CN108277191A - 通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用 - Google Patents

通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108277191A
CN108277191A CN201810333598.4A CN201810333598A CN108277191A CN 108277191 A CN108277191 A CN 108277191A CN 201810333598 A CN201810333598 A CN 201810333598A CN 108277191 A CN108277191 A CN 108277191A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ccpn
gene
bacillus licheniformis
knockout
bacillus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810333598.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108277191B (zh
Inventor
陈守文
蔡冬波
朱江
占杨杨
李俊辉
段茂华
楼丽君
陈晓斌
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lifecome Biochemistry Co ltd
Original Assignee
Lifecome Biochemistry Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lifecome Biochemistry Co ltd filed Critical Lifecome Biochemistry Co ltd
Priority to CN201810333598.4A priority Critical patent/CN108277191B/zh
Publication of CN108277191A publication Critical patent/CN108277191A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108277191B publication Critical patent/CN108277191B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/32—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bacillus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C12N15/03—Bacteria

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fodder In General (AREA)

Abstract

本发明提供一种通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法及所得菌株及其应用，本发明采用基因工程的方法通过敲除地衣芽孢杆菌DW2基因组中的ccpN基因构建得到了地衣芽孢杆菌DW2ΔccpN，该菌株与地衣芽孢杆菌DW2相比，其杆菌肽产量提高了16%以上。

Description

通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用
技术领域
本发明涉及地衣芽孢杆菌菌株改造领域，尤其是一种通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用。
背景技术
杆菌肽是由枯草芽孢杆菌和地衣芽胞杆菌产生的一种环肽类抗生素。杆菌肽作为一种广谱性抗生素，能有效的抑制革兰氏阳性菌及部分革兰氏阴性菌。并且，杆菌肽几乎不会在动物的肠道内被吸收，且排泄迅速、没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。
杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，杆菌肽的组成氨基酸包括鸟氨酸（Orn）、D-苯丙氨酸（D-Phe）、异亮组氨酸（His）、D-天冬氨酸（D-Asp）、天冬酰胺（Asn）、赖氨酸（Lys）、D-谷氨酸（D-Glu）、半胱氨酸（Cys）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile） 和缬氨酸（Val）11种氨基酸。
转录抑制因子CcpN在菌体的碳代谢中具有重要作用，但目前关于转录抑制因子CcpN的调控机理的研究鲜有报道。现有技术中也没有转录抑制因子CcpN与杆菌肽合成之间关联性的相关报道，因此，转录抑制因子CcpN是否会影响杆菌肽的产量不可预知。
虽然现有技术（《过量合成核黄素的枯草芽孢杆菌的代谢工程》，娄凯，天津大学博士学位论文，2002年07月01日）中有公布“通过敲除枯草芽孢杆菌中的ccpN基因（即转录抑制因子CcpN的基因）构建的枯草芽孢杆菌能够过量合成核黄素”，但是，杆菌肽与核黄素属于完全不同的两种产物，杆菌肽为以初级代谢中产生的各种相应氨基酸为前提物质经非核糖体肤合成途径合成的次级代谢产物，而核黄素为以葡萄糖作为前提物质经磷酸戊糖途径合成的一类碳代谢化合物。因此，该现有技术也并未给出“转录抑制因子CcpN与杆菌肽合成之间关联性”的技术启示，转录抑制因子CcpN是否会影响杆菌肽的产量仍然是不可预知的。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）的方法，所得到的基因工程菌的杆菌肽产量有了大幅提升。
通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ccpN基因的上游同源臂和ccpN基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将ccpN基因的上游同源臂和ccpN基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；
（2）采用限制性内切酶Xba Ⅰ和Sac I对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；
（3）准备质粒 T2(2)-ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和Sac I对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；
（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到ccpN基因敲除质粒T2(2)-ori- ccpN；
（5）将ccpN基因敲除质粒T2(2)-ori- ccpN转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ccpN基因的上游臂或ccpN基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（6）挑选ccpN基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与ccpN基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除ccpN基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN；
其中，其中上述步骤中的地衣芽胞杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：M2011344的地衣芽孢杆菌DW2；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的ccpN基因为SEQUENCE LISTING中所示。
本发明人首次尝试构建敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌DW2ΔccpN，得到了大幅提高地衣芽胞杆菌DW2的杆菌肽产量的技术效果，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。与地衣芽孢杆菌DW2相比，通过本发明构建得到的地衣芽孢杆菌DW2 ΔccpN的杆菌肽产量提高了16%以上。本发明的研究结果表明：敲除转录抑制因子基因ccpN是一种十分有效的提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量的方法。
本发明的目的之二在于根据上述通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN。
本发明的目的之三在于根据上述通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN在抗菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。
所述种子发酵的培养基配方为：6-10g/L蛋白胨，2-6g/L酵母浸出粉，6-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2。
所述生产发酵的培养基配方为：60-100g/L豆粕；15-45g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO3和0.5-5 g/L (NH4)2SO4。
附图说明
图1为ccpN基因的上游同源臂和下游同源臂的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNAmarker，泳道2为ccpN基因的上游同源臂，泳道3为ccpN基因的下游同源臂；
图2为地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN的PCR验证图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为地衣芽胞杆菌DW2的验证条带；泳道3为地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN的验证条带；
其中，图1-图2中的DNA marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000 bp，3000 bp，2000 bp，1500 bp，1000 bp，750bp，500 bp，250 bp，100 bp。
具体实施方式
通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ccpN基因的上游同源臂和ccpN基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将ccpN基因的上游同源臂和ccpN基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；
（2）采用限制性内切酶Xba Ⅰ和Sac I对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；
（3）准备质粒 T2(2)-ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和Sac I对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；
（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到ccpN基因敲除质粒T2(2)-ori- ccpN；
（5）将ccpN基因敲除质粒T2(2)-ori- ccpN转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ccpN基因的上游臂或ccpN基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（6）挑选ccpN基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与ccpN基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除ccpN基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN；
其中，其中上述步骤中的地衣芽胞杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：M2011344的地衣芽孢杆菌DW2；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的ccpN基因为SEQUENCE LISTING中所示。
通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法的具体实施方式如下：
1、步骤（1）的具体操作步骤为：
以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ccpN基因的上游同源臂（所用引物为ccpN-F1和ccpN-R1，如图1所示，ccpN基因的上游同源臂为605 bp）和ccpN基因的下游同源臂（所用引物为ccpN-F2和ccpN-R2，如图1所示，ccpN基因的下游同源臂为592bp）；再利用重叠延伸PCR方法将ccpN基因的上游同源臂和ccpN基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A（1197 bp）；
其中，用于扩增ccpN基因的上、下游同源臂的引物为：
ccpN-F1：GCGAGCTCACATCCGCTACGATGTGGTGG、
ccpN-R1：ATTTCATTTTCAGATAAGCAAGTCGATAACATATTATAACGC、
ccpN -F2：GCGTTATAATATGTTATCGACTTGCTTATCTGAAAATGAAAT、
ccpN -R2：GCTCTAGACCACCTCGGGAACGATCGGA；
2、步骤（2）的具体操作步骤为：
采用限制性内切酶XbaⅠ和Sac I对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A（1195 bp）；
3、步骤（3）的具体操作步骤为：
准备质粒 T2(2)-ori（其中，质粒T2(2)-ori的构建方法为：将来自pE194质粒的194-ori、来自于pDG780质粒的卡那霉素抗性基因、来自质粒pBluescript II SK(+)-X52328的pUC-ori通过PCR反应扩增，并回收、酶切。按照194-ori，卡那霉素抗性基因，pUC-ori的顺序连接。此构建方法参考文献下述文献：郭兴华,熊占等(1991)枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.生物工程学报7(3):224-229和彭清忠,张惟材等(2002)短短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建.生物工程学报18(4):438-441），并采用限制性内切酶XbaⅠ和Sac I对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori（4250bp）；其中，所述的限制性内切酶XbaⅠ和Sac I限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；
4、 步骤（4）的具体操作步骤为：
将步骤（2）得到的酶切基因片段A与步骤（3）得到的线性质粒片段经DNA 连接酶（市售的DNA连接酶均可，通常为T4 DNA连接酶）进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证（所用引物为：T2-F和T2-R）。若转化子的PCR验证结果为：在1347bp处出现电泳条带，说明敲除载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：敲除载体T2(2)-ΔccpN)；
将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到ccpN基因敲除质粒T2(2)-ori- ccpN；并对ccpN基因敲除质粒T2(2)-ori- ccpN进行PCR验证，其验证引物为：
T2-F：ATGTGATAACTCGGCGTA、
T2-R：GCAAGCAGCAGATTACGC；
5、 步骤（5）的具体操作步骤为：
将ccpN基因敲除质粒T2(2)-ori- ccpN转入地衣芽孢杆菌DW2中，在37℃的条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证（所用引物为：T2-F和T2-R），得到阳性转化子；将阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的转接培养数次后，并以T2-F和ΔccpN -KYR为引物（或以T2-R与ΔccpN-KYF为引物）进行菌落PCR检测单交换菌株，扩增出1356bp或2010bp长度的条带，即证明为单交换菌株；
其中，ΔccpN - KYF和ΔccpN - KYR的序列为:
ΔccpN -KYF： CGAGCGGCATCGTCCAAA、
ΔccpN-KYR： TCGCTTTGTCGTTGAGGC；
6、步骤（6）的具体操作步骤为：
将步骤（5）得到的PCR检测出现1356bp条带的单交换菌株和步骤（5）得到的PCR检测出现2010bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证（引物为ΔccpN -KYF和ΔccpN -KYR）。若转化子的PCR验证结果为：在2115bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽孢杆菌DW2；在1461 bp处出现电泳条带时，说明DW2的基因组上的ccpN基因成功敲除，该转化子为阳性转化子。本发明的验证结果如图2所示，转化子的菌落PCR验证结果为：在1461 bp处出现电泳条带，证明该转化子为阳性转化子。随后针对该阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的ccpN敲除菌株（即地衣芽孢杆菌DW2ΔccpN）。
本发明人还根据上述通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到了地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN。
本发明人根据上述通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN在抗菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。
所述种子发酵的培养基配方为：6-10g/L蛋白胨，2-6g/L酵母浸出粉，6-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2。
所述生产发酵的培养基配方为：60-100g/L豆粕；15-45g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO3和0.5-5 g/L (NH4)2SO4。
本发明人根据上述地衣芽孢杆菌DW2ΔccpN在杆菌肽生产中的应用步骤提供了14种实施例，并在表1中分别列举了实施例1-实施例14的种子培养基和发酵培养基的配方。
表1
其中，上述实施例1-14中均采用本发明构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN菌株；种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽孢杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1%接种于装有5mLLB培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1%接种量接种于种子发酵的培养基（实施例1-14中的种子发酵的培养基均为液体培养基，若需要种子发酵培养基为固体培养基时，仅需在原有的种子发酵的培养基（即液体培养基）的配方的基础上加琼脂 15 ~ 18 g/L即可）后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液；生产发酵的具体步骤为：向500mL三角瓶中装入25～150mL的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2%（体积百分比），转速180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。上述种子发酵的具体步骤和生产发酵的具体步骤均为现有技术。本发明人采用高效液相色谱(HPLC)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中杆菌肽的产量进行测定。测定条件具体为：使用Agilent 1200液相色谱仪检测；色谱柱为Hypersil BDS C18(5μm,4.6 mm×250 mm) ；流动相为A:B＝35:65(A相：100mL pH6.0磷酸盐缓冲液到300 mL水中混合均匀；B相：520 mL甲醇与40 mL乙腈混合均匀)；流速：1.0mL/min；柱温30°C；紫外检测器波长：254 nm；进样量20μL。根据杆菌肽标准品制作的标准曲线计算出上述实施例1-14的生产发酵的菌液中杆菌肽的产量（见表2）。
表2
从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于现有技术的地衣芽孢杆菌DW2来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN的生产发酵的菌液中杆菌肽效价有了大幅提升（提高16%-22%），说明：本发明的技术方案在提高地衣芽孢杆菌杆菌肽产量方面具有重大应用价值。
序列表
<110> 绿康生化股份有限公司
<120> 通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用
<130> DS-P18016
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 700
<212> DNA
<213> 地衣芽胞杆菌DW2(Bacillus licheniformis)
<400> 1
atgcgttata atatgttatc gacttttata cataacgaac gaattgtgag cttcggctta 60
aaggtggtga gtacgatcga actaaataaa cgtcaggagc atattttgca gattgtcaaa 120
gagaacgggc cgattaccgg agaacatatc gcggaaaagc tgaatctgac aagagctaca 180
cttcgtccgg acttggcgat attgacgatg tcaggatttt tggaagcaag gccgcgggtc 240
ggttatttct acacgggaaa gacgggcacg cagctcttgg ctgataagct gaaaaagctg 300
caggtgaaag acttccagtc cattccggtg gtcattcatg aaaatgtctc cgtttatgat 360
gcgatttgca cgatgttttt agaggacgta ggaacgcttt ttgtcgttga tgataatgcc 420
atcttagtcg gtgtactttc acgaaaagac ttgctcagag ccagcatcgg caaacaggag 480
ctcccttcaa tacccgtcca tatcattatg acgagaatgc cgaacattac gctttgcagg 540
cgcgacgatt tcattttgga cattgccaag atgcttatcg aaaaacaaat tgacgcactg 600
cctgttgtaa aagatacaga aaaaggctat gaagttgtgg gaagaattac gaaaacgaac 660
atgacaaaaa ttttagtcgg cttatctgaa aatgaaatca 700

Claims (5)

1.通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出ccpN基因的上游同源臂和ccpN基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将ccpN基因的上游同源臂和ccpN基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；
（2）采用限制性内切酶Xba Ⅰ和Sac I对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；
（3）准备质粒 T2(2)-ori，并采用限制性内切酶XbaⅠ和Sac I对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；
（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到ccpN基因敲除质粒T2(2)-ori- ccpN；
（5）将ccpN基因敲除质粒T2(2)-ori- ccpN转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到ccpN基因的上游臂或ccpN基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（6）挑选ccpN基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与ccpN基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除ccpN基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN；
其中，其中上述步骤中的地衣芽胞杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：M2011344的地衣芽孢杆菌DW2；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的ccpN基因为SEQUENCE LISTING中所示。
2.根据权利要求1所述的通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN。
3.根据权利要求1所述的通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN在抗菌肽生产中的应用，其特征在于，该应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。
4.根据权利要求3所述的通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN在抗菌肽生产中的应用，其特征在于，所述种子发酵的培养基配方为：6-10g/L蛋白胨，2-6g/L酵母浸出粉，6-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2。
5.根据权利要求3所述的通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔccpN在抗菌肽生产中的应用，其特征在于，所述生产发酵的培养基配方为：60-100g/L豆粕；15-45g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO3和0.5-5 g/L (NH4)2SO4。
CN201810333598.4A 2018-04-13 2018-04-13 地衣芽孢杆菌DW2ΔccpN在杆菌肽生产中的应用 Active CN108277191B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810333598.4A CN108277191B (zh) 2018-04-13 2018-04-13 地衣芽孢杆菌DW2ΔccpN在杆菌肽生产中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810333598.4A CN108277191B (zh) 2018-04-13 2018-04-13 地衣芽孢杆菌DW2ΔccpN在杆菌肽生产中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108277191A true CN108277191A (zh) 2018-07-13
CN108277191B CN108277191B (zh) 2020-12-29

Family

ID=62811497

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810333598.4A Active CN108277191B (zh) 2018-04-13 2018-04-13 地衣芽孢杆菌DW2ΔccpN在杆菌肽生产中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108277191B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108913645A (zh) * 2018-08-08 2018-11-30 绿康生化股份有限公司 一种敲除malR的地衣芽孢杆菌菌株及构建方法和应用
CN110029081A (zh) * 2019-04-15 2019-07-19 厦门大学 过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的工程菌及其构建方法
CN110904174A (zh) * 2019-12-16 2020-03-24 湖北大学 缺失亮氨酸脱氢酶基因的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103937735A (zh) * 2014-05-05 2014-07-23 绿康生化股份有限公司 一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法和应用
US20140273122A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Mitsui Chemicals, Inc. Novel microorganism of the genus bacillus

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140273122A1 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Mitsui Chemicals, Inc. Novel microorganism of the genus bacillus
CN103937735A (zh) * 2014-05-05 2014-07-23 绿康生化股份有限公司 一种敲除PBSX的xpf基因的地衣芽孢杆菌菌株及其构建方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
RACHINGER,M.等: "Bacillus paralicheniformis ATCC 9945a, complete genome", 《GENBANK DATABASE》 *
SABINE BRANTL等: "Characterisation of Bacillus subtilis Transcriptional Regulators Involved in Metabolic Processes", 《CURRENT PROTEIN AND PEPTIDE SCIENCE》 *
鲍帅帅: "地衣芽胞杆菌产杆菌肽的代谢及工艺优化研究", 《中国优秀硕士学位论文工程科技Ⅰ辑》 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108913645A (zh) * 2018-08-08 2018-11-30 绿康生化股份有限公司 一种敲除malR的地衣芽孢杆菌菌株及构建方法和应用
CN108913645B (zh) * 2018-08-08 2019-06-28 绿康生化股份有限公司 敲除malR的地衣芽胞杆菌菌株在杆菌肽生产中的应用
WO2020029910A1 (zh) * 2018-08-08 2020-02-13 绿康生化股份有限公司 一种敲除malR的地衣芽胞杆菌菌株及构建方法和应用
US11111516B2 (en) 2018-08-08 2021-09-07 Lifecome Biochemistry Co., Ltd malR-knockout Bacillus licheniformis strain, construction method and use
CN110029081A (zh) * 2019-04-15 2019-07-19 厦门大学 过表达碳分解代谢物阻遏效应转录抑制因子基因的工程菌及其构建方法
CN110904174A (zh) * 2019-12-16 2020-03-24 湖北大学 缺失亮氨酸脱氢酶基因的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用
CN110904174B (zh) * 2019-12-16 2022-08-30 湖北大学 缺失亮氨酸脱氢酶基因的地衣芽胞杆菌在异源蛋白生产中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108277191B (zh) 2020-12-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Fernández-Moreno et al. The act cluster contains regulatory and antibiotic export genes, direct targets for translational control by the bldA tRNA gene of Streptomyces
Li et al. Overexpression of ribosome recycling factor causes increased production of avermectin in Streptomyces avermitilis strains
CN108277191A (zh) 通过敲除ccpN基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用
CN108559708A (zh) 强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌的制备方法及所得菌株及其应用
CN108913645B (zh) 敲除malR的地衣芽胞杆菌菌株在杆菌肽生产中的应用
CN102174420A (zh) 生产高纯度头孢菌素c的基因工程菌及其应用
Thiara et al. Interplay of novobiocin-resistant and-sensitive DNA gyrase activities in self-protection of the novobiocin producer, Streptomyces sphaeroides
CN111304235B (zh) 强化cysP表达的地衣芽胞杆菌及其制备方法和应用
CN101591634B (zh) 一种生产尼可霉素z的方法及其专用培养基和工程菌
CN108531438A (zh) 一种通过改造氨基酸代谢途径制备地衣芽孢杆菌的方法及所得菌株的应用
CN105200078A (zh) 一种黑曲霉基因敲除方法
CN108018304A (zh) 一种高产杆菌肽的地衣芽孢杆菌菌株和制备方法及其应用
CN108441508A (zh) 通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用
CN106148378A (zh) 通过糖多孢红霉菌SACE_Lrp基因途径提高红霉素产量
Wei et al. Enhancement and selective production of oligomycin through inactivation of avermectin’s starter unit in Streptomyces avermitilis
CN103290032B (zh) 硫藤黄链霉菌抗生素调控基因及提高链霉菌抗生素产量的方法
CN104263738A (zh) Fas ii抑制剂abx的生物合成基因簇
CN108441507A (zh) 通过敲除lysE基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用
CN109182240A (zh) 敲除phoP基因的地衣芽胞杆菌菌株及构建方法和应用
Kawachi et al. Identification by gene deletion analysis of a regulator, VmsR, that controls virginiamycin biosynthesis in Streptomyces virginiae
CN111139208A (zh) 一种伊短菌素高产工程菌及其制备方法和应用
CN102993168B (zh) 链黑菌素类似化合物及其制备方法、用途
CN108865965A (zh) 强化YugT表达的地衣芽孢杆菌菌株及制备方法和应用
CN110343650A (zh) 一种高产两性霉素b的重组结节链霉菌及其应用
CN114875095B (zh) 一种丙氨酰美登醇及其合成方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant