CN110029081A - 过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的工程菌及其构建方法 - Google Patents

Abstract

过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的工程菌及其构建方法。过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，核苷酸序列如SEQ ID No1。利用PCR扩增克隆碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN，将基因ccpN片段连接到表达载体上，导入地衣芽孢杆菌中，通过四环素抗性筛选获得目的基因的工程菌。构建方法：设计PCR引物；将目的基因插入到PHY300PLK‑PamyL‑TTamyL组成型启动子PamyL下游多克隆位点，得过表达质粒，导入到E.coli DH5α中扩增；将过表达质粒电转化地衣芽孢杆菌，筛选转化子，验证得地衣芽孢杆菌重组菌。

Description

过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的工程菌及 其构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程及微生物发酵工程，尤其是涉及过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的工程菌及其构建方法。

背景技术

细菌在多种碳源共存的环境中优先利用一种(通常是葡萄糖)的现象被称为分解代谢产物阻遏效应(CCR)。碳控制蛋白CcpN是细胞中碳代谢的一个中心调控蛋白，主要通过抑制糖异生基因(gapB、pckA)和甘油降解途径(glpFK、glpD)调节中央碳代谢(Bioscience,biotechnology,and biochemistry,2009,73(2):245-259；Journal of Biotechnology,2002,184(15):4288-4295)。其也是革兰氏阳性菌，特别是芽孢杆菌属碳分解代谢物阻遏的转录抑制因子，在糖酵解和糖异构条件下都起代谢作用，但在糖酵解过程中其作为阻遏物的作用更明显(Molecular Microbiology,2005,55(5):1435-1451)。

当培养基中存在葡萄糖时，CcpN的表达量急剧增加，糖酵解途径增强，柠檬酸循环受抑制，甘油代谢途径的碳代谢流被切断，加快菌体生长，碳通量重新分配到多糖产生途径，使菌体从合成γ-PGA的代谢模式转向分泌多糖絮凝剂，有利于多糖的合成；当葡萄糖耗尽，CcpN表达量下调，甘油代谢的抑制作用被解除，甘油的消耗速率开始加快，有利于γ-PGA的生物合成。

生物絮凝剂是一种新型絮凝剂，由真菌和细菌等微生物产生，与传统絮凝剂相比，易被生物降解，无毒，无二次污染。组成的絮凝物质主要是多糖，多肽，蛋白质，脂类和核酸(AppliedMicrobiology and Biotechnology,1998,50(6):682-691)。其中，多糖和多肽(γ-PGA)是目前研究报告中最常见的两种微生物絮凝物质(Carbohydrate Polymers,2011,84(1):454-458)。γ-PGA作为絮凝活性物质在食品、发酵、水处理、制糖工业和微藻收集等领域具有广阔的应用前景(Molecular Microbiology,2005,57(3):717-726；Biotechnology Advances,2018,36,1424–1433)。多糖絮凝剂也广泛应用于去除工业废水中的色素、悬浮物和重金属离子(Pb²⁺，Cd²⁺，Zn²⁺)(Colloids and Surfaces B-Biointerfaces,2005,44(4):179-186.；Bioresource Technology,2007,98(2):361-367.)以及对高岭土溶液(Biotechnology Letters,1996,18(12):1459-1464；BioresourceTechnology,2018,255,171–179)和微观小球藻(Science of The Total Environment,2018,634:488-496)的絮凝。然而，低产率、低絮凝活性和高价格等因素限制了生物絮凝剂的规模和产业化，以往，大部分关于生物絮凝剂的报道多指向培养基、生长条件的优化和应用领域(ProcessBiochemistry,2014,49(4:576-582)，关于地衣芽孢杆菌的遗传和代谢途径对絮凝剂合成的调控的报道比较少。对于芽孢杆菌在合成多糖和γ-PGA两种絮凝活性物质的代谢途径的了解不够深入(Biotechnology Advances,2018,36,1424–1433)，不利于对该菌的代谢进行调控，因此，通过基因工程改造得到高产优良菌株提高，进一步提高生物絮凝剂活性及产量，同时为絮凝活性物质成分代谢的研究奠定基础，具有重要的经济价值及社会意义。

发明内容

本发明的第一目的在于针对现有技术中生物絮凝剂絮凝活性不高、调控机理不明等问题，提供过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因(ccpN)。

本发明的第二目的在于提供一株过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌。

本发明的第三目的在于提供过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌的构建方法。

本发明的第四目的在于提供过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌在制备多糖絮凝剂中的应用。

所述过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因(ccpN)利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，ccpN基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

利用PCR扩增克隆碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN，将基因ccpN片段连接到表达载体上，然后利用电转化的方法导入到地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中，通过四环素抗性筛选获得目的基因的工程菌。

所述表达载体为游离载体，优选的所述表达载体为本实验室构建的表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL。所述表达载体的启动子为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因的启动子PamyL。

所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)为实验室自主筛选的菌株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformisCGMCC 2876)，已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876(参见中国专利CN200910111262.4，专利名称为利用地衣芽孢杆菌制备生物絮凝剂的方法)。

所述过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，包括以下步骤：

1)设计碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的PCR引物；

2)将扩增得到的目的基因插入到PHY300PLK-PamyL-TTamyL组成型启动子PamyL下游多克隆位点，得到PHY300－ccpN过表达质粒；

3)将PHY300－ccpN过表达质粒导入到E.coli DH5α中扩增；

4)将经提取、浓缩后的PHY300－ccpN过表达质粒电转化地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h，于四环素抗性LB固体培养基上涂布，在37℃培养12h，筛选转化子；

5)转化子经质粒提取后，通过菌落PCR和双酶切进行验证，获得过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的地衣芽孢杆菌重组菌HN301-6。

所述过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌在制备多糖絮凝剂中应用。

所述过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌在制备多糖絮凝剂中应用的具体步骤如下：

1)使用接种环于四环素抗性培养基上取一环地衣芽孢杆菌重组菌HN301-6单菌落接种于液体种子培养基中，35～37℃，200r/min培养12～16h，制备种子培养液；

2)以体积百分比为4％的接种量接种于多糖絮凝剂发酵培养基中，在30～40℃，150～300r/min条件下培养50～60h，进行发酵产多糖絮凝剂实验；

3)将多糖絮凝剂发酵后所得发酵液离心收集上清液，将上清液用乙醇沉淀法沉淀溶解于水后冷冻真空干燥即得。

在步骤3)中，所述乙醇沉淀法的具体步骤为用三倍体积的乙醇提取，4℃静置12h，离心的速度为6000rpm，离心时间为15min，离心温度为4℃。

碳代谢调控蛋白CcpN是细胞中碳代谢的另一个中心调控蛋白，是革兰氏阳性菌碳分解代谢物阻遏的另一个调节者。它主要通过抑制糖异生基因(gapB、pckA)和甘油降解途径(glpFK、glpD)调节中央碳代谢。它在糖酵解和糖异构条件下都起代谢作用，但在糖酵解过程中作为阻遏物的作用更明显。在葡萄糖存在时，CcpN会抑制一系列二次分解蛋白。CcpN能够增强糖酵解途径，并且抑制碳代谢流进入TCA循环，加快菌体生长，同时对菌体合成γ-PGA和多糖都有一定作用。基于以上理论分析，过表达ccpN基因，有利于提高絮凝活性物质的产量和絮凝活性，有效降低成本，同时为探究地衣芽孢杆菌CGMCC 2876合成两种絮凝活性物质的代谢机制奠定基础。

本发明的技术效果在于：提供了一株能提高多糖絮凝剂产量和活性的过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的地衣芽孢杆菌构建方法。将碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因(ccpN)克隆至大肠杆菌－芽孢杆菌穿梭质粒构建重组表达载体，通过电转化的方法将重组质粒导入到地衣芽孢杆菌，构建了重组地衣芽孢杆菌HN301-6。构建的重组菌在发酵过程中，比原始菌株的多糖絮凝剂产量增加了6.87％，絮凝活性提高了97.51％。该株工程菌可用于多糖絮凝剂的工业化生产，能够提高产量并降低成本。

附图说明

图1为重组表达质粒PHY300-ccpN的PCR和酶切验证结果图。在图1中，泳道1：重组质粒pHY300-ccpN；泳道2：Kpn I和Spe I双酶切重组质粒PHY300-ccpN；泳道3：Kpn I单酶切重组质粒PHY300-ccpN。Marker：TAKARA DL5000DNA Marker。

图2为地衣芽孢杆菌CGMCC 2876及其过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因工程菌HN301-6多糖絮凝剂产量及絮凝活性比较图。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。。

实施例1:重组表达载体PHY300-ccpN的构建

设计PCR引物，用于扩增ccpN基因片段。

上下游引物分别为：

上游引物：CGACTAGTCTACATGATTTCATTTTCAGATAAGCCGAC(下划线为SpeI酶切位点)

下游引物：TGGGTACCTTGCAGATTGTCAAAGAGAAC(下划线为KpnI酶切位点)

以Bacillus licheniformis CGMCC 2876基因组DNA为模板，进行如下PCR程序:(1)94℃,5min；(2)94℃,30s；(3)63℃,30s；(4)72℃,1min，步骤(2)～(4)重复35个循环；(5)72℃,10min，4℃保存。

PCR反应体系如表1所示。

表1

将PCR产物和表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL分别用限制性内切酶Kpn I和SpeI双酶切，回收后，将PCR产物和表达载体以3︰1的比例用T4DNA连接酶在4℃连接12h构建重组表达载体PHY300-ccpN。

实施例2:地衣芽孢杆菌基因工程菌HN301-6的构建

将PHY300-ccpN过表达质粒经提取及浓缩后，电击转入地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h后，涂布四环素抗性平板，再在37℃培养12h，筛选转化子。转化子经质粒提取后，利用菌落PCR及双酶切进行验证(如图1)。从而获得过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌工程菌HN301-6。

电转化具体步骤如下：

1)地衣芽孢杆菌感受态的制备：

(1)在50mL LB培养基中接种一环B.licheniformis,37℃，200r·min^-1过夜培养12h；

(2)取过夜培养液1mL接入50mL生长培养基中，于37℃，200r·min^-1培养至对数中后期，直到细胞OD₆₀₀达到0.85～0.95；

(3)细胞冰浴30min，停止生长后，(取预先预冷的50mL干净离心管，加入40mL停止生长的培养液)再于4℃以6 000r·min^-1离心收获细胞；

(4)用冰冷(0℃冰水浴)的EP缓冲液40mL悬浮细胞四次(每次都在0℃冰水浴中晃动，使沉淀悬浮，可用枪轻轻吹吸)，并最终将细胞悬浮于1mL EP缓冲液中,使细胞浓度达到(1～1.3)×10¹⁰CFU·mL^-1；

(5)将感受态细胞分装于1.5mL离心管(预冷过的)中，每管100μL，再直接进行下一步实验或-70℃保存感受态；

地衣芽孢杆菌的电转：

(1)将感受态细胞和1～5μg质粒混合物转移到冰上预冷的0.1cm间隙的电击池中；

(2)以1800V、5ms脉冲转化；

(3)迅速往电击池中加入1mL复苏培养基，将菌悬液回收到2mL离心管中，于37℃，200r/min培养5h；

(4)将菌液涂布于四环素抗性平板上，于37℃培养直到平板上出现菌落。

实施例3:利用地衣芽孢杆菌及其基因工程菌发酵制备多糖絮凝剂

将地衣芽孢杆菌CGMCC 2876出发菌株和实施例2所述的基因工程菌接种于液体种子培养基中，37℃，200r/min培养16h，制备种子培养液，以体积百分比为4％的接种量接种于多糖絮凝剂发酵培养基中，37℃，200r/min培养，进行发酵产多糖絮凝剂实验。56h后分别测定发酵液絮凝活性及多糖絮凝剂产量(如图2)。ccpN基因过表达重组基因工程菌发酵液的最终絮凝活性为5973.33U·mL^-1，比原菌株发酵液最终絮凝活性3024.28U·mL^-1提高97.51％；ccpN基因过表达重组基因工程菌多糖絮凝剂的粗提产量为9.49g·L^-1，较原菌株粗提产量8.88g·L^-1提高了6.87％。

生物絮凝剂的絮凝活性可采用以下方法测定：

称取高岭土粉末0.2g与50mL刻度试管中，依次加入2.5mLCaCl₂溶液(10g·L^-1)和1mL待测液，蒸馏水加至与刻度线平齐。充分混合后，迅速置于比色皿中，静置5min后，用紫外可见分光光度计在波长550nm下测定吸光度。以蒸馏水做空白测定。计算公式如下：

絮凝活性(U·mL^-1)＝(B-A)/B×100×D

式中，A：待测样品的OD₅₅₀值，B：空白培养基的OD₅₅₀值，D：发酵液稀释倍数。

2)生物絮凝剂的提取纯化方法：

(1)取10mL发酵液8000rpm离心5min，除菌体，收集上清液，重复操作两次。

(2)上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下静置12h。

(3)8000rpm离心10min，弃上清液，加10mL去离子水溶解。上清液中加入3倍体积的无水乙醇，4℃条件下静置12h后，离心弃上清液。

(4)冷冻真空干燥。

本发明公开了一株过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的地衣芽孢杆菌及其构建方法。将碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因(ccpN)克隆至大肠杆菌－芽孢杆菌穿梭质粒构建重组表达载体，通过电转化的方法将重组质粒导入到地衣芽孢杆菌，构建了重组地衣芽孢杆菌HN301-6。构建的重组菌在发酵过程中，比原始菌株的多糖絮凝剂产量增加了6.87％，絮凝活性提高了97.51％。该株工程菌可用于多糖絮凝剂的工业化生产，能够提高产量并降低成本。

序列表

<110> 厦门大学

<120> 过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的工程菌及其构建方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 600

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)

<400> 1

ctacatgatt tcattttcag ataagccgac taaaattttt gtcatgttcg ttttcgtaat 60

tcttcccaca acttcatagc ctttttctgt atcttttaca acaggcagtg cgtcaatttg 120

tttttcgata agcatcttgg caatgtccaa aatgaaatcg tcgcgcctgc aaagcgtaat 180

gttcggcatt ctcgtcataa tgatatggac gggtattgaa gggagctcct gtttgccgat 240

gctggctctg agcaagtctt ttcgtgaaag tacaccgact aagatggcat tatcatcaac 300

gacaaaaagc gttcctacgt cctctaaaaa catcgtgcaa atcgcatcat aaacggagac 360

attttcatga atgaccaccg gaatggactg gaagtctttc acctgcagct ttttcagctt 420

atcagccaag agctgcgtgc ccgtctttcc cgtgtagaaa taaccgaccc gcggccttgc 480

ttccaaaaat cctgacatcg tcaatatcgc caagtccgga cgaagcgtag cccttgtcag 540

attcagcttt tccgcgatat gttctccggt aatcggtccg ttctctttga caatctgcaa 600

Claims (10)

1.过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN，其特征在于利用PCR扩增克隆多糖絮凝剂合成途径获得，ccpN基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No：1所示。

2.一株过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于利用PCR扩增克隆碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN，将基因ccpN片段连接到表达载体上，然后利用电转化的方法导入到地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)中，通过四环素抗性筛选获得目的基因的工程菌。

3.如权利要求2所述一株过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述表达载体为游离载体。

4.如权利要求2所述一株过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述表达载体为表达载体PHY300PLK-PamyL-TTamyL。

5.如权利要求2所述一株过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述表达载体的启动子为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因的启动子PamyL。

6.如权利要求5所述一株过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌，其特征在于所述地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)已于2009年01月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCCNo.2876。

7.如权利要求2所述过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)设计碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的PCR引物；

2)将扩增得到的目的基因插入到PHY300PLK-PamyL-TTamyL组成型启动子PamyL下游多克隆位点，得到PHY300－ccpN过表达质粒；

3)将PHY300－ccpN过表达质粒导入到E.coli DH5α中扩增；

4)将经提取、浓缩后的PHY300－ccpN过表达质粒电转化地衣芽孢杆菌，37℃复苏5h，于四环素抗性LB固体培养基上涂布，在37℃培养12h，筛选转化子；

5)转化子经质粒提取后，通过菌落PCR和双酶切进行验证，获得过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的地衣芽孢杆菌重组菌HN301-6。

8.如权利要求2所述过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌在制备多糖絮凝剂中应用。

9.如权利要求8所述应用，其特征在于所述过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因ccpN的地衣芽孢杆菌基因工程菌在制备多糖絮凝剂中应用的具体步骤如下：

1)使用接种环于四环素抗性培养基上取一环地衣芽孢杆菌重组菌HN301-6单菌落接种于液体种子培养基中，35～37℃，200r/min培养12～16h，制备种子培养液；

2)以体积百分比为4％的接种量接种于多糖絮凝剂发酵培养基中，在30～40℃，150～300r/min条件下培养50～60h，进行发酵产多糖絮凝剂实验；

3)将多糖絮凝剂发酵后所得发酵液离心收集上清液，将上清液用乙醇沉淀法沉淀溶解于水后冷冻真空干燥即得。

10.如权利要求9所述应用，其特征在于在步骤3)中，所述乙醇沉淀法的具体步骤为用三倍体积的乙醇提取，4℃静置12h，离心的速度为6000rpm，离心时间为15min，离心温度为4℃。