CN104774789B - 垃圾堆肥中草坪耐低温强化复合微生物菌群的制备方法及应用 - Google Patents

垃圾堆肥中草坪耐低温强化复合微生物菌群的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种垃圾堆肥中草坪耐低温强化复合微生物菌群的制备方法及应用。本发明的方法就是：将城市生活垃圾堆肥微生物在10℃条件下培养，获得强化耐低温微生物菌株，在组配强化菌剂。本发明也公开了强化复合微生物菌群在提高草坪的抗寒性、提高返青率方面的应用；其中所述的强化复合微生物菌群指的是施氏假单胞菌、枯草芽孢杆菌、pleosporaceae和隐球菌按重量份数比1:1:1:1的比例进行配置。本发明旨在获得强化堆肥微生物，并为强化城市生活垃圾堆肥微生物菌剂的草坪低温应用提供技术支撑。

Description

垃圾堆肥中草坪耐低温强化复合微生物菌群的制备方法及 应用
技术领域
本发明属于环境保护技术领域，涉及生活垃圾堆肥耐低温微生物强化菌群制备方法。
背景技术
微生物菌剂尤其是由多种微生物组成的复合微生物菌剂是近年来发展起来具有广泛应用前景的生物技术。微生物菌剂不仅可以修复石油污染的土壤和降解水体中的有机污染物，还可以防治病虫害，促进作物生产和增产增收，有些微生物菌剂可以提高植物的抗逆性自20世纪70年代以来，欧美日本等国家或地区都相继研制成功了一些复合菌剂，很多已经开始进行大规模的生产，并形成了系列化的产品。其中20世纪80年代由日本琉球大学教授研制的EM（有效微生物群）获得了极大的成功，已经广泛应用在90多个国家涉及植业养殖业及环境净化方面，并取得了显著的经济效益和社会效益。基于微生物菌剂在一些发达国家研究和推广得较早，相关技术较为成熟，应用也更普遍。近年来，国外也没有再出现像EM那样可以在全世界都引起很大效应的微生物菌剂。
相对于国外发达国家相关微生物菌剂的研究，我国是从20世纪80年代才开始微生物菌剂的相关研究，从理论到实践，从单一菌种的利用到多个菌种的复合应用，也相继取得了一些成果。南京农业大学生物防治产品主要有防治黄瓜根结线虫病害的蜡质芽孢杆菌AT31菌剂（使命/线灭，LS20120060）、防治蔬菜土传病害的微生态制剂（蔬得康）、宁盾系列产品，已获生物肥料正式登记。山东生物所木霉菌剂（防治灰霉病）、湖南植保所光合细菌（促进光合作用）、镇江润州短吻杆菌（防治鳞翅目害虫）以及宁夏诺得曼生物技术公司根瘤菌（促进豆科植物生长）等。最近几年，国内有很多关于复合菌剂研制的报道，主要利用微生物净化环境，降解有机污染、提高粮食产量和提高植物抗性等方面。有研究表明利用从水产养殖的优良水质中分离得到的优势菌种研制出水质净化剂，将其用于淡水鱼养殖池中，对降低水体中的COD，NH3-N，亚硝酸盐等起到了理想的效果。还有研究表明，微生物菌肥均能在适宜的浓度下不同程度的促进生菜的生长，改善生菜品质，降低硝酸盐含量。但这些大都还处于试验研究与初步应用水平，还没有广泛应用于实际。生防菌本身具有固氮、解磷、解钾的作用，刺激植物产生适量生长素；降解大分子有机物，提高有机肥利用率；微生物菌剂就像是植物的开胃剂；保护细胞膜的完整性、维持较高水平的根系活力和叶绿素含量，这方面就不光是一个促生的作用，也有一种抗逆的作用。微生物菌剂诱导植物体内多种抗逆基因的表达，显著提高植物体的抗氧化酶活性。同时微生物菌剂可以防止作物收获后产生病害，诱导抗逆基因表达，诱导SOD等多种相关物质的产生。所以，微生物菌剂对于改善植物在逆境即盐胁迫、干旱胁迫和低温胁迫条件下的建植有积极的影响。
草坪草除了具有美化环境、净化空气、防止水土流失、保持生态平衡、给人们提供休息和运动场所等功能外，尚有调节小气候的作用。然而草坪草同其它植 物一样，常遭受不良环境的影响，如干旱、高温、低温、盐渍等逆境都会抑制草坪草的生长，使草坪质量下降。尤其是盐碱、低温（冷害）和干旱是强烈限制草坪生长的3大非生物因素。
低温冷害是我国主要的气象灾害之一，并以北方地区最为频繁和严重。低温冷害是在作物生长发育期间，尽管日最低气温0℃以上，天气比较温暖，但出现较长时间的持续性低温天气，或者亦是作物生殖生长期间出现短期的强低温天气过程，日平均气温低于作物生长发育适宜温度的下限指标，从而影响农作物的生长发育或结实而引起减产的农业自然灾害。低温冷害也不同程度地影响这草坪植物的生长和正常生理生化过程，尤其是限制草皮生产周期的主要原因。低温胁迫会导致SOD（超氧化物歧化酶）、CAT（过氧化氢酶）等保护酶活性的降低，叶绿素分解，脯氨酸和丙二醛含量增加即质膜相对透性增大，进而植物细胞受到损伤。有研究表明低温胁迫对高羊茅生长影响时，得出随着温度的降低及胁迫时间延长，高羊茅叶片中的CAT活性降低也越快，叶绿素含量也随之降低，脯氨酸含量增加明显。冷季型草最适宜的播种时间是夏末初秋或早春，而暖季型草坪草在春末夏初。在播种后40～50d后，草皮上的草坪草的覆盖率达95%以上时即可移坪。所以，在北方第一批草皮卷一般在五、六月份才可上市。如果能够缩短草皮生产的年周期，提早草皮上市时间，可大幅提高草皮卷的市场竞争力，提高人们的经济收入。传统的提高草坪植物的耐寒性的方法有，喷施生长调节剂，如低温保护剂等；进行抗寒锻炼。而采用施加复合微生物菌剂来提高草坪植物的抗寒性研究还未见报道。微生物菌剂作为一种高效、环保的生物肥料，其抗病促生作用已得到认可，其在提高草坪植物抗寒性和缩短草皮生产周等方面也必将有一定作用。
城市生活垃圾堆肥是自然界中的微生物，比如说是细菌和真菌等，通过它们的生理代谢，可以加快对有机物的分解速度，进而将其变成腐植酸的过程。城市生活垃圾堆肥有氧处理过程中，会产生大量的热量，垃圾中的有机物被分解完成，同时也杀死了垃圾中的病菌等，而产芽孢的杆菌能够大量存在。各种微生物对有机物分解能力和分解速度是不尽相同的，随着温度、季节的变化，堆肥过程中的微生物群落和数量亦不相同；且已有研究表明，堆肥中的微生物群落是相当复杂的。堆肥中微生物数量及种群分布与堆肥有机物质成分和含量、微生物间的相互作用等多种因素密切相关。有人研究接种外源菌剂对堆肥中微生物数量和酶活性变化的影响，为微生物菌剂的应用和堆肥工艺的改进提供了依据。猪粪秸秆堆肥复合微生物菌剂能够更有效地促进和优化堆肥过程迅速提高堆体温度提高最高温度延长高温期时间并能更有效地提高堆体养分水平。牛粪堆肥试验表明，添加本源菌剂能快速提高堆肥温度，促进堆体发酵腐熟，缩短堆制时间；从纤维素和半纤维素降解率看，添加菌剂处理后明显比未添加菌剂的对照处理强，由此可见，添加微生物菌剂有利于牛粪堆肥腐熟。而针对从固体废气物基质中提取微生物菌种，并将其用于实验和生产中，还有人分别从鸡粪发酵和牛粪中筛选出高效降解菌并配制成相应的复合微生物菌剂，为复合微生物菌剂的应用奠定了一定的基础，这对前期堆肥微生物菌剂的配置都提供了依据。近期的相关文献及生产表明：微生物菌剂作为成为一种新型的生物技术已经应用到我们的社会生活和生产当中。尤其是微生物菌剂在促进植物生长、提高植物抗性等方面的研究不胜枚举。但是关于微生物菌剂的来源与制备，大多数研究者也仅仅只限于从土壤或污泥中提取和筛选。有关堆肥中微生物菌落结构、堆肥菌种之间共生及相互影响关系具有模糊性和复杂性。强化制备垃圾堆肥中微生物菌种，将强化堆肥微生物菌种作为接种剂，配制成不同浓度的强化复合微生物菌剂接种应用，将具有重要的意义。
从生活垃圾堆肥（以下简称堆肥）中筛选出有效菌株，再配制成相应微生物菌剂，具有广泛的应用前景。一些研究表明城市生活垃圾堆肥过程中发现，在有机物被分解的过程中，生物群落也发生了重要的变化，主要是致病菌大量减少，而产芽孢的杆菌则数量剧增。生活垃圾在经过高温发酵处理后得到的堆肥酸性变大而且含盐量变高，因此处于高渗体系环境中的微生物具有一定的耐酸、耐盐和耐高温特性。不论是一般的微生物菌剂，还是堆肥微生物菌剂中菌种的选育，都是直接从自然环境（或堆肥）中筛选出有效的菌株，再配制成微生物菌剂应用于相应的领域。而将自然环境（或堆肥）中的微生物经过某些特定方向的强化，进而得到一些高效强化微生物菌剂的研究尚无报道。
本技术方法就是：将城市生活垃圾堆肥微生物在10℃条件下培养，获得强化耐低温微生物菌株，在组配强化菌剂。本技术旨在获得强化堆肥微生物，并为强化城市生活垃圾堆肥微生物菌剂的草坪低温应用提供技术支撑。
发明内容
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
一种垃圾堆肥中耐低温强化复合微生物菌群的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）材料：生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂，垃圾堆肥的pH为7.62，有机质含量12.12 %，全氮量5.18 %，有效磷含量77.92 mg·kg-1，全钾50.83 g·kg-1，容重0.85g·L-1，饱和含水量66.58 g·mL-1；
（2）培养基：
1）富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4-7.6，加15g琼脂成固体培养基；
2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.0-7.2，加15g琼脂成固体培养基；
3）高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 20g，K2HPO3 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO40.01g，水1000ml， pH 7.2-7.4，加琼脂20g成固体培养基，配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000ml；
4）马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHPO3 1g，MgSO(7H2O) 0.5g，1%孟加拉红水溶液，3.3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基，临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每ml培养基含链霉素30µg；
（3）菌种的富集：
将垃圾堆肥样品称取10g置于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28℃，220r/min下振荡培养3d ，即为复合微生物菌群；
（4）耐低温复合微生物菌群的强化;
将不同浓度梯度的复合微生物菌群涂布在牛肉膏蛋白胨培养基、高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基上，放置在人工气候培养箱中培养2周，温度为10℃；所述的不同浓度梯度的复合微生物菌群指的是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6µg/ml。
（5）强化复合微生物的分离及纯化：
1）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏（PDA）琼脂培养基高温灭菌，冷却至55-60℃时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液，终质量浓度为30µg/ml，混均匀后分别倒平板；
2）制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6µg/ml几种浓度的稀释液；
3）涂布：用移液枪分别吸取0.2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀；
4）培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养，将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基（PDA）的平板倒置于28℃培养箱中培养；
（6）平板划线分离法
挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划线纯化，直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤，最后对强化的复合微生物进行鉴定；经过多次划线纯化得到强化复合微生物菌群。其中得到强化复合微生物菌群指的是：枯草芽孢杆菌、施氏假单胞菌、霉菌pleosporaceae和隐球菌。
本发明进一步公开了采用上述方法制备的强化复合微生物菌群在提高草坪的抗寒性、提高返青率方面的应用；特别是在提高高羊茅的质地、密度与色泽方面的应用。其中所述的强化复合微生物菌群指的是施氏假单胞菌、枯草芽孢杆菌、pleosporaceae和隐球菌按重量份数比1:1:1:1的比例进行配置。
本发明更加详细的描述如下：
1研制材料与方法
1.1材料：
生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂。堆肥的pH为7.62，有机质含量12.12%，全氮量5.18 %，有效磷含量77.92 mg·kg-1，全钾50.83 g·kg-1，容重0.85 g·L-1，饱和含水量66.58 g·mL-1。
1.2培养基
1）富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4-7.6，加15g琼脂成固体培养基；
2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.0-7.2，加15g琼脂成固体培养基；
3）高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 20g，K2HPO3 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO40.01g，水1000ml， pH 7.2-7.4，加琼脂20g成固体培养基（配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000ml）；
4）马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHPO3 1g，MgSO(7H2O) 0.5g，1%孟加拉红水溶液，3.3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基（临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每ml培养基含链霉素30µg）。
1.3菌种的富集
将堆肥样品称取10g置于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28℃，220r/min下振荡培养3d ，即为混合微生物菌群。
1.4耐低温微生物的强化
混合微生物耐低温强化是将不同浓度梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6µg/ml）涂布在相应的培养基上（即牛肉膏蛋白胨培养基，高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基）放置在人工气候培养箱中培养2周，温度为10℃。
1.5强化微生物的分离及纯化
1.5.1稀释涂布平板法
1)倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏（PDA）琼脂培养基高温灭菌，冷却至55~60℃时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液（终质量浓度为30µg/ml），混均匀后分别倒平板。
2)制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6几种浓度的稀释液。
3)涂布：用移液枪分别吸取0.2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次。用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
4)培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养，将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基（PDA）的平板倒置于28℃培养箱中培养。
1.5.2平板划线分离法
挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划线纯化。直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤。
1.6强化微生物的鉴定
按照Ezup柱式试剂盒的操作手册提取优势菌种的DNA。优势细菌的PCR体系：10×Buffer（with MgCl2）2 µL，dNTP（10mmol/L）0.4µL，341f（10µmol/L）1µL，534r（10µmol/L）1µL，Taq酶（5u/µL）0.4µL，模板DNA 1µL，加超纯水定容至终体积20µL。PCR反应条件：94℃5min预变性，94℃变性1min，55℃复性45s，72℃延伸45s，30个循环，72℃延伸10min。引物为341f（5′-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAGCAG-3′）和534r（5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′）。优势真菌的PCR反应体系：10×Buffer（without MgCl2）2 µL，MgCl2（25mmol/L）1.6µL，dNTP（10mmol/L）0.4µL，Geo11（10µmol/L）0.4µL，GeoA2（10µmol/L）0.4µL，Taq酶（5u/µL）0.2µL，模板DNA 1µL，加超纯水定容至终体积20µL。PCR反应条件：94℃4min预变性，94℃变性1min，54℃复性1min，72℃延伸2min，30个循环，72℃延伸7min。引物为GeoA2 （5′-CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′）和Geo11 （5′-ACC TTG TTA CTT TTA CTT CC-3′）。将得到的PCR产物送到北京华大基因测序部，根据测序的结果，在BLAST系统中找出对应菌种。
2研制结果分析
2.1强化耐低温微生物分离及纯化结果
本次实验对堆肥中的微生物进行耐低温强化，最终经过多次划线纯化得到的4种纯种微生物，为2种细菌和2种真菌，结果如图1所示。
依据培养特征和菌体形态进行初步鉴定，可以将得到的2种细菌，归为假单胞菌和芽孢杆菌，而真菌为霉菌和酵母菌. 详细的微生物菌落形态见下表
2.2强化耐低温微生物分子鉴定结果
对上述4菌种通过对其菌落形态观察，结合分子鉴定结果（PCR序列相似度）比较，鉴定出1种芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌，1种假单胞菌为施氏假单胞菌；1种霉菌为pleosporaceae。一种酵母菌为隐球菌。
3研制结果结论
堆肥中耐低温微生物经过强化，分离和纯化之后，成功筛选得到了4种纯种微生物，经过初步鉴定为1种假单胞菌、1种芽孢杆菌、1种霉菌和1种酵母。但是本技术方法所得到的微生物是经过强化而得到的，具有更强的耐低温的特性；其应用于改善草坪植物耐低温环境生长现状具有重要价值。
附图说明：
图1为强化耐低温优势细菌和真菌图；
图2 施氏假单胞菌、枯草芽孢杆菌和隐球菌的生长曲线 。
具体实施方式
为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。需要特别说明是：本发明筛选得到的复合微生物菌群施氏假单胞菌、枯草芽孢杆菌、pleosporaceae和隐球菌市场上均有销售，也可以采用本发明的方法从生活垃圾堆肥中分离得到复合微生物菌群，其得到的菌群的生化特性与市售的相同故未在保藏。
实施例1
垃圾堆肥中耐低温强化复合微生物菌群的制备：
（1）材料：生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂，垃圾堆肥的pH为7.62，有机质含量12.12 %，全氮量5.18 %，有效磷含量77.92 mg·kg-1，全钾50.83 g·kg-1，容重0.85g·L-1，饱和含水量66.58 g·mL-1；
（2）培养基：
1）富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4-7.6，加15g琼脂成固体培养基；
2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.0-7.2，加15g琼脂成固体培养基；
3）高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 20g，K2HPO3 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO40.01g，水1000ml， pH 7.2，加琼脂20g成固体培养基，配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000ml；
4）马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHPO3 1g，MgSO(7H2O) 0.5g，1%孟加拉红水溶液，3.3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基，临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每ml培养基含链霉素30ug；
（3）菌种的富集：
将垃圾堆肥样品称取10g置于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28℃，220r/min下振荡培养3d ，即为复合微生物菌群；
（4）耐低温复合微生物菌群的强化;
将不同浓度梯度的复合微生物菌群涂布在牛肉膏蛋白胨培养基、高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基上，放置在人工气候培养箱中培养2周，温度为10℃；所述的不同浓度梯度的复合微生物菌群指的是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6µg/ml
（5）强化复合微生物的分离及纯化：
1）倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏（PDA）琼脂培养基高温灭菌，冷却至55~60℃时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液，终质量浓度为30ug/ml，混均匀后分别倒平板；
2）制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6µg/ml几种浓度的稀释液；
3）涂布：用移液枪分别吸取0.2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀；
4）培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养，将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基（PDA）的平板倒置于28℃培养箱中培养；
（6）平板划线分离法
挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划线纯化，直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤，最后对强化的复合微生物进行鉴定；经过多次划线纯化得到强化复合微生物菌群。其中得到强化复合微生物菌群指的是：枯草芽孢杆菌、施氏假单胞菌、霉菌pleosporaceae和隐球菌。
实施例2应用实例
1、强化复合微生物菌群的应用。其中所述的强化复合微生物菌群指的是施氏假单胞菌、枯草芽孢杆菌、pleosporaceae和隐球菌按重量份数比1:1:1:1的比例进行配置。
2、复合微生物菌剂对高羊茅株高的影响
2.1菌种筛选
本实验所选用的4种强化耐低温微生物分别为施氏假单胞菌、枯草芽孢杆菌、pleosporaceae和隐球菌。通过测定施氏假单胞菌、枯草芽孢杆菌和隐球菌的生长曲线（图2），再依据微生物生长曲线可以判断其生长对数期，再将此期的菌种提取出来，配成不同处理，用于草坪植物的接种。
将微生物菌剂中的施氏假单胞菌、枯草芽孢杆菌和隐球菌用平板菌落计数法测定菌种数量，pleosporaceae则用纸片法测定。测定结果如表2，所得4菌种的菌落数在（1.51±0.11）×109/mL~ （2.85±0.03）×109/mL之间，施氏假单胞菌的OD600 nm值为0.447，菌枯草芽孢杆菌的OD600 nm值为0.356，隐球菌的OD560 nm值为0.64。
表1微生物菌剂所含的菌落数
2.2复合微生物菌剂对高羊茅株高的影响
接种了不同浓度的复合微生物菌剂后高羊茅动态株高见表2。从表中可以看出，接种菌剂10d、15d和20d，处理组与对照组之间都存在显著性差异。以稀释100倍的复合微生物菌剂施加组处理效果最好，与对照组相比，分别提高了24.30%、9.51%和9.85%。
表2不同浓度的复合微生物菌剂对高羊茅株高的影响(cm)
2.3复合微生物菌剂对高羊茅地上生物量的影响
从表3中可知，复合微生物菌剂显著提高了高羊茅单株鲜重、干重和干鲜比。不同浓度的复合微生物菌剂之间以及处理组与对照组之间都存在显著性差异。其中，接种100倍稀释复合微生物菌剂与对照组相比，鲜重、干重和干鲜比分别提高了105%、198.48%和38.46%。接种200倍稀释复合微生物菌剂与对照组相比，鲜重、干重和干鲜比分别提高了56.26%、100.38%和23.08%。
表3不同浓度的复合微生物菌剂对高羊茅地上生物量的影响(mg/株)
2.4复合微生物菌剂对高羊茅叶绿素含量的影响
从表4可知，复合微生物菌剂处理可以显著提高高羊茅叶绿素含量。其中复合微生物菌剂的100倍稀释液处理最为显著，其叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量分别为对照的1.22倍、1.34倍和1.27倍（P<0.05）。
表4不同浓度的复合微生物菌剂对高羊茅叶绿素含量的影响(mg·g-1 FW)
3 研制结论
本研究中复合微生物菌剂的使用显著提高了高羊茅叶绿素含量。高羊茅接种复合微生物菌剂后，其单株干鲜比增加，就说明高羊茅干物质积累增加，相对水含量降低，抗寒性相对的也就升高。本技术中接种复合微强化生物菌剂，能显著提高高羊茅的单株生物量及干鲜比，叶绿素含量，从而可以有效缓解了低温胁迫对高羊茅带来的伤害，有助于提高高羊茅的耐低温性。100倍稀释液复合微生物菌剂的效果显著优于200倍稀释液。所以，筛选和培养相应的复合微生物菌种进行人工接种，可以提高植物抗寒性的，进而提高其返青率及外观综合质量。这对于强化堆肥高效菌剂的研制和应用及草坪草抗低温都是至关重要。

Claims (3)

1.一种垃圾堆肥中草坪耐低温强化复合微生物菌群的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）材料：生活垃圾堆肥取自天津市小淀垃圾堆肥厂，垃圾堆肥的pH为7.62，有机质含量12.12 %，全氮量5.18 %，有效磷含量77.92 mg·kg-1，全钾50.83 g·kg-1，容重0.85 g·L-1，饱和含水量66.58 g·mL-1；
（2）培养基：
1）富集培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.4-7.6，加15g琼脂成固体培养基；
2）牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000ml，pH 7.0-7.2，加15g琼脂成固体培养基；
3）高氏Ⅰ号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 20g，K2HPO3 0.5g，MgSO4 0.5g，FeSO4 0.01g，水1000ml， pH 7.2-7.4，加琼脂20g成固体培养基，配置时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，导入煮沸的水中，在火中加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补水至1000ml；
4）马丁氏培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，KHPO3 1g，MgSO(7H2O) 0.5g，1%孟加拉红水溶液，3.3ml，水1000ml，pH自然，加琼脂15g成固体培养基，临用前加入0.03%链霉素稀释液100ml，使每ml培养基含链霉素30ug；
（3）菌种的富集：
将垃圾堆肥样品称取10g置于无菌锥形瓶中，加入100mL无菌水振荡均匀后，取10mL悬浮液于盛有100mL富集培养基的锥形瓶中，在28℃，220r/min下振荡培养3d ，即为复合微生物菌群；
（4）耐低温复合微生物菌群的强化：
将不同浓度梯度的复合微生物菌群涂布在牛肉膏蛋白胨培养基、高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基上，放置在人工气候培养箱中培养2周，温度为10℃；所述的不同浓度梯度的复合微生物菌群指的是10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6µg/ml；
（5）强化复合微生物的分离及纯化：
倒平板：将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基、马丁氏（PDA）琼脂培养基高温灭菌，冷却至55-60℃时，在马丁氏琼脂培养基中加入链霉素溶液，终质量浓度为30ug/ml，混均匀后分别倒平板；
2）制备混合微生物稀释液：用移液枪吸取1ml强化后的混合微生物菌悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-2、10-3、10-4、10-5和10-6µg/ml几种浓度的稀释液；
3）涂布：用移液枪分别吸取0.2ml不同浓度的稀释菌悬液准确放入相应培养基平板中央，每个不同浓度梯度处理重复3次，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀；
4）培养：牛肉膏蛋白胨平板倒置于37℃培养箱中培养，将含高氏Ⅰ号培养基和马丁氏培养基（PDA）的平板倒置于28℃培养箱中培养；
（6）平板划线分离法
挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许菌苔在新的上述3种培养基上进行划线纯化，直到培养基上长出来的是纯培养，如不纯，仍需重复该步骤，最后对强化的复合微生物进行鉴定；经过多次划线纯化得到强化复合微生物菌群；其中得到强化复合微生物菌群指的是：枯草芽孢杆菌、施氏假单胞菌、霉菌pleosporaceae和隐球菌。
2.采用权利要求1所述方法制备的强化复合微生物菌群在提高草坪的抗寒性、提高返青率方面的应用；其中所述的强化复合微生物菌群指的是施氏假单胞菌、枯草芽孢杆菌、pleosporaceae和隐球菌按重量份数比1:1:1:1的比例进行配置。
3.采用权利要求1所述方法制备的强化复合微生物菌群在提高高羊茅的质地、密度与色泽方面的应用；其中所述的强化复合微生物菌群指的是施氏假单胞菌、枯草芽孢杆菌、pleosporaceae和隐球菌按重量份数比1:1:1:1的比例进行配置。
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