CN113151029A - 一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113151029A CN113151029A CN202110542207.1A CN202110542207A CN113151029A CN 113151029 A CN113151029 A CN 113151029A CN 202110542207 A CN202110542207 A CN 202110542207A CN 113151029 A CN113151029 A CN 113151029A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rlp
- sophorolipid
- leu3
- gene
- strain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- ZTOKUMPYMPKCFX-CZNUEWPDSA-N (E)-17-[(2R,3R,4S,5S,6R)-6-(acetyloxymethyl)-3-[(2S,3R,4S,5S,6R)-6-(acetyloxymethyl)-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxyoxan-2-yl]oxyoctadec-9-enoic acid Chemical compound OC(=O)CCCCCCC/C=C/CCCCCCC(C)O[C@@H]1O[C@H](COC(C)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COC(C)=O)O1 ZTOKUMPYMPKCFX-CZNUEWPDSA-N 0.000 title claims abstract description 101
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 22
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims description 20
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 69
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 69
- 101100377470 Caenorhabditis elegans ztf-1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 101150004296 rlp gene Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 22
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims abstract description 16
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 101100398959 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) leu3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 101150063944 leu3 gene Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 101150098614 ztf-1 gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 108091007916 Zinc finger transcription factors Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 102000038627 Zinc finger transcription factors Human genes 0.000 claims abstract description 5
- 150000005693 branched-chain amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 claims abstract description 3
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 25
- 241001278026 Starmerella bombicola Species 0.000 claims description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 18
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 17
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 17
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 15
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 14
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 11
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 8
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 7
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 6
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 5
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 5
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 claims description 3
- 241001138401 Kluyveromyces lactis Species 0.000 claims description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 3
- 235000019484 Rapeseed oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 3
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims 1
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 5
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 10h-anthracen-9-one;sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O.C1=CC=C2C(=O)C3=CC=CC=C3CC2=C1 MYKOKMFESWKQRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100352376 Rattus norvegicus Plaat3 gene Proteins 0.000 description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 6
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001251200 Agelas Species 0.000 description 2
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 241001480043 Arthrodermataceae Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N Hygromycin-B Natural products OC1C(NC)CC(N)C(O)C1OC1C2OC3(C(C(O)C(O)C(C(N)CO)O3)O)OC2C(O)C(CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229910009891 LiAc Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 241000193624 Wickerhamiella Species 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000003876 biosurfactant Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000037304 dermatophytes Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N hygromycin B Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NC)C[C@@H](N)[C@H](O)[C@H]1O[C@H]1[C@H]2O[C@@]3([C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](C(N)CO)O3)O)O[C@H]2[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 GRRNUXAQVGOGFE-NZSRVPFOSA-N 0.000 description 1
- 229940097277 hygromycin b Drugs 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 1
- 238000005065 mining Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen(.) Chemical compound [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000000643 oven drying Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
- C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/12—Disaccharides
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌，是以球拟假丝酵母CGMCC 1576为出发菌株，敲除其响应pH相关的蛋白rlp基因和调控支链氨基酸合成的leu3转录因子及锌指转录因子ztf1获得，其基因型为ΔrlpΔleu3Δztf1；其中所述rlp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述leu3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ztf1基因的核苷酸序列如SEQID No.3所示。本发明还公开了所述工程菌株在发酵生产槐糖脂中的应用，实验证实该工程菌株摇瓶发酵后槐糖脂产量达到102g/L，比野生型菌株提高了57.19％，尤其是内酯型槐糖脂产量提高了25.25％。本发明所提供的对三个基因同时敲除获得高产槐糖脂菌株的方法及菌株为开发基因工程菌并大规模工业化生产槐糖脂进一步满足市场需求提供了途径。
Description
技术领域
本发明涉及一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
槐糖脂是一种生物表面活性剂，它们具有很好的环境相容性和生物相容性，可生物降解性，低毒性，是一种环境友好的表面活性剂。由于槐糖脂的这些特性，它们能够广泛应用于日化、食品、环境保护、石油开采等工业。相比于化学合成的表面活性剂，槐糖脂不仅具有良好的表面活性，同时也具有独特的生物活性，主要体现在其具有抗细菌和真菌活性，可以治疗败血症、抑制皮肤癣菌的生产，具有抗肝癌、食管癌、宫颈癌等活性(申请人课题组先前的专利)。不同结构的槐糖脂分子具有不同的生物学活性，酸型槐糖脂具有良好的润湿，乳化和发泡能力等表面活性，而内酯型槐糖脂则具有更好的降低表面张力和抗菌，抗炎，抗病毒等生物学活性。
申请人先前的专利报道槐糖脂可以利用拟威克酵母变种(Wickerhamielladomercqiae var.sophorolipid)CGMCC 1576发酵制得，相关拟威克酵母变种后更名为球拟假丝酵母Starmerella bombicola)。然而目前野生型的球拟假丝酵母菌株槐糖脂的产量偏低，无法满足市场和大规模工业化生产的需求，迫切需要开发高产槐糖脂的基因工程菌。但是申请人在近期的检索中没有找到关于对槐糖脂产生菌基因组中的转录因子进行挖掘和利用多个基因连续敲除效果累加的方法构建槐糖脂高产工程菌株及其应用的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用。
本发明所述的高产槐糖脂的三基因敲除工程菌，其特征在于：该高产槐糖脂的三基因敲除的工程菌株是以球拟假丝酵母(S.bombicola)CGMCC 1576为出发菌株，敲除其响应pH相关的蛋白rlp基因和两个转录因子基因即调控支链氨基酸合成的leu3转录因子及锌指转录因子ztf1获得，其基因型为ΔrlpΔleu3Δztf1；其中所述rlp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述leu3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ztf1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
上述高产槐糖脂的三基因敲除工程菌的构建方法是：
(1)敲除盒的构建：对球拟假丝酵母(S.bombicola)CGMCC 1576中响应pH相关的蛋白rlp基因和调控支链氨基酸合成的leu3转录因子及锌指转录因子ztf1两个转录因子基因，分别使用高保真酶
Max Super-Fidelity DNA Polymerase扩增基因rlp、leu3、ztf1编码区的上下游同源臂序列(1kb左右)，以潮霉素筛选标记自删除质粒pRSH为模板，用引物对rec-hphfor/rec-hphrev扩增含有自删除系统的hph抗性表达盒；采用OMEGA GelExtraction Kit胶回收试剂盒纯化rlp上游同源臂、潮霉素表达盒和下游同源臂三个目的片段，利用Double-joint PCR将纯化得到的rlp上下游同源臂和潮霉素表达盒进行融合PCR，再采用引物对rlp-gfor/rlp-grev进行巢式PCR扩增，最终获得rlp基因敲除盒(长度约7.4kb)；与rlp基因敲除盒的构建过程相同，使用引物对leu3-5’flankingfor/leu3-5’flankingrev，和leu3-3’flankingfor/leu3-3’flankingrev扩增得到leu3的敲除盒上下游同源臂；使用引物对ztf1-5’flankingfor/ztf1-5’flankingrev，和ztf1-3’flankingfor/ztf1-3’flankingrev扩增得到ztf1的敲除盒上下游同源臂；leu3和ztf1的所有片段经切胶回收纯化后，利用Double-joint PCR方法进行融合扩增，再分别采用引物对leu3-gfor/leu3-grev、ztf1-gfor/ztf1-grev进行巢式PCR扩增，获得leu3和ztf1基因敲除盒；其中，所述rlp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述leu3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ztf1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
(2)利用醋酸锂方法制备野生型球拟假丝酵母(S.bombicola)感受态细胞，将线性的rlp敲除盒电转化感受态细胞；在潮霉素平板的筛选下发生同源双交换的菌株能获得潮霉素抗性基因的表达，在潮霉素平板上能够生长，即可获得含有hph标记的rlp基因敲除株Δrlp::six；
(3)利用半乳糖诱导Δrlp::six中hph表达盒的自删除，去除rlp基因敲除株Δrlp::six中的hph标记，最终获得不含潮霉素抗性筛选标记的敲除菌株，命名为Δrlp；
(4)以Δrlp为出发株，以如上所述方法继续敲除转录因子leu3，获得基因型为ΔrlpΔleu3的双敲除菌株；
(5)在得到的双敲除菌株ΔrlpΔleu3中，以如上所述方法继续敲除转录因子ztf1，获得基因型为ΔrlpΔleu3Δztf1的球拟假丝酵母(S.bombicola)工程菌，即高产槐糖脂的三基因敲除工程菌株。
其中，上述使用到的引物核苷酸序列如下所示：
rlp-5’flankingfor：CTTGCCGAACTACGAGACTGG
rlp-5’flankingrev：CTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCCGAAGTCCTCTTTGGAGTGTTGTAG
rlp-3’flankingfor：AACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTAGAGCCCTCTAATTTATGCTGCC
rlp-3’flankingrev：TGGACTGGTGAAGTTGCGTTTG
rec-hphfor：GCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAG
rec-hphrev：ACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTT
rlp-gfor：ATGCTCTCACTGGAAACATTTACTG
rlp-grev：CAAATACTTGTGGAACTTGAATGAC
rlp-p1：ATGGGCTGGCATCGATCAGTTTC
rlp-p2：CTATCTCATTCCGGGCCGCTTCT
leu3-5’flankingfor：GGGAGGATTACGCAAGGT
leu3-5’flankingrev：CTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATTTATGGCTACCAGTGACTTAG
leu3-3’flankingfor：AACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTCTGGCTCCCTACTGCTCTACT
leu3-3’flankingrev：TCACGCCACTTTGCTTCTC
leu3-gfor：GTGTTGCGGCTTAGTGTCAAATG
leu3-grev：GAACTCAAAGGTCTGCTCTCCAAAC
leu3-p1：ATGAGTGGCCTGGTGGCCTG
leu3-p2：TCATGGGGAAATGTAGGGGAGC
ztf1-5’flankingfor：ATCACCACTACTCCAGCGGTC
ztf1-5’flankingrev：CTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTTAGTGATTTATGCCGTAGCGT
ztf1-3’flankingfor：AACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTTGAATAAATGTGATAACTGTGGGTG
ztf1-3’flankingrev：CTATATATACTCTTGCCCCGCAAC
ztf1-gfor：TCAACTAAGCGGATTGGAGCAC
ztf1-grev：GAGTCTGATGAGGAAAACGAAGTG
ztf1-p1：GTCGCAGGAAACGCAATCAA
ztf1-p2：TGACAACAGGTGGTATTGAGTGAG。
本发明所述高产槐糖脂的三基因敲除工程菌在发酵生产槐糖脂中的应用。
其中，所述发酵生产槐糖脂的方法是：
将三基因敲除的ΔrlpΔleu3Δztf1基因工程菌接种到装有5mL YPD种子培养基的试管中，30±2℃，转速为180-220rpm，培养24-36h，待OD600＝1.0时，得发酵种子液；将得到的种子液按体积比2％的接种量转移至含50mL发酵培养基的300mL摇瓶中，在26～30℃，200-300rpm下培养7～14天得到含槐糖脂的发酵液；所有发酵均有三个重复，发酵罐发酵用量按摇瓶用量比例放大；取发酵液样品对槐糖脂产量、菌体干重、残余葡萄糖量各参数进行测定，评价所用工程菌及其发酵生产效果；其中，
所述YPD种子培养基的组成成分为：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母粉10.0g/L；YPD种子固体培养基还添加琼脂粉20.0g/L；
所述发酵培养基的组成成分为：葡萄糖80.0g/L，酵母粉3.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，Na2HPO4·12H2O 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，菜籽油80ml/L。
上述种子液的培养条件优选是：30℃，转速为200rpm，培养30h。
上述摇瓶发酵的条件优选是：30℃，200rpm下培养7天。
本发明所述用三个基因连续敲除效果累加的方法构建的高产槐糖脂菌株与野生型菌株，单基因敲除株、双基因敲除株的发酵产物分析：
(1)将野生型菌株，单基因敲除株、双基因敲除株和三基因敲除株在发酵培养基中进行发酵，发酵结束后对发酵液取样进行生物量、残余葡萄糖量、槐糖脂产量以及槐糖脂的组分等参数的测定和分析。
(2)发酵液中残余的葡萄糖使用生物传感器SBA-40C来测定。
将发酵液离心取上清，稀释到合适倍数，取25μL进样，发酵液残余葡糖糖含量(g/L)＝n×m/100(n为仪器读数，m为稀释倍数)。
(3)细胞生物量用细胞干重法测定。
一倍体积的发酵液加入5倍体积的正丁醇/乙醇/三氯甲烷(10:10:1)的混合液，振荡充分混匀后，8,000～10,000rpm常温离心10min，弃掉上清液，用双蒸水重悬，洗涤两次，在50～60℃烘箱干燥至恒重。
(4)发酵液中槐糖脂含量采用蒽酮-硫酸法测定。
1mL发酵液加入两倍体积的乙酸乙酯，涡旋振荡充分萃取，室温静置10min，8,000rpm常温下离心10min。取上清液采用蒽酮-硫酸法测定内酯型槐糖脂含量。2mL无水乙醇加入到1mL发酵液中，充分振荡，静置10min，8,000rpm室温下离心10min，用蒽酮-硫酸法测定总糖含量，总槐糖脂的含量为总糖的量去除发酵液中残余葡糖糖量，然后乘以换算系数1.91。
本发明所述用三个基因连续敲除效果累加的方法构建的高产槐糖脂菌株发酵产物中槐糖脂组分分析：
(1)槐糖脂粗品的制备。两倍体积的色谱纯乙腈添加至1倍体积的发酵液中，充分震荡后，室温静置10min，8,000～10,000rpm常温离心10min。收集上清，50～60℃烘箱干燥后，所得到的槐糖脂粗品用正己烷洗涤两次，去除残余的油酸，再次干燥至恒重。
(2)发酵液中槐糖脂的组分用高效液相色谱HPLC分析。
槐糖脂粗品用色谱纯乙腈溶解，再用0.22μm的有机滤膜过滤，槐糖脂的样品使用分析型HPLC检测。使用的色谱柱为Venusil MP-C18column(250mm×4.6mm,AgelaTechnologies Inc.,USA)。使用二元梯度洗脱，流动相是水和乙腈，流速为1.0～1.5mL/min。HPLC程序如下：0-15min，乙腈由40％升到60％；15-30min，乙腈由60％缓慢上升至70％；30-40min，乙腈由原来的70％上升到90％，并保留5min。进样体积为20～25μL，检测器检测的波长为207nm。
上述步骤(1)中，所述离心转速优选10,000转/分钟。
上述步骤(1)中，所述槐糖脂的烘干温度优选50℃。
上述步骤(2)中，所述HPLC的流速优选1.0mL/min。
上述步骤(2)中，所述HPLC的进样体积优选20μL。
实验检测显示：本发明所述用三个基因连续敲除效果累加的方法构建的高产槐糖脂的菌株ΔrlpΔleu3Δztf1，其摇瓶发酵后槐糖脂产量达到102g/L，比野生型菌株提高了57.19％，尤其是内酯型槐糖脂产量提高了25.25％。具体的，与野生型菌株相比，ΔrlpΔleu3Δztf1的峰3(C18:2DASL)和峰5(C18:1DLSL)的产量明显增加，其中C18:1DLSL在总产物中的比例比野生株中提高了11％。据报道，C18:1DLSL具有最强的生物学活性，包括对人食道癌细胞KYAE 109和KYSE 450均有很强的抑制作用。这使得ΔrlpΔleu3Δztf1菌株成为生产总槐糖脂和C18:1DLSL的优势菌株。
本发明提供了一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用。基于目前所报道的获得槐糖脂高产菌株的方法主要是诱变筛选或是对单基因进行操作，本发明所提供的对槐糖脂产生菌株中与槐糖脂合成相关的三个基因同时进行敲除获得高产槐糖脂菌株的方法为槐糖脂菌株的基因工程改造提供了新的途径，也为开发高产槐糖脂的基因工程菌并大规模工业化生产槐糖脂满足市场需求奠定了基础，应用前景、经济价值和社会效益广阔。
附图说明
图1潮霉素敲除盒的构建。
图2利用同源重组构建rlp敲除菌株Δrlp的原理图。
图3使用本发明构建的单基因敲除菌株的槐糖脂发酵结果。
图4使用本发明构建的三基因连续敲除菌株的槐糖脂发酵结果。
图5使用本发明构建的三基因敲除菌株的槐糖脂组分的HPLC分析结果。
其中，a是野生株发酵液的槐糖脂组分分析结果，b是单敲除株Δrlp发酵液的槐糖脂组分分析结果，c是双敲除株ΔrlpΔleu3发酵液的槐糖脂组分分析结果，d是三敲除株ΔrlpΔleu3Δztf1发酵液的槐糖脂组分分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
一般性说明：
本发明实施例中的出发菌株球拟假丝酵母(S.bombicola)CGMCC 1576是由拟威克酵母变种(Wickerhamielladomercqiaevar.sophorolipid CGMCC 1576更名后的菌株，该菌株是申请人课题组先前专利申请时保藏的菌株，其已于2006年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号是CGMCC 1576。申请人课题组已于2016年公布了球拟假丝酵母基因组序列(Li J,et al.2016)。
质粒pRSH购自上海北诺生物科技有限公司；OMEGA Gel Extraction Kit胶回收试剂盒购自美国omega公司。
YPD/YEPD培养基的组成成分为：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母粉10.0g/L；YPD种子固体培养基还添加琼脂粉20.0g/L。2％的接种量，200rpm，30℃培养。
SC酵母合成培养基(g/L)：酵母氮基1.7，(NH4)2SO4 5.0，酵母合成培养基补充剂1.3，半乳糖20.0(半乳糖替代葡萄糖)，琼脂粉20.0(固体培养基时加)。用于突变体中诱导hph的缺失。
发酵培养基的组成成分为：葡萄糖80.0g/L，酵母粉3.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，Na2HPO4·12H2O 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，菜籽油80ml/L。2％的接种量，200rpm，30℃，7天培养。
实施例1以潮霉素(hph)为标记的单基因敲除盒的构建
(1)以球拟假丝酵母S.bombicola CGMCC 1576的基因组为模板，用引物对rlp-5’flankingfor/rlp-5’flankingrev和rlp-3’flankingfor/rlp-3’flankingrev扩增敲除盒上下游同源臂序列(1kb左右)；以潮霉素筛选标记自删除质粒pRSH为模板，用引物对rec-hphfor/rec-hphrev扩增含有自删除系统的hph抗性表达盒，所有的片段使用高保真酶
Max Super-Fidelity DNA Polymerase进行扩增，用DNA纯化试剂盒OMEGA GelExtraction Kit纯化上游同源臂，潮霉素表达盒和下游同源臂三个目的片段。
(2)通过Double-joint PCR获得融合的目的片段。
先将步骤(1)中纯化得到的rlp上下游同源臂和潮霉素表达盒进行融合PCR，再采用引物对rlp-gfor/rlp-grev进行巢式PCR扩增，最终获得长度约7.4kb的rlp基因敲除盒。构建策略如图1所示。其中，所述rlp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
其中，上述使用到的引物核苷酸序列如下所示：
rlp-5’flankingfor：CTTGCCGAACTACGAGACTGG
rlp-5’flankingrev：CTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCCGAAGTCCTCTTTGGAGTGTTGTAG
rlp-3’flankingfor：AACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTAGAGCCCTCTAATTTATGCTGCC
rlp-3’flankingrev：TGGACTGGTGAAGTTGCGTTTG
rec-hphfor：GCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAG
rec-hphrev：ACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTT
rlp-gfor：ATGCTCTCACTGGAAACATTTACTG
rlp-grev：CAAATACTTGTGGAACTTGAATGAC
rlp-p1：ATGGGCTGGCATCGATCAGTTTC
rlp-p2：CTATCTCATTCCGGGCCGCTTCT。
实施例2野生型球拟假丝酵母(S.bombicola)感受态细胞的制备
(1)将甘油管保藏的S.bombicola接种到5mL YEPD液体试管中，30℃，200rpm活化培养。
(2)将活化后菌液按1％接种量，转接至300mL三角瓶中含有50mL YEPD液体培养基，30℃，200rpm过夜培养至OD600＝1。
(3)无菌环境中，将菌液导入50mL离心管中，4℃，5,000rpm离心5min，收集菌体，并用10mL预冷双蒸水重悬菌液，4℃，5,000rpm离心收集菌体，重复一次双蒸水洗涤步骤。
(4)用4mL预冷的1M的山梨醇重悬菌液，4℃，5,000rpm离心收集菌体。
(5)用4mL预冷的0.1M LiAc(含有2.5mM DTT)悬浮菌体，室温静置10-15min。
(6)4℃，5,000rpm离心收集菌体，再用4mL预冷的1M山梨醇溶液洗涤菌体。用250mL预冷的1M山梨醇溶液，重悬4℃离心收集的菌体，即得到S.bombicola的感受态细胞。
实施例3含有hph抗性标记的单基因敲除株的构建
(1)将50μL制备的S.bombicola感受态细胞加入1.5mL预冷的无菌离心管中，缓慢的加入668ng的上述构建的rlp敲除表达盒，轻轻混匀，置于冰上2分钟。
(2)将混合液在无菌环境中转入预冷的2mm电转杯中，冰浴5min。电穿孔仪参数如下：
(3)用吸水纸擦去电转杯外壁的水，进行电脉冲，脉冲结束立即在电转杯中加入1mL预冷的1M山梨醇，无菌环境中将混合液转入新的1.5mL无菌离心管，并在30℃水浴锅中孵育1h。
(4)准备抗性平板：将含有100mL YEPD固体培养基的300mL三角瓶，微波加热至固体培养基全部溶解，待冷却至培养基不烫手背，立即加入1mL的潮霉素B，充分混匀后，倒入准备好的无菌平板中，20mL左右一个平板。
(5)从孵育的离心管中，取出200μL转化液均匀涂布于上述含有潮霉素的YEPD平板，封口膜封口后，30℃，培养3-4天。
(6)待长出单菌落后，挑取转化子培养，提基因组采用引物对rlp-p1/rlp-p2进行PCR验证，纯化得到含有hph抗性自删除标记的敲除株Δrlp::six。
实施例4去除hph标记的单基因敲除菌株的构建
(1)敲除株Δrlp::six，在不含有潮霉素抗性的SC酵母合成培养基(半乳糖替代葡萄糖，作为碳源)中进行诱导培养，30℃，200rpm培养12h。
(2)在不含潮霉素的YPD固体平板上进行划线分纯，30℃恒温箱孵育3-4天，将单菌落分别点种在不含抗生素和含有潮霉素的YPD固体平板上，30℃恒温箱培养1天。
(3)选取能够在没有抗生素的平板上生长，且在潮霉素的平板上不能生长的单菌落，在不含潮霉素的YPD液体试管中继续培养，最终获得不含潮霉素抗性筛选标记的rlp敲除菌株Δrlp。并用潮霉素表达盒缺失引物进行验证。菌株构建策略如图2所示。
实施例5三基因敲除菌株的构建
(1)与rlp基因敲除盒的构建过程相同，按照rlp基因的敲除方法，使用引物对leu3-5’flankingfor/leu3-5’flankingrev，和leu3-3’flankingfor/leu3-3’flankingrev扩增得到leu3的敲除盒上下游同源臂；使用引物对ztf1-5’flankingfor/ztf1-5’flankingrev，和ztf1-3’flankingfor/ztf1-3’flankingrev扩增得到ztf1的敲除盒上下游同源臂；leu3和ztf1的所有片段经切胶回收纯化后，利用Double-joint PCR方法进行融合扩增，再分别采用引物对leu3-gfor/leu3-grev、ztf1-gfor/ztf1-grev进行巢式PCR扩增，获得leu3和ztf1基因敲除盒；其中，所述leu3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ztf1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
重复上述rlp敲除菌株Δrlp的步骤，在Δrlp中进一步分别敲除槐糖脂合成相关的转录因子基因gcl，ztf1和leu3，获得三个双基因敲除菌株ΔrlpΔztf1，ΔrlpΔleu3和ΔrlpΔgcl。
(2)对得到的上述三个双基因敲除菌株利用发酵培养基发酵7天，分别测定其内酯型槐糖脂、酸型槐糖脂和总槐糖脂产量。其中总槐糖脂产量最高的菌株为ΔrlpΔleu3。
(3)选择总槐糖脂产量最高的双敲除菌株ΔrlpΔleu3作为三基因敲除菌株的起始菌株，在ΔrlpΔleu3中进一步敲除ztf1基因，获得三基因敲除菌株ΔrlpΔleu3Δztf1。该基因型为ΔrlpΔleu3Δztf1的球拟假丝酵母(S.bombicola)工程菌，即为高产槐糖脂的三基因敲除工程菌株。
其中，上述实施例中使用到的引物核苷酸序列如下所示：
rlp-p1：ATGGGCTGGCATCGATCAGTTTC
rlp-p2：CTATCTCATTCCGGGCCGCTTCT
leu3-5’flankingfor：GGGAGGATTACGCAAGGT
leu3-5’flankingrev：CTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATTTATGGCTACCAGTGACTTAG
leu3-3’flankingfor：AACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTCTGGCTCCCTACTGCTCTACT
leu3-3’flankingrev：TCACGCCACTTTGCTTCTC
leu3-gfor：GTGTTGCGGCTTAGTGTCAAATG
leu3-grev：GAACTCAAAGGTCTGCTCTCCAAAC
leu3-p1：ATGAGTGGCCTGGTGGCCTG
leu3-p2：TCATGGGGAAATGTAGGGGAGC
ztf1-5’flankingfor：ATCACCACTACTCCAGCGGTC
ztf1-5’flankingrev：CTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTTAGTGATTTATGCCGTAGCGT
ztf1-3’flankingfor：AACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTTGAATAAATGTGATAACTGTGGGTG
ztf1-3’flankingrev：CTATATATACTCTTGCCCCGCAAC
ztf1-gfor：TCAACTAAGCGGATTGGAGCAC
ztf1-grev：GAGTCTGATGAGGAAAACGAAGTG
ztf1-p1：GTCGCAGGAAACGCAATCAA
ztf1-p2：TGACAACAGGTGGTATTGAGTGAG。
实施例6三基因连续敲除菌株ΔrlpΔleu3Δztf1的发酵
(1)菌种选择：球拟假丝酵母Starmerella bombicola的野生株和三基因连续敲除株ΔrlpΔleu3Δztf1。
(2)菌种活化：将2％(体积/体积)野生株和敲除株的菌悬浮液分别接种到液体YPD种子培养基的试管中，30±2℃，转速为180-220rpm，培养24-36h，待OD600＝1.0时，得发酵种子液。
(3)摇瓶发酵：将步骤(2)得到的野生株和三基因敲除株种子液分别按2％(体积/体积)的接种量转移至含50mL发酵培养基的300mL摇瓶中，在26～30℃，200rpm下培养7～14天，即得到含槐糖脂的发酵液。
所有发酵均有三个重复。发酵罐发酵用量按摇瓶用量比例放大即可。
上述种子液的培养条件优选是：30℃，转速为200rpm，培养30h。
上述摇瓶发酵的条件优选是：30℃，200rpm下培养7天。
实施例7三基因敲除菌株的槐糖脂产量及组分分析
(1)野生型菌株和三基因敲除株在发酵培养基中进行发酵7天，发酵结束后对发酵液取样进行生物量、残余葡萄糖量、槐糖脂产量以及槐糖脂的组分等参数的测定和分析。
(2)发酵液中残余的葡萄糖使用生物传感器SBA-40C来测定。
将发酵液离心取上清，稀释到合适倍数，取25μL进样，发酵液残余葡糖糖含量(g/L)＝n×m/100(n为仪器读数，m为稀释倍数)。
(3)细胞生物量用细胞干重法测定。
一倍体积的发酵液加入5倍体积的正丁醇/乙醇/三氯甲烷(10:10:1)的混合液，振荡充分混匀后，8,000rpm常温离心10min，弃掉上清液，用双蒸水重悬，洗涤两次，在50℃烘箱干燥至恒重。
(4)发酵液中槐糖脂含量采用蒽酮-硫酸法测定。
1mL发酵液加入两倍体积的乙酸乙酯，涡旋振荡充分萃取，室温静置10min，8,000rpm常温下离心10min。取上清液采用蒽酮-硫酸法测定内酯型槐糖脂含量。2mL无水乙醇加入到1mL发酵液中，充分振荡，静置10min，8,000rpm室温下离心10min，用蒽酮-硫酸法测定总糖含量，总槐糖脂的含量为总糖的量去除发酵液中残余葡糖糖量，然后乘以换算系数1.91。
单基因敲除株的产量测定如图3所示，相比野生型菌株，总槐糖脂产量提高了10％～20％。多敲除菌株的产量测定结果如图4所示。
(5)槐糖脂粗品的制备。
两倍体积的色谱纯乙腈添加至1倍体积的发酵液中，充分震荡后，室温静置10min，10,000rpm常温离心10min。收集上清，50℃烘箱干燥后，所得到的槐糖脂粗品用正己烷洗涤两次，去除残余的油酸，再次干燥至恒重。
(6)发酵液中槐糖脂的组分用高效液相色谱HPLC分析。
槐糖脂粗品用色谱纯乙腈溶解，再用0.22μm的有机滤膜过滤，槐糖脂的样品使用分析型HPLC检测。使用的色谱柱为Venusil MP-C18column(250mm×4.6mm,AgelaTechnologies Inc.,USA)。使用二元梯度洗脱，流动相是水和乙腈，流速为1.0mL/min。HPLC程序如下：0-15min，乙腈由40％升到60％；15-30min，乙腈由60％缓慢上升至70％；30-40min，乙腈由原来的70％上升到90％，并保留5min。进样体积为20μL，检测器检测的波长为207nm。
结果如图5所示。槐糖脂产量达到102g/L，比野生型菌株提高了57.19％，尤其是内酯型槐糖脂产量提高了25.25％，其中C18:1DLSL槐糖脂分子的比例提高了11％，这种分子具有很好的抑菌、抗病毒和抗肿瘤等生物活性。统计结果见表1。
表1：统计结果
表1中：NASL非乙酰化酸型槐糖脂，MASL单乙酰化酸型槐糖脂，DASL双乙酰化酸型槐糖脂，DLSL单乙酰化内酯型槐糖脂。
综上所述，本发明成功实现了球拟假丝酵母的高产槐糖脂工程菌株的构建，通过三基因敲除效果累加的方法，获得了槐糖脂产量显著提高的工程菌株(基因型为ΔrlpΔleu3Δztf1的球拟假丝酵母(S.bombicola)工程菌)，为槐糖脂的工业化生产提供了优秀的生产菌株。其中所得的槐糖脂组分中C18:1DLSL槐糖脂分子的比例提高了11％，其具有很好的抑菌、抗病毒和抗肿瘤等生物活性，临床应用前景广阔，同时本发明的工程菌株具有很好的理论研究意义和实际应用价值。
序列表
<110> 山东大学
<120> 一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用
<141> 2021-05-14
<160> 3
<210> 1
<211> 1437
<212> DNA
<213> Starmerella bombicola
<221> rlp基因的核苷酸序列
<400> 1
atgggctggc atcgatcagt ttcgctgtta actctggtgg tattcttggc ctttgggttc 60
caggttgtcg gtgtattttc ccagccaata gcacgaaagc agctatcgat agcaaccgtt 120
ggtgactaca aatatggtat actaggttgg tgtccaaccg acacctctca gaactgctca 180
tcctacggag tgggatacac tttacaggac aactctgata ccaaatggaa cagctccacg 240
caaaaaacac tgagttccat agccatcgtg cacattgtgg cggctggtct cctgctcata 300
acgttattga tgtcatgtgg tacggtctgg agaaatcaga aatactggac tgccgtagaa 360
attatgctca gcttgtgctt cactgctgct gcgctctctt tcgctgctga ggtggcgttg 420
tttcgaacct ctttgaattt tgcaggatgg ttcacgctcg catccaccgt gctttgtgtt 480
gtcgctattg ttgcgttggc tctgatgcag aagagtctgc aagctagtct tggccgcacc 540
aatatcaacg gcaaagacac gctgctgact gatgattcgg tcctgttcgg aagaggcgga 600
gactttgtga ttggtagaga cgatgaaaag atgttgcaag gtcccacgaa atcaggcttc 660
tctaccacat cgctctcaag ttctgcgttt cagatcccca agccgcctca gctgagaaca 720
catggctcag agagtaaata tgagaggatt cccgagagta gaaagggtca aggagatagc 780
tcactccaac aaccaggcat catgtcaaat accaggaatg gcacgcaatc aaattctcgc 840
cttccgcagc taccagtcgg cagcagtgaa tccgtaggag ccatcccaag acagcagcag 900
ggtaactggc agagaggtcc gatcgtccag aataaagcag gcgttccccc agcaagtgca 960
ccaagcggcg gtgctgaaca gcagcaacag aaacaagatc cgaattcaac aaggccgccc 1020
ccagaggctg caacacatca caatgcgaat aataatgcct cttcatacca gaatgctccg 1080
gctcagcaga acgacatgta cgcacagtac tatcgaaaca ctcaaccgta ccaaggcaac 1140
gaggcctcgt actcttacta tccacaaact cagcccaatt accaatacta tcaaaaccca 1200
cagccccaat attatggaca aggaatgaat gctaattacc aacaaccgat ggtttatgga 1260
aatcaaaatg aaagctatca aggtgtccac cctagtgcag gctacgcagc gtataagccg 1320
gccaggcgag gccagtctcg accccaagtc aatcaacgca gtgatctagc gctgcaatca 1380
aacccggatt tcagtcttgg taacctgggt agaaagaagc ggcccggaat gagatag 1437
<210> 2
<211> 2241
<212> DNA
<213> Starmerella bombicola
<221> leu3基因的核苷酸序列
<400> 2
atgagtggcc tggtggcctg caaaaactgc cgccagcaaa aggttagatg cagcggcaga 60
tccgagaatg gcgatccctg cgaccgatgt actcgccgga cacttgattg tgttgtggac 120
aacaattaca agcgcactgt aaagcgaaaa gccattgagg ctctggaggc cgaaattagc 180
gatctcaaaa gaaagttgca cgcagagaca agtaactggg attccgagag cagtgcagca 240
tctagaaggt tgtcacctgc caagtttcag cccccggctc cacgagggct tctcctcaaa 300
agtaagaatg gcactcttct ctcgtcttcg ccggtttacc aggttgagac ctggttttgc 360
ttgcccaaat cgactcaagg gagtcagaat gagcctctga ctctagactc ggcgtcgatt 420
gagcttcttt tcaaagaata cgtctcattt tatcatagag ttttacccgt tgtcgaggtc 480
catagggggc ctgagttcgt gtatggcgct agcgctgctt tattctggac aataatggct 540
attgctagtc gtcgacgcag caaggacctg cccaggggaa tcaacttcga gaagctttgt 600
gacgttcaaa agcagcattt gagcgagatc gctgtctctc cagtgttggg ccagggaaaa 660
tcgtccgagt ttaacctgcc tagcctgtat gccgtccagg catttctatt gtgcacactc 720
tggccaccac cgacagcctc aatcaatgcc gacatgagct ggaataccag cggaatcgcc 780
atactcactg caatcagagc cgggcttcat tgccctggtc acgctcacga ctttgagaga 840
atattcaagt cgaacaaggc gcatcgcaca aatctcagag agcagttagt gacttggctt 900
gcgaccaatg cactaagcca agcgatagcg aacatgttcg gctatccctc cgccgcgaaa 960
tttcaggcgc atagacaata cctcttcaac aacgtcgagc ttccgccgag ggtgaggcat 1020
atgtacgaaa tccaacgcaa cgcccacgaa attgagcaaa gcctgggcca gcttggccag 1080
gctaacggct ctccaagctt agaactctcc atggcgacat ctctcatcag agtgcacgcc 1140
attcggtacg accagataga ggccgaattc ggagagcaaa tggacgcttg gacgatgttc 1200
acgctgcatg ccggtcgagc gcagctcttt tcatattatt tatttggcga cgtggacgaa 1260
aatggtattt tggcattgta caatagttgc cttgcgcttc tcaaccatgt cgtcatccag 1320
ccagacgagt atatgaagta tctccccgtg gtgagcataa tgattctgtg gcaaacagcg 1380
agtgttgtcg ctcgcctata tcactctgag tggagcaaaa atttcgaccg atatagtggc 1440
gagaaattgt actcttctgt cgtgaaaaaa gtcagcttaa gctcggtatt tgaacatgat 1500
cttccatata gagcctctga gatcatggct caaatgtggg gtgcatttag agcagtacgg 1560
cggtctaatc cgggaaaatg catccctttg aagctatctt tgaggagccg catgtctgcg 1620
tctgtgttct ttgactcact atgggcgatg cgcgcaagca cagagattaa atctcaggcc 1680
ccaaccactt tgtcaaaacc aactgttttg aggaccgaaa gcacagcaga taatagcaat 1740
gcctcctcag cttcgccagt gccctctggt gcttctacag atgctgcacc accgcaaaac 1800
ccgcctttca gcgcgcacct accaatgcct gtatcaccag tcgcccctgc cgctattgaa 1860
caaaaaagac cttcaccaaa atactcccca atcactgaat ctgccggagc taactcaggg 1920
tatacacata cgagtccggc agttccctca atagaccaag gaagccgtct cgctggacct 1980
caaccacgat ctaatacttc aaactgggta agcagacaat taccgtccgt ggagtctctg 2040
ctctcaccag aacctggtac cccaggagtg atcaatatca agtccccaat aactcctgtc 2100
tctccagcga tgtcggcgat gatagaccct acgtgggcag atattgatcc cgaagccgcc 2160
acttctatct ggcacgatgt taacgcagtg atggaagact tcggctttgg ccttggagag 2220
ctcccctaca tttccccatg a 2241
<210> 3
<211> 2175
<212> DNA
<213> Starmerella bombicola
<221> ztf1基因的核苷酸序列
<400> 3
atgacgcgtg gcagagtctt taaggaagca cccccgagaa aatcagagtc tctgagatcc 60
ctgagactac gtcgcaggaa acgcaatcaa gatccaacat ccttggaaaa tgagattgaa 120
gacgagaaag gtttgactgt accgccagaa accgaggaaa tgcgcaatga tattgcccag 180
acctctagcg gtcctcattc tgctgtcagt gaagacacaa tgccgccatt aggatctttt 240
gctgctccca agcgtaaatc atcaactcag tcaacgccag ggtcatcctc acctgagtct 300
gccacaagtt cgccgggtaa gcatttgagc gatcagtcct ctaatgtctc ctcaccacgt 360
tcgagacctg ccgtccccaa agtagttgag catgaagata gagactcaga gagttcccat 420
tcttctagaa atgaaaatgc cagctcacca aagacggagt cccgggcagc taacaatacc 480
gcagggaagg ctgcgcccag cattccggga gtccagccag gcagcattcc atggccaaat 540
ccattcttgg gagcccatct accatatgcg ggctctttga gttatgggcc ttttgctggc 600
tcgataccag gcgttgcacc ccccgttatg ctcgctgatt ctattctcag ggatccctcc 660
aaggtcatgc caccaccacc gcagggtttc aacgccctcc cgcagctttc tctgcctcat 720
ggcctctttc cagctccttt gtatcctggg tctttgccat ataacgcagg ttcttggtgt 780
caaatcattg gcccaacagg gcaaccaacg atggcttggg tcccatccag tcctgggccg 840
cagttgcagt cgcagaatag aatttacact ccgtcaagaa ctaagctgaa gccaagatct 900
ccccaaactt ttaaactgac gacctacgaa gcgcaacgag agcatatcat caacgagcaa 960
aacaaagagc ggcttcgcat tcgcgaaatg cgtagggccg aaactctgcg tagatatatg 1020
cggagtggca gcactgaaga agacgcgcat acaaatgaat cagcgcatga aagatccaca 1080
gctgaaaaca ggacgttagg tgaagaaagg agatcttcgg tacctcagag taagtcatcg 1140
gaattgccaa gctcggccca atccaacaat cctgtccccg gtagcacaaa ctatctgggg 1200
acacatattg ctgtccaagg tcgccctata cccatgatcc caggaatggc tgagagttgg 1260
cgcagctgga tccagcaacc aaacaataaa tcggatcaaa caggtaatgc tcacaacagt 1320
ttaccggcta gccttgtgcc agattctcat acattcaaga aatccgggta tttgcgcaat 1380
tctcacaagc tgtatggtaa atcccaaccg agatcgtacg gctatggaga catcatccct 1440
caattcattg aacggaaaga cactattact gaacaggatc gggagagggc tttgaagatg 1500
ctaacagagt cttttgaagt attcaagaaa aaaagacaga gcaagccttc acataatgga 1560
cccaccatag atgagcttgc agactccgct gctctcttag ccaattataa tcgctctgcg 1620
ggattatatg ttcgtaatgt ggctcatcga agaatcgagg aagaatatgc gaaccaacgg 1680
agagactttc acgatgcagt cgatacgctt caaatgccag ctatcaaaaa ctcccaggaa 1740
cgctggatct gcgccctgtg tccagcagaa gcgccgacct tcctttatta caaacatctc 1800
ttgaggcatg cagctcacca cctcgacata aagcccttca agtgcccttt ttgctcaaga 1860
tgttttcgcc gtagtgatac tgcaagaaga catcaattga gctgtgtcca attgtccttg 1920
gcagtcaaag aacgtaatcg taatcgcgct tcagcagggg tttctcgaaa gaacaaacct 1980
gaagcagcca aagtaactcg tggaaatgct aaagacaagg aatcgacctc ggctcacgat 2040
gacgacgaaa cctccgaaga agaactcatt gactctgacg atgatacacg agtaggggat 2100
gagtcgtctg cgggaaatga ggtagtggct cactcaatac cacctgttgt catgcctttg 2160
caagactcga actag 2175
Claims (6)
1.一株高产槐糖脂的三基因敲除工程菌，其特征在于：所述高产槐糖脂的三基因敲除的工程菌株是以球拟假丝酵母(S.bombicola)CGMCC 1576为出发菌株，敲除其响应pH相关的蛋白rlp基因和两个转录因子基因即调控支链氨基酸合成的leu3转录因子及锌指转录因子ztf1获得，其基因型为ΔrlpΔleu3Δztf1；其中所述rlp基因的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，所述leu3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ztf1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.权利要求1所述高产槐糖脂的三基因敲除工程菌的构建方法，步骤是：
(1)敲除盒的构建：对球拟假丝酵母(S.bombicola)CGMCC 1576中响应pH相关的蛋白rlp基因和调控支链氨基酸合成的leu3转录因子及锌指转录因子ztf1两个转录因子基因，分别使用高保真酶
Max Super-Fidelity DNA Polymerase扩增基因rlp、leu3、ztf1编码区的上下游同源臂序列，以潮霉素筛选标记自删除质粒pRSH为模板，用引物对rec-hphfor/rec-hphrev扩增含有自删除系统的hph抗性表达盒；采用OMEGA Gel ExtractionKit胶回收试剂盒纯化rlp上游同源臂、潮霉素表达盒和下游同源臂三个目的片段，利用Double-joint PCR将纯化得到的rlp上下游同源臂和潮霉素表达盒进行融合PCR，再采用引物对rlp-gfor/rlp-grev进行巢式PCR扩增，最终获得rlp基因敲除盒；与rlp基因敲除盒的构建过程相同，使用引物对leu3-5’flankingfor/leu3-5’flankingrev，和leu3-3’flankingfor/leu3-3’flankingrev扩增得到leu3的敲除盒上下游同源臂；使用引物对ztf1-5’flankingfor/ztf1-5’flankingrev，和ztf1-3’flankingfor/ztf1-3’flankingrev扩增得到ztf1的敲除盒上下游同源臂；leu3和ztf1的所有片段经切胶回收纯化后，利用Double-joint PCR方法进行融合扩增，再分别采用引物对leu3-gfor/leu3-grev、ztf1-gfor/ztf1-grev进行巢式PCR扩增，获得leu3和ztf1基因敲除盒；其中，所述rlp基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述leu3基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述ztf1基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；
(2)利用醋酸锂方法制备野生型球拟假丝酵母(S.bombicola)感受态细胞，将线性的rlp敲除盒电转化感受态细胞，在潮霉素平板的筛选下发生同源双交换的菌株能获得潮霉素抗性基因的表达，在潮霉素平板上能够生长，即可获得含有hph标记的rlp基因敲除株Δrlp::six；
(3)利用半乳糖诱导Δrlp::six中hph表达盒的自删除，去除rlp基因敲除株Δrlp::six中的hph标记，最终获得不含潮霉素抗性筛选标记的敲除菌株，命名为Δrlp；
(4)以Δrlp为出发株，以如上所述方法继续敲除转录因子leu3，获得基因型为ΔrlpΔleu3的双敲除菌株；
(5)在得到的双敲除菌株ΔrlpΔleu3中，以如上所述方法继续敲除转录因子ztf1，获得基因型为ΔrlpΔleu3Δztf1的球拟假丝酵母(S.bombicola)工程菌，即高产槐糖脂的三基因敲除工程菌株。
3.权利要求1所述高产槐糖脂的三基因敲除工程菌在发酵生产槐糖脂中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵生产槐糖脂的方法是：
将三基因敲除的ΔrlpΔleu3Δztf1基因工程菌接种到装有5mL YPD种子培养基的试管中，30±2℃，转速为180-220rpm，培养24-36h，待OD600＝1.0时，得发酵种子液；将得到的种子液按体积比2％的接种量转移至含50mL发酵培养基的300mL摇瓶中，在26～30℃，200-300rpm下培养7～14天得到含槐糖脂的发酵液；所有发酵均有三个重复，发酵罐发酵用量按摇瓶用量比例放大；取发酵液样品对槐糖脂产量、菌体干重、残余葡萄糖量各参数进行测定，评价所用工程菌及其发酵生产效果；其中，
所述YPD种子培养基的组成成分为：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨20.0g/L，酵母粉10.0g/L；YPD种子固体培养基还添加琼脂粉20.0g/L；
所述发酵培养基的组成成分为：葡萄糖80.0g/L，酵母粉3.0g/L，KH2PO4 1.0g/L，Na2HPO4·12H2O 1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，菜籽油80ml/L。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述种子液的培养条件是：30℃，转速为200rpm，培养30h。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述摇瓶发酵的条件是：30℃，200rpm下培养7天。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110542207.1A CN113151029B (zh) | 2021-05-18 | 2021-05-18 | 一株产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110542207.1A CN113151029B (zh) | 2021-05-18 | 2021-05-18 | 一株产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113151029A true CN113151029A (zh) | 2021-07-23 |
| CN113151029B CN113151029B (zh) | 2022-10-11 |
Family
ID=76876824
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110542207.1A Active CN113151029B (zh) | 2021-05-18 | 2021-05-18 | 一株产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113151029B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105483153A (zh) * | 2015-10-23 | 2016-04-13 | 山东金城生物药业有限公司 | 酿酒酵母代谢工程改造提高s-腺苷-l-蛋氨酸生产水平的方法 |
| CN106434394A (zh) * | 2016-12-08 | 2017-02-22 | 山东省药学科学院 | 出芽短梗霉alb1基因敲除突变株及其应用 |
| WO2019067356A1 (en) * | 2017-09-27 | 2019-04-04 | Locus Oil Ip Company, Llc | MATERIALS AND METHODS FOR RECOVERING PETROLEUM IN BITUMINOUS SANDS |
| CA3081329A1 (en) * | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Locus Ip Company, Llc | Matrix fermentation systems and methods for producing microbe-based products |
| CN110168072A (zh) * | 2017-01-06 | 2019-08-23 | 轨迹Ip有限责任公司 | 新发酵系统和方法 |
| CN111218408A (zh) * | 2020-01-21 | 2020-06-02 | 天津科技大学 | 一株高效生产苹果酸的黑曲霉菌株、构建方法及应用 |
-
2021
- 2021-05-18 CN CN202110542207.1A patent/CN113151029B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105483153A (zh) * | 2015-10-23 | 2016-04-13 | 山东金城生物药业有限公司 | 酿酒酵母代谢工程改造提高s-腺苷-l-蛋氨酸生产水平的方法 |
| CN106434394A (zh) * | 2016-12-08 | 2017-02-22 | 山东省药学科学院 | 出芽短梗霉alb1基因敲除突变株及其应用 |
| CN110168072A (zh) * | 2017-01-06 | 2019-08-23 | 轨迹Ip有限责任公司 | 新发酵系统和方法 |
| WO2019067356A1 (en) * | 2017-09-27 | 2019-04-04 | Locus Oil Ip Company, Llc | MATERIALS AND METHODS FOR RECOVERING PETROLEUM IN BITUMINOUS SANDS |
| CA3081329A1 (en) * | 2017-10-31 | 2019-05-09 | Locus Ip Company, Llc | Matrix fermentation systems and methods for producing microbe-based products |
| CN111218408A (zh) * | 2020-01-21 | 2020-06-02 | 天津科技大学 | 一株高效生产苹果酸的黑曲霉菌株、构建方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113151029B (zh) | 2022-10-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103025862B (zh) | 新型破囊壶菌类微藻及用其生产生物油的方法 | |
| CN111549073B (zh) | 基因sng1缺失在提高酿酒酵母香草醛抗性中的应用 | |
| US10889841B2 (en) | Oleaginous yeast variant, method for obtaining thereof and use thereof for lipid production | |
| CN113980993B (zh) | Mal33基因缺失在提高酿酒酵母对木质纤维素水解液抑制物耐受性中的应用 | |
| CN111471602A (zh) | 一种利用纤维素高效合成γ-亚麻酸的卷枝毛霉工程菌株的构建方法及应用 | |
| CN109385391B (zh) | 菌株及其构建方法，以及其用于发酵生产耐高温黄原胶的应用 | |
| CN114517158A (zh) | 一种正常培养条件下高产油及淀粉的工程藻及其构建方法与应用 | |
| CN113151029B (zh) | 一株产槐糖脂的三基因敲除工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN112725205B (zh) | 一株酵母属菌种及其筛选方法和应用 | |
| CN113174352B (zh) | 枯草芽孢杆菌hf1突变体及其构建方法与应用 | |
| JP5512613B2 (ja) | Ｃｙｓｔｏｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ属の酵母によるオイルの製造方法 | |
| KR20110122424A (ko) | 신규 유지성 미세조류 ｋｒｓ１０１ 균주 및 이를 이용한 바이오오일의 제조방법 | |
| CN108642136A (zh) | 一种嗜热属真菌pcr模板的制备方法 | |
| CN112143681B (zh) | 一株可产阿魏酸酯酶的贝莱斯芽孢杆菌及其应用 | |
| CN111154679B (zh) | 一种黄曲霉毒素降解菌的高效发酵方法 | |
| Buddiwong et al. | Screening of thermotolerant yeast isolated from sugarcane plantations in Northeastern part of Thailand | |
| CN110029081A (zh) | 过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的工程菌及其构建方法 | |
| CN112175850B (zh) | 一种高产核酸的工业酿酒酵母及其应用 | |
| CN110713940B (zh) | 一种高产重油出芽短梗霉菌株及其构建方法与用途 | |
| CN113913448B (zh) | 一种提高甲基营养菌吡咯喹啉醌产量的方法及应用 | |
| CN118256402B (zh) | 一株耐酸枯草芽孢杆菌及其在发酵生产肌苷中的应用 | |
| CN117417869B (zh) | 一株约氏黄杆菌w24h及其生产2,3-丁二醇的应用 | |
| CN115820440B (zh) | 一株四乙酰植物鞘氨醇高产诱变菌株及其应用 | |
| CN111909952B (zh) | 构建食烷菌敲除酰基辅酶a硫脂酶基因的方法和应用 | |
| CN107142219B (zh) | 一株产三萜类化合物的滴孔菌及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |