BR112019013777A2 - sistemas e métodos de fermentação - Google Patents

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Abstract

a presente invenção refere-se a sistemas e aparelhos para a produção de composições à base de micróbios que podem ser utilizadas na indústria de óleo e gás, limpeza ambiental, bem como para outras aplicações. mais especificamente, a presente invenção inclui reatores biológicos, equipamentos e materiais para a fermentação de composições à base de micróbios.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para
SISTEMAS E MÉTODOS DE FERMENTAÇÃO.
REFERÊNCIA REMISSIVA A UM PEDIDO RELACIONADO [001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório US NQ 62/443.356, depositado em 6 de janeiro de 2017, que está aqui integralmente incorporado, por referência.
CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção refere-se a métodos e sistemas para a produção de composições baseadas em micróbios que podem ser usados, por exemplo, na indústria de petróleo, agricultura, mineração, tratamento de resíduos e biorremediação.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [003] O cultivo de microrganismos como bactérias, leveduras e fungos é importante para a produção de uma grande variedade de biopreparações úteis. Os microrganismos desempenham papéis cruciais, por exemplo, nas indústrias de alimentos, farmacêutica, agricultura, mineração, remediação ambiental e manejo de dejetos.
[004] Existe um enorme potencial para o uso de micróbios em uma ampla gama de indústrias. O fator de restrição na comercialização de produtos à base de micróbios tem sido o custo por densidade de propágulo, onde é particularmente caro e inviável aplicar produtos microbianos para operações em grande escala com inóculo suficiente para ver os benefícios.
[005] Duas formas principais de cultivo de micróbios existem: cultivo submerso e cultivo de superfície. Bactérias, leveduras e fungos podem ser produzidos usando os métodos de cultivo de superfície ou submerso. Ambos os métodos de cultivo exigem um meio de nutrientes para o crescimento de microrganismos. O meio de nutriente, que pode ser em uma forma líquida ou sólida, normalmente inclui uma fonte de
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2/49 carbono, uma fonte de nitrogênio, sais e nutrientes adicionais adequados e microelementos. O pH e os níveis de oxigênio são mantidos em valores adequados para um determinado microrganismo. [006] Os micróbios têm o potencial para desempenhar funções altamente benéficas, por exemplo, nas indústrias de petróleo e na agricultura, se eles pudessem ser disponibilizados mais prontamente e, de preferência, de uma forma mais ativa.
[007] O petróleo e o gás natural são obtidos pela perfuração na superfície da terra, utilizando o que é genericamente referido como um equipamento de perfuração. Um poço ou furo começa com a perfuração de um furo de diâmetro grande (por exemplo, 60-90 cm de diâmetro) no solo, com auxílio de uma broca. A broca é conectada a um tubo de perfuração, que é girado pelo equipamento de perfuração. O equipamento de perfuração geralmente continua a perfurar um furo grande até a broca passar debaixo do lençol freático. A seguir, um forro de metal (ou revestimento) é colocado no furo de diâmetro grande e cimento é bombeado pelo interior do forro. Quando o cimento atinge o fundo do forro, ele flui para cima, preenchendo o vazio entre o forro e a formação circundante, isolando o lençol freático e protegendo-o de qualquer fluido de perfuração que seja bombeado para baixo do furo nas etapas subsequentes.
[008] Depois que o primeiro revestimento é cimentado, uma broca de tamanho médio pode ser usada para perfurar mais fundo na formação subterrânea. Geralmente, há um ou mais pontos de paragem onde a broca é removida, seguido por um forro de revestimento menor e cimento. Este processo é repetido até que o poço seja concluído.
[009] Durante o processo de perfuração, fluidos de perfuração são bombeados através do tubo de perfuração e fora da broca de perfuração. Este fluido flui de volta no espaço entre o tubo de perfuração e a formação ou o revestimento. O fluido de perfuração remove as
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3/49 estacas de perfuração, equilibra as pressões do poço, lubrifica o furo, e também funciona para limpar o poço de substâncias causadoras de fricção.
[0010] Após o poço ser perfurado, um forro de produção (ou revestimento) é geralmente definido e o poço é, então, perfurado (por exemplo, explosivos são usados para perfurar o forro de produção em pontos específicos na formação de rolamento do óleo). Em seguida o óleo começa a fluir para fora do poço, quer sob a pressão natural da formação ou usando a pressão que é induzida por meio de equipamento mecânico, inundação de água, ou outros meios. Enquanto o óleo cru flui através do poço, substâncias no óleo cru são geralmente coletadas nas superfícies dos forros da produção, causando redução no fluxo, e às vezes até mesmo interrompendo a produção toda.
[0011] Uma variedade de diferentes produtos químicos e equipamentos são utilizados para prevenir e remediar este problema, mas há uma necessidade de melhoria dos produtos e métodos. Em particular, há uma necessidade de produtos e métodos mais ecológicos, menos tóxicos e que melhorarem a eficácia.
[0012] Na agricultura, os agricultores têm se baseado fortemente sobre a utilização de produtos químicos sintéticos e adubos químicos para aumentar rendimentos e proteger as culturas contra patógenos, pragas e doenças; no entanto, quando usados em excesso ou mal aplicados, estas substâncias podem ser poluentes da atmosfera e da água através de escoamento, lixiviação e evaporação. Mesmo quando usado corretamente, o uso de dependência excessiva e a longo prazo de determinados fertilizantes químicos e pesticidas, altera prejudicialmente os ecossistemas do solo, reduz a tolerância ao estresse, aumenta a resistência a pragas, e impede o crescimento da planta e do animal e a vitalidade.
[0013] Mandatos reguladores de fixação que regem a
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4/49 disponibilidade e o uso de produtos químicos, e as exigências dos consumidores para alimentos livres de resíduos, produzidos de forma sustentável com o mínimo de danos ao meio ambiente, estão impactando a indústria e causando uma evolução do pensamento sobre como abordar a miríade de desafios. A demanda por pesticidas mais seguros e estratégias de controle de pragas alternativas está aumentando. Enquanto a eliminação por atacado de produtos químicos não é viável neste momento, os agricultores estão adotando cada vez mais o uso de medidas biológicas como componentes viáveis dos programas de Manejo de Nutrientes e Manejo Integrado de Pragas. [0014] Por exemplo, nos últimos anos, o controle biológico de nematoides despertou um grande interesse. Este método utiliza os agentes biológicos como pesticidas, como micróbios vivos, bio-produtos derivados desses micróbios, e suas combinações. Estes pesticidas biológicos têm importantes vantagens em relação a outros pesticidas convencionais. Por exemplo, eles são menos nocivos em relação aos pesticidas químicos convencionais. Eles são mais eficientes e específicos. Eles muitas vezes se biodegradam rapidamente, levando a menor poluição ambiental.
[0015] O uso de biopesticidas e outros agentes biológicos têm sido grandemente limitado por dificuldades na produção, transporte, administração, preço e eficácia. Por exemplo, muitos micróbios são difíceis de ser cultivados e, posteriormente, implantados nos sistemas de produção agrícolas e florestais em quantidades suficientes para ser úteis. Este problema é agravado por perdas em viabilidade e/ou atividade devido ao processamento, elaboração, armazenamento e estabilização antes da distribuição. Além disso, uma vez aplicados, os produtos biológicos podem não prosperar por um número variado de razões, incluindo, por exemplo, densidades de célula inicial insuficientes, incapacidade de competir efetivamente com a microflora
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5/49 existente em um local específico, e sendo introduzidos no solo e/ou outras condições ambientais em que o micróbio não pode florescer ou mesmo sobreviver.
[0016] As composições à base de micróbios poderíam ajudar a resolver alguns dos problemas mencionados anteriormente enfrentados pela indústria agrícola, indústria de óleo e gás, assim como muitos outros. Portanto, há necessidade de métodos de cultivo mais eficientes para a produção em massa de microrganismos e metabólitos microbianos.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO [0017] A presente invenção fornece materiais, métodos e sistemas para a produção de composições à base de micróbios que podem ser utilizadas na indústria de óleo e gás, agricultura, cuidados de saúde e limpeza ambiental, bem como para uma variedade de outras aplicações. Especificamente, a invenção fornece materiais, métodos e sistemas de cultivo eficiente de microrganismos e produção de subprodutos de crescimento microbiano.
[0018] Modalidades da presente invenção fornecem novos métodos e sistemas de fermentação e de baixo custo. Mais especificamente, a presente invenção fornece reatores biológicos para a fermentação. Em modalidades específicas, os sistemas são usados para cultivar levedura e/ou outras composições baseadas em micróbios. Em algumas modalidades, os sistemas podem ser usados para a produção de composições de levedura Starmerella bombicola.
[0019] Os sistemas podem ser usados para cultivar leveduras, fungos e bactérias. Em certas modalidades, os sistemas podem ser usados para a produção de composições à base de levedura, incluindo, por exemplo, composições compreendendo leveduras Starmerella bombicola, Wickerhamomyces anomalus e/ou Pseudozyma aphidis. Em algumas modalidades, os sistemas podem ser usados para a produção
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6/49 de composições à base de bactérias, incluindo, por exemplo, composições contendo Bacillus subtilis e/ou Bacillus licheniformis. [0020] Em uma modalidade específica, o sistema da presente invenção compreende pelo menos dois tanques que estão conectados entre si por tubos. Neste reator multitanque, uma bomba força a cultura microbiana através da tubulação de um tanque para outro tanque. Em modalidades preferidas, a tubulação é instalada no, ou perto do topo dos tanques. Enquanto a cultura está se movendo através da tubulação, ela pode ser oxigenada pelo ar empurrado para o fluxo de fluido através de, por exemplo, um compressor de ar. Isto mistura e oxigena a cultura. Mais perto da parte inferior dos tanques, outro tubo conecta os dois tanques, a fim de equilibrar os níveis de cultura em cada tanque. Estes tubos podem ter outra entrada para facilitar a suplementação de ar. Estes tubos podem, portanto, fornecer mistura adicional e aeração. Além disso, ambos os tanques podem ser suplementados com sistemas individuais de pulverização.
[0021] A inoculação pode ocorrer em um ou ambos os tanques e o inóculo é misturado em ambos os tanques através dos sistemas de tubulação referidos acima. Em modalidades preferenciais do sistema multitanque, a bomba ou bombas operam continuamente durante o processo de fermentação. A taxa de fluxo pode ser, por exemplo, de 10 a 20 a 200 galões por minuto. Em modalidades específicas, uma troca de cultura completa ocorre entre os tanques a cada 5 a 10 minutos. [0022] Vantajosamente, os sistemas da presente invenção podem ser ajustados dependendo do uso a que se destina. Por exemplo, os tanques podem variar em tamanho de alguns galões para dezenas de milhares de galões.
[0023] Em uma modalidade, a invenção fornece métodos de cultivo de microrganismos sem contaminação usando esse sistema. Em certas modalidades, os métodos de cultivo compreendem a adição de um meio
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7/49 de cultura compreendendo água e componentes de nutrientes para os sistemas usando, por exemplo, uma bomba peristáltica; inoculando o sistema com um microrganismo viável; e, opcionalmente, adicionando um agente antimicrobiano ao meio de cultura. O agente antimicrobiano pode ser, por exemplo, um antibiótico ou um soporolipídio.
[0024] Em uma modalidade, a invenção fornece ainda uma composição compreendendo pelo menos um tipo de microrganismo e/ou, pelo menos, um metabólito microbiano produzido pelo microrganismo que tem sido cultivado utilizando o sistema de fermentação da invenção. Os microrganismos na composição podem estar em uma forma ativa ou inativa. A composição também pode ser em uma forma seca ou em uma forma líquida.
[0025] Vantajosamente, o método e o equipamento da invenção reduzem os custos de capital e trabalho da produção de microrganismos e seus metabólitos em grande escala. Além disso, o processo de cultivo da invenção reduz ou elimina a necessidade de concentrar organismos depois de completar o cultivo. A invenção fornece um método de cultivo que não somente aumenta substancialmente o rendimento de produtos microbianos por unidade de meio de nutrientes mas simplifica a produção e facilita a portabilidade.
[0026] A portabilidade pode resultar em economias significativas de custo uma vez que as composições à base de micróbios podem ser produzidas no, ou perto do local de uso a que se destina. Isto significa que a composição final pode ser fabricada no local, utilizando materiais de origem local, se desejado, reduzindo assim os custos de envio. Além disso, as composições podem incluir micróbios viáveis no momento da aplicação, o que pode aumentar a eficácia do produto.
[0027] Assim, em certas modalidades, os sistemas da invenção aproveitam o poder de microrganismos de ocorrência natural local e seus subprodutos metabólicos. O uso de populações microbianas locais
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8/49 pode ser vantajoso em configurações, incluindo, mas não limitadas a, remediação ambiental (como no caso de um derramamento de óleo), pecuária, aquacultura, silvicultura, pastagens, manejo de grama, produção de horticultura ornamental, tratamento e eliminação de resíduos, mineração, recuperação de óleos, e saúde humana, inclusive em locais remotos.
[0028] Composições produzidas pela presente invenção também podem ser usadas em uma ampla variedade de aplicações da indústria de petróleo, como recuperação de óleo potencializada por micróbios. Estas aplicações incluem, mas não estão limitadas a, reforço da recuperação de óleo cru; estimulação de poços de óleo e gás (para melhorar o fluxo de óleo para dentro do furo do poço); remoção de contaminantes e/ou obstruções, como parafinas, asfaltenos e escala de equipamentos, como barras, tubos, forros, tanques e bombas; prevenção da corrosão de produção de óleo e gás e material de transporte; redução da concentração de H2S em óleo cru e gás natural; redução da viscosidade do óleo cru; aprimoramento de óleos crus pesados e asfaltenos em frações de hidrocarbonetos mais leves; limpeza de tanques, linhas de fluxo e tubulações; reforçamento de mobilidade de óleo durante a inundação de água através de plugues seletivos e não-seletivos, e fraturamento de fluidos.
[0029] Quando usado em aplicações de óleo e gás, os sistemas da presente invenção podem ser usados para diminuir o custo de composições de campos petrolíferos à base de micróbios e podem ser usados em combinação com outros produtos potencializadores químicos, como polímeros, solventes, areia de fraturamento e grânulos, emulsificantes, tensoativos e outros materiais conhecidos na técnica. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0030] A Figura 1 mostra um sistema de dois tanques de acordo com uma modalidade da invenção.
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9/49 [0031] A Figura 2 mostra uma visão lateral de um sistema de dois tanques de acordo com uma modalidade da invenção, incluindo medições do tanque exemplificadoras.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0032] A presente invenção fornece materiais, métodos e sistemas para a produção de composições à base de micróbios que podem ser utilizadas na indústria de óleo e gás, aquicultura, agricultura, limpeza ambiental, cuidados de saúde humana, bem como outras aplicações. Mais especificamente, em modalidades preferidas, a presente invenção fornece reatores biológicos para a fermentação de composições à base de leveduras e/ou outros micróbios.
[0033] Modalidades da presente invenção também fornecem novos métodos e sistemas de fermentação e de baixo custo. Os sistemas podem ser usados para cultivar leveduras, fungos e bactérias e/ou seus subprodutos de cultura. Em certas modalidades, os sistemas podem ser usados para a produção de composições à base de levedura, incluindo, por exemplo, composições compreendendo leveduras Starmerella bombicola, Wickerhamomyces anomalus e/ou Pseudozyma aphidis. Em algumas modalidades, os sistemas podem ser usados para a produção de composições à base de bactérias, incluindo, por exemplo, composições contendo Bacillus subtilis e/ou Bacillus licheniformis.
[0034] Em uma modalidade preferida em que as leveduras são cultivadas, a composição resultante pode ter uma ou mais das seguintes propriedades vantajosas: altas concentrações de manoproteína e betaglucano como parte da parede celular de leveduras; e a presença de biotensoativos e outros metabólitos microbianos (por exemplo, ácido lático e etanol, etc.) na cultura.
Definições selecionadas [0035] Como usado aqui, a referência a uma composição à base de micróbios significa uma composição que compreende componentes
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10/49 que foram produzidos como resultado do crescimento de microrganismos ou outras culturas de células. Assim, a composição à base de micróbios pode compreender os próprios micróbios e/ou subprodutos do crescimento microbiano. Os micróbios podem estar em estado vegetativo, em forma de esporos, em forma de micélio, em qualquer outra forma de propágulo, ou uma mistura destes. Os micróbios podem ser planctônicos ou em forma de biofilme, ou uma mistura de ambos. Os subprodutos do crescimento podem ser, por exemplo, metabólitos, componentes da membrana celular, proteínas expressadas, e/ou outros componentes celulares. Os micróbios podem ser intactos ou lisados. Em modalidades preferidas, os micróbios estão presentes, com caldo em que foram cultivados, na composição à base de micróbio. As células podem estar presentes em, por exemplo, uma concentração de 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106, 1 x 107, 1 x 108, 1 x 109, 1 x 1O10 ou 1 x 1011 ou mais propágulos por mililitro da composição. Como usado aqui, um propágulo é qualquer parte de um microrganismo do qual um novo e/ou maduro organismo pode desenvolver, incluindo, mas não limitado a, células, esporos, micelas, botões e sementes.
[0036] A invenção fornece ainda produtos à base de micróbios, que são produtos que estão para ser aplicados na prática para alcançar um resultado desejado. O produto à base de micróbio pode ser simplesmente a composição à base de micróbios colhidos do processo de cultivo de micróbios. Alternativamente, o produto à base de micróbio pode incluir outros ingredientes que foram adicionados. Estes ingredientes adicionais podem incluir, por exemplo, estabilizadores, tampões, carreadores apropriados, como água, soluções salinas, ou qualquer outro carreador adequado, nutrientes adicionados para suportar crescimento microbiano adicional, potenciadores de crescimento não-nutriente, como hormônios vegetais e/ou agentes que facilitam o rastreamento dos micróbios e/ou a composição no ambiente
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11/49 para a qual ele é aplicado. O produto à base de micróbios pode incluir também misturas de composições à base de micróbios. O produto à base de micróbios também pode incluir um ou mais componentes de uma composição à base de micróbios que foram processados, de alguma forma, como, mas não limitado a, filtragem, centrifugação, lise, secagem, purificação e similares.
[0037] Como usado aqui, colhidos refere-se a remoção de algumas ou de toda a composição à base de micróbio de um recipiente de crescimento.
[0038] Como usado aqui, um biofilme é um complexo agregado de microrganismos, como bactérias, em que as células aderem umas as outras. As células nos biofilmes são fisiologicamente distintas de células planctônicas do mesmo organismo, que são células únicas que podem flutuar ou nadar em meio líquido.
[0039] Como usado aqui, o termo controle usado em referência à atividade produzida por microrganismos do indivíduo estende-se para o ato de matar, desativação ou imobilizar pragas ou substancialmente tornando as pragas incapazes de causar dano.
[0040] Como usado aqui, uma molécula de ácido nucleico isolada ou purificada, polinucleotídeo, polipeptídeo, proteínas ou composto orgânico como uma molécula pequena (por exemplo, as descritas abaixo), é substancialmente livre de outros compostos, como material celular, com o qual ele está associado na natureza. Conforme usado aqui, a referência a isolado no contexto de uma cepa microbiana, significa que a cepa é removida do ambiente em que existe na natureza. Assim, a cepa isolada pode existir como, por exemplo, uma cultura biologicamente pura, ou como esporos (ou outras formas da cepa) em associação com um carreador.
[0041] Em algumas modalidades, os compostos purificados são pelo menos 60% em peso (peso seco) do composto de interesse. De
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12/49 preferência, a preparação é pelo menos 75%, mais de preferência pelo menos 90%, e com mais preferência pelo menos 99%, em peso, do composto de interesse. Por exemplo, um composto purificado é aquele que é, pelo menos, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 98%, 99% ou 100% (p/p) do composto desejado por peso. A pureza é medida por qualquer método padrão apropriado, por exemplo, por cromatografia em coluna, cromatografia de camada fina e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Um polinucleotídeo purificado ou isolado (ácido ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA) é livre de genes ou sequências que os flanqueiam, em seu estado de ocorrência natural. Um polipeptídeo purificado ou isolado é livre de aminoácidos ou sequências que o flanqueia em seu estado de ocorrência natural.
[0042] Um metabólito refere-se a qualquer substância produzida pelo metabolismo ou uma substância necessária para tomar parte em um determinado processo metabólico. Um metabólito pode ser um composto orgânico que é um material de partida (por exemplo, glicose), um intermediário (por exemplo, acetil-CoA), ou um produto final (por exemplo, n-butanol) do metabolismo. Exemplos de metabólitos incluem, mas não estão limitados a, enzimas, toxinas, ácidos, solventes, álcoois, proteínas, vitaminas, minerais, microelementos, aminoácidos e biotensoativos.
[0043] Conforme usado aqui, tensoativo significa um componente que reduz a tensão superficial (ou tensão interfacial) entre dois líquidos ou entre um líquido e um sólido. Os tensoativos agem como detergentes, agentes umectantes, emulsionantes, agentes antiespuma e dispersantes. Um biotensoativo é um tensoativo produzido por um organismo vivo.
Design e operação de sistema de fermentação [0044] Em uma modalidade específica, o sistema da presente invenção compreende pelo menos dois tanques que estão conectados
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13/49 entre si por tubos. Uma bomba força a cultura microbiana através da tubulação de um tanque para outro tanque. Em modalidades preferidas, a tubulação é instalada no, ou perto do topo dos tanques. A bomba pode ter uma entrada conectada ao primeiro tanque através de um primeiro tubo (ou mangueira ou cano), e uma saída ligada ao segundo tanque através de um segundo tubo.
[0045] Um ou mais compressores de ar podem ser incluídos para aeração e cada compressor de ar pode, opcionalmente, ter um filtro de ar para evitar contaminação. Os compressores de ar podem ser conectados a um ou mais injetores de gás, borbulhadores e/ou aspersores. Injetores de gás podem estar localizados em, por exemplo, quaisquer e/ou todos os tubos e/ou tanques do reator. Os borbulhadores e/ou aspersores podem estar localizados em qualquer e/ou todos os tanques. Enquanto a cultura está se movendo através da tubulação, ela pode ser oxigenada pelo ar empurrado para o fluxo de fluido através de, por exemplo, o compressor de ar. Isto mistura e oxigena a cultura.
[0046] Mais perto do fundo dos tanques, um terceiro tubo (ou mangueira ou cano) pode ser conectado do segundo tanque para o primeiro tanque. O terceiro tubo permite que o líquido flua sob pressão hidrostática do segundo tanque para o primeiro tanque. Este tubo conecta os dois tanques, a fim de equilibrar os níveis de cultura em cada tanque. Estes tubos podem ter outra entrada para facilitar a suplementação de ar. Estes tubos podem, portanto, fornecer mistura adicional e aeração. O sistema pode incluir uma válvula de controle de fluxo na saída da primeira bomba adequada para controlar a taxa de fluxo da primeira bomba. A primeira bomba também pode ser controlada usando um motor de frequência variável, de modo que as taxas de fluxo podem ser ajustadas adequadamente através de mudanças na frequência elétrica.
[0047] A tubulação perto da parte superior dos dois tanques é de
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14/49 preferência ligada a cada tanque em um ponto que está no topo 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2% e 1% do tanque. O tubo mais perto da parte inferior dos dois tanques é de preferência conectado a cada tanque em um ponto que está na parte inferior 50%, 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 2% e 1% do tanque.
[0048] A bomba e/ou as bombas do sistema pode ser dimensionada para ser adequada para o estabelecimento de uma razão de reciclagem (o volume bombeado por hora/o volume total do reator líquido) variando de, por exemplo, 30 a 0,10. A bomba pode ser uma bomba centrífuga. O sistema pode incluir uma ou mais válvulas de bloqueio (qualquer válvula genérica usada para interromper o fluxo) nas entradas e saídas do primeiro e do segundo tanque. Uma mangueira pode ser conectada à primeira bomba (ou uma segunda bomba conectada ao reator), para drenar o reator e a bomba da composição ao seu lugar de uso a que se destina. Um bico pode estar localizado na extremidade da mangueira e ser adequado para a pulverização da composição.
[0049] Em modalidades preferenciais do sistema, a bomba ou bombas operam continuamente durante o processo de fermentação. A taxa de fluxo pode ser, por exemplo, de 10 a 20 a 200 galões por minuto. Em modalidades específicas, uma troca de cultura completa ocorre entre os tanques a cada 5 a 10 minutos.
[0050] O sistema pode incluir um ou mais visores de vidro sobre, por exemplo, quaisquer e/ou todos os tubos e/ou tanques para a monitorização visual do processo de fermentação. Além disso, quaisquer e/ou todos os tubos podem ter uma válvula de retenção para evitar o refluxo.
[0051] Uma ou mais saídas de ar (ou válvulas de liberação de pressão (PSVs)) pode estar localizada em qualquer um e/ou todos os tanques. As saídas de ar ou PSVs podem permitir que os gases fluam pra fora, mas não permitem que o ar entre (por exemplo, a válvula pode
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15/49 abrir quando a pressão do gás interno do reator vai acima de 1,2 atm e pode fechar quando a pressão do gás interno cai abaixo de 1,1 atm).
[0052] Os tanques usados de acordo com a invenção podem ser qualquer reator fermentador ou de cultivo para uso industrial. Esses tanques podem ser, por exemplo, feitos de vidro, polímeros, metais, ligas metálicas, e suas combinações. Os tanques podem ser, por exemplo, de 5 litros a 2.000 litros ou mais. Normalmente, os recipientes serão de 10 a 1.500 litros e, de preferência, são de 100 a 1.000 litros, e com mais preferência de 250 a 750 litros, de 300 a 600 litros ou de 400 a 550 litros.
[0053] Antes do crescimento de micróbios, os tanques podem ser desinfectados ou esterilizados. Em uma modalidade, o meio de fermentação, o ar e o equipamento utilizado no método e processo de cultivo são esterilizados. O equipamento de cultivo como o reator/recipiente pode ser separado de, mas conectado a, uma unidade de esterilização, por exemplo, uma autoclave. O equipamento de cultivo pode ter também uma unidade de esterilização que esteriliza in situ, antes de iniciar a inoculação, por exemplo, através de um vaporizador. O ar pode ser esterilizado por métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o ar ambiente pode passar por pelo menos um filtro antes de suplementado no recipiente. Em outras modalidades, o meio pode ser pasteurizado ou opcionalmente nenhum calor ser adicionado, onde o uso de baixa atividade de água e pH baixo pode ser explorado para controlar o crescimento bacteriano.
[0054] O sistema pode ser usado como um reator de batelada (ao contrário de um reator contínuo). Vantajosamente, o sistema pode ser ajustado dependendo do uso a que se destina. Para pequenas aplicações, como, por exemplo, biorremediação, o sistema pode ser tão pequeno quanto 50 galões ou ainda menor. Para aplicações em que grandes volumes da composição são necessários, como recuperação
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16/49 de óleo potencializada por micróbios, o sistema pode ser dimensionado para produzir 20.000 ou mais galões de produto.
[0055] O sistema pode incluir controles de temperatura. O sistema pode ser isolado para que o processo de fermentação possa permanecer em temperaturas adequadas em ambientes de baixa temperatura. Qualquer um dos materiais isolantes conhecidos na técnica pode ser aplicado, incluindo fibra de vidro, aerogel de silica, isolamento de fibra cerâmica, etc. O isolamento pode cercar qualquer e/ou todos os tubos e/ou tanques do sistema.
[0056] O sistema também pode ser adaptado para garantir a manutenção de uma temperatura de fermentação adequada. Por exemplo, o exterior do sistema pode ser reflexivo para evitar o aumento de temperatura do sistema durante o dia. Além disso, um sistema de refrigeração pode ser adicionado que inclui, por exemplo, uma ou mais jaqueta de resfriamento e um trocador de calor de refrigeração. A água de refrigeração pode trocar calor com o ar ambiente e ser recirculada através do sistema de refrigeração. O trocador de calor e/ou a jaqueta de resfriamento pode cercar ou ser instalado dentro de qualquer e/ou todos os tubos e/ou tanques do sistema. Para ambientes extremos, o sistema pode incluir sistemas de refrigeração e bobinas de refrigeração dentro do reator, uma jaqueta em torno do reator, ou trocadores de calor conectados aos tubos.
[0057] O sistema pode utilizar um aquecedor eléctrico. No entanto, para aplicações maiores, onde é necessário calor, vapor ou combustível de hidrocarbonetos podem ser utilizados. Uma entrada de vapor e/ou uma fonte de vapor pode ser conectada a um ou mais de um injetor de vapor, uma jaqueta de vapor e um trocador de calor a vapor. A jaqueta de vapor pode cercar qualquer e/ou todos os tanques do sistema. Além disso, o vapor pode ser direcionado para qualquer e/ou todos os tubos e/ou tanques do sistema. Um trocador de calor a vapor pode ser colocado
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17/49 dentro do reator, o vapor pode se condensar dentro dos tubos do trocador de calor e, em seguida, ser expulso. O trocador de calor a vapor pode ser um sistema fechado que não misture água ou vapor no reator.
[0058] Em uma modalidade, os tanques têm controles funcionais/sensores ou podem ser conectados a controles funcionais/sensores para medir fatores importantes no processo de cultivo, como pH, oxigênio, pressão, temperatura, potência do eixo agitador, umidade, viscosidade e/ou densidade microbiana e/ou concentração do metabólito.
[0059] Um termômetro pode ser incluído e o termômetro pode ser manual ou automático. O termômetro pode ser colocado de preferência em qualquer um e/ou em todos os tanques do reator. Um termômetro automático pode gerenciar as fontes de calor e de frio para controlar adequadamente a temperatura durante todo o processo de fermentação. As temperaturas desejadas podem ser programadas no local ou pré-programadas antes de o sistema ser entregue no local de fermentação. As medições de temperatura podem, então, ser usadas para controlar automaticamente os sistemas de aquecimento e resfriamento que são discutidos acima.
[0060] O ajuste de pH pode ser realizado por meios automáticos ou pode ser feito manualmente. O ajuste automático de pH pode incluir uma sonda de pH e um dispositivo eletrônico para dispensar as substâncias de ajuste do pH apropriadamente, dependendo das medições de pH. A sonda de pH pode ser colocada de preferência em qualquer um e/ou em todos os tanques do reator. O pH pode ser definido para um número específico por um usuário ou pode ser pré-programado para alterar o pH de acordo em todo o processo de fermentação. Se o ajuste de pH for feito manualmente, ferramentas de medição de pH conhecidas na técnica podem ser incluídas com o sistema para o teste manual.
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18/49 [0061] Um sistema de computador para medição e ajuste do pH e da temperatura pode ser usado para monitorar e controlar os parâmetros de fermentação para cada tanque dos reatores. O computador pode ser conectado a um termômetro e uma sonda de pH, por exemplo. Além de monitorar e controlar a temperatura e o pH, cada recipiente pode também ter a capacidade de monitorar e controlar, por exemplo, oxigênio dissolvido, agitação, espuma, pureza de culturas microbianas, produção de metabólitos desejados e similares. Os sistemas podem ser adaptados ainda para monitoração remota desses parâmetros, por exemplo, com um tablet, smartphone, ou outro dispositivo de computação móvel capaz de enviar e receber dados sem fios.
[0062] Em uma outra modalidade, os tanques também podem ser capazes de monitorar o crescimento de microrganismos no interior do recipiente (por exemplo, medição do número de células e fases de crescimento). Alternativamente, uma amostra diária pode ser obtida a partir do recipiente e submetida à enumeração por técnicas conhecidas na área, como técnica de diluição em placas. Diluição em placas é uma técnica simples utilizada para estimar o número de bactérias em uma amostra. A técnica também pode fornecer um índice pelo qual diferentes ambientes ou tratamentos podem ser comparados.
[0063] Em uma modalidade, o sistema de fermentação é um biorreator móvel ou portátil que pode ser fornecido para a produção no local de um produto microbiológico incluindo uma quantidade adequada de uma cepa desejada de microrganismo. Porque o produto microbiológico é gerado no local da aplicação, sem recorrer aos processos de estabilização bacteriana, preservação, armazenamento e transporte de produção convencional, uma densidade muito maior de microrganismos vivos pode ser gerada, exigindo, assim, um volume muito menor da composição do microrganismo para uso na aplicação no local. Isto permite um biorreator reduzido (por exemplo, tanques de
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19/49 fermentação menores, suprimentos menores de material de partida, nutrientes, agentes de controle de pH, e agente antiespumante etc.), que facilita a mobilidade e a portabilidade do sistema.
[0064] O sistema pode incluir uma estrutura para suportar os componentes do aparelho (incluindo os tanques, laços de fluxo, bombas, etc.). O sistema pode incluir rodas para mover o aparelho, bem como alças para direção, empurrando e puxando quando manusear o aparelho.
[0065] O sistema pode ser configurado na parte de trás de um ou mais reboque do caminhão e/ou semirreboques. Isto é, o sistema pode ser projetado para ser portátil (ou seja, o sistema pode ser adequado para ser transportado em uma caminhonete, um reboque plataforma ou semirreboque).
Microrganismos [0066] Os microrganismos cultivados de acordo com os sistemas e os métodos dessa invenção podem ser, por exemplo, bactérias, leveduras e/ou fungos. Esses microrganismos podem ser naturais ou microrganismos geneticamente modificados. Por exemplo, os microrganismos podem ser transformados com genes específicos que apresentam características específicas. Os microrganismos também podem ser mutantes de uma cepa desejada. Procedimentos para produzir mutantes são bem conhecidos na técnica microbiológica. Por exemplo, luz ultravioleta e nitrosoguanidina são amplamente utilizados para este fim.
[0067] Os micróbios e seus produtos de crescimento fabricados conforme a presente invenção podem ser utilizados para a produção de uma vasta gama de produtos úteis, incluindo, por exemplo, biopesticidas, biotensoativos, etanol, compostos nutricionais, proteínas terapêuticas, como a insulina, compostos úteis como vacinas, e outros biopolímeros. Os micróbios usados como estas fábricas microbianas
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20/49 podem ser naturais, modificados ou recombinantes.
[0068] Em uma modalidade, o microrganismo é uma levedura ou fungo. Espécies de leveduras e fungos adequados para uso de acordo com a invenção incluem Candida, Saccharomyces (S. cerevisiae, S. boulardii sequela, S. torula), Issalchenkia, Kluyveromyces, Pichia, Wickerhamomyces (por exemplo, W. anomalus), Starmerella (por exemplo, S. bombicola), Mycorrhiza, Mortierel-la, Phycomyces, Blakeslea, Thraustochytrium, Phythium, Ento-mophthora, Aureobasidium pullulans, Pseudozyma aphidis, Fusarium venenalum, Aspergillus, Trichoderma (por exemplo, T. reesei, T. harzianum, T. hamatum, T. viride), Rhizopus spp., Mycorrhiza (por exemplo, Glomus spp., Acaulospora spp., vesicular-arbuscular mycorrhizae (VAM), arbuscular mycorrhizae (AM)), endophytic fungi (por exemplo, Piriformis indica), qualquer cepa de levedura assassina, e suas combinações.
[0069] Em uma modalidade, a levedura é uma levedura assassina. Neste documento, levedura assassina significa uma cepa de levedura, caracterizada pela sua secreção de proteínas tóxicas ou glicoproteínas, para as quais a cepa em si é imune. As exotoxinas secretadas pelas leveduras assassinas são capazes de matar outras cepas de leveduras, fungos ou bactérias. Por exemplo, microrganismos que podem ser controlados por leveduras assassinas incluem Fusarium e outros fungos filamentosos. Exemplos de leveduras assassinas de acordo com a presente invenção são aquelas que podem ser usadas com segurança nas indústrias de alimentos e de fermentação, por exemplo, cerveja, vinho e pão; as que podem ser usadas para controlar outros microrganismos que possam contaminar tais processos de produção; as que podem ser usadas no controle biológico para a preservação de alimentos; aquelas que podem ser usadas para o tratamento de infecções fúngicas de ambos os seres humanos e plantas; e aquelas que podem ser usadas na tecnologia do DNA recombinante. Tais
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21/49 leveduras podem incluir, mas não estão limitadas a, Wickerhamomyces, Pichia (por exemplo, P. anômala, P. guielliermondii, P. kudriavzevii), Hansenula, Saccharomyces, Hanseniaspora, (por exemplo, H. uvarum), Ustilago maydis, Debaryomyces hansenii, Candida, Crypto-coccus, Kluyveromyces, Torulopsis, Ustilago, Williopsis, Zygosaccha-romyces (por exemplo, Z. bailii), entre outras.
[0070] Em uma modalidade, o micróbio é uma levedura assassina, como uma levedura Pichia selecionada de Pichia anômala (Wickerhamomyces anomalus), Pichia guielliermondii e Pichia kudriavzevii. Pichia anômala, em particular, é um eficiente produtor de vários solventes, enzimas, toxinas assassinas, bem como biotensoativos soporolipídicos.
[0071] Em uma modalidade, a cepa microbiana é escolhida da Starmerella ciado. Uma cultura de um micróbio Starmerella útil de acordo com a invenção, Starmerella bombicola, pode ser obtido a partir da American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd, Manassas, Virgínia 20110-2209 USA. O depósito foi atribuído o número de adesão ATCC N° 22214 pelo depositário.
[0072] O sistema também pode utilizar uma ou mais cepas de leveduras capazes de melhorar a recuperação de óleo e realizar a degradação de parafina, por exemplo, Starmerella (Candida) bombicola, Candida apicola, Candida batistae, Candida floricola, Candida riodocensis, Candida stellate, Candida kuoi, Candida sp. NRRL Y27208, Rhodotorula bogoriensis sp., Wickerhamiella domericqiae, bem como quaisquer outras cepas produtoras de soporolipídicos do ciado Starmerella. Em uma modalidade específica, a cepa de levedura é ATCC 22214 e mutantes destas.
[0073] Em uma modalidade, o micróbio é uma cepa de pseudozyma aphidis. Este micróbio é um eficiente produtor de biotensoativos lipídicos de manosileritritol.
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22/49 [0074] Em uma modalidade, os microrganismos são bactérias, incluindo bactérias gram-positivas e gram-negativas. Estas bactérias podem ser, mas não estão limitadas a, por exemplo, Bacillus (por exemplo, B. subtil is, B. licheniformis, B. firmus, B. laterosporus, B. megaterium, B. amyloliquifaciens), Clostridium (C. butyricum, C. tyrobutyricum, C. acetobutyricum, Clostridium NIPER 7 eC. beijerinckii), Azobacter (A. vinelandii, A. chroococcum), Pseudomonas (P. chlororaphis subsp. aureofaciens (Kluyver), P. aeruginosa), Azospirillum brasiliensis, Ralslonia eulropha, Rhodospirillum rubrum, Sphingomonas (por exemplo, S. paucimobilis), Streptomyces (por exemplo, S. griseochromogenes, S.qriseus, S. cacaoi, S. aureus e S. kasugaenis), Streptoverticillium (por exemplo, S. rimofaciens), Ralslonia (por exemplo, R. eulropha), Rhodospirillum (por exemplo, R. rubrum), Xanthomonas (por exemplo, X. campestris), Erwinia (por exemplo, E. carotovora), Escherichia coli, Rhizobium (por exemplo, R. japonicum, Sinorhizobium meliloti, Sinorhizobium fredii, R. leguminosarum biovar trifolii e R. etli), Bradyrhizobium (por exemplo, B. japanicum e B. parasponia), Arthrobacter (por exemplo, A. radiobacter), Azomonas, Derxia, Beije rinckia, Nocardia, Klebsiella, Clavibacter (por exemplo, C. xyli subsp. xyli e C. xyli subsp. cynodontis), Cyanobacteria, Pantoea (por exemplo, P. agglomerans), e suas combinações.
[0075] Em uma modalidade, o microrganismo é uma cepa de B. subtilis, como, por exemplo, B. subtilis var. locuses B1 ou B2, que são produtores eficazes, por exemplo, de surfactina e outros biotensoativos, bem como biopolímeros. Este relatório descritivo incorpora por referência Publicação Internacional n° WO 2017/044953 A1 na medida em que é coerente com os ensinamentos revelados aqui. Em outra modalidade, o microrganismo é uma cepa de Bacillus licheniformis, que é um eficiente produtor de biotensoativos, bem como biopolímeros, como levana.
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23/49 [0076] Em uma modalidade, o micróbio é uma cepa não-patogênica de Pseudomonas. Preferencialmente, a cepa é um produtor de biotensoativos ramnolipídio.
[0077] Outras cepas microbianas, incluindo, por exemplo, cepas capazes de acumular quantidades significativas de, por exemplo, biotensoativos glicolipídeo, podem ser usadas de acordo com a invenção. Outros subprodutos microbianos úteis de acordo com a presente invenção incluem manoproteína, beta-glucano e outros metabólitos que têm bioemulsificação e propriedades de redução de tensão de superfície/interfacial.
[0078] Em uma modalidade, um único tipo de micróbio é cultivado em um recipiente. Em modalidades alternativas, vários micróbios, que podem ser cultivados juntos sem efeitos deletérios sobre o crescimento ou o produto resultante, podem ser cultivados em um único recipiente. Pode haver, por exemplo, 2 a 3 ou mais diferentes micróbios cultivados em único recipiente ao mesmo tempo.
Métodos de cultivo usando os sistemas de fermentação da invenção [0079] A presente invenção fornece métodos e sistemas para a produção eficiente de micróbios usando novos reatores biológicos. O sistema pode incluir todos os materiais necessários para o processo de fermentação (ou cultura), incluindo, por exemplo, equipamento, suprimentos de esterilização e componentes do meio de cultura, apesar de se esperar que a água pode ser fornecida a partir de uma fonte local e esterilizada de acordo com os métodos presentes.
[0080] Em uma modalidade, o sistema é fornecido com um inóculo de microrganismos viáveis. De preferência, os micróbios são os micróbios produzidos bioquimicamente capazes de acumular, por exemplo, biotensoativos, enzimas, solventes, biopolímeros, ácidos e/ou outros metabólitos úteis. Em modalidades particularmente preferidas, os
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24/49 microrganismos são leveduras bioquímicas produtoras (incluindo leveduras assassinas), fungos e/ou bactérias, incluindo, sem limitação, aqueles listados aqui.
[0081] Em uma modalidade, o sistema é fornecido com um meio de cultura. O meio pode incluir fontes de nutrientes, por exemplo, uma fonte de carbono, uma fonte de lipídio, uma fonte de nitrogênio, e/ou uma fonte de micronutriente. Cada fonte de carbono, fonte de lipídio, fonte de nitrogênio, e/ou fonte de micronutriente pode ser fornecida em uma embalagem individual que pode ser adicionada ao reator em momentos adequados durante o processo de fermentação. Cada um dos pacotes pode incluir vários subpacotes que podem ser adicionados em pontos específicos (por exemplo, quando a levedura, o pH, e/ou níveis de nutrientes vão acima ou abaixo de uma determinada concentração) ou tempos (por exemplo, após 10 horas, 20 horas, 30 horas, 40 horas, etc.) durante o processo de fermentação.
[0082] Antes da fermentação os tanques podem ser lavados com uma solução de peróxido de hidrogênio (por exemplo, de 2,0% a 4,0% de peróxido de hidrogênio; isso pode ser feito antes ou após um enxágue em água quente, por exemplo, a 80-90°C) para evitar a contaminação. Além disso, ou, em alternativa, os tanques podem ser lavados com um desinfetante comercial, uma solução de água sanitária e/ou água quente ou vapor. O sistema pode vir com formas concentradas de alvejante e peróxido de hidrogênio, que pode ser posteriormente diluído no sítio de fermentação antes do uso. Por exemplo, o peróxido de hidrogênio pode ser fornecido de forma concentrada e ser diluído a formulação de 2,0% a 4,0% peróxido de hidrogênio (por peso ou volume) de descontaminação préenxaguamento.
[0083] Em uma determinada modalidade, o método de cultivo compreende a esterilização reatores de fermentação da invenção antes
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25/49 da fermentação. As superfícies internas do reator (incluindo, por exemplo, tanques, portas, aspersores e sistemas de mistura) podem primeiro ser lavadas com um desinfectante comercial; em seguida enevoada (ou pulverizada com um sistema de spray altamente disperso) com 2% a 4% de peróxido de hidrogênio, de preferência 3% de peróxido de hidrogênio; e, finalmente, vaporizadas com um vaporizador portátil a uma temperatura de cerca de 105°C a cerca de 110°C ou superior. [0084] Os componentes do meio de cultura (por exemplo, a fonte de carbono, água, fonte de lipídio, micronutrientes, etc.) também podem ser esterilizados. Isto pode ser conseguido usando descontaminação de temperatura e/ou descontaminação de peróxido de hidrogênio (potencialmente seguido de neutralização do peróxido de hidrogênio usando um ácido como o HCI, H2SO4, etc.).
[0085] Em uma modalidade específica, a água usada no meio de cultura é esterilizada com radiação UV usando um esterilizador de água UV em linha e filtrado usando, por exemplo, um filtro de água de 0,1 mícron. Em outra modalidade, todos os componentes nutricionais e outros meios podem ser autoclavados antes da fermentação.
[0086] Para evitar a contaminação, 0 meio de cultura do sistema pode conter ácidos adicionais, antibióticos e/ou antimicrobianos, adicionados antes e/ou durante 0 processo de cultivo. A uma ou mais substâncias antimicrobianas podem incluir, por exemplo, estreptomicina, oxitetraciclina, soporolipídeos e ramnolipídeos.
[0087] A inoculação pode ocorrer em qualquer e/ou todos os tanques do reator, ponto em que 0 inóculo é misturado através dos sistemas de tubulação. Tempos de fermentação totais podem variar de 10 a 200 horas, de preferência de 20 a 180 horas.
[0088] A temperatura de fermentação utilizada nos presentes sistemas e métodos pode ser, por exemplo, de cerca de 25 a 40°C, embora 0 processo possa operar fora desta faixa. Em uma modalidade,
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26/49 o método de cultivo de microrganismos é realizado em cerca de 5o a cerca de 100°C, de preferência de 15° a 60°C, mais preferencialmente 25 a 50°C. Em outra modalidade, o cultivo pode ser realizado de forma contínua a uma temperatura constante. Em outra modalidade, o cultivo pode estar sujeito às mudanças de temperaturas.
[0089] O pH do meio deve ser adequado para o microrganismo de interesse. Sais de tamponagem e reguladores de pH como carbonatos e fosfatos, podem ser usados para estabilizar o pH próximo de um valor ideal. Quando íons metálicos estão presentes em concentrações elevadas, o uso de um agente quelante no meio líquido pode ser necessário.
[0090] Em certas modalidades, os microrganismos podem ser fermentados em uma faixa de pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0 e, mais especificamente, em uma faixa de pH de cerca de 3,0 a cerca de 7,0 (ao ajustar manualmente ou automaticamente o pH usando bases, ácidos e tampões; por exemplo, HCI, KOH, NaOH, H2SO4 e/ou H3PO4). A invenção também pode ser praticada fora dessa faixa de pH.
[0091] A fermentação pode começar em um primeiro pH (por exemplo, pH de 4,0 a 4,5) e, mais tarde, mudar para um segundo pH (por exemplo, pH de 3,2 a 3,5) para 0 restante do processo para ajudar a evitar a contaminação, bem como para produzir outros resultados desejáveis (0 primeiro pH pode ser maior ou menor do que 0 segundo pH). Em algumas modalidades, 0 pH é ajustado a partir de um primeiro pH para um segundo pH depois que um acúmulo desejado de biomassa é alcançado, por exemplo, de 0 horas a 200 horas após 0 início da fermentação, mais especificamente de 12 a 120 horas depois, mais especificamente de 24 a 72 horas depois.
[0092] Em uma modalidade, 0 teor de umidade do meio de cultura deve ser adequado para 0 microrganismo de interesse. Em uma outra modalidade, 0 teor de umidade pode variar de 20% a 90%,
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27/49 preferencialmente de 30 a 80%, mais preferencialmente de 40 a 60%. [0093] Os processos de cultivo da presente invenção podem ser anaeróbicos, aeróbicos ou uma combinação destes. De preferência, o processo é aeróbico, mantendo a concentração de oxigênio dissolvido acima de 10 ou 15% de saturação durante a fermentação, mas dentro de 20% em algumas modalidades, ou dentro de 30% em algumas modalidades.
[0094] Vantajosamente, o sistema proporciona oxigenação fácil da cultura crescente com, por exemplo, movimento lento de ar para remover o ar com baixo teor de oxigênio e introdução de ar oxigenado. O ar oxigenado pode ser ar ambiente suplementado periodicamente, como, por exemplo, diariamente.
[0095] Além disso, agentes antiespumantes também que podem ser adicionados ao sistema impedem a formação e/ou acumulação de espuma quando o gás é produzido durante o cultivo e a fermentação.
[0096] Em uma modalidade, a composição à base de micróbio não precisa ser processada depois da fermentação (por exemplo, leveduras, metabólitos, e demais fontes de carbono não precisam ser separadas dos soporolipídeos). As propriedades físicas do produto final (por exemplo, viscosidade, densidade, etc.) também podem ser ajustadas usando vários produtos químicos e materiais que são conhecidos na técnica.
[0097] Em uma modalidade, o meio de cultura usado no presente sistema pode conter nutrientes suplementares para o microrganismo. Normalmente, estes incluem fontes de carbono, proteínas, gorduras ou lipídios, fontes de nitrogênio, oligoelementos, e/ou fatores de crescimento (por exemplo, vitaminas, reguladores de pH). Será aparente para um profissional versado na técnica que a concentração de nutrientes, teor de umidade, pH, e similares pode ser modulada para otimizar o crescimento para um determinado micróbio.
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28/49 [0098] A fonte lipídica pode incluir óleos ou gorduras de origem animal ou vegetal que contêm ácidos graxos livres ou seus sais e seus ésteres, incluindo triglicerídeos. Exemplos de ácidos graxos incluem, mas não estão limitados a, ácidos graxos livres e esterificadas contendo de 16 a 18 átomos de carbono, fontes de carbono hidrofóbico, óleo de palma, gordura animal, óleo de coco, ácido oleico, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de canola, ácido palmítico e esteárico.
[0099] O meio de cultura do presente sistema pode incluir mais de uma fonte de carbono. A fonte de carbono é tipicamente um carboidrato, como glicose, xilose, sacarose, lactose, frutose, trealose, galactose, manose, manitol, sorbose, ribose e maltose; ácidos orgânicos, como ácido acético, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido propiônico, ácido málico, ácido malônico e ácido pirúvico; álcoois como etanol, propanol, butanol, pentanol, hexanol, eritritol, isobutanol, xilitol e glicerol; gorduras e óleos, como óleo de canola, óleo de soja, óleo de farelo de arroz, azeite, óleo de milho, óleo de gergelim e linhaça; etc. Outras fontes de carbono podem incluir arbutina, rafinose, gluconato, citrato, melaço, amido hidrolisado, extrato de batata, xarope de milho e material celulósico hidrolisado. As fontes de carbono acima podem ser usadas independentemente ou em combinação de duas ou mais.
[00100] Em uma modalidade, fatores de crescimento e traços de nutrientes para microrganismos são incluídos no meio do sistema. Isto é particularmente preferido quando cultivar os micróbios que são incapazes de produzir todas as vitaminas de que necessitam. Nutrientes inorgânicos, incluindo oligoelementos como ferro, zinco, potássio, cálcio, cobre, manganês, molibdênio e cobalto; fosforosos, como fosfatos; e outros componentes que estimulam o crescimento podem ser incluídos no meio de cultura dos presentes sistemas. Além disso, fontes de vitaminas, aminoácidos essenciais e microelementos podem ser incluídos, por exemplo, sob a forma de farinhas ou refeições, como
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29/49 farinha de milho, ou sob a forma de extratos, como extrato de levedura, extrato de batata, extrato de carne, extrato de soja, extrato de casca de banana e similares, ou em formas purificadas. Aminoácidos, como, por exemplo, aqueles úteis para a biossíntese de proteínas, também podem ser incluídos, por exemplo, L-alanina.
[00101] Em uma modalidade, os sais inorgânicos ou minerais também podem ser incluídos. Sais inorgânicos podem ser, por exemplo, di-hidrogenofosfato de potássio, fosfato di-hidrogênio de potássio, fosfato di-hidrogênio de sódio, sulfato de magnésio, cloreto de magnésio, sulfato ferroso, cloreto de ferro, sulfato de manganês, cloreto de manganês, sulfato de zinco, sulfato de cobre, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, carbonato de cálcio, carbonato de sódio. Esses sais inorgânicos podem ser usados independentemente ou em uma combinação de dois ou mais.
[00102] O meio de cultura do presente sistema pode incluir ainda uma fonte de nitrogênio. A fonte de nitrogênio pode ser, por exemplo, em uma forma inorgânica como nitrato de potássio, nitrato de amônio, sulfato de amônio, nitrato de amônio, fosfato de amônio, amônia, ureia e cloreto de amônio, ou uma forma orgânica como proteínas, aminoácidos, extratos de levedura, autolisatos de levedura, peptona de milho, caseína hidrolisada e proteína de soja. Essas fontes de nitrogênio podem ser usadas independentemente ou em uma combinação de duas ou mais.
[00103] Os micróbios podem ser cultivados em forma planctônica, ou como biofilme. No caso de biofilme, o recipiente pode ter dentro de si um substrato sobre o qual os micróbios podem ser cultivados em um estado de biofilme. O sistema também pode ter, por exemplo, a capacidade de aplicar estímulos (como tensão de cisalhamento), que estimula e/ou melhora as características de crescimento do biofilme.
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Preparação de produtos à base de micróbios [00104] Produtos à base de micróbios da presente invenção incluem produtos compreendendo os micróbios e/ou subprodutos de crescimento microbiano e, opcionalmente, o meio de crescimento e/ou ingredientes adicionais como, por exemplo, água, carreadores, adjuvantes, nutrientes, modificadores de viscosidade e outros agentes ativos.
[00105] Um produto à base de micróbios da presente invenção é simplesmente o meio de fermentação contendo o microrganismo e/ou os subprodutos de crescimento microbiano produzidos pelo microrganismo e/ou quaisquer nutrientes residuais. O produto de fermentação pode ser usado diretamente sem extração ou purificação. Se desejar, extração e purificação podem ser facilmente obtidas usando métodos ou técnicas de extração padrão conhecidos pelos versados na técnica.
[00106] Os microrganismos nos produtos à base de micróbios podem estar em uma forma ativa ou inativa e/ou sob a forma de células vegetativas, esporos, micela, conídios e/ou qualquer forma de propágulos microbianos. Os produtos à base de micróbios podem ser usados sem estabilização, preservação e armazenamento posterior. Vantajosamente, o uso direto destes produtos à base de micróbios preserva uma alta viabilidade dos microrganismos, reduz a possibilidade de contaminação por agentes externos e microrganismos indesejáveis, e mantém a atividade dos subprodutos de crescimento microbiano.
[00107] Os micróbios e/ou meio resultante do crescimento microbiano podem ser removidos do recipiente de crescimento e transferidos através de, por exemplo, tubulação para uso imediato.
[00108] Em outras modalidades, a composição (micróbios, meio ou micróbios e meio) pode ser colocada em recipientes de tamanho
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31/49 adequado, levando em consideração, por exemplo, a o uso pretendido, o método de aplicação contemplado, o tamanho do tanque de fermentação, e qualquer modo de transporte da instalação do crescimento do micróbio para o local de uso. Assim, os recipientes em que a composição à base de micróbio é colocada podem ser, por exemplo, de 1 galão a 1.000 galões ou mais. Em outras modalidades, os recipientes são 2 galões, 5 galões, 25 galões, ou maior.
[00109] Após a colheita da composição à base de micróbios dos recipientes de crescimento, novos componentes podem ser adicionados uma vez que o produto colhido é colocado em recipientes e/ou tubulados (ou transportados para uso). Os aditivos podem ser, por exemplo, tampões, carreadores, outras composições à base de micróbios produzidas na mesma ou em diferente instalação, modificadores de viscosidade, conservantes, nutrientes para crescimento de micróbios, nutrientes para crescimento de planta, agentes de rastreamento, pesticidas, herbicidas, ração animal, produtos alimentares e outros ingredientes específicos para um uso pretendido.
[00110] Vantajosamente, de acordo com a presente invenção, o produto à base de micróbios pode incluir caldo em que os micróbios foram cultivados. O produto pode ser, por exemplo, pelo menos, em peso, 1%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% ou 100% de caldo. A quantidade de biomassa no produto, em peso, pode ser, por exemplo, qualquer uma de 0% a 100%, incluindo todas as percentagens entre elas.
[00111] Opcionalmente, o produto pode ser armazenado antes do uso. O tempo de armazenamento é de preferência curto. Assim, o tempo de armazenamento pode ser inferior a 60 dias, 45 dias, 30 dias, 20 dias, 15 dias, 10 dias, 7 dias, 5 dias, 3 dias, 2 dias, 1 dia ou 12 horas. Em uma modalidade preferida, se células vivas estiverem presentes no produto, o produto é armazenado a uma temperatura fresca, como, por exemplo, menos de 20°C, 15°C, 10°C ou 5°C. Por outro lado, uma
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32/49 composição de biotensoativos geralmente pode ser armazenada em temperatura ambiente.
[00112] Os produtos à base de micróbios da presente invenção podem ser, por exemplo, inoculantes microbianos, biopesticidas, fontes de nutrientes, agentes de remediação, produtos de saúde e/ou de biotensoativos.
[00113] Em uma modalidade, os produtos de fermentação (por exemplo, microrganismos e/ou metabólitos) obtidos após o processo de cultivo são tipicamente de alto valor comercial. Os produtos contendo microrganismos têm teor de nutrientes potencializado do que aqueles produtos deficientes em microrganismos. Os microrganismos podem estar presentes no sistema de cultivo, no caldo de cultivo e/ou na biomassa de cultivo. O caldo de cultivo e/ou a biomassa pode ser secado (por exemplo, secado por atomização) para produzir os produtos de interesse.
[00114] Em uma modalidade, os produtos de cultivo podem ser preparados como um produto de biomassa secado por atomização. A biomassa pode ser separada por métodos conhecidos, como centrifugação, filtração, separação, decantação, uma combinação de separação e decantação, ultrafiltração ou microfiltração. Os produtos de cultivo de biomassa podem ser tratados para facilitar o desvio do rúmen. O produto de biomassa pode ser separado do meio de cultivo, secado por atomização e, opcionalmente, tratado para modular o desvio do rúmen, e adicionado à alimentação como uma fonte nutricional.
[00115] Em uma modalidade, os produtos de cultivo podem ser usados como uma ração animal ou como suplemento alimentar para os humanos. Os produtos de cultivo podem ser ricos em, pelo menos, uma ou mais das gorduras, ácidos graxos, lipídios, como fosfolípides, vitaminas, aminoácidos essenciais, peptídeos, proteínas, carboidratos, esteróis, enzimas, e minerais traço, como ferro, cobre, zinco, manganês,
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33/49 cobalto, iodo, selênio, molibdênio, níquel, flúor, vanádio, estanho e silício. Os peptídeos podem conter, pelo menos, um aminoácido essencial.
[00116] Em outras modalidades, os aminoácidos essenciais são encapsulados dentro de um microrganismo modificado usado na reação de cultivo. Os aminoácidos essenciais estão contidos em polipeptídeos heterólogos expressados pelo microrganismo. Quando desejado, os peptídeos heterólogos são expressados e armazenados nos corpos de inclusão em um microrganismo adequado (por exemplo, fungos).
[00117] Em uma modalidade, os produtos de cultivo têm um alto teor nutritivo. Como resultado, uma maior percentagem dos produtos de cultivo pode ser usada em uma alimentação animal completa. Em uma modalidade, a composição da alimentação compreende os produtos de cultivo modificados variando de 15% da alimentação para 100% da alimentação.
[00118] A presente invenção fornece materiais e métodos para a produção de biomassa (por exemplo, material celular viável), metabolitos extracelulares (por exemplo, pequenas e grandes moléculas), e/ou componentes intracelulares (por exemplo, enzimas e outras proteínas). Os micróbios e os subprodutos de crescimento microbiano da presente invenção também podem ser usados para a transformação de um substrato, como um minério, em que o substrato transformado é o produto.
[00119] A presente invenção fornece produtos à base de micróbios, bem como usos para estes produtos para alcançar resultados benéficos em muitas configurações, incluindo, por exemplo, biorremediação melhorada, mineração e produção de óleo e gás; eliminação e tratamento de resíduos; melhor saúde do gado e outros animais; e melhor saúde e produtividade das plantas mediante a aplicação de um ou mais dos produtos à base de micróbios.
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34/49 [00120] Em modalidades específicas, os sistemas da presente invenção fornecem soluções à base de ciência que melhorar a produtividade agrícola, por exemplo, promovendo a vitalidade da cultura; reforçando a produtividade das culturas; reforçando as respostas imunes de plantas; reforçando a resistência a doenças, insetos e pragas; controlando insetos, nematoides, doenças e plantas daninhas; melhorando a nutrição de plantas; melhorando o conteúdo nutricional de solos agrícolas, florestais e de pastagem; e promovendo um melhor e mais eficiente uso da água.
[00121] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para melhorar a saúde das plantas e/ou aumentar a produtividade da cultura, aplicando a composição apresentada aqui ao solo, semente ou partes da planta. Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para aumentar o rendimento da cultura ou planta compreendendo várias aplicações da composição descritas aqui. [00122] Vantajosamente, o método pode efetivamente controlar nematoides e as respectivas doenças causadas por parasitas, enquanto um aumento de produtividade é alcançado, e os efeitos colaterais e custos adicionais são evitados.
[00123] Em outra modalidade, o método para a produção de subprodutos de crescimento microbiano pode ainda incluir etapas de concentração e purificação do subproduto de interesse.
[00124] Em uma modalidade, a presente invenção fornece ainda uma composição compreendendo pelo menos um tipo de microrganismo e/ou pelo menos um subproduto de crescimento microbiano produzido pelo dito microrganismo. Os microrganismos na composição podem estar em uma forma ativa ou inativa e/ou sob a forma de células vegetativas, esporos, micela, conídios e/ou qualquer forma de propágulos microbianos. A composição pode ou não compreender a matriz de crescimento em que os micróbios foram
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35/49 cultivados. A composição também pode ser em uma forma seca ou em uma forma líquida.
[00125] Em uma modalidade, a composição é adequada para a agricultura. Por exemplo, a composição pode ser usada para tratar o solo, as plantas e as sementes. A composição também pode ser usada como um pesticida.
[00126] Em uma modalidade, a presente invenção fornece customizações para os materiais e métodos de acordo com as necessidades locais. Por exemplo, o método de cultivo de microrganismos pode ser usado para crescer os microrganismos localizados no solo local ou em um poço de óleo específico ou local de poluição. Em modalidades específicas, os solos locais podem ser usados como substratos sólidos no método de cultivo para fornecer um ambiente de crescimento nativo. Vantajosamente, esses microrganismos podem ser benéficos e mais adaptáveis às necessidades locais.
[00127] O método de cultivo, de acordo com a invenção, não só aumenta substancialmente o rendimento de produtos microbianos por unidade de meio de nutriente, mas também melhora a simplicidade da operação de produção. Além disso, o processo de cultivo pode eliminar ou reduzir a necessidade de concentrar os microrganismos após finalizar a fermentação.
[00128] Vantajosamente, o método não exige equipamento complicado ou consumo de energia alto, e reduz, assim, os custos de capital e trabalho da produção de microrganismos e seus metabólitos em grande escala.
Subprodutos de Crescimento Microbiano [00129] Os métodos e sistemas da presente invenção podem ser usados para produzir subprodutos de crescimento microbiano úteis, como, por exemplo, biotensoativos, enzimas, ácidos, biopolímeros, solventes e/ou outros metabólitos microbianos. Em modalidades
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36/49 específicas, o subproduto de crescimento é um biotensoativo. Ainda mais especificamente, o subproduto de crescimento pode ser um biotensoativo selecionado a partir de surfactina, soporolipídeos (SLPs), ramnolipídeos (RLPs) e lipídios manosileritritol (MELs).
[00130] Biotensoativos são um grupo estruturalmente diversificado de substâncias de superfície ativa produzidos por microrganismos. Os biotensoativos são biodegradáveis e podem ser facilmente e produzidos de forma barata através de organismos selecionados em fontes de substratos. A maioria dos organismos produtores de biotensoativos produzem biotensoativos em resposta à presença de uma fonte de hidrocarboneto (por exemplo, óleos, açúcar, glicerina, etc.) no meio de cultura. Outros elementos do meio, como concentração de ferro, também podem afetar significativamente a produção de biotensoativo. Por exemplo, a produção de RLPs pela bactéria Pseudomonas aeruginosa pode ser aumentada se o nitrato for usado como fonte de nitrogênio ao invés de amônio. Também a concentração de ferro, magnésio, sódio e potássio; a razão de carbono:fósforo; e a agitação podem afetar muito a produção de ramnolipídeos.
[00131] Todos os biotensoativos são anfifilos. Eles consistem de duas partes: uma porção polar (hidrofílica) e grupo não polar (hidrofóbico). Devido à sua estrutura anfifílica, os biotensoativos aumentam a área de superfície de substâncias insolúveis em água hidrofóbicas, aumentam a biodisponibilidade de tais substâncias, e alteram as propriedades das superfícies de células bacterianas.
[00132] Os biotensoativos incluem glicolipídieos de baixo peso molecular (por exemplo, ramnolipídeos, soporolipídeos, manosileritritol), lipopeptídeos (por exemplo, surfactina), flavolipídeos, fosfolipídeos e polímeros de alto peso molecular, como lipoproteínas, complexos lipopolissacarídeo-proteína e complexos polissacarídeo-proteínaácidos graxos. A porção lipofílica comum de uma molécula de
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37/49 biotensoativo é a cadeia de hidrocarboneto de um ácido graxo, enquanto a parte hidrofílica é formada por grupos de éster ou álcool de lipídios neutros, ou peptídeos), ácido orgânico no caso de flavolipídeo, ou, no caso de glicolipídeo, pelo carboidrato.
[00133] Os biotensoativos microbianos são produzidos por uma variedade de microrganismos, como bactérias, fungos e leveduras. Os microrganismos produtores de biotensoativo exemplares incluem Pseudomonas species (P. aeruginosa, P. putida, P. florescens, P. fragi, P. syringae); Flavobacterium spp.; Bacillus spp. (B. subtilis, B. pumillus, B. cereus, B. licheniformis); Wickerhamomyces spp., Candida spp. (C. albicans, C. rugosa, C. tropical is, C. lipolytica, C. torulopsis); Rhodococcus spp.; Arthrobacter spp.; campylobacter spp.; cornybacterium spp.; Pichia spp.; Starmerella spp.; e assim por diante. Os biotensoativos podem ser obtidos por processos de fermentação conhecidos na técnica.
[00134] Outras cepas microbianas, incluindo, por exemplo, outras cepas de fungos capazes de acumular quantidades significativas de glicolipídeo-biotensoativo, por exemplo, e/ou cepas de bactérias capazes de acumular quantidades significativas de surfactina, por exemplo, podem ser usadas de acordo com a presente invenção. Outros metabólitos úteis de acordo com a presente invenção incluem
manoproteína, beta-glucano e outros bioquímicos que têm
bioemulsificação e propriedades de redução de tensão de
superfície/interfacial.
[00135] Em uma modalidade da presente invenção, os
biotensoativos produzidos pelos presentes sistemas incluem surfactina e glicolipídeos como ramnolipídeos (RLP), soporolipídeos (SLP), lipídios trealose ou lipídeos manosileritritol (MEL). Em modalidades específicas, o presente sistema é usado para produzir SLPs e/ou MELs em grande escala.
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38/49 [00136] Soporolipídeos são glicolipídeo biotensoativos produzidos por, por exemplo, diversas leveduras do ciado Starmerella. Entre leveduras do ciado Starmerella que foram examinadas, o maior rendimento de soporolipídeos tem sido relatado de Candida apicola e Starmerella bombicola. SLPs consistem de um dissacarídeo sacarose ligado aos ácidos graxos hidróxi de cadeia longa. Estes SLPs são uma unidade parcialmente acetilada 2-O-p-D-glicopiranosil-D-glucopiranose conectada β-glicosidicamente ao ácido 17-L-hidroxioctadecanóico ou 17-L-hidroxi-A9-octadecenóico. O ácido graxo hidróxi é geralmente 16 ou 18 átomos de carbono, e pode conter uma ou mais ligações insaturadas. O grupo carboxila do ácido graxo pode ser livre (ácido ou de forma aberta) ou internamente esterificado na posição 4 (lactona lactona).
[00137] Lipídios manosileritritol são uma classe de glicolipídeo de biotensoativos produzidos por uma variedade de cepas de fungos e leveduras. Produção de MEL eficaz é limitada principalmente ao gênero Pseudozyma, com significativa variabilidade entre as estruturas MEL produzidas por cada espécie. MELs contêm 4-O-b-D-manopiranosileritritol como sua porção de açúcar ou uma unidade hidrofílica. De acordo com o grau de acetilação nas posições 04' e 06' em manopiranosil, os MELs são classificados como MEL-A, MEL-B, MEL-C e MEL-D. MEL-A representa o composto diacetilado, enquanto MEL-B e MEL-C são monoacetilados em 06' e 04', respectivamente. A estrutura completamente desacetilada é atribuída a MEL-D. Fora de Pseudozyma, uma cepa isolada recentemente, Ustilago scitaminea, tem mostrado exibir uma produção abundante de MEL-B a partir de caldo de cana de açúcar. MELs agem como hidratantes tópicos eficazes e podem reparar o cabelo danificado. Além disso, estes compostos têm mostrado exibir ambas as atividades de proteção e de cura, para ativar os fibroblastos e células da papila, e para agir como antioxidantes naturais.
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39/49 [00138] Devido à estrutura e composição dos SLPs e MELs, estes biotensoativos têm excelentes propriedades de redução de tensão de superfície e interfacial, bem como outras propriedades bioquímicas benéficas, o que pode ser útil em aplicações como usos industrial em grande escala e de agricultura e em outros campos, incluindo, mas não limitado a, cosméticos, produtos de uso doméstico, e campos de saúde, médicos e farmacêuticos.
[00139] Os biotensoativos se acumulam nas interfaces, reduzindo assim a tensão interfacial e levando à formação de estruturas micelulares agregadas na solução. Biotensoativos microbianos seguros e eficazes reduzem a tensões superficiais e interfaciais entre as moléculas de líquidos, sólidos e gases. A capacidade de biotensoativos para formar poros e desestabilizar as membranas biológicas permite seu uso como agentes antibacterianos, antifúngicos e hemolíticos. Combinado com as características de baixa toxicidade e biodegradabilidade, os biotensoativos são vantajosos para o uso na indústria de óleo e gás para uma grande variedade de aplicações da indústria de petróleo, como recuperação de óleo potencializada por micróbios. Estas aplicações incluem, mas não estão limitadas a, reforço da recuperação de óleo cru de uma formação contendo óleo; estimulação de poços de óleo e gás (para melhorar o fluxo de óleo para dentro do furo do poço); remoção de contaminantes e/ou obstruções, como parafinas, asfaltenos e escala de equipamentos, como barras, tubos, forros, tanques e bombas; prevenção da corrosão de produção de óleo e gás e material de transporte; redução da concentração de H2S em óleo cru e gás natural; redução da viscosidade do óleo cru; aprimoramento de óleos crus pesados e asfaltenos em frações de hidrocarbonetos mais leves; limpeza de tanques, linhas de fluxo e tubulações; reforçamento de mobilidade de óleo durante a inundação de água através de plugues seletivos e não-seletivos, e fraturamento de fluidos.
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40/49 [00140] Quando usado em aplicações de óleo e gás, os sistemas da presente invenção podem ser usados para diminuir o custo de composições de campos petrolíferos à base de micróbios e podem ser usados em combinação com outros produtos potencializadores químicos, como polímeros, solventes, areia de fraturamento e grânulos, emulsificantes, tensoativos e outros materiais conhecidos na técnica.
[00141] Os biotensoativos produzidos de acordo com a presente invenção podem ser usados para outros fins de recuperação de óleo, incluindo, por exemplo, limpeza de tubos, reatores, e outras máquinas ou superfícies, bem como o controle de pragas, por exemplo, quando aplicados às plantas e/ou ao seu ambiente circundante. Alguns biotensoativos produzidos de acordo com a presente invenção podem ser usados para o controle de pragas, porque eles são capazes de penetrar através dos tecidos das pragas e são eficazes em baixas quantidades sem o uso de adjuvantes. Verificou-se que em concentrações acima da concentração de micela crítica, os biotensoativos são capazes de penetrar de forma mais eficaz em objetos tratados.
[00142] As pragas podem ser controladas usando organismos produtores de biotensoativo como um agente de biocontrole ou pelo próprio biotensoativo. Além disso, p controle de pragas pode ser atingido através do uso de substratos específicos para suportar o crescimento de organismos produtores de biotensoativo, bem como para a produção de agentes pesticidas biotensoativos. Vantajosamente, os biotensoativos naturais são capazes de inibir o crescimento de organismos concorrentes e aumentar o crescimento de organismos específicos produtores de biotensoativos.
[00143] Além disso, estes biotensoativos podem desempenhar um papel importante no tratamento de doenças humanas e animais. Os
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41/49 animais podem ser tratados, por exemplo, por imersão ou banhando-se em uma solução de biotensoativo sozinho, com ou sem massa de células microbianas, e/ou na presença de outros compostos, tais como o cobre ou zinco.
[00144] As composições produzidas de acordo com a presente invenção tem vantagens sobre os biotensoativos sozinhos devido ao uso de toda a cultura de células, incluindo: altas concentrações de manoproteína como parte da superfície externa da parede celular de levedura (manoproteína é um biotensoativo altamente eficaz, capaz de atingir até 80% de índice de emulsificação); a presença de biopolímero beta-glucano (um emulsificador) nas paredes celulares de levedura; a presença de soporolipídeos na cultura, que é um poderoso biotensoativo capaz de reduzir tanto a tensão superficial como interfacial; e a presença de metabólitos (por exemplo, ácido lático, etanol, etc.) na cultura. Essas composições podem, entre muitos outros usos, agir como biotensoativos e podem ter propriedades de redução de tensão superficial/ interfacial.
[00145] O cultivo de biostensoativos microbianos de acordo com a técnica anterior é um processo complexo, que consome tempo e recursos, que requer várias etapas. A presente invenção fornece equipamentos, aparelhos, métodos e sistemas que simplificam e reduzem o custo deste processo. A presente invenção também fornece novas composições e usos dessas composições.
EXEMPLOS [00146] Uma maior compreensão da presente invenção e das suas muitas vantagens podem ser a partir de exemplos a seguir, dados a título de ilustração. Os exemplos a seguir são ilustrativos de alguns dos métodos, aplicações, modalidades e variantes da presente invenção. Não devem ser considerados como limitando a invenção. Inúmeras alterações e modificações podem ser feitas em relação à invenção.
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EXEMPLO 1- SISTEMA DE FERMENTAÇÃO MULTI-TANQUE [00147] Um reator de plástico portátil e distribuível foi construído como mostrado nas Figuras 1 e 2. O reator tem dois tanques quadrados de plástico com dois laços para troca de massa entre os dois tanques.
[00148] A parte superior do sistema foi equipado com um mecanismo de bombeamento para puxar de um primeiro tanque e depositar em um segundo tanque, que representa um dos laços. O outro laço estava no fundo do tanque e contou com a pressão hidrostática para igualar os volumes nos tanques.
[00149] A adição de ar filtrado para os tanques foi controlada por um mecanismo de pulverização que corria através de um borbulhador. O ar filtrado para pulverização foi gerado através de um sistema de bombeamento aquático de alto volume. Havia dois borbulhadores 182 cm por tanque, resultando em um total de quatro por sistema. Um compressor de ar também foi usado para adicionar o ar filtrado nos laços superiores e inferiores para aeração extra.
[00150] O laço superior foi equipado com um visor de vidro, para permitir a visualização da turbidez, cor, espessura e outras características da cultura. O reator tinha um volume de trabalho de 750 - 850 L para o cultivo de levedura Starmerella para produção de células e metabólito (no entanto, o tamanho e a escala podem variar, dependendo da aplicação necessária). O reator é particularmente bem adequado para a produção em massa de levedura do ciado Starmerella em pequenas ou grandes escalas.
[00151] A fim de reduzir ainda mais o custo de produção da cultura e garantir a escalabilidade da tecnologia, o sistema não foi esterilizado usando os métodos tradicionais. Em vez disso, um método de sanitização de recipiente vazio foi usado que incluiu tratamento de superfícies internas com 2 -3% de peróxido de hidrogênio e lavagem
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43/49 com água sanitária e água quente de alta pressão. Além disso, para reduzir a possibilidade de contaminação, a água usada para preparar a cultura foi filtrada através de um filtro de 0,1 mícron.
[00152] Os componentes do meio de cultura foram descontaminados por temperatura entre 85-90°C ou dissolvidos em peróxido de hidrogênio a 3% (razão de componentes secos e H2O é 1:3 v/v), com exceção do óleo, que só foi descontaminado por temperatura.
[00153] A temperatura de fermentação normalmente deve ser entre cerca de 23 a 37°C, e, de preferência, entre cerca de 25 a 30°C.
[00154] O pH deve ser de cerca de 3 a 5, e, de preferência, entre cerca de 3,5 a cerca de 4,5. Além disso, a fim de reduzir ainda mais a possibilidade de contaminação, o processo de cultura começou em um pH de 4,0 a 4,5 e, em seguida, foi ainda conduzido em pH médio de 3,2 a 3,5.
[00155] Nestas condições de cultivo, produção industrialmente útil de biomassa, soporolipídeos e outros metabólitos foi alcançada a partir de cerca de 60 a cerca de 120 horas de fermentação. Após a conclusão da fermentação, a cultura pode, então, ser aplicada a uma variedade de fins industriais.
EXEMPLO 2- MIO DE CULTURA E SEU USO PARA O CULTIVO DE STARMERELLA EM REATOR MULTITANQUE [00156] Um meio composto de 20 - 100 gL-1 de glicose, 0 - 50 gL-1 (que pode mudar, por exemplo, dependendo da quantidade desejada de biotensoativo a ser produzido) de óleo de canola, 5 gL-1 de extrato de levedura, 4 gL·1 de NH4CI, 1 gL·1 de KH2PO4.H2O, 0,1 gL·1 de NaCI e 0,5 gL-1 de MgSO4.7H2O foi preparado em água filtrada.
[00157] O pH inicial foi ajustado para cerca de 4,5 com 6N KOH. As culturas foram cultivadas em cerca de 25°C. Os tempos de cultivo foram até 120 h e o pH das culturas do reator foi ajustado para cerca de 3,5 duas vezes ao dia pela adição de 1,0M NaOH.
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44/49 [00158] Nessas condições de cultivo, a quantidade de biomassa úmida de Starmerella chegou até 100 gramas por litro de cultura.
EXEMPLO 3- PREPARAÇÃO DA CULTURA DE SEMENTE USANDO ANTIBIÓTICOS [00159] A seguir é um exemplo de um método para a preparação em escala de produtos à base de micróbios de acordo com a presente invenção. Uma cultura de sementes pode ser preparada e, em seguida, escalonada para uso nos presentes sistemas. O escalonamento pode ocorrer em um recipiente separado, por exemplo, adicionando os reagentes a um misturador de tambor, e permitindo que a cultura cresça por 2 ou mais dias. Após a cultura de sementes ter sido deixada crescer por pelo menos 2 dias no misturador, a cultura pode ser dividida em um número adequado de porções para inoculação de qualquer número dos presentes sistemas de reatores.
Composição do meio
Reagente Peso (g/L)
Extrato de levedura 5
Glicose 100
Ureia 1
Estreptomicina (antibiótico) 0,1
Oxitetraciclina (antibiótico) 0,01
Frascos de Agitação [00160] Dois litros da composição do meio foram preparados sem os antibióticos em frascos de 4L. Os frascos foram, então, preparados por autoclavagem. Um pedaço de pano de queijo, seguido por um pedaço de papel de autoclave azul, foi fixado ao aro dos frascos com uma faixa de borracha. (O pano de queijo e o papel azul devem ser grande o suficiente para que o pano e o papel se estendam onde o elástico de borracha prende os pedaços do aro). Os ciclos de autoclave ocorreram
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45/49 a 121°C por 20 minutos e, em seguida, os frascos foram deixados arrefecer a 30°C ou inferior.
[00161] Em seguida, os antibióticos foram pesados e dissolvidos com água Dl em um béquer ou um tubo cônico de 50 ml_. As placas de ágar foram marcadas com C. bombicola ou S. bombicola. Colônias individuais foram selecionadas a partir da placa com um laço (um a dois laços devem ser suficientes), praticando a técnica asséptica, e os frascos foram inoculados sob o capô no laboratório. Os antibióticos dissolvidos também foram adicionados aos frascos. Ao remover e substituir o pano de queijo e o papel azul de autoclave sob o capô, tomou-se o cuidado para não tocar a parte inferior do pano de queijo que foi exposta para dentro do frasco.
[00162] Uma vez que os frascos de 4L foram inoculados, eles foram colocados em agitadores em uma sala de fermentação. A temperatura dos agitadores foi definida para 30°C. Os frascos foram deixados fermentar durante pelo menos 2 dias antes do uso da cultura de sementes. Amostras do inóculo da cultura de sementes foram realizadas sob um capô antes do uso para garantir que o inóculo era puro e sem contaminação. Lâminas das amostras foram feitas usando mancha gram simples.
Dimensionamento usando o misturador de tambor [00163] Após a cultura de sementes ser deixada crescer por 2 dias, a cultura de sementes foi dimensionada em um misturador de tambor preto para inoculação dos reatores. Ingredientes secos de lote de 40L dos reagentes listados acima foram pesados. Os antibióticos foram pesados e mantidos em um recipiente separado.
[00164] Os componentes do meio foram dissolvidos em garrafões de 40L, garantindo que o volume não excedesse o nível de 40L. Os 40L de meio foram adicionados ao misturador, seguido de 2L de inóculo dos agitadores e a quantidade apropriada de antibióticos dissolvidos. A
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46/49 cultura foi, em seguida, deixada crescer por pelo menos 2 dias no misturador antes de porções serem transferidas para os reatores. A quantidade de cultura em porções individuais em cada cubículo dependia de quantos litros de cultura foram produzidos e o número de cubículos para ser iniciados. Cada reator foi dado pelo menos 10L da cultura.
[00165] A cultura escalonada foi colhida usando uma bomba de tambor em garrafões de 20L ou 40L, dependendo de quanto volume de cultura foi necessário por reator. A cultura foi então transferida para os garrafões com a mesma bomba de tambor e os reatores foram inoculados.
Limpeza do Misturador de Tambor [00166] Após a colheita de toda a cultura para fora do misturador de tambor, o misturador foi movido para um dreno enxaguado com água quente, tendo o cuidado de remover qualquer biofilme. Depois de enxaguar bem, 70% IPA foi usado para esterilizar o reator. O misturador foi deixado secar, e quando não havia sobrado nenhum IPA residual, outro lote de cultura de sementes podería começar.
EXEMPLO 3 - OPERAÇÃO DO REATOR MULTITANQUE USANDO UM MEIO DE CULTURA COMPREENDENDO ANTIBIÓTICOS [00167] Meios de cultura
Reagente Peso (g/L)
Ureia 1
Extrato de levedura 5
Glicose 60
Óleo de canola 70 ml/L
Estreptomicina (antibiótico) 0,1
Oxitetraciclina (antibiótico) 0,01
Preparação do Reator Multitanque [00168] O volume total do reator de dois tanques foi de 750L, então
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47/49 a quantidade adequada dos reagentes acima foi determinada e pesada. Ingredientes secos foram dissolvidos em um barril com água filtrada. Óleo de canola não foi adicionado durante a etapa de dissolução. Os antibióticos foram mantidos separados, e dissolvido em água Dl num grande béquer.
[00169] A seguir, o meio dissolvido foi adicionado ao reator. O reator foi preenchido até ~185 galões total com água filtrada, seguido pelo óleo de canola. O volume final foi de 100 galões em cada tanque, o que equivale a 200 galões no total.
[00170] A temperatura inicial foi de pelo menos 23°C, mas não superior a 30°C. Assim que a temperatura foi estabelecida na faixa de 23 a 30°C, o inóculo foi adicionado no misturador, seguido por antibióticos dissolvidos. As amostras foram tomadas para medir o pH e DO%. A cultura foi deixada crescer para um mínimo de ~3 dias, monitoramento de pH, temperatura e DO% pelo menos uma vez por dia. Uma vez que o cubo estava pronto para a colheita, a amostra foi tirada para medir o pH.
[00171] Foi feita uma lâmina, uma placa serial diluída foi feita, e uma medição de OD foi realizada para o controle/garantia de qualidade. DO e temperatura também foram medidos. Uma vez que a qualidade da cultura foi assegurada, a cultura foi colhida usando um encaixe de camlock na parte inferior do laço e uma bomba de transferência equipada com dois conjuntos de mangueiras.
[00172] No caso em que a qualidade do lote de cultura foi imprópria para uso, meia garrafa de alvejante foi derramada entre os dois tanques do reator, deixando em descanso por 20 minutos e, em seguida, esvaziado.
Limpeza do reator [00173] Primeiro, os tanques do reator foram lavados. O reator foi desligado da tomada, ambas as válvulas de esfera inferior foram
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48/49 desligadas, e o laço inferior do conjunto foi removido ao desconectar os encaixes camlock, Cuidado foi tomado para não deixar muito derramamento de meio ao tirar fora o laço do fundo. Com o laço removido, uma praleteira foi usada para transferir o reator para um dreno no armazém.
[00174] O laço superior foi removido e os componentes do laço inferior foram lavados com água quente. Se estes laços ou seus componentes estavam excessivamente sujos, um desinfetante foi usado para limpá-los completamente. Em seguida, os tanques foram lavados com água quente e o bico de pulverização sobre a mangueira no armazém perto do dreno. Cuidado foi tomado para remover qualquer filme dentro dos tanques.
[00175] Em seguida, o interior dos tanques foi pulverizado com peróxido de hidrogênio a 3% (H2O2) por pelo menos 3 a 5 minutos. Vestindo EPI foi crucial para esta etapa.
[00176] Observação: Se a contaminação foi preocupante, 0 reator foi transferido de volta para sua posição de funcionamento e os tanques cheios com solução de peróxido de hidrogênio 0,5%. O volume total do reator foi de cerca de 1100 L, então cerca de 55L de peróxido de hidrogênio a 10% foi necessário. O laço inferior foi remontado e a unidade ligada. O reator foi deixado pelo menos 4 horas para limpar-se cuidadosamente com 0 peróxido de hidrogênio a 0,5%. Uma vez que pelo menos 2 horas tinham decorrido, a unidade foi desativada. As válvulas de esfera do laço inferior foram desligadas, e 0 laço inferior desligado. Uma praleteira foi usada para transferir a unidade para 0 dreno para drenagem.
[00177] Então 0 reator foi lavado completamente com água filtrada (de preferência quente) e estava pronto para outro lote para começar. EXEMPLO 4 - LIQUEFAÇÃO DE PARAFINA [00178] Um experimento foi conduzido para mostrar a eficácia de
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49/49 uma cultura Starmerella na liquefação de parafina. Os resultados do experimento podem ser vistos na Figura 2, e os resultados de uma cultura são marcados como Star3.
[00179] Vinte e um (21) produtos de emulsificação químicos e microbianos (inclusive comerciais) foram investigados para eficácia de degradação de parafina. Tubos Falcon de cinquenta (50) ml_ com um volume de trabalho de 25 ml_ foram utilizados no experimento. Parafina sólida foi obtida a partir de um campo de petróleo. Quatro (4,0) gramas de parafina sólida foram pesados e, em seguida, adicionados em cada tubo Falcon e 20 ml_ de cada líquido da Tabela 1 foram adicionados aos tubos Falcon. Todos os tubos Falcon foram, então, colocados horizontalmente em uma incubadora ENVIRO GENE a 30°C a 40°C e cuidadosamente misturados. Após diferentes tempos de incubação (1, 2 ou 4 dias), os tubos foram coletados e analisados.
[00180] Três (3) conjuntos de experimentos foram realizados em diferentes tempos de incubação e diferentes temperaturas. O primeiro conjunto de experimentos foi realizado a 30°C. Neste conjunto de experimentos, Star3 continha S. bombicola com cerca de 4g/L de soporolipídeo (que é aproximadamente o nível de saturação). O tratamento Star3 mostrou completa difusão dentro dos tubos, e foi o único aditivo para transformar completamente a parafina em líquido, enquanto a parafina manteve forma sólida em todos os outros testes (incluindo Naxan comercial). Esta prova de experiência de conceito mostrou que uma cultura de Starmerella pode ser altamente eficaz para liquefação de parafina, e até mesmo superior a outros agentes biológicos e químicos disponíveis comercialmente.

Claims (27)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Sistema para produzir uma composição à base de micróbios caracterizado pelo fato de que compreende:
    um reator compreendendo um primeiro tanque e um segundo tanque;
    uma bomba tendo uma entrada conectada ao primeiro tanque através de um primeiro tubo, e uma saída conectada ao segundo tanque através de um segundo tubo;
    um terceiro tubo conectando do segundo tanque para o primeiro tanque em que o dito terceiro tubo é adequado para permitir que o líquido flua sob pressão hidrostática do segundo tanque para o primeiro tanque.
  2. 2. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um ou mais ventiladores de ar ou compressores de ar, onde um ou mais ventiladores de ar ou compressores de ar são conectados a um ou mais injetores de gás, borbulhadores e/ou aspersores.
  3. 3. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o reator tem um volume de trabalho de 10 a 40 mil galões.
  4. 4. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende uma estrutura para suportar os componentes do sistema.
  5. 5. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende rodas e cabos para manusear o sistema.
  6. 6. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o sistema é configurado na parte de trás de um reboque do caminhão e/ou semirreboque, e/ou onde o sistema é portátil.
  7. 7. Sistema, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma ou mais bombas são capazes de estabelecer uma
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    2/4 razão de reciclagem variando de 30 a 0,1.
  8. 8. Método de cultivo de microrganismos sem contaminação, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende:
    adicionar um meio de cultura composto por água e componentes de nutriente para o sistema como definido na reivindicação 1, usando uma bomba peristáltica;
    inocular o sistema com um microrganismo viável; e opcionalmente, adicionar um agente antimicrobiano ao sistema.
  9. 9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é uma levedura.
  10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é a Starmerella bombicola.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o microrganismo é a Pseudozyma aphidis.
  12. 12. Método, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o sistema é esterilizado antes de cultivar o microrganismo.
  13. 13. Método, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a esterilização compreende:
    lavar as superfícies internas do reator com um desinfetante;
    pulverizar o interior do reator com uma solução de peróxido de hidrogênio a 3%; e/ou vaporizar o interior do reator com água a uma temperatura de 105°Ca 110°C.
  14. 14. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura é descontaminado antes de ser adicionado ao sistema.
  15. 15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a descontaminação é alcançada por:
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    3/4 autoclavar os componentes do meio de cultura;
    filtrar a água com um filtro de água de 0,1 mícron; e esterilizar com UV a água.
  16. 16. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o agente antimicrobiano é um biotensoativo.
  17. 17. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um microrganismo e/ou um ou mais produtos do crescimento do microrganismo produzido pelo sistema como definido na reivindicação 1.
  18. 18. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o microrganismo é a Starmerella bombicola.
  19. 19. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o microrganismo é a Pseudozyma aphidis.
  20. 20. Composição, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o subproduto de crescimento é um biotensoativo.
  21. 21. Composição, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o biotensoativo é um soporolipídeo.
  22. 22. Composição, de acordo com a reivindicação 20, caracterizada pelo fato de que o biotensoativo é um lipídio manosileritritol.
  23. 23. Método para potencializar a quantidade de óleo recuperável a partir de uma formação contendo óleo, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende a aplicação de uma composição como definida na reivindicação 17 à formação contendo óleo.
  24. 24. Método para limpar uma haste do poço de óleo, tubo e/ou revestimento, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende a aplicação da haste de poço de óleo, tubo e estruturas de revestimento
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    4/4 de uma composição como definida na reivindicação 17.
  25. 25. Método para melhorar o crescimento, rendimento e/ou de saúde da planta, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende a aplicação à planta ou ao seu ambiente uma composição como definida na reivindicação 17.
  26. 26. Método para controlar uma praga de animais, caracterizado pelo fato de que o dito método compreende colocar a praga em contato com uma composição como definida na reivindicação 17.
  27. 27. Método para a alimentação animal, caracterizado pelo fato de que o método compreende a adição da composição como definida na reivindicação 17 à comida do animal e/ou fonte de água potável.
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