamente, a invenção em questão pode ser usada como um processo “verde” para a produção de microrganismos em larga escala e a baixo custo, sem liberar produtos químicos nocivos ao meio ambiente.

[0011] A presente invenção provê sistemas para a produção e o uso eficazes de micróbios benéficos, bem como para a produção e o uso de substâncias, tais como, metabólitos, derivados desses micróbios e do meio de fermentação em que são produzidos. Os organismos de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, leveduras, fungos, bactérias, arqueas e células de plantas. Em modalidades preferidas, os microrganismos são fungos. Ainda mais de preferência, os microrganismos são fungos de Trichoderma, incluindo, mas não limitados a, Trichoderma harzianum, Trichoderma viride, e/ou Trichoderma hamatum.

[0012] Em modalidades específicas, a presente invenção provê composições à base de micróbios compreendendo fungos de clado Trichoderma e/ou seus subprodutos de crescimento. Os produtos à base de Trichoderma podem ser, por exemplo, na forma líquida ou seca. Vantajosamente, em uma modalidade, os produtos à base de micróbios podem estar na forma de um inoculante, que pode ser escalonado para concentrações em escala industrial para aplicações comerciais usando fermentação submersa, fermentação em estado sólido e/ou combinações ou híbridos dos mesmos.

[0013] Os produtos à base de Trichoderma podem compreender os próprios microrganismos e/ou seus subprodutos de crescimento. Os microrganismos podem ser viáveis, ativos ou de forma inativa. Eles podem estar na forma de células vegetativas, esporos, conídios, micélios, hifas e/ou uma combinação dos mesmos. Opcionalmente, as composições podem compreender o meio de fermentação no qual os microrganismos foram produzidos, bem como nutrientes residuais e/ou adicionados para o crescimento microbiano.

[0014] Além disso, os produtos à base de Trichoderma em questão podem ser formulados como, por exemplo, biofertilizantes e/ou biopesticidas, que podem ser úteis em aplicações incluindo, por exemplo, jardinagem, horticultura, produção de efeito estufa, bem como para operações de agricultura e reflorestamento em larga escala. O produto também pode ser útil, por exemplo, tal como tratamento de sementes, para recuperação do solo, para produção intensificada, para saúde das raízes das plantas intensificada e/ou para estimulação do crescimento das plantas.

[0015] Em modalidades preferidas, a presente invenção provê o cultivo de produtos à base de micróbios na forma líquida e produtos à base de micróbios no estado sólido a partir de uma cultura de sementes. Em modalidades específicas, os produtos à base de micróbios são um produto à base de Trichoderma de acordo com a presente descrição.

[0016] Os métodos de produção de microrganismos podem compreender fermentação submersa ou em estado sólido, ou híbridos e/ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, os métodos podem ser usados para produzir inóculos para a produção de produtos à base de micróbios em escala industrial.

[0017] Em certas modalidades, a presente invenção provê métodos para produzir produtos à base de micróbios no estado sólido e líquido (por exemplo, produtos à base de Trichoderma) a partir de uma cultura de sementes em quantidades em escala industrial, os métodos compreendendo: (a) preparar um inoculante em microesfera de alginato- ágar a partir de uma cultura de sementes de Trichoderma; (b) cultivar o inoculante em microesfera de alginato- ágar em meio de cultura de nutrientes líquido em um reator para produzir uma densidade microbiana desejada na microesfera; (c) coletar o inoculante de alginato-ágar do meio de cultura líquido; (d) preparar o produto à base de Trichoderma na forma líquida, em que os inoculantes em microesferas de alginato- ágar cultivados são usados para inocular um reator de fermentação submerso e/ou preparar o produto à base de Trichoderma no estado sólido, em que os inoculantes em microesferas de alginato-ágar cultivados são usados para inocular um reator de fermentação no estado sólido.

[0018] Mais especificamente, em uma modalidade, os métodos compreendem (a), a preparação de um inoculante de Trichoderma na forma de microesferas de alginato compreendendo uma cultura de sementes pré-fabricadas, componentes nutricionais, alginato de sódio e ágar. O inoculante em microesfera de alginato pode ser preparado combinando meio nutriente líquido estéril com uma mistura estéril de 1% de ágar e 2% de alginato de sódio e uma pasta fluida de cultura de sementes homogênea a 5% para produzir uma solução de inóculo.

[0019] Um dispositivo de ducha por gotejamento e uma bomba peristáltica são então usados para gotejar a solução de inóculo em um vaso de mistura tendo uma solução a cloreto de cálcio a 1% no mesmo. Durante o processo de gotejamento, as gotículas de inóculo formam microesferas de gel que compreendem componentes nutricionais e a cultura de Trichoderma incorporada na massa de alginato-ágar. Após formar as microesferas, o líquido residual no vaso de mistura pode ser liberado e descartado em um sistema de resíduos líquidos.

[0020] Em uma modalidade, os métodos compreendem (b) o cultivo do inoculante em microesfera de ágar de alginato- ágar em meio de cultura de nutrientes líquido até uma densidade microbiana desejada em e/ou nas microesferas. Em certas modalidades, os inoculantes em microesferas de alginato-ágar são coletados do vaso de mistura e, em seguida, cultivados em um reator contendo um volume suficiente de um meio nutriente líquido adequado para permitir que uma alta concentração de Trichoderma mycelia se disperse dentro e ao longo da superfície de cada microesfera de alginato-ágar. Em certas modalidades, alguns Trichoderma também são produzidos no meio nutriente líquido das microesferas.

[0021] Em uma modalidade exemplificativa, a cultura de sementes para produzir as microesferas inoculantes pode ser obtida a partir de uma cultura produzida usando fermentação submersa em um meio de cultura líquido adequado e sob aeração e agitação contínuas. A temperatura e o pH são mantidos em níveis constantes ou essencialmente constantes ao longo desta etapa (isto é, temperatura entre cerca de 28°C e cerca de 30°C; pH entre cerca de 5,0 e cerca de 6,5). A cultura de sementes pode ser desenvolvida por qualquer período de tempo suficiente para atingir uma concentração e/ou densidade desejada do microrganismo, e homogeneizada para produzir uma pasta fluida de cultura de sementes.

[0022] Em uma modalidade, o método compreende (c), coletar os inoculantes em microesferas de alginato-ágar do meio de cultura líquido após a densidade micelial desejada ser alcançada. Essas microesferas inoculantes podem compreender uma alta concentração de Trichoderma no interior e na superfície. As microesferas podem ser utilizadas para semear culturas aumentadas em escala imediatamente após a coleta, ou podem ser processadas para armazenamento a curto e/ou longo prazo.

[0023] Em certas modalidades, o método compreende adicionalmente, após a etapa (c) e antes da etapa (d), o processamento das microesferas para armazenamento. Isso pode incluir colocar os inoculantes em microesferas de alginato- ágar coletados em uma solução de criopreservação, de modo que os inoculantes possam ser armazenados em um congelador ou um refrigerador sem perda de viabilidade de micróbios. De preferência, a solução de criopreservação compreende água e glicerol, a uma razão de, por exemplo, 50%. Essa solução, com os inoculantes em microesferas colocados na mesma, pode ser armazenada por longos períodos de tempo a temperaturas de, por exemplo, -80 °C a -10 °C, ou por períodos mais curtos em um refrigerador padrão, a, por exemplo, -10 °C a 4,0 °C, sem comprometer a eficácia da cultura de inoculante. Em certas modalidades, as microesferas são armazenadas em grupos de, por exemplo, 1-50 microesferas em frascos vedados.

[0024] Em uma modalidade, os métodos compreendem adicionalmente (d), preparar um produto à base de Trichoderma em forma líquida aumentado em escala e/ou preparar um produto à base de Trichoderma em forma seca ou sólida aumentada em escala. Em certas modalidades, (d) compreende o uso das microesferas inoculantes para semear uma cultura aumentada em escala em um reator de fermentação submersa, em um reator de fermentação em estado sólido ou em uma forma híbrida ou modificada do mesmo, dependendo de um produto líquido ou sólido é desejado.

[0025] Em certas modalidades, a preparação de um produto em forma líquida compreende a semeadura de um reator de fermentação submerso tendo um meio nutriente líquido com uma microesfera inoculante de alginato-ágar da presente invenção.

[0026] Em uma modalidade específica, as microesferas inoculantes são adicionadas a um meio nutriente líquido em, por exemplo, um reator de 200-250 galões (757,08-946,35 L) (volume de trabalho) sob mistura e aeração substancialmente constantes a uma temperatura de cerca de 28°C a cerca de 30°C. O pH do meio é mantido ao longo do processo de fermentação de cerca de 5,0 a cerca de 6,5. A cultura é mantida por 3-10 dias ou até que a densidade de conídios produzidos a partir do inoculante não seja menor que 5 × 108 conídios por ml de meio líquido.

[0027] Em algumas modalidades, a preparação de um produto em forma líquida pode compreender simplesmente o cultivo de quaisquer microrganismos residuais que permanecem no meio líquido da etapa (b) após as microesferas inoculantes terem sido coletadas de acordo com a etapa (c). Os microrganismos residuais podem ser cultivados em um segundo reator ou no mesmo reator em que ocorreu a etapa (b).

[0028] Em uma modalidade, a preparação do produto líquido à base de micróbios compreende adicionalmente aumentar a concentração de microrganismos em até 1 bilhão de propágulos por mililitro e adicionar mais aditivos, conservantes e/ou ajustadores de pH, conforme necessário. O produto líquido “pronto para uso” pode então ser enchido em recipientes (por exemplo, recipientes de 1 galão (3,79 L)), hermeticamente vedados e rotulados para uma variedade de usos, incluindo em ambientes comerciais.

[0029] Em certas modalidades, o método compreende a preparação de um produto à base de Trichoderma em estado sólido aumentado em gel usando fermentação em estado sólido ou um híbrido ou uma modificação do mesmo. Os inoculantes em microesferas de alginato-ágar podem ser misturados com um substrato sólido ou semissólido, tal como vermiculita ou artigos alimentares (por exemplo, farinha de milho, arroz, massa ou feijão). O substrato é, de preferência, umedecido em um meio nutriente apropriado e, em seguida, a mistura pode ser cultivada por cerca de 3 a cerca de 10 dias ou mais, ou de 5 a cerca de 6 dias, em uma incubadora. O substrato e a cultura podem então ser combinados e/ou moídos e secos para preparar um produto à base de Trichoderma na forma de pó para uma variedade de usos, inclusive em ambientes comerciais.

[0030] Em algumas modalidades, a presente invenção também provê métodos de produção de um metabólito e/ou subproduto de crescimento de um fungo, em que o método compreende cultivar os fungos sob condições favoráveis ao crescimento e metabólito e/ou produção de subproduto de crescimento e,

opcionalmente, purificar o metabólito e/ou subproduto do crescimento. Em modalidades específicas, o metabólito e/ou subproduto do crescimento é uma enzima, um biopolímero, um ácido, um solvente, um biotensoativo, um aminoácido, um ácido nucleico, um peptídeo, uma proteína, um lipídeo e/ou um carboidrato.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0031] A presente invenção refere-se à produção em larga escala de produtos à base de micróbios líquidos e secos para aplicação comercial. Especificamente, são providos materiais e métodos para o cultivo eficiente de fungos, tal como Trichoderma, e/ou seus subprodutos de crescimento em larga escala. Também são providos métodos para usar esses produtos à base de micróbios.

[0032] A presente invenção provê sistemas para a produção e o uso eficiente de micróbios benéficos, bem como para a produção e uso de substâncias, tais como metabólitos, derivados desses micróbios e o meio de fermentação em que são produzidos. Os organismos de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, leveduras, fungos, bactérias, arqueas e células de plantas. Em modalidades preferidas, os microrganismos são fungos. Ainda mais de preferência, os microrganismos são fungos Trichoderma, incluindo, mas não limitados a, Trichoderma harzianum, Trichoderma viride e/ou Trichoderma hamatum.

[0033] Em modalidades específicas, são providos materiais e métodos para o cultivo de produtos à base de micróbios no estado sólido e líquido, compreendendo fungos de clado Trichoderma e/ou subprodutos de crescimento de Trichoderma, usando fermentação submersa, fermentação em estado sólido ou híbridos e/ou combinações dos mesmos. Em uma modalidade, os métodos podem ser usados para produzir inóculos para a produção desses produtos à base de micróbios em escala industrial. Definições Selecionadas

[0034] Como usado na presente invenção, referência a uma “composição à base de micróbios” significa uma composição que compreende componentes que foram produzidos como resultado do crescimento de microrganismos ou outras culturas de células. Assim, a composição à base de micróbios pode compreender os próprios micróbios e/ou subprodutos do crescimento microbiano. Os micróbios podem estar no estado vegetativo, na forma de esporos, na forma micelial, em qualquer outra forma de propágulo microbiano ou em uma mistura dos mesmos. Os micróbios podem ser planctônicos ou na forma de biofilme, ou uma mistura de ambos. Os subprodutos do crescimento podem ser, por exemplo, metabólitos (por exemplo, biotensoativos), componentes da membrana celular, proteínas expressadas e/ou outros componentes celulares. Os micróbios podem estar intactos ou lisados. As células podem estar totalmente ausentes ou presentes, por exemplo, em uma concentração de 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1010, 1 x 1011, 1 x 1012, 1 x 1013 ou mais células ou propágulos por mililitro da composição. Como usado na presente invenção, um propágulo é qualquer porção de um microrganismo a partir do qual um organismo novo e/ou maduro pode se desenvolver, incluindo, mas não limitados a, células, micélios, hifas, cistos, esporos (por exemplo, esporos reprodutivos, conídios, endosporos e/ou exósporos), brotos e sementes.

[0035] A presente invenção provê adicionalmente “produtos à base de micróbios", que são produtos que devem ser aplicados na prática para alcançar o resultado desejado. O produto à base de micróbios pode ser simplesmente a composição à base de micróbios coletados no processo de cultivo de micróbios. Alternativamente, o produto à base de micróbios pode compreender ingredientes adicionais que foram adicionados. Esses ingredientes adicionais podem incluir, por exemplo, estabilizadores, tampões, carreadores (por exemplo, soluções de água ou sal), nutrientes adicionados para suportar o crescimento microbiano adicional, intensificadores de crescimento que não sejam nutrientes e/ou agentes que facilitam o rastreamento dos micróbios e/ou composição no ambiente em que é aplicada. O produto à base de micróbios também pode compreender misturas de composições à base de micróbios. O produto à base de micróbios também pode compreender um ou mais componente(s) de uma composição à base de micróbios que foram processados de alguma forma, tais como, mas não limitados a, filtração, centrifugação, lise, secagem, purificação e similares.

[0036] Como usado na presente invenção, os termos “inóculo” ou “inoculante” (plural “inóculos”) podem ser incluídos no termo “produto à base de micróbios”. Como usados na presente invenção, inóculo significa um produto à base de micróbios que pode ser usado, por exemplo, tal como uma cultura de sementes para inocular um sistema ou processo de fermentação em maior escala. O inóculo pode ser escalonado em tal sistema de fermentação para produzir quantidades desejadas de composições e produtos à base de micróbios.

[0037] Conforme usado na presente invenção, uma molécula de ácido nucleico “isolado” ou “purificado", polinucleotídeo, polipeptídeo, proteína, composto orgânico, tal como uma molécula pequena (por exemplo, as descritas abaixo), ou outro composto é substancialmente livre de outros compostos, tal como material celular ao qual está associado na natureza. Por exemplo, um polinucleotídeo purificado ou isolado (ácido ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA)) é livre dos genes ou das sequências que flanqueiam o mesmo em seu estado de ocorrência natural. Um polipeptídeo purificado ou isolado é livre dos aminoácidos ou das sequências que flanqueiam o mesmo em seu estado de ocorrência natural. Uma cepa microbiana purificada ou isolada é removida do ambiente em que existe na natureza. Assim, a cepa isolada pode existir como, por exemplo, uma cultura biologicamente pura, ou como esporos (ou outras formas da cepa) em associação com um carreador.

[0038] Em certas modalidades, os compostos purificados são pelo menos 60% em peso (peso seco) do composto de interesse. De preferência, a preparação é de pelo menos 75%, mais de preferência de pelo menos 90%, e mais de preferência de pelo menos 99% em peso do composto de interesse. Por exemplo, um composto purificado é aquele que possui pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% ou 100% (p/p) do composto desejado em peso. A pureza é medida por qualquer método padrão apropriado, por exemplo, por cromatografia em coluna, cromatografia em camada fina ou análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).

[0039] Um “metabólito” refere-se a qualquer substância produzida pelo metabolismo (por exemplo, um subproduto do crescimento) ou uma substância necessária para participar de um processo metabólico específico. Um metabólito pode ser um composto orgânico que é um material de partida (por exemplo, glicose), um intermediário (por exemplo, acetil-CoA) ou um produto final (por exemplo, n-butanol) do metabolismo. Exemplos de metabólitos podem incluir, mas não limitados a, enzimas, toxinas, ácidos, solventes, álcoois, proteínas, carboidratos, vitaminas, minerais, microelementos, aminoácidos, polímeros e tensoativos.

[0040] Conforme usadas na presente invenção, as expressões “ampliado”, “em larga escala”, “escala comercial” e “escala industrial” podem ser usadas de forma intercambiável e referem-se a produtos que, por volume, concentração, quantidade, conteúdo, e/ou potência, podem ser usadas em aplicações industriais e/ou comerciais. Por exemplo, uma quantidade em escala industrial de um produto à base de micróbio líquido ou um produto à base de micróbio seco dissolvido em um carreador líquido, pode compreender de 100 galões (378,54 L) a 10.000 galões (37854,12 L) ou mais. As aplicações industriais e/ou comerciais podem incluir, por exemplo, jardinagem, horticultura, produção de efeito estufa, agricultura, recuperação de solo, biorremediação, reflorestamento e supressão de pragas.

[0041] Conforme usado na presente invenção, “coletado” refere-se à remoção de parte ou toda a composição à base de micróbios de um vaso de crescimento.

[0042] O termo de transição “compreendendo”, que é sinônimo de “incluindo” ou “contendo”, é inclusivo ou aberto e não exclui elementos adicionais não especificados ou etapas do método. Por outro lado, a expressão transitória “consistindo em” exclui qualquer elemento, etapa ou ingrediente não especificado(a) na reivindicação. A expressão de transição “consistindo essencialmente em” limita o escopo de uma reivindicação aos materiais ou etapas especificados “e àqueles que não afetam materialmente as características básicas e novas características” da invenção reivindicada.

[0043] A menos que seja especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, como usado na presente invenção, o termo “ou” é entendido como inclusivo. A menos que seja especificamente declarado ou óbvio no contexto, conforme usado na presente invenção, os termos “um(a)”, “e” e “o(a)” são entendidos como singulares ou plurais.

[0044] A menos que seja especificamente declarado ou óbvio a partir do contexto, como usado na presente invenção, o termo “cerca de” é entendido como dentro de uma faixa de tolerância normal na técnica, por exemplo, dentro de 2 desvios padrão da média. Sobre pode ser entendido como dentro de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1%, 0,05% ou 0,01% do valor indicado.

[0045] A recitação de uma lista de grupos químicos em qualquer definição de uma variável na presente invenção inclui definições dessa variável como qualquer grupo único ou combinação de grupos listados. A recitação de uma modalidade para uma variável ou um aspecto na presente invenção inclui essa modalidade como qualquer modalidade única ou em combinação com quaisquer outras modalidades ou porções das mesmas.

[0046] Todas as referências citadas na presente invenção são incorporadas por referência na sua totalidade. Métodos de produção de produtos à base de Trichoderma

[0047] A presente invenção provê métodos para o cultivo de microrganismos Trichoderma e produção de metabólitos microbianos e/ou outros subprodutos do crescimento microbiano. Em algumas modalidades, são providos métodos para a produção de produtos à base de Trichoderma na forma seca e líquida. Os métodos de produção de microrganismos podem compreender cultura submersa, fermentação em estado sólido ou híbridos e/ou combinações dos mesmos. Como usado na presente invenção, “fermentação” refere-se ao cultivo e/ou crescimento de células sob condições controladas. O crescimento pode ser aeróbico ou anaeróbico.

[0048] Em uma modalidade, a presente invenção provê materiais e métodos para a produção de biomassa (por exemplo, material celular viável), metabólitos extracelulares (por exemplo, pequenas moléculas e proteínas excretadas), nutrientes residuais e/ou componentes intracelulares (por exemplo, enzimas e outras proteínas).

[0049] O vaso de crescimento de micróbios (por exemplo, reator) usado de acordo com a invenção em questão pode ter controles/sensores funcionais ou pode ser conectado a controles/sensores funcionais para medir fatores importantes no processo de cultivo, tais como, pH, oxigênio, pressão, temperatura, umidade, viscosidade e/ou densidade microbiana e/ou concentração de metabólitos.

[0050] O vaso do reator pode ser inoculado com um microrganismo de escolha. De preferência, o vaso é inoculado com um inoculante produzido de acordo com a presente invenção, por exemplo, uma microesfera de inoculante de alginato-ágar como descrito na presente invenção. Dependendo do tamanho do vaso, o número de inoculantes necessários para inocular um vaso para produção aumentada em escala pode variar de 1 microesfera de inoculante a 40 ou 50 microesferas, ou mais.

[0051] Em uma modalidade adicional, o vaso também pode ser capaz de monitorar o crescimento de microrganismos no interior do vaso (por exemplo, medição do número de células e fases de crescimento). Alternativamente, uma amostra diária pode ser retirada do recipiente e submetida à enumeração por técnicas conhecidas na técnica, tal como a técnica de diluição em placas. A diluição em placas é uma técnica simples usada para estimar o número de micróbios em uma amostra. A técnica também pode prover um índice pelo qual diferentes ambientes ou tratamentos podem ser comparados.

[0052] O método pode prover oxigenação para a cultura em crescimento. Uma modalidade utiliza movimento lento do ar para remover o ar contendo baixo teor de oxigênio e introduzir o ar oxigenado. No caso de fermentação submersa, o ar oxigenado pode ser suplementado diariamente com ar ambiente através de mecanismos incluindo impulsores para agitação mecânica do líquido, e aspersores de ar para fornecer bolhas de gás ao líquido para dissolução de oxigênio no líquido.

[0053] Em uma modalidade, o método inclui suplementar o cultivo com uma fonte de nitrogênio. A fonte de nitrogênio pode ser, por exemplo, nitrato de potássio, nitrato de amônio, sulfato de amônio, fosfato de amônio, amônia, ureia e/ou cloreto de amônio. Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas independentemente ou em uma combinação de duas ou mais.

[0054] O método pode compreender adicionalmente a suplementação do cultivo com uma fonte de carbono. A fonte de carbono é tipicamente um carboidrato, tais como, glicose, sacarose, lactose, frutose, trealose, manose, manitol, maltose, dextrose de batata, celulose, amido e/ou laminarina; ácidos orgânicos, tais como, ácido acético, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido propiônico, ácido málico, ácido malônico e/ou ácido pirúvico; álcoois, tais como, etanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, isobutanol e/ou glicerol; gorduras e óleos, tais como, óleo de soja, óleo de farelo de arroz, azeite, óleo de canola, óleo vegetal, óleo de milho, óleo de gergelim e/ou óleo de linhaça; etc. Essas fontes de carbono podem ser usadas independentemente ou em uma combinação de duas ou mais.

[0055] Em uma modalidade, fatores de crescimento e traços de nutrientes para microrganismos são incluídos no meio. Isso é particularmente preferido na coleta de micróbios que são incapazes de produzir todas as vitaminas necessárias. Nutrientes inorgânicos, incluindo oligoelementos, tais como, ferro, zinco, cobre, manganês, molibdênio e/ou cobalto também podem ser incluídos no meio. Além disso, fontes de vitaminas, aminoácidos essenciais e microelementos podem ser incluídos, por exemplo, na forma de farinhas ou refeições, tais como, farinha de milho, ou na forma de extratos, tais como, extrato de levedura, extrato de batata, extrato de carne bovina, extrato de soja, extrato de casca de banana e similares, ou em formas purificadas. Também podem ser incluídos aminoácidos tais como, por exemplo, aqueles úteis para a biossíntese de proteínas.

[0056] Em uma modalidade, sais inorgânicos também podem ser incluídos. Os sais inorgânicos utilizáveis podem ser di- hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato de dipotássio, hidrogenofosfato dissódico, sulfato de magnésio, cloreto de magnésio, sulfato de ferro, cloreto de ferro, sulfato de manganês, cloreto de manganês, sulfato de zinco, cloreto de chumbo, sulfato de cobre, cloreto de cálcio, carbonato de cálcio, e/ou carbonato de sódio. Estes sais inorgânicos podem ser usados independentemente ou em uma combinação de dois ou mais.

[0057] Em algumas modalidades, o método para cultivo pode compreender adicionalmente a adição de ácidos e/ou antimicrobianos adicionais no meio líquido antes e/ou durante o processo de cultivo para proteger a cultura contra a contaminação por microrganismos indesejáveis. Adicionalmente, agentes antiformação de espuma também podem ser adicionados para impedir a formação e/ou o acúmulo de espuma quando o gás é produzido durante o cultivo.

[0058] O pH da mistura deve ser adequado para o crescimento de fungos, principalmente de Trichoderma. Em certas modalidades, o pH é de cerca de 5,0 a cerca de 7,0, de preferência cerca de 5,0 a cerca de 6,5. Tampões e reguladores de pH, tais como carbonatos e fosfatos, podem ser usados para estabilizar o pH próximo a um valor preferido. Quando íons metálicos estão presentes em altas concentrações, pode ser necessário o uso de um agente quelante no meio líquido.

[0059] O método e o equipamento para o cultivo de microrganismos Trichoderma e a produção de subprodutos microbianos podem ser realizados em processos em batelada, semicontínuos ou contínuos.

[0060] Em uma modalidade, o método para cultivo é realizado a cerca de 5°C a cerca de 100°C, de preferência, 15°C a 60°C, mais de preferência, 25°C a 30°C. Em uma outra modalidade, o cultivo pode ser realizado continuamente a uma temperatura constante. Em outra modalidade, o cultivo pode ser submetido a mudanças de temperatura.

[0061] Em uma modalidade, o equipamento usado no método e no processo de cultivo é estéril. O equipamento de cultivo, tal como o reator/vaso, pode ser separado, mas conectado a, uma unidade de esterilização, por exemplo, uma autoclave. O equipamento de cultivo também pode ter uma unidade de esterilização que esteriliza in situ antes de iniciar a inoculação. O ar pode ser esterilizado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o ar ambiente pode passar por pelo menos um filtro antes de ser introduzido no vaso. Em outras modalidades, o meio pode ser pasteurizado ou, opcionalmente, nenhum calor adicionado, onde o uso de baixa atividade de água e pH pode ser explorado para controlar o crescimento bacteriano.

[0062] Em uma modalidade, a presente invenção provê adicionalmente um método para a produção de metabólitos microbianos, tais como, etanol, ácido lático, beta-glucana, proteínas, peptídeos, intermediários metabólicos, ácido graxo poli-insaturado e lipídeos, em que o método compreende cultivar um microrganismo sob condições favoráveis para crescimento e expressão do metabólito. Em modalidades específicas, o metabólito é um(a) enzima, biopolímero, ácido, solvente, biotensoativo, aminoácido, ácido nucleico, peptídeo, proteína, lipídeo e/ou carboidrato. O teor de metabólito produzido pelo método pode ser, por exemplo, pelo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%.

[0063] No caso de fermentação submersa, o teor de biomassa do caldo de fermentação pode ser, por exemplo, de 5 g/l a 180 g/l ou mais. Em uma modalidade, o teor de sólidos do caldo é de 10 g/l a 150 g/l.

[0064] O subproduto do crescimento microbiano produzido por Trichoderma pode ser retido nos microrganismos ou secretado no meio de crescimento. Em outra modalidade, o método para a produção de subproduto de crescimento microbiano pode adicionalmente compreender etapas de concentração e purificação do subproduto de crescimento microbiano de interesse. Em uma modalidade adicional, o meio líquido pode conter compostos que estabilizam a atividade do subproduto do crescimento microbiano.

[0065] Em uma modalidade, toda a composição de cultivo microbiano é removida após a conclusão do cultivo (por exemplo, ao atingir, por exemplo, uma densidade celular desejada ou densidade de um metabólito especificado no meio). Neste procedimento em batelada, uma batelada totalmente nova é iniciada após a coleta da primeira batelada.

[0066] Em outra modalidade, apenas uma porção do produto de fermentação é removida a qualquer momento. Nesta modalidade, a biomassa com células viáveis permanece no vaso como um inoculante para uma nova batelada de cultivo. A composição que é removida pode ser um caldo ou substrato sem células, ou pode conter células. Dessa maneira, um sistema semicontínuo é criado.

[0067] Vantajosamente, o método não requer equipamentos complicados ou alto consumo de energia. O Trichoderma pode ser cultivado em pequena ou grande escala no local e utilizado, mesmo sendo ainda misturado com seus meios. De forma similar, os metabólitos microbianos também podem ser produzidos em grandes quantidades no local de necessidade.

[0068] Os organismos que podem ser cultivados usando a presente invenção podem incluir, por exemplo, leveduras, fungos, bactérias, arqueas e células de plantas. Em modalidades preferidas, os microrganismos são fungos. Ainda mais de preferência, os microrganismos são fungos Trichoderma, incluindo, mas não se limitando a, Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum (Trichoderma narcissi), Trichoderma viride, e/ou Trichoderma hamatum.

[0069] Outros fungos também podem ser produzidos de acordo com a presente invenção, incluindo Mycorrhizae, fungos ectomicorrízicos, leveduras, tal como Starmerella bombicola, e até esporos de fungos formadores de cogumelos, tal como shiitake (Lentinula edodes).

[0070] De acordo com a presente invenção, é possível desenvolver quantidades comerciais em larga escala de produtos à base de Trichoderma. Vantajosamente, Trichoderma pode ser desenvolvido dentro de 3 a 10 dias, ou 5 a 6 dias, com rendimentos de 5 x 108 a 5 x 109 conídios por ml de cultura líquida usando um reator de fermentação de 200 galões (757,08 L); e rendimentos de mais de 1 x 109 conídios por grama de produto seco em uma incubadora, tal como um reator do tipo forno de crescimento.

[0071] Em certas modalidades, a presente invenção provê métodos de produção de produtos à base de micróbios nos estados sólido e líquido (por exemplo, produtos à base de Trichoderma) a partir de uma cultura de sementes em quantidades em escala industrial. Vantajosamente, o uso de inoculantes em microesferas de alginato-ágar (ou “microesferas inoculantes", “inoculantes em microesferas", “microesferas” ou “inoculantes") de acordo com a presente invenção permite a inoculação de um reator com uma concentração celular muito maior do que poderia ser alcançado se um inoculante líquido padrão fosse usado. Uma “alta concentração” refere-se a, por exemplo, pelo menos 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013 ou mais células ou propágulos de um microrganismo desejado por unidade (peso ou volume).

[0072] Em modalidades preferidas, os métodos compreendem: (a) preparar um inoculante em microesfera de alginato- ágar a partir de uma cultura de sementes de Trichoderma; (b) cultivar o inoculante em microesfera de alginato- ágar em meio de cultura de nutrientes líquido em um reator para produzir uma densidade microbiana desejada na microesfera; (c) coletar o inoculante em microesfera de alginato-ágar do meio de cultura líquido; (d) preparar o produto à base de Trichoderma na forma líquida, em que os inoculantes em microesferas de alginato- ágar cultivados são usados para inocular um reator de fermentação submerso e/ou preparar o produto à base de Trichoderma no estado sólido, em que os inoculantes em microesferas de alginato-ágar cultivados são usados para inocular um reator de fermentação no estado sólido.

[0073] Mais especificamente, em uma modalidade, os métodos compreendem (a), preparação de um inoculante de Trichoderma na forma de microesferas de alginato-ágar compreendendo uma cultura de sementes pré-fabricada, componentes nutricionais, alginato de sódio e ágar. A cultura de sementes (por exemplo, uma pasta fluida de cultura de sementes homogênea a 5%) pode ser dissolvida em meio nutriente estéril, e combinada com uma mistura de ágar e alginato de sódio para produzir uma solução de inóculo.

[0074] A concentração do alginato na solução de inóculo pode ser de cerca de 0,1 a cerca de 3,0%, de preferência cerca de 0,5 a cerca de 2,5%, mais de preferência cerca de 2,0%. A concentração do ágar pode ser de cerca de 0,1% a cerca de 2,0%, de preferência cerca de 0,5% a cerca de 1,5%, mais de preferência cerca de 1,0%. Em uma modalidade, o ágar de alginato pode ser autoclavado e/ou aquecido antes da mistura com a cultura de sementes.

[0075] Um dispositivo de ducha por gotejamento e uma bomba peristáltica são então usados para gotejar a solução de inóculo em um vaso de mistura tendo uma solução de cloreto de cálcio no mesmo. Durante o processo de gotejamento, as gotículas de inóculo formam microesferas de gel compreendendo componentes nutricionais e partículas de fungos de Trichoderma incorporadas na massa de alginato- ágar. Em certas modalidades, cerca de 5 a 10 kg de inoculante em microesfera de alginato são produzidos a partir de uma batelada. Após formar as microesferas, o líquido residual no vaso de mistura pode ser liberado e descartado em um sistema de resíduos líquidos.

[0076] Em certas modalidades, a solução de CaCl2 pode ser de cerca de 1,0% a cerca de 5,0%, de preferência cerca de 1% a 2%.

[0077] Em uma modalidade, o vaso de mistura é um tanque rotativo móvel equipado com um motor. O tanque pode ter cerca de 2 a cerca de 4 (56,6 a cerca de 113,3 L), a cerca de 6 pés cúbicos (169,90 L) de volume, ou mais, e ser feito de polietileno, qualquer outra fonte polimérica ou metal. O tanque rotativo pode conter, por exemplo, 5 a 10 galões (18,93 a 37,85 L) de uma solução a cloreto de cálcio a 1%.

[0078] Em uma modalidade exemplificativa, a cultura de sementes para produzir as microesferas inoculantes pode ser obtida de uma cultura produzida usando fermentação submersa em um meio de cultura líquido adequado (ver, por exemplo, Elad et al. (1982), incorporado por referência na presente invenção) e sob contínua aeração e agitação. A temperatura e o pH são mantidos em níveis constantes ou essencialmente constantes ao longo desta etapa (isto é, temperatura entre cerca de 28°C e cerca de 30°C; pH entre cerca de 5,0 e cerca de 6,5). A cultura de sementes pode ser desenvolvida por qualquer período de tempo suficiente para atingir uma concentração e/ou densidade desejada do microrganismo e homogeneizada para produzir uma pasta fluida de cultura de sementes.

[0079] Em uma modalidade, os métodos compreendem (b) o cultivo do inoculante em microesfera de ágar de alginato- ágar em meio de cultura de nutrientes líquido até uma densidade microbiana desejada nas e/ou nas microesferas. Em certas modalidades, os inoculantes em microesferas de alginato-ágar são coletados do vaso de mistura e, em seguida, cultivados em um reator contendo um meio nutriente líquido adequado para permitir que uma alta concentração de Trichoderma mycelia cresça dentro de cada microesfera de alginato-ágar e se dispersam sobre a superfície do cada microesfera. Em certas modalidades, os parâmetros de cultivo para a etapa (b), tais como, temperatura, meio e pH, podem ser os mesmos que os usados para produzir a cultura inicial de sementes. Em certas modalidades, uma certa quantidade de células de Trichoderma também cresce no meio nutriente líquido, desacoplado das microesferas de inoculante.

[0080] Em uma modalidade, o método compreende (c), em que as microesferas de inoculantes de alginato-ágar que compreendem uma alta concentração de Trichoderma são coletadas do meio líquido. Essas esferas inoculantes podem compreender uma alta concentração de Trichoderma dentro e/ou na superfície. As microesferas podem ser utilizadas para semear culturas aumentadas em escala imediatamente após a coleta, ou podem ser processadas para armazenamento a curto e/ou longo prazo. Em algumas modalidades, as microesferas são colocadas em um recipiente, tal como um tubo ou um balão, após a coleta.

[0081] Em certas modalidades, o método pode compreender adicionalmente, após a etapa (c) e antes da etapa (d), o processamento das microesferas para armazenamento. Isso pode compreender a suspensão dos inoculantes em microesferas de alginato-ágar coletados em uma solução de criopreservação, de modo que os inoculantes possam ser armazenados em um congelador ou um refrigerador sem perda de viabilidade de micróbios. De preferência, o armazenamento ocorre em um tubo, balão, cilindro, frasco ou prato ou outro recipiente de laboratório padrão semelhante.

[0082] Em certas modalidades, a solução de criopreservação compreende água e uma substância crioprotetora. Os crioprotetores são compostos anticongelantes bem conhecidos que são capazes de proteger células e outros tecidos biológicos contra danos causados por congelamento e formação de gelo. Muitas espécies animais e vegetais nativas de zonas climáticas mais frias produzem crioprotetores naturais para proteger seus corpos e células. Crioprotetores isolados e sintéticos também são usados na preservação de materiais vivos para pesquisas biológicas e em produtos alimentícios.

[0083] Exemplos de crioprotetores úteis de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, glicóis, tais como, etilenoglicol, propilenoglicol e glicerol, dimetilssulfóxido (DMSO), trealose, 2-metil-2,4- pentanodiol (MPD) e sacarose.

[0084] Em modalidades preferidas, a solução de criopreservação compreende água e glicerol, em que a porcentagem de glicerol é de 35% a 75%, de preferência cerca de 50%.

[0085] Esta solução, com os inoculantes em microesferas colocados na mesma, pode ser armazenada por longos períodos de tempo em um congelador ajustado para, por exemplo, cerca de -80°C a cerca de 0°C, de preferência de cerca de -80°C a cerca de -20°C. O armazenamento nessas temperaturas pode durar o tempo necessário, mantendo a eficácia e a viabilidade do material biológico em, por exemplo, até 1 mês, 6 meses ou 1, 2, 3, 4, 5 ou até 10 ou mais anos.

[0086] Em certas modalidades, quando o armazenamento a curto prazo é desejado, por exemplo, 1 mês ou menos, os recipientes tendo esferas inoculantes em suspensão em solução de glicerol podem ser armazenados em um refrigerador ajustado a uma temperatura de cerca de -15°C a cerca de 4°C,

ou cerca de -10°C a cerca de 4°C, ou cerca de 0°C a 4°C.

[0087] Em certas modalidades, as microesferas são armazenadas em grupos compreendendo a solução de criopreservação e, por exemplo, 1-50 microesferas por um recipiente vedado.

[0088] Em outras modalidades, as microesferas não são coletadas no reator de fermentação de acordo com (c), mas, em vez disso, a solução de criopreservação é vertida diretamente no reator de fermentação usado na etapa (b) e o próprio reator é usado para armazenar e preservar toda a batelada de microesferas. A temperatura no interior do reator pode ser ajustada em conformidade.

[0089] Em uma modalidade, os métodos compreendem adicionalmente (d), preparar um produto à base de Trichoderma em forma líquida expandida e/ou preparar um produto à base de Trichoderma em forma seca ou sólida aumentado em escala. Em certas modalidades, (d) compreende o uso das microesferas inoculantes para semear uma cultura aumentada em escala em um reator de fermentação submersa, em um reator de fermentação em estado sólido, ou em uma forma híbrida ou modificada do mesmo, dependendo de um produto líquido ou sólido é desejado.

[0090] Em certas modalidades, a preparação de um produto em forma líquida compreende a semeadura de um reator de fermentação submerso tendo um meio nutriente líquido com uma microesfera inoculante de alginato-ágar da presente invenção. Em algumas modalidades, quando, por exemplo, as microesferas de inoculantes foram preservadas usando a solução de glicerol, as microesferas podem ser retiradas diretamente do congelador ou refrigerador onde estavam sendo armazenadas e usadas para semear o reator. Vantajosamente, os métodos em questão permitem inocular vários reatores de fermentação em larga escala (por exemplo, tendo um volume de 100 a 2.000 galões (378,54 L), a 10.000 galões (37854,12 L) ou mais) de uma única cultura de sementes.

[0091] Em uma modalidade preferida, a produção em larga escala (ampliada) é realizada em um novo reator portátil e distribuível. A fermentação usando este sistema é conduzida como um processo em lote, sem agitação, mas com mistura e aeração. Em uma modalidade, o sistema compreende um tanque de alto volume. O reator pode compreender adicionalmente um sistema de mistura compreendendo um primeiro e um segundo sistemas de tubulação, em que o primeiro sistema de tubulação é localizado no lado vertical esquerdo do tanque e o segundo está localizado no lado vertical direito do tanque. Cada sistema de tubulação tem uma conexão no fundo do tanque e no topo do tanque. Cada sistema de tubulação pode ser equipado com bombas capazes de transferir líquido de cultura do fundo do tanque, através da tubulação, e voltar ao topo do tanque a uma velocidade de até 200 galões (757,08 L) por minuto. Esses sistemas de tubulação podem operar continuamente durante todo o processo de fermentação para misturar a cultura.

[0092] Este reator de tanque único pode compreender um aspersor fornecido com ar filtrado por um soprador de ar capaz de prover 2 litros de ar por litro de cultura por minuto. O ar filtrado para aspersão pode ser gerado através de um sistema de bombeamento aquático de alto volume, compreendendo bombas fornecidas com filtros adicionais.

[0093] O reator do sistema tem de preferência um volume de trabalho de 200 a 2.000 galões (757,08 a 7570,82 L), mas pode ser menor (por exemplo, 100-200 galões (378,54-757,08 L) ou maior (por exemplo, até 10.000 galões (37854,12 L) ou mais). No entanto, os tamanhos e a configuração dos reatores podem variar (dependendo, por exemplo, do volume final de produto à base de micróbios em escala industrial desejado). O sistema pode ser usado para culturas microbianas de uma variedade de cepas e espécies, e praticamente sem limite para a quantidade total de produto à base de micróbios que pode ser produzido.

[0094] Em algumas modalidades, para reduzir o custo da produção da cultura e garantir a escalabilidade da produção, os sistemas de fermentação não são esterilizados usando métodos tradicionais. Em vez disso, é usados um método de saneamento de vasos vazios, que compreende o tratamento de superfícies internas com 2 a peróxido de hidrogênio a 3% e a lavagem com alvejante e água quente de alta pressão. Adicionalmente, de modo a reduzir a probabilidade de contaminação significativa, a água usada para preparar a cultura de cultivo é filtrada através de um filtro de 0,1 micrômetro. Os componentes do meio de cultura são descontaminados à temperatura a 85-90°C, ou dissolvidos em peróxido de hidrogênio a 3% (a razão de componentes secos e H2O é de 1:3 v/v).

[0095] Em certas modalidades, o meio para uso na etapa de aumento de produção de Trichoderma é um meio nutritivo basal líquido compreendendo caldo de dextrose de batata ou glicose como fonte de carbono. O meio também pode compreender uma fonte de carbono adicional e uma fonte de nitrogênio. A fonte de carbono adicional pode ser selecionada de glicose,

sacarose, maltose, frutose, celulose, amido e laminarina. O meio também pode opcionalmente compreender extrato de malte.

[0096] Uma variedade de fontes de nitrogênio pode ser usada no meio nutriente basal líquido, embora de preferência sejam usados nitratos ou nitritos. Em modalidades preferidas, o nitrato de amônio é usado como uma fonte de nitrogênio.

[0097] O meio nutriente basal líquido também pode compreender quantidades adequadas de minerais e oligoelementos, tais como, MgSO4, FeCl2, MnSO4, ZnSO4, KCl e K2HPO4. Outros oligoelementos e minerais também podem ser adicionados.

[0098] Em algumas modalidades, o meio nutriente basal líquido compreende extrato de levedura como uma fonte de vitamina. De modo a desenvolver um produto “orgânico”, compostos antibacterianos, tais como, antibióticos, não devem ser incluídos no meio nutritivo. Em vez disso, devem ser utilizados compostos naturais com propriedades antibacterianas (por exemplo, biotensoativos, tais como, soporolipídeos e ramnolipídeos; e/ou ácidos de lúpulo ou lúpulos), desde que não tenham um efeito adverso no microrganismo sendo produzido pelos métodos em questão (por exemplo, espécies de Trichoderma).

[0099] Em uma modalidade exemplificativa, o meio nutriente basal líquido para produção em larga escala de Trichoderma nos sistemas de reator em questão compreende os componentes nas quantidades listadas na Tabela 1 do Exemplo 1 abaixo.

[00100] A temperatura de fermentação para produção em larga escala de produtos à base de Trichoderma deve variar entre cerca de 25 a cerca de 32°C, de preferência entre cerca de 28 e 30°C. O pH deve variar entre cerca de 5,0 e cerca de 6,5, de preferência entre cerca de 5,5 e cerca de 6,0. A estabilização do pH durante a fermentação não é crítica, mas o pH não deve cair abaixo de 4,5. Se necessário, o controle ou manutenção do pH durante a fermentação pode ser realizado usando técnicas manuais ou automáticas convencionais na técnica, tal como o uso de controladores automáticos de pH para adicionar componentes básicos. As bases preferidas empregadas para controle de pH incluem, mas não estão limitadas a, NaOH e KOH.

[00101] De preferência, a cultura é mantida por 3 a 10 dias, ou mais, ou 5 a 6 dias, até que a densidade dos conídios produzidos a partir das microesferas inoculantes de alginato seja de aproximadamente 5 x 108 a 5 x 109 conídios por mililitro de cultura líquida.

[00102] Em algumas modalidades, a preparação de um produto em forma líquida pode compreender simplesmente o cultivo de quaisquer microrganismos residuais que permanecem no meio líquido restante após a colheita das microesferas inoculantes de acordo com a etapa (c). Os microrganismos residuais podem ser cultivados em um segundo reator ou no mesmo reator em que ocorreu a etapa (b).

[00103] Em uma modalidade, a preparação do produto líquido à base de micróbios compreende adicionalmente o crescimento da concentração de microrganismos em até 1 bilhão de propágulos por mililitro, e a adição de mais aditivos, conservantes e/ou ajustadores de pH, conforme necessário. O produto líquido “pronto para uso” pode então ser enchido em recipientes (por exemplo, recipientes de 1 galão),

hermeticamente vedados e rotulados para uma variedade de usos, incluindo em ambientes comerciais.

[00104] Em certas modalidades, o método compreende a preparação de um produto à base de Trichoderma em estado sólido aumentado em escala usando fermentação em estado sólido ou um híbrido ou uma modificação do mesmo. Os inoculantes em microesferas de alginato-ágar podem ser misturados com um substrato sólido ou semissólido, tais como, vermiculita ou artigos alimentares (por exemplo, farinha de milho, massa, arroz ou feijão). O substrato é, de preferência, umedecido em um meio nutriente apropriado. Por exemplo, as bandejas podem ser pulverizadas regularmente (por exemplo, uma vez por dia, uma vez a cada dois dias, uma vez por semana) com um meio nutriente estéril durante o cultivo.

[00105] A mistura pode ser cultivada por cerca de 3 a cerca de 10 dias ou mais, ou de 5 a cerca de 6 dias, em uma incubadora. O substrato e a cultura podem então ser misturados e/ou moídos e secos para preparar um produto à base de Trichoderma na forma de pó para uma variedade de usos, inclusive em ambientes comerciais.

[00106] Em algumas modalidades, quando, por exemplo, as microesferas inoculantes foram preservadas usando a solução de glicerol, as microesferas podem ser retiradas diretamente do congelador ou refrigerador onde estavam sendo armazenadas e usadas para semear o substrato sólido ou semissólido.

[00107] Em modalidades específicas, a produção de produto comercial de estado sólido de, por exemplo, Trichoderma, pode compreender misturar as microesferas coletadas com o substrato e o meio nutriente e incubar a mistura em bandejas.

Em certas modalidades, as bandejas são incubadas em fornos de crescimento ou em um aparelho de aquecimento semelhante.

[00108] Em uma modalidade exemplificativa, quando a vermiculita é usada, a vermiculita é esterilizada por calor a 150°C durante a noite em um forno. Cerca de 3 a 4 partes de vermiculita esterilizada são completamente misturadas com 1 parte de esferas de alginato-ágar. A mistura é espalhada finamente nas bandejas. O cultivo pode ocorrer por cerca de 5 a 6 dias, a cerca de duas semanas, com aeração pelo ar ambiente.

[00109] Após o término do processo de cultivo, a temperatura na incubadora é aumentada para cerca de 40°C, e a secagem pode ocorrer por cerca de 3 a cerca de 4 dias usando suplementação de ar seco e aspiração de ar umedecido. O produto seco à base de micróbios pode ser triturado, moído ou micronizado até o tamanho de partícula desejado. A concentração de propágulos não deve ser menor que 1 × 109 conídios por grama do produto seco, e pode atingir até 1 × 1010, 1 × 1011, 1 × 1012 ou mesmo 1 × 1013 propágulos por grama.

[00110] O produto microbiano seco pode então ser misturado com terra de diatomáceas seca e produto de compostagem comercial para redistribuir a umidade residual e padronizar o produto final. A concentração de propágulos após a mistura pode ser, por exemplo, cerca de 1 × 106 conídios por grama. Este produto final seco à base de Trichoderma pode ser acondicionado em sacos plásticos rotulados e vedado hermeticamente para realização comercial.

[00111] Em certas modalidades, o produto final à base de Trichoderma seco pode compreender fontes de carbono, proteínas e/ou minerais.

Produção Local de Produtos à Base de Micróbios

[00112] Em certas modalidades da presente invenção, uma instalação de crescimento de micróbios produz microrganismos frescos de alta densidade e/ou subprodutos de crescimento microbiano de interesse em uma escala desejada. A instalação de crescimento de micróbios pode estar localizada no ou próximo ao local da aplicação. A instalação produz composições à base de micróbios de alta densidade em cultivo em batelada, semicontínuo ou contínuo.

[00113] As instalações de crescimento de micróbios da presente invenção podem estar localizadas no local onde o produto à base de micróbios será usado (por exemplo, uma fazenda de peixes). Por exemplo, a instalação de crescimento de micróbios pode ser menor que 300, 250, 200, 150, 100, 75, 50, 25, 15, 10, 5, 3 ou 1 milha (1 milha = 1,61 quilômetros) a partir da localização de uso.

[00114] Como o produto à base de micróbios é gerado no local ou próximo ao local de aplicação, sem a necessidade de estabilização, preservação, armazenamento prolongado e processos extensos de transporte da produção convencional, uma densidade muito maior de microrganismos vivos pode ser gerada, exigindo, assim, uma volume muito menor do produto à base de micróbios para uso em um aplicativo no local. Isso permite um biorreator reduzido em escala (por exemplo, tanque de fermentação menor; suprimentos menores de material de partida, nutrientes, agentes de controle de pH e agente antiespumante, etc.), o que torna o sistema eficiente. Além disso, a produção local facilita a portabilidade do produto.

[00115] A geração local do produto à base de micróbios também facilita a inclusão do meio de crescimento no produto.

O meio pode conter agentes produzidos durante a fermentação que são particularmente bem adequados para uso local.

[00116] As culturas robustas de micróbios produzidas localmente, de alta densidade, são mais eficazes no campo do que aquelas que sofreram estabilização de células vegetativas ou permaneceram na cadeia de suprimentos por algum tempo. Os produtos à base de micróbios da presente invenção são particularmente vantajosos em comparação com os produtos tradicionais, em que as células foram separadas dos metabólitos e nutrientes presentes no meio de crescimento da fermentação. Os tempos reduzidos de transporte permitem a produção e a dispensação de novas bateladas de micróbios e/ou seus metabólitos no tempo e no volume como exigidos pela demanda local.

[00117] As instalações de crescimento de micróbios da presente invenção produzem composições frescas à base de micróbios, compreendendo os próprios micróbios, metabólitos microbianos e/ou outros componentes do meio em que os micróbios são desenvolvidos. Se desejado, as composições podem ter uma alta densidade de células vegetativas, células inativadas, ou uma mistura de células vegetativas, células inativadas, esporos, micélios e/ou outros propágulos microbianos. Vantajosamente, as composições podem ser adaptadas para uso em uma localização especificada. Em uma modalidade, a instalação de crescimento de micróbios é localizada em, ou próximo a, um local onde os produtos à base de micróbios serão usados.

[00118] Vantajosamente, essas instalações de crescimento de micróbios provêm uma solução para o problema atual de contar com produtores industriais de grande porte amplamente distribuídos cuja qualidade do produto sofre devido a atrasos no processamento a montante, gargalos na cadeia de suprimentos, armazenamento inadequado e outras contingências que inibem a dispensação e a aplicação oportunas de, por exemplo, um produto viável, com alta contagem de células e/ou propágulos e o meio e metabólitos associados nos quais os micróbios são originalmente desenvolvidos.

[00119] Vantajosamente, em modalidades preferidas, os sistemas da presente invenção aproveitam o poder de microrganismos locais de ocorrência natural e seus subprodutos metabólicos para tratar bactérias patogênicas de plantas. Os micróbios locais podem ser identificados com base, por exemplo, na tolerância a sal, na capacidade de desenvolver a altas temperaturas e no uso da identificação genética de sequências. Adicionalmente, as instalações de crescimento de micróbios oferecem versatilidade de fabricação por sua capacidade de adaptar os produtos à base de micróbios para melhorar as sinergias com as geografias de destino.

[00120] O tempo de cultivo para os vasos individuais pode ser, por exemplo, de 1 dia a 2 semanas ou mais. O produto de cultivo pode ser cultivado de várias maneiras diferentes.

[00121] A produção e a dispensação locais dentro de, por exemplo, 24 horas de fermentação resultam em composições puras de alta densidade de micróbios e custos de transporte substancialmente mais baixos. Dadas as perspectivas de avanço rápido no desenvolvimento de inoculantes microbianos mais eficazes e poderosos, os consumidores se beneficiarão muito dessa capacidade de dispensar rapidamente produtos à base de micróbios.

[00122] Os produtos à base de micróbios da presente invenção podem ser usados em uma variedade de configurações únicas devido, por exemplo, à capacidade de dispensar com eficiência: 1) caldo de fermentação fresco com metabólitos ativos; 2) uma mistura de micróbios e caldo de fermentação; 3) uma composição com células vivas, ou esporos, micélios, conídios ou outros propágulos microbianos; 4) composições com uma alta densidade de micróbios, incluindo células vivas e/ou esporos, micélios, conídios ou outros propágulos microbianos; 5) produtos à base de micróbios a curto prazo; e 6) produtos à base de micróbios em localizações remotas.

EXEMPLOS

[00123] Uma maior compreensão da presente invenção e de suas muitas vantagens pode ser obtida a partir dos exemplos a seguir, dados como ilustração. Os exemplos a seguir são ilustrativos de alguns dos métodos, aplicações, modalidades e variantes da presente invenção. Eles não devem ser considerados como limitativos da invenção. Numerosas alterações e modificações podem ser feitas com relação à invenção. EXEMPLO 1 - PRODUÇÃO DE CULTURA DE SEMENTES E MÉTODO DE

CONTAGEM DE PROPÁGULOS

[00124] A cultura de sementes de Trichoderma foi preparada a um pH de 5,5 com a composição do meio da Tabela

1. Tabela 1. Composição do meio para produção de Trichoderma Quantidade Componente (g/L) Glicose 30 Extrato de levedura 2,8 Extrato de batata líquido 0,5 (ml/L) NH4NO3 1,0 KH2PO4 1,0

MgSO4.7H2O 0,5 KCl 0,5 FeSO4.7H2O 0,01 ZnSO4.7H2O 0,01 CuSO4.5H2O 0,005

[00125] Os balões foram inoculados com conídios fúngicos e hifas em crescimento ativo de uma placa. Para a preparação de culturas de sementes homogêneas, as pastilhas miceliais foram quebradas com microesferas de vidro. Os balões de agitação foram incubados a 30°C por 3-4 dias a 200 rpm. Após 3-4 dias, Trichoderma formou granulados miceliais para fermentação em maior escala. Todo o conteúdo dos frascos contendo substrato fermentado e biomassa foi completamente homogeneizado com microesferas de vidro por um tempo predeterminado de 180 segundos para obter conídios e fragmentos de micélio. Após a homogeneização, foram preparadas diluições em série e as contagens de micropropágulos foram estimadas. EXEMPLO 2 - DESENVOLVIMENTO DA CULTURA DE MICROESFERAS DE ALGINATO-ÁGAR

[00126] As microesferas de alginato contendo Trichoderma são preparadas combinando os meios líquidos da Tabela 1 acima com uma mistura de ágar a 1% e alginato de sódio a 2%. Esta mistura é combinada com uma pasta fluida de cultura de sementes homogênea a 5% do Exemplo 1. Após a mistura bem, toda a mistura é deixada cair lentamente em solução de cloreto de cálcio a 100 mM autoclavada com mistura constante. Microesferas de alginato com partículas de fungos no interior são formadas imediatamente. As microesferas de alginato são então coletadas da solução e o líquido restante é descartado. EXEMPLO 3 - PRODUÇÃO DE CONÍDIOS EM CULTURA LÍQUIDA

[00127] Os conídios são coletados de uma cultura biologicamente pura de Trichoderma harzianum que é desenvolvida em um reator. A composição do meio nutriente compreende: glicose (30 g/L), extrato de levedura (2,8 g/L), KH2PO4 (1,0 g/L), MgSO4.7H2O (0,5 g/L), KCl (0,5 g/L), FeSO4.7H2O (0,01 g/L), ZnSO4.7H2O (0,01 g/L), CuSO4.5H2O (0,005 g/L). O pH inicial do cultivo é de 5,5 e a temperatura é de 25 a 28°C. A quantidade de cultura é de cerca de 100 galões (378,54 L). Após o cultivo por 5 dias, o rendimento é maior que aproximadamente 5 x 108 a 5 x 109 conídios por mililitro de cultura líquida. EXEMPLO 4 - CULTURA EM ESTADO SÓLIDO DE TRICHODERMA EM

SUBSTRATO DE VERMICULITA

[00128] A terra de vermiculita e diatomácea é esterilizada por calor a 150°C durante a noite em um forno de aquecimento. Misturam-se três a quatro partes de vermiculita com uma parte de terra de diatomáceas e uma parte de microesferas de inoculantes de Trichoderma ou 150 ml de pasta fluida de cultura de sementes. Os componentes são misturados com 1 litro de meio nutriente. Esta mistura é espalhada finamente em uma bandeja e incubada a 30°C por 4- 6 dias em um forno de crescimento, com aeração pelo ar ambiente. Os conídios são observados pela primeira vez no dia 4.

[00129] O rendimento de uma bandeja é de aproximadamente 652,60 gramas antes da secagem e do processamento. Após o término do processo de cultivo, a temperatura na incubadora pode ser aumentada para cerca de 40°C, e a secagem pode ocorrer por cerca de 3 a cerca de 4 dias usando suplementação de ar seco e aspiração de ar umedecido. Após a secagem e a moagem completa, é possível produzir até 4 libras (1,81 Kg)

ou mais do produto de Trichoderma por bandeja. O produto seco à base de micróbios pode ser triturado, moído ou micronizado até um tamanho de partícula desejado, e depois misturado com terra de diatomáceas seca e produto de compostagem comercial para redistribuir a umidade residual e padronizar o produto final. A concentração de propágulo não deve ser menor que 1 × 106 conídios por grama do produto seco, de preferência não menor que 1 x 109.

[00130] Este produto final seco à base de Trichoderma pode ser acondicionado em sacos plásticos rotulados e vedado hermeticamente para realização comercial. O produto pode ser dissolvido em água para uma variedade de aplicações. EXEMPLO 5 - FERMENTAÇÃO DE ESTADOS SÓLIDOS DE ESPOROS

FÚNGICOS NO SUBSTRATO DE FARINHA DE MILHO

[00131] Para o desenvolvimento de esporos de fungos, tal como Trichoderma spp., misturam-se 250 g de farinha de milho nixtamilizada com água deionizada e esterilizam-se em uma panela a vapor de aço inoxidável e depois selam-se com uma tampa e faixas de panela. Essas panelas com farinha de milho são inoculadas assepticamente com a cultura de sementes de fungos. As panelas são então incubadas em um forno de crescimento a 30°C por 10 dias. Após 10 dias, foram coletados aproximadamente 1 x 109 propágulos/g. EXEMPLO 6 - FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO DE ESPOROS FÚNGICOS

EM SUBSTRATOS DE MASSA

[00132] Para o desenvolvimento de Trichoderma spp., 250 gramas de massa de farinha de milho seco misturados com 1000 L de água são espalhados em panelas a vapor de aço inoxidável. As panelas a vapor, massas e água são então autoclavadas, e vedadas com tampas esterilizadas e faixas de panelas.

O substrato massa-água é então inoculado assepticamente com a cultura de sementes de Trichoderma.

As panelas são incubadas no forno de crescimento a 30°C por 8 dias.

Após 8 dias, são cultivados aproximadamente 1x109 propágulos/g de Trichoderma.

Claims (23)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir um produto à base de Trichoderma na forma líquida e um produto à base de Trichoderma no estado sólido, o método caracterizado pelo fato de que compreende: (a) preparar um inoculante em microesfera de alginato- ágar a partir de uma cultura de sementes de Trichoderma; (b) cultivar o inoculante em microesfera de alginato- ágar em meio de cultura de nutrientes líquido em um reator para produzir uma densidade microbiana desejada na microesfera; (c) coletar o inoculante de alginato-ágar do meio de cultura líquido; (d) preparar o produto à base de Trichoderma na forma líquida, em que os inoculantes em microesferas de alginato- ágar cultivados são usados para inocular um reator de fermentação submerso, e preparar o produto à base de Trichoderma no estado sólido, em que os inoculantes em microesferas de alginato-ágar cultivados são usados inocular um reator de fermentação em estado sólido.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o microrganismo Trichoderma é selecionado de Trichoderma reesei, Trichoderma harzianum, Trichoderma viride, e Trichoderma hamatum.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (a) compreende a combinação de uma pasta fluida homogênea a 5% da cultura de sementes de (a) com meio nutriente estéril, ágar a 1% e alginato de sódio a 2% para produzir uma solução de inóculo; e usar um dispositivo de ducha por gotejamento para depositar gotas da solução de inóculo em um vaso de mistura contendo cloreto de cálcio a

1%, em que as gotas formam inoculantes em microesferas de alginato-ágar que compreendem componentes nutrientes e partículas do microrganismo embutido na massa de alginato- ágar.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (b) compreende coletar a microesfera de alginato-ágar e depois cultivá-la em um reator contendo um volume suficiente de um meio nutriente líquido adequado para permitir que uma alta concentração de Trichoderma mycelia se disperse por dentro e por todo a superfície da microesfera de alginato-ágar.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que (b) é realizado por cerca de 1 a cerca de 10 dias, sob aeração e agitação contínuas, a uma temperatura de cerca de 28°C a cerca de 30°C e pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,5.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a densidade microbiana aumentada em escala desejada das microesferas de alginato é de 1 × 109 conídios por grama de microesfera de alginato.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que, após a etapa (c) mas antes da etapa (d), o método compreende o processamento do inoculante em microesfera de alginato-ágar para armazenamento, em que o processamento compreende a coleta do inoculante em microesfera de alginato-ágar do reator e colocação do microesfera em uma solução de criopreservação compreendendo glicerol e água na razão de 50%.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a solução de criopreservação está em um recipiente selecionado de um balão, tubo, frasco e prato.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o recipiente compreende até 50 inoculantes em microesferas.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o recipiente é colocado em um congelador a uma temperatura de -80°C a -10°C.

11. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o recipiente é colocado em um refrigerador a uma temperatura de -10°C a 4°C.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a preparação do produto à base de Trichoderma na forma líquida compreende o cultivo do inoculante em um sistema de reator com um volume de trabalho de pelo menos 200 galões (757,08 L) por cerca de 1 a cerca de 10 dias, sob aeração e agitação contínuas, a uma temperatura de cerca de 28°C a cerca de 30°C e pH de cerca de 5,0 a cerca de 6,5.

13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a concentração de Trichoderma é aumentada na cultura líquida de até 1 x 109 propágulos por mililitro e, opcionalmente, são adicionados conservantes, aditivos e/ou ajustadores de pH.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a preparação do produto à base de Trichoderma no estado sólido compreende misturar os inoculantes em microesferas de alginato-ágar coletados com um meio nutritivo líquido e um substrato sólido ou semissólido para formar uma mistura; espalhar a mistura finamente em bandejas à prova de calor; cultivar a mistura nas bandejas em uma incubadora a 30°C por 3 a 10 dias com aeração constante pelo ar ambiente.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as bandejas são pulverizadas regularmente com meio nutriente estéril durante todo o cultivo.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a incubadora é um forno de crescimento.

17. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o substrato é vermiculita e a razão de microesferas de vermiculita para alginato-ágar na mistura é 3:1 ou 4:1.

18. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o substrato é um alimento selecionado de farinha de milho, arroz, feijão e massa.

19. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente o aumento da temperatura da incubadora para 40°C; secar as bandejas por cerca de 3 a cerca de 4 dias usando suplementação de ar seco e aspirando o ar umedecido para produzir um produto seco; triturar o produto seco em um triturador até um tamanho de partícula desejado; e misturar o produto seco triturado com terra de diatomáceas seca e produto de compostagem comercial.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente acondicionar o produto seco misturado com terra de diatomáceas e produto de compostagem comercial em sacos hermeticamente vedados para uso comercial.

21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a concentração de Trichoderma no produto seco após mistura com a terra de diatomáceas e o produto de compostagem comercial não é menor que 1 × 106 conídios por grama.

22. Composição, caracterizada pelo fato de que que compreende um microrganismo Trichoderma cultivado e/ou um ou mais de subprodutos de crescimento microbiano, em que a composição é produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1-21.

23. Composição, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente o meio de cultura, em que o microrganismo foi produzido e/ou os nutrientes para o crescimento microbiano.