CN104321422A - 生产生物表面活性剂的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产生物表面活性剂(如，枯草菌表面活素)的方法，其包括在包含酒糟作为碳源的液体培养基中培养至少一种生物表面活性剂产生微生物。还描述了在三次采油中使用含有粗制生物表面活性剂的培养液和作为三次采油中的抗细菌组合物的方法。还描述了分离所述生物表面活性剂后使用所述培养液残余物作为肥料的方法以及用于该用途的组合物。

Description

生产生物表面活性剂的方法
发明领域
本发明涉及一种生产生物表面活性剂(如，枯草菌表面活素)的方法，其包括在包含酒糟(vinasse)作为碳源的液体培养基中培养至少一种生物表面活性剂产生微生物。还描述了在三次采油中使用含有粗制生物表面活性剂的培养液和作为三次采油中的抗细菌组合物的方法。还描述了分离该生物表面活性剂后使用所述培养液残余物作为肥料的方法以及用于该用途的组合物。
发明背景
已经对生物表面活性剂(如，枯草菌表面活素)的生产产生了浓厚的兴趣，因为它们是非常有力的表面活性剂，能够在非常低的浓度下改变液体的界面张力。此外，许多表面活性剂具有抗微生物活性。
环状脂肽，如枯草菌表面活素，具有环状肽部分和源自脂肪酸的部分。枯草菌表面活素具有包括D-和L-氨基酸的七个氨基酸的环状肽，Glu-Leu-D-Leu-Val-Asp-D-Leu-Leu，通过C12-C17β羟基脂肪酸，从N端连接至C端，以形成环状部分，如以下所示。
地衣素(lichenysin)具有相似的结构，氨基酸序列不同于枯草菌表面活素，Gln-Leu-D-Leu-Val-Asp-D-Leu-Ile，通过C12-C17β羟基脂肪酸，从N端连接至C端，以形成环状部分。
芬芥素(fengycin)是具有序列Glu-D-Orn-Tyr-D-Allo-Thr-Glu-D-Ala-Pro-Glu-D-Tyr-Ile的环状脂肽，其中该肽在位置3的酪氨酸苯氧基和位置10的Ile的C-端之间环化，脂肪酸连接该肽，与N-端形成酰胺。
枯草菌表面活素
伊枯草菌素是指一组具有序列Asn-D-Tyr-D-Asn-Gln-Pro-D-Asn-Ser的环状肽，其中N-端和C-端通过不同长度的β-氨基脂肪酸连接。
生产这些生物表面活性剂的方法集中于鉴定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的高产菌株[US 3030789，Mulligan等，1989，Applied Microbiology and Biotechnology 31:486-489]，或通过调节培养条件，如在磁场中培养[JP-A-6-121668]、高铁浓度[Wei等，Enz.Microbial.Technol.1989，22:724-728]、在泥炭[Sheppard等，1989，Appl.Microbial.Biotechnol.27:486-489]或降低的氧[Kim等，J.Ferment.Bioeng.1997情况下，84:41-46]的存在下。
在多数情况下，培养基含有食品或商品作为可异化的碳源，例如，葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、水解淀粉、糖蜜、马铃薯提取物、麦芽、泥炭、植物油、玉米浆、果糖、糖浆、糖、液体糖、转化糖、醇、有机酸及其盐或链烷[US 7011959]。然而，这些碳源中的许多是其他商业领域中有价值的商品或者是食品。
酒糟是糖工业的副产物。将甘蔗或甜菜加工以生产结晶糖、浆状物和糖蜜。然后通过发酵来加工糖蜜，以生产乙醇、抗坏血酸和其他产品。所需产品发酵和分离后，剩余的残余物就是酒糟。酒糟是废产物，常常通过燃烧[Cortez&Perez，Brazilian Journal of ChemicalEngineering，1997，14]或倒入河中来处置。
酒糟是粘性的、黑红色液体，当直接从甘蔗汁获得时，具有2-4％的总固体，或当从糖蜜获得时，具有5-10％固体。其具有高生物需氧量(BOD)(30000-40000)和高酸度(pH4-5)。
由于其高BOD，将酒糟倒入河中对水生生物造成损害。燃烧是昂贵的处置方式。
酒糟有时候被用作肥料。然而，其高酸度将其实用性限于特定类型的土壤。
它们产生的微生物和生物表面活性剂已经被用于三次采油(微生物增强的采油，MEOR)中。为了在接近生产结束时增强从井中的采油，已经使用了：
i)刺激内源性细菌产生生物表面活性剂、将重质油分解成轻质油、降低油粘度、提高储油(井)压力和控制扫油过程中油移动性的营养素组合物；
ii)或可以在高压、高温和高盐度的油井条件下执行这些功能的外源性微生物的组合物。
然而，MEOR的缺陷是硫化氢的生物产生(也称为酸化)，这可能导致采油过程中使用的管道和机械的腐蚀。
生物表面活性剂可以被用于降低井中油和岩面之间的界面张力。影响多孔岩储层中石油流动的力包括重力和毛细管压力。毛细管压力是油/水和岩面之间的界面张力的函数，因此，通过降低两相弹性界面层的粘着能障，界面张力的降低有助于多孔岩中捕获的油的流动。岩石变成水润湿的。
对于生产高产量的生物表面活性剂同时避免消耗有价值的商品和/或食品的方法存在着需求。对于使用酒糟副产物的有效方式也存在着需求。
发明概述
本发明部分地基于以下的发现：酒糟可以被用作生物表面活性剂的微生物生产中的碳源，以低成本获得良好的产量。
在本发明的一个方面中，提供了生产生物表面活性剂的方法，其包括在包含酒糟作为碳源的液体培养基中培养至少一种生物表面活性剂产生微生物，其中所述培养在pH6至8和25℃至40℃的温度下进行。
在一些实施方案中，所述至少一种生物表面活性剂产生微生物选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacillus popilliae)及其混合物，尤其是枯草芽孢杆菌枯草亚种NRRL B-3383(美国农业部，农业研究局，ARS菌种保藏中心NRRL)。在一些实施方案中，所述至少一种生物表面活性剂产生微生物是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合物。在一些实施方案中，所述酒糟是甘蔗酒糟。在一些实施方案中，所述酒糟以3％至10％w/v的量存在于液体培养基中。在一些实施方案中，所生产的生物表面活性剂选自枯草菌表面活素、地衣素、芬芥素、伊枯草菌素及其混合物，尤其是生物表面活性剂、地衣素及其混合物，更特别是枯草菌表面活素。
在一些实施方案中，所述培养过程的温度为30℃至35℃。在一些实施方案中，所述pH为6.4至7.2。在一些实施方案中，所述液体培养基进一步包含可异化氮源，尤其是铵离子和/或硝酸根离子的盐，如硝酸铵。在一些实施方案中，所述液体培养基进一步包含至少一种无机盐，如磷酸盐、硫酸盐、铁盐、锰盐、镁盐和钙盐。在一些实施方案中，所述硫酸盐被最少化或被省略。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在培养过程中给液体培养基通气并且在通气过程中收集产生的起泡物(foamate)。在一些实施方案中，在培养基接种之前开始通气。在一些实施方案中，在培养基接种时开始通气。
在本发明的另一个方面中，提供了通过上述方法生产的生物表面活性剂，尤其是其中生物表面活性剂选自生物活性素、地衣素及其混合物。
在一些实施方案中，以至少50％，尤其是至少60％、70％、80％或高于90％，更特别是至少95％的纯度，例如，约98％的纯度来生产所述生物表面活性剂。
在一些实施方案中，所述生物表面活性剂留在培养液中。在其他实施方案中，从培养液中分离出所述生物表面活性剂。
在本发明的另一个方面中，提供了包含至少一种生物表面活性剂产生微生物和酒糟残余物的组合物，其中所述酒糟残余物是在发酵过程中通过至少一种生物表面活性剂产生微生物分解酒糟形成的。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种生物表面活性剂，如枯草菌表面活素、地衣素、伊枯草菌素、芬芥素及其混合物，尤其是枯草菌表面活素、地衣素及其混合物，更特别是枯草菌表面活素。
在一些实施方案中，所述组合物含有微量生物表面活性剂，例如，低于30μmol的生物表面活性剂。在其他实施方案中，所述组合物包含约750mg/L至2000mg/L范围的生物表面活性剂。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包含添加的食物源，如糖蜜、甘油或高果糖玉米糖浆的残余物。
在本发明的另一个方面中，提供了上述组合物在三次采油中的用途。
在本发明的另一个方面中，提供了上述组合物作为抗细菌组合物在三次采油或天然气高压井加工过程中保护设备免受腐蚀的用途。
在本发明的再另一个方面中，提供了上述组合物作为肥料的用途。
发明详述
本文中使用的冠词“一个(a)”和“一个(an)”是指一个或超过一个(即，至少一个)的冠词语法对象。例如，“一种元素”意思是一种元素或超过一种元素。
在整个说明书和随后的权利要求书中，除非文中另外需要，否则词语“包含(comprise)”和变化形式，如“包含(comprises)”和“包含(comprising)”，应被理解为包含所述整体或步骤或整体或步骤的组，但不排除任何其他整体或步骤或整体或步骤的组。
在本发明的第一个方面中，提供了生产生物表面活性剂的方法，其包括在包含酒糟作为碳源的液体培养基中培养至少一种生物表面活性剂产生微生物，其中在pH6至8和25℃至40℃的温度下进行。
尽管所述至少一种生物表面活性剂产生微生物可以是已知产生生物表面活性剂的任何微生物，但在特定的实施方案中，所述至少一种生物表面活性剂产生微生物来自芽孢杆菌属，例如，它们可以选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、日本甲虫芽孢杆菌及其混合物。在一些实施方案中，所述液体培养基中存在一种生物表面活性剂产生微生物。在其他实施方案中，所述液体培养基中存在两种生物表面活性剂产生微生物。在再另一个实施方案中，所述液体培养基中存在三种生物表面活性剂产生微生物。在再进一步的实施方案中，所述液体培养基中存在四种生物表面活性剂产生微生物。在一些实施方案中，所述至少一种生物表面活性剂产生微生物是五种生物表面活性剂产生微生物的混合物。所述至少一种生物表面活性剂产生微生物可以是已知以提高的产量产生生物表面活性剂的微生物的菌株。例如，芽孢杆菌属的许多种产生生物表面活性剂，然而，已知枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌产生显著量的生物表面活性剂。此外，已知枯草芽孢杆菌的特定菌株产生提高产量的生物表面活性剂，如枯草芽孢杆菌ATCC 21331、枯草芽孢杆菌ATCC 21332、枯草芽孢杆菌SD901(FERM BP.7666)、枯草芽孢杆菌NRRL B-3383和枯草芽孢杆菌RSA-203或其混合物。生物表面活性剂产生微生物的许多菌株是商业上或公众可获得的。在一些实施方案中，所述至少一种生物表面活性剂产生微生物是枯草芽孢杆菌RSA-203菌株。
RSA-203是枯草芽孢杆菌菌株的微生物。其是杆状、需氧、革兰氏阳性、能够形成内生孢子的β-溶血微生物。核酸序列分析证实了其是枯草芽孢杆菌菌株。这种微生物的样品于2013年1月9日保藏于ATCC保藏中心，10801University Boulevard，Manassas，Virginia20110-2209，United States of America，并且已经指定保藏号No.______。
RSA-203产生显著量的生物表面活性剂枯草菌表面活素。如果培养条件包括在培养过程中除去起泡物，则在培养基中可以以250mg/L至1000mg/L的量而在起泡物中以850mg/L至2g/L的量产生枯草菌表面活素。
在特定的实施方案中，所述至少一种生物表面活性剂产生微生物是枯草芽孢杆菌NRRL B-3383，其是公众可获得的。在其他特定的实施方案中，所述至少一种生物表面活性剂产生微生物是枯草芽孢杆菌RSA-203菌株。
在一些实施方案中，所述至少一种生物表面活性剂产生微生物是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合物。在其他实施方案中，所述至少一种生物表面活性剂产生微生物是枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和日本甲虫芽孢杆菌的混合物。在这些实施方案中，可以调节每种微生物的比例，以确定所产生的不同生物表面活性剂的量。在一些实施方案中，所述枯草芽孢杆菌以混合物的约50-98％，尤其是60-95％、70-95％、80-95％，更特别是约90％存在于生物表面活性剂产生微生物的混合物中。
所述液体培养基中使用的碳源是酒糟。酒糟是从甘蔗或甜菜的加工获得的糖工业的副产物。在糖生产过程中产生的糖蜜发酵产生乙醇和抗坏血酸。此发酵后留下的残余物称为酒糟。酒糟是粘性液体，具有2-10％的总固体含量，pH4-5的高酸度和高BOD(30000-40000)。
在一些实施方案中，所述液体培养基中的酒糟的量为3至20％w/v，尤其是3至15％w/v，更特别是3至12％w/v或3-10％w/v，最特别是约10％w/v。在一些实施方案中，改变酒糟的量以在所述培养液中获得所需浓度的生物表面活性剂。
在一些实施方案中，除了酒糟以外，加入另外的碳源。合适的碳源包括碳水化合物源，如糖蜜、右旋糖、葡萄糖、甘油等。所述另外的碳源可以以0至15％w/v，尤其是0至10％w/v的量存在于所述液体培养基中。
在一些实施方案中，所述培养方法在糖加工厂，例如，甘蔗加工厂进行。有利地，这降低了生物表面活性剂生产所涉及的成本，因为如果需要将酒糟运输至另一个工厂，则该酒糟可能需要在运输之前脱水以除去过量的水，而脱水和运输成本增加了生物表面活性剂的成本。
所产生的生物表面活性剂优选是环状脂肽生物表面活性剂，如枯草菌表面活素、地衣素、伊枯草菌素、芬芥素及其混合物。这些生物表面活性剂中的每一种可以含有脂肽的脂肪酸部分的链长不同的化合物的混合物。将特定的氨基酸和/或烃脂肪酸加入到培养液中可以产生具有不同比例的脂质脂肪酸链长的生物表面活性剂。
在一些实施方案中，所产生的生物表面活性剂选自枯草菌表面活素和地衣素及其混合物。在其他实施方案中，所产生的生物表面活性剂是枯草菌表面活素。
所述培养过程的温度为25℃至40℃，尤其是30℃至40℃，更特别是约30℃至35℃。所用的温度可能取决于生物表面活性剂产生微生物的性质。例如，所述温度是导致微生物生长至由于培养液内化学产生的微生物标志物的产生而限制能动性的应激点的温度。这使得针对给定的微生物群允许最大的生物表面活性剂产生。本领域技术人员可以通过常规试验方法来确定用于给定细菌群的合适温度。
培养基的pH维持在6至8，尤其是6至7.5，更特别是6.5至7.2。在特定的实施方案中，通过用氢氧化物，如氢氧化钠或氢氧化钾，调节至pH7的磷酸二氢盐和磷酸氢盐缓冲液，将培养基缓冲在约pH7下。
至少一种生物表面活性剂产生微生物的接种物是处于对数中期生长中的至少一种生物表面活性剂产生微生物的培养物。将该接种物加入到所述培养基中，以提供在600nm(OD600nm)下0.1至0.15的初始光密度。
在一些实施方案中，液体培养基进一步包括可异化氮源。在一些实施方案中，可异化氮源选自含氮无机盐或含氮有机化合物，例如，铵盐、硝酸盐、脲、蛋白胨、肉提取物、酵母提取物、大豆饼、玉米浆、蛋白胨或源自豆类的粉，如大豆、红豆、豌豆、蚕豆、鹰嘴豆、小扁豆和菜豆，或这样的粉的提取物。在某些实施方案中，可异化氮源是无机盐，如铵盐或硝酸盐，尤其是硝酸铵、氯化铵、乙酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、硝酸钾、硝酸钠、硝酸镁和硝酸钙。在某些实施方案中，可异化氮源是硝酸铵。
液体培养基中存在的可异化氮源的量将取决于来源的性质和来源内氮的可利用率。例如，氮源可以以1至20g/L的量存在。当氮源是无机氮源时，可以以1至10g/L，尤其是2至7g/L，更特别是3.5至4.5g/L的量存在。
在一些实施方案中，液体培养基进一步包含至少一种无机盐，如硫酸盐、磷酸盐、氯化物，尤其是如锰、铁、钠、钾、镁和钙这样的金属的盐。在一些实施方案中，无机盐选自如锰、钠、钾和铁这样的离子的硫酸盐、氯化物和磷酸盐，或这些盐的混合物。在特定的实施方案中，至少一种无机盐选自硫酸锰、磷酸铵、氯化钙、硫酸镁、硫酸亚铁或其混合物。在其他实施方案中，存在的无机盐不是硫酸盐。例如，在一些实施方案中，存在的无机盐是磷酸盐或氯化物。这个实施方案降低了可以用于三次采油的组合物中存在的硫酸盐的量，其中硫酸盐的存在可能导致硫化氢的产生。
无机盐的量根据所用盐而改变。如果存在磷酸盐的来源，可以以约1至10g/L，尤其是2至7g/L，更特别是4至7g/L，最特别是5至6g/L的量存在。在加入无机盐以提供微量元素，如铁、锰和钙的情况下，其量将在1mg/L至5g/L之间变化，例如，可以以0.5g/L至1g/L的量加入钙盐，可以以1至10mg/L的量加入铁和锰盐，可以以0.5至1g/L的量加入锰盐，可以以0.5g/L至5g/L的量加入镁盐。
在一些实施方案中，培养基进一步包含螯合剂。特定的螯合剂包括氨基羧酸及其盐，如乙二胺四乙酸(EDTA)、羟乙基乙二胺四乙酸、1,2-二氨基-环己烷四乙酸、乙二醇-双([β]-氨基乙醚)-N,N,N’,N’-四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺-戊乙酸(DPTA)、三乙烯四胺六乙酸(TTG)、氨基二乙酸和羟乙基氨基二乙酸。特别的螯合剂是EDTA的盐和混合盐，如二钾、铵、钙、二钠、三钠和四钠盐，最优选EDTA的二钠或四钠盐，尤其是EDTA二钠。螯合剂以0.1至5mg/L，尤其是0.5至3mg/L，更特别是1至2.5mg/L培养基的量存在。
所述培养方法可以在培养箱中的实验室烧瓶中小规模进行，或者可以大规模，如生物反应器中的工业规模进行。该方法在需氧条件下进行。
培养过程的持续时间将取决于培养液的用途。在一些实施方案中，培养过程具有8至120小时，尤其是8至72小时，8至48小时或8至24小时，例如10至14小时的持续时间。培养过程的持续时间取决于获得高于～1.2至1.4，尤其是约～1.3的OD600nm的细胞密度，其中生物表面活性剂产生开始，并且采用该时间长度来达到生长静止期，1.8至2.5的～OD600nm，其中生物表面活性剂产生停止。
在一些实施方案中，该方法进一步包括给培养基通气以提供溶解氧。通常，这涉及以1L/分钟至3L/分钟，尤其是约1.5L/分钟的速率通过培养基鼓泡。通气速率可以由本领域技术人员容易地确定。通气可以从培养过程开始进行，或者可以在培养过程开始后开始，或者可以在培养过程开始时接种前开始，尤其从培养过程开始或接种前开始。在特定的实施方案中，通气维持约20至40％，尤其是25至35％的溶解氧浓度。在一些实施方案中，在培养过程中，将溶解氧浓度维持在约30％。
一旦生物表面活性剂产生开始，由于生物表面活性剂的存在，培养基可能起泡。在一些实施方案中，可以通过给起泡物喷射醇(如，乙醇)和溶剂(如，二氯甲烷或丙酮)的混合物来控制泡沫产生。在一些实施方案中，其中进行发酵的生物反应器是防爆的。在一些实施方案中，泡沫收集设备是防爆的。通过泵压和进入泡沫塔的流速来确定设备必须经受住的压力程度。
在一些实施方案中，促进起泡物的产生并且从培养容器中收集该起泡物。所述起泡物包含与少量的培养基一起产生的生物表面活性剂。可以经由旋转阀将泡沫收集至低度真空的罐中或具有喷雾塔的罐中以破坏泡沫。可以从收集的起泡物中分离出所述生物表面活性剂。在一些实施方案中，通过酸化，接着液/液萃取，然后蒸发液体来分离所述生物表面活性剂。在其他实施方案中，通过离心，接着液/液萃取和液体的蒸发或蒸馏来分离所述生物表面活性剂。
在一些实施方案中，在完成培养过程后，从培养液中分离出所述生物表面活性剂。例如，可以将粗制培养液离心，以除去生物质。然后用酸，如HCl，将上清液酸化至酸性pH，例如，pH2。酸性pH导致生物表面活性剂沉淀，将酸化的上清液在4℃下放置一段时间以确保沉淀完全。然后，例如，通过离心或过滤收集沉淀物，并且重悬浮于水中。将悬浮液的pH调节至碱性pH，如pH8以溶解沉淀物。可以用有机溶剂，如二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿，尤其是二氯甲烷来萃取所得到的水溶液，并且将有机相蒸发以获得高纯度晶体形式的生物表面活性剂。在一些实施方案中，在培养完成后，可以通过泡沫蒸馏来收集生物表面活性剂。
纯化的生物表面活性剂适用于许多已知的用途，如去污剂、乳化剂、润湿剂、分散剂、增溶剂、抗静电剂、抗浑浊剂、润滑剂、管道阻力降低剂，或者可以用于化妆品、食物、药物制剂、农业制剂、墨水等中，如本领域已知的。
在本发明的另一个方面中，提供了一种包含至少一种生物表面活性剂产生微生物和酒糟残余物的组合物，其中在培养过程中通过至少一种生物表面活性剂产生微生物分解酒糟形成了酒糟残余物。
在一些实施方案中，所述组合物是从上述方法获得的粗制培养液。在一些实施方案中，因为在培养过程中通过除去包含生物表面活性剂的起泡物，除去了由至少一种生物表面活性剂产生微生物产生的生物表面活性剂，因此组合物耗尽了生物表面活性剂。在这些实施方案中，所述组合物可以含有微量的未在培养过程中除去的或在培养过程已经终止后由至少一种生物表面活性剂产生微生物产生的生物表面活性剂。例如，在一些实施方案中，其量为低于30μmol生物表面活性剂。
该组合物可以用作肥料组合物以刺激植物生长。所述肥料可以具有来自培养液内的细菌群或作为用于植物根附着的共生生物体而加入到培养液中的细菌群。
在其他实施方案中，所述组合物进一步包含生物表面活性剂，尤其是枯草菌表面活素、地衣素、伊枯草菌素、芬芥素或其混合物。可以通过将生物表面活性剂或生物表面活性剂的混合物加入到组合物中来获得这一组合物，或可以作为来自以上方法的没有从其分离生物表面活性剂或只提取了一部分生物表面活性剂的粗制培养液来获得。通常，所述组合物中存在的生物表面活性剂的量为2mg/L至7000mg/L，例如，50mg/L至7000mg/L或500mg/L至7000mg/L，如500mg/L至3g/L，尤其是750mg/L至2g/L。
在一些其中所述组合物包含至少一种生物表面活性剂产生微生物、酒糟残余物和生物表面活性剂的实施方案中，该组合物可以进一步包含添加的微生物食物源。在一些实施方案中，添加的食物源是选自糖蜜、右旋糖、葡萄糖、酒糟、甘油和其他碳水化合物中的至少一种。食物源的添加使得微生物一旦处于合适环境(例如，油井)中就可以生长，并且因此使得其他不理想的微生物竞争出局，并且产生对不理想的微生物具有抗微生物作用的其他生物表面活性剂。
包含生物表面活性剂和任选的细菌食物源的组合物在三次采油中是有用的，例如，用于微生物强化采油(MEOR)方法中，并且在从耗尽的碳酸钙储油岩采油中特别有用。
在一些实施方案中，用含有生物表面活性剂(如枯草菌表面活素)的生物表面活性剂组合物处理油井，以降低油的表面张力并提供水润湿的岩石。然后用本发明的组合物处理油井。
在本发明的另一个方面中，提供了一种三次采油方法，其包括：
1.用包含至少一种生物表面活性剂的组合物处理油井，和
2.用包含至少一种生物表面活性剂产生微生物和酒糟残余物的组合物处理油井，其中在培养过程中通过生物表面活性剂产生微生物分解酒糟形成了酒糟残余物。
在一些实施方案中，生物表面活性剂在组合物中的浓度为2mg/L至4g/L。在一些实施方案中，该组合物是具有约1g/L至4g/L生物表面活性剂，尤其是约1.5/L至3g/L，例如约2g/L的浓缩物。在其他实施方案中，浓缩物是稀释的，例如，用水力压裂(hydrofracking)基底水稀释。例如，随着泵入井中，将浓缩物与水力压裂基底水混合。可以通过维持至少2mg/L生物表面活性剂的量来稀释浓缩物。例如，生物表面活性剂组合物的稀释可以以1:100至1:2000，尤其是1:1000生物表面活性剂比稀释剂的范围来进行。典型的浓缩物包含10-40％w/v培养液(其包含微生物、酒糟残余物和粗制生物表面活性剂、水和矿物质)、10至20％w/v水性生物表面活性剂组合物(其包含0.01至1％w/v生物表面活性剂)、10至30％表面活性剂组合物(其包含10至25％w/v表面活性剂和水)，并且浓缩物的平衡是水。在进入油井稀释时，该组合物可以含有94.9至98.98％w/v水、1-5％w/v表面活性剂、0.01至1％w/v生物表面活性剂和0.01至0.1％w/v微生物。在一些实施方案中，该组合物进一步包含微生物食物源，例如，碳水化合物，如糖蜜、葡萄糖、右旋糖、酒糟等。食物源可以替代浓缩物中高达约30％w/v的水。例如，包含食物源的浓缩物可以包含10-40％w/v培养液(其包含微生物、酒糟残余物和粗制生物表面活性剂、水和矿物质)、10至20％w/v水性生物表面活性剂组合物(其包含0.01至1％w/v生物表面活性剂)、10至30％表面活性剂组合物(其包含10至25％w/v表面活性剂和水)、10％至25％糖蜜(其任选地含有高达1％的酒糟)，并且浓缩物的平衡是水。
包含至少一种生物表面活性剂产生微生物和酒糟残余物的组合物如上所述。在一些实施方案中，至少一部分微生物是孢子形式的。在一些实施方案中，所有微生物是孢子形式的。在一些实施方案中，该孢子以102cfu/mL至1010cfu/mL的量存在，尤其是104cfu/mL至108cfu/mL。
在一些实施方案中，步骤1和2分开进行。在其他实施方案中，使用包含至少一种生物表面活性剂产生微生物和酒糟残余物和至少一种生物表面活性剂的组合物，同时进行步骤1和2。
包含生物表面活性剂产生细菌、酒糟残余物和生物表面活性剂的组合物还用作高含盐量组合物(例如，7％盐溶液)中的抗微生物剂。这样的组合物用作天然气高压井处理中的水力压裂(hydraulicfracturing)(水力压裂(hydrofracking))组合物。最初的水力压裂组合物可以不包括高盐，但在使用过程中，可以从其接触的岩石溶解盐，将其盐浓度从0提高至12％。
可以将所述组合物加入到水力压裂组合物中，以防止天然气处理过程中使用的管道内表面上不需要的细菌的生物膜的形成，所述细菌如硫酸盐和铁还原细菌。这样的处理中使用的钢管常常遭受硫化氢生产细菌的腐蚀，或遭受其他类型的细菌(如，盐耐受性细菌)的生物膜在管道内部产生的阻塞或阻力。问题细菌包括Acidithiobacillusferrooxidans和Desulfotomaculum halophilum。
不希望受到理论的束缚，本发明的组合物含有和产生生物表面活性剂并且破坏细菌的生物膜形成或分散已经形成的生物膜，由此降低或防止硫化氢产生和管道上的阻塞或淤泥形成。所述生物表面活性剂还可以破坏不需要的细菌的细胞壁，形成胶束和破坏细胞质，导致杀生物活性。
在一些实施方案中，特别是用于水力压裂水中，存在的生物表面活性剂产生细菌是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的组合，并且存在的生物表面活性剂是枯草菌表面活素和地衣素。
本发明现在将参考以下实施例来描述，所述实施例说明了本发明的一些优选方面。然而，应当明白以下本发明描述的特殊性不能代替之前描述的一般性。
附图简述
图1是显示了生物表面活性剂产生微生物随着时间生长的图示，没有使用硫酸盐离子或使用了改变量的硫酸盐离子。
实施例1：枯草菌表面活素的生产
以2％v/v接种物将来自营养琼脂平板上的细菌培养物的枯草芽孢杆菌NRRL B-3383株(最初获自美国农业部)转移至含有2.5L基于10％酒糟的MMS培养液的4L烧瓶中。基于酒糟的MMS培养液含有：
将烧瓶置于150rpm的轨道摇床(SKC 6100，Jeio Tech)上，同时在30℃下孵育(MCO-801C Incubator，Sanyo)。72小时后，从培养箱中取出烧瓶，并且通过在8,500rpm下在4℃下离心20分钟(Sorvall Evolution RC)，从粗制培养液中除去生物质。
使用HCl，将所得到的上清液的pH带至2.0的pH，这导致枯草菌表面活素沉淀，并且将上清液在4℃下储存过夜，以确保完全沉淀。通过在8,500rpm下在4℃下离心20分钟来收集沉淀物。在沉淀物中收集到大约2.5g/L的粗制材料。将沉淀物重悬浮于去离子水中，并且使用1M NaOH将pH调节至8.0。用等体积的二氯甲烷萃取水溶液。分离二氯甲烷层，并且使其蒸发，以提供50mg/L至750mg/L的量的纯化晶体枯草菌表面活素。
相对于标准的纯枯草菌表面活素的组合物(Sigma Aldrich，98％纯)，检查晶体枯草菌表面活素样品的纯度。通过LC-MS的标准组合物的分析显示出具有1.03、1.23、1.61、1.74、2.15和2.93分钟停留时间的峰。基于峰面积计算纯度。
发现使用以上方法测试纯度的四种样品为80％、56％、58％和61％纯。
实施例2：枯草菌表面活素和地衣素的混合物的生产
将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌用于接种含有基于10％糖蜜的MMS培养液的4L烧瓶。基于糖蜜的MMS培养液含有：
将烧瓶置于150rpm的轨道摇床上(SKC 6100，Jeio Tech)，同时在30℃下孵育(MCO-801C Incubator，Sanyo)。72小时后，从培养箱中取出烧瓶，并且通过在8,500rpm下在4℃下离心20分钟(Sorvall Evolution RC)，从粗制培养液中除去生物质。
将粗制产物标记为MEGR102、MEGR103和MEGR104，各自是不同浓度的枯草菌表面活素和地衣素的混合物。
实施例3：MEGR102、MEGR103和MEGR104的抗生物特性
测试了每种组合物MEGR102、MEGR103和MEGR104对抗大肠杆菌、Desulfotomaculum halophilum和Acidithiobacillusferrooxidans的抗生物特性。
通过将每种组合物以1mg/L、3mg/L和5mg/L的量加入到含有54,356mg/L NaCl、16,151mg/L CaCl2、2,383mg/L MgCl2和535mg/LKCl(模拟水力压裂水)的7％盐水中。然后给每种浓度的盐水组合物接种大肠杆菌(108cfu)、Desulfotomaculum halophilum(108cfu)和Acidithiobacillus ferrooxidans(108cfu)。
对照是用与测试样品等量的每种细菌接种7％盐水，没有添加MEGR组合物。
将组合物在室温下培养。在一定时间间隔下，取样，并在琼脂平板上分析培养物生长，以测定cfu的目测计数。
结果显示于以下表中：
表1：MEGR102/大肠杆菌
样品 时间0 2小时 4小时 6小时 72小时
对照 生长 生长 生长 生长 无生长
1mg/L 生长 生长 无生长 无生长 无生长
3mg/L 生长 生长 无生长 无生长 无生长
5mg/L 生长 生长 无生长 无生长 无生长
表2：MEGR102/D.halophilum
样品 时间0 2小时 4小时 6小时 72小时
对照 生长 生长 生长 生长 生长
1mg/L 生长 生长 无生长 无生长 无生长
3mg/L 无生长 无生长 无生长 无生长 无生长
5mg/L 生长 无生长 无生长 无生长 无生长
表3：MEGR102/A.ferrooxidans
样品 时间0 2小时 4小时 6小时 72小时
对照 生长 生长 生长 生长 生长
1mg/L 生长 生长 生长 生长 无生长
3mg/L 生长 生长 生长 无生长 无生长
5mg/L 生长 生长 无生长 无生长 无生长
表4：MEGR103/大肠杆菌
样品 时间0 2小时 4小时 6小时 72小时
对照 生长 生长 生长 生长
1mg/L 生长 生长 生长 无生长 无生长
3mg/L 生长 生长 无生长 无生长 无生长
5mg/L 生长 生长 无生长 无生长 无生长
表5：MEGR103/D.halophilum
样品 时间0 2小时 4小时 6小时 72小时
对照 生长 生长 生长 生长 生长
1mg/L 生长 生长 生长 生长 生长
3mg/L 生长 无生长 无生长 无生长 无生长
5mg/L 生长 无生长 无生长 无生长 无生长
表6：MEGR103/A.ferrooxidans
样品 时间0 2小时 4小时 6小时 72小时
对照 生长 生长 生长 生长 生长
1mg/L 生长 生长 生长 生长 无生长
3mg/L 生长 生长 生长 无生长 无生长
5mg/L 生长 生长 无生长 无生长 无生长
表7：MEGR104/大肠杆菌
样品 时间0 2小时 4小时 6小时 72小时
对照 生长 生长 生长 生长 无生长
1mg/L 生长 生长 无生长 无生长 无生长
3mg/L 生长 生长 无生长 无生长 无生长
5mg/L 生长 无生长 无生长 无生长 无生长
表8：MEGR104/D.halophilum
样品 时间0 2小时 4小时 6小时 72小时
对照 生长 生长 生长 生长 生长
1mg/L 生长 生长 无生长 无生长 生长
3mg/L 生长 无生长 无生长 无生长 生长
5mg/L 无生长 无生长 无生长 无生长 无生长
表9：MEGR104/A.ferrooxidans
样品 时间0 2小时 4小时 6小时 72小时
对照 生长 生长 生长 生长 生长
1mg/L 生长 生长 生长 生长 生长
3mg/L 生长 生长 生长 无生长 生长
5mg/L 生长 生长 生长 无生长 无生长
实施例4：油的界面张力的降低
使用测试方法ASTM D1331-89来测量界面张力，发现所用的99.065g轴承润滑脂的界面张力为7510达因/cm。
将轴承润滑脂与25mL的含有水95.4％、表面活性剂3.5％、十二烷基苯磺酸>0.9％(DBSA)、右旋糖>0.5％、氢氧化钠>0.2％、芽孢杆菌孢子105cfu/L和枯草菌表面活素5000ppm的组合物混合，并使其静置。
在624小时时，轴承润滑脂的界面张力降至630达因/cm，并且在696小时时，界面张力进一步降至420达因/cm。
界面张力的降低表明轴承润滑脂基质分解成低级烃。这一过程表明该产品适用于碳酸盐地层中重质油的三次采油中。
实施例5：不同浓度的硫酸盐离子对培养的影响
通过从培养基除去所有来源的硫酸盐并且用氯化物盐替代它们来测试硫酸盐对培养液的影响。所述培养液含有用氢氧化钾调节至pH7的磷酸二氢钾/磷酸氢钾缓冲液。然后用1mL/L、0.8mL/L、0.6mL/L、0.4mL/L和0.2mL/L的不同浓度的硫酸钠(1.8M)刺激(spike)样品。每半个小时，评价光密度、pH和表面张力。使用RSA-203枯草芽孢杆菌进行了这一测试。
结果显示于图1中。结果表明使用氯化物盐，所述微生物同样可以与使用硫酸盐那样生长地很好。在所有样品中，表面张力下降并且在5小时时稳定在大约27达因。

Claims (30)

1.生产生物表面活性剂的方法，其包括在包含酒糟作为碳源的液体培养基中培养至少一种生物表面活性剂产生微生物，其中所述培养在pH6至8和25℃至40℃的温度下进行。
2.权利要求1的方法，其中所述至少一种生物表面活性剂产生微生物选自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、日本甲虫芽孢杆菌(Bacilluspopilliae)、RSA-203及其混合物。
3.权利要求2的方法，其中所述至少一种生物表面活性剂产生微生物选自枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及其混合物。
4.权利要求2或3任一项的方法，其中所述枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌NRRL B-3383、枯草芽孢杆菌RSA-203或其混合物。
5.权利要求2和4任一项的方法，其中所述至少一种生物表面活性剂产生微生物包含枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的混合物。
6.权利要求1至5任一项的方法，其中所述酒糟是甘蔗酒糟。
7.权利要求1至6任一项的方法，其中所述酒糟以3至10％w/v的量存在于所述液体培养基中。
8.权利要求1至7任一项的方法，其中所述生物表面活性剂选自枯草菌表面活素、伊枯草菌素、地衣素、芬芥素及其混合物。
9.权利要求8的方法，其中所述生物表面活性剂是枯草菌表面活素。
10.权利要求1至9任一项的方法，其中所述温度为30℃至35℃。
11.权利要求1至10任一项的方法，其中所述pH为6.5至7.2。
12.根据权利要求1至11任一项的方法，其中给所述液体培养基接种至少一种生物表面活性剂产生微生物的接种物，以提供600nm下1.2至1.4的初始光密度。
13.权利要求1至12任一项的方法，其中所述液体培养基进一步包含可异化氮源。
14.权利要求13的方法，其中所述可异化氮源是铵盐。
15.权利要求14的方法，其中所述铵盐是硝酸铵。
16.权利要求1至15任一项的方法，其中所述液体培养基进一步包含至少一种无机盐。
17.权利要求16的方法，其中所述至少一种无机盐是锰、钠或铁的硫酸盐、氯化物或磷酸盐，或所述盐的混合物。
18.权利要求1至17任一项的方法，其中所述培养进一步包括在培养过程中给所述液体培养基通气，并且收集通气过程中产生的起泡物。
19.权利要求18的方法，其中在所述培养开始前开始通气。
20.由权利要求1至19任一项的方法生产的生物表面活性剂。
21.包含至少一种生物表面活性剂产生微生物和酒糟残余物的组合物，其中所述酒糟残余物是通过在培养过程中由生物表面活性剂产生微生物分解酒糟而形成的。
22.权利要求21的组合物，进一步包含至少一种生物表面活性剂。
23.权利要求22的组合物，其中所述生物表面活性剂选自枯草菌表面活素、地衣素、伊枯草菌素、芬芥素或其混合物。
24.权利要求23的组合物，其中所述生物表面活性剂是枯草菌表面活素。
25.权利要求21至24任一项的组合物，进一步包含微生物食物源。
26.权利要求21至25任一项的组合物在三次采油中的用途。
27.权利要求21至25任一项的组合物作为抗细菌组合物保护设备在三次采油或天然气高压井处理过程中免受腐蚀的用途。
28.根据权利要求27的用途，其中所述天然气高压井处理是水压裂。
29.权利要求21至25任一项的组合物作为肥料的用途。
30.三次采油的方法，其包括：
1.用包含生物表面活性剂的组合物处理油井，和
2.用根据权利要求21至25任一项的组合物处理所述油井。
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