CN112442510A - 一种耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法 - Google Patents

一种耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法 Download PDF

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Abstract

一种耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法。包括：a选择受CCR抑制的目的基因，如ackA、ycgE、ptsH、budA、acsA、xylA与sucC等，确定其cre box的位点及碱基序列；b设计一组与cre box共有序列目标片段相似性为30～100％的gRNA，确保能实现多个目标cre box片段的编辑；c构建含有CRISPR/Cas9基因座和gRNA的整合型质粒，并转入芽孢杆菌，实现对基因组多个cre box位点的编辑。采用本发明提出的基因改造方法，能同时解除多个基因的CCR阻遏效应，从而增加细菌的次级代谢产物，能够得到一种高分泌型基因工程受体菌。CCR效应的解除，提高了该工程菌的葡萄糖耐受性，使其具有较强的细胞分泌能力，能够作为微生物发酵的受体细胞。

Description

一种耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法
技术领域
本发明涉及分子生物学与基因工程领域，特别是一种耐糖高分泌型基因工程受体菌基因改造和构建方法。
背景技术
现在工业中使用的常见工程受体菌一般为大肠杆菌与枯草芽孢杆菌等，利用基因重组技术将特定目的蛋白基因导入受体菌中，从而得到需要的蛋白，再经分离纯化处理得到用于治疗的蛋白药物等。其中大肠杆菌具有遗传背景清楚、受体系统完备、生长迅速和培养简单等优点，但大肠杆菌的产物繁杂，不易分离而且具有多种内毒素，在工业应用方面受限。枯草芽孢杆菌同样具有生长快、培养简单、遗传背景清楚同时不含内毒素的优点，但遗传不稳定且受体系统不完备。
微生物对碳源的利用有一定的先后次序，它们总是优先利用易于分解的碳源，例如葡萄糖。而首先被利用的碳源的分解物，会抑制其它碳源的利用，这种抑制会影响糖代谢相关的基因或操纵子的调控和表达水平，这种现象被称为碳分解代谢物阻遏(CarbonCatabolite Repression CCR)。许多糖代谢相关基因中都存在一段相似的回文序列，在基因转录起始点附近，是一种顺式作用元件，这段回文序列的突变会导致对应基因单一糖原抑制作用的消失，但不影响基因表达，这一序列被称为crebox。在工业应用中许多菌种都存在这种效应，抑制了菌种对碳源的利用。在工业生产中CCR效应会降低细胞比生长速率，导致产能降低。本发明中采用的短小芽孢杆菌在自然界中存在广泛，能产生并分泌多种蛋白酶，有改造成优势基因工程菌的潜力。
发明内容
本发明目的是解决现在使用的工程受体菌含有内毒素或遗传不稳定，以及各类工程受体菌在工业应用中受CCR效应限制等问题，并提高工业产率，提供一种耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法。本发明使用新型CRISPR/Cas9基因编辑技术，采用一种非专一性gRNA引导Cas9蛋白同时编辑多个基因的crebox顺式元件，解除CCR效应构建耐糖高分泌型基因工程受体菌。通过这种方法可获得用于构建各类高产基因工程受体菌株。
本发明的技术方案：
一种耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术一次性同时编辑多位点crebox序列，导致转换与颠换等多种突变，解除短小芽孢杆菌的CCR效应，得到耐糖高分泌型工程菌，包括以下步骤：
1)确定糖代谢相关基因中待编辑的目的基因，所述目标基因均为糖代谢途径中具有CCR效应且含有crebox这一顺式元件的基因，如ackA、ycgE、ptsH、budA、acsA、xylA与sucC等等，确定目的基因中cre box的序列及位置，cre box约为14～15bp，通式为：WWGNAANCGNWNNCW。
2)根据多个目的基因crebox的序列以及其附近20bp碱基，设计多组目标片段，对多个目的基因的多组目标片段分析比对后，设计出与单个基因目标片段序列相似性为30～100％的几种非特异性gRNA序列。所设计的目标片段序列包含部分或全部的crebox序列，约为4～15bp。
3)将设计合成的gRNA与pCas9质粒连接构成重组质粒，分别采用两种方法进行质粒重组：一种是将所设计的多个gRNA序列重组到同一个pCas9质粒中；另一种是将多个gRNA序列分别与pCas9质粒连接构成多种重组质粒。
4)将重组质粒转入大肠杆菌中复制扩增，并提取转入短小芽孢杆菌中对目的基因进行编辑，构建重组菌株Bacilluspumilus LG3145。
5采用重测序法检验目的基因cre box突变类型，得到以cre box片段为中心，上下游200～500bp内摆动式突变，包括颠换和转化。被编辑后的细胞同时发生多种形态变化，包括产生多种色素，菌落光滑且色彩绚丽，液体培养时出现大量分泌物。采用电镜可观察到菌细胞壁外出现荚膜或糖被。
所选用短小芽孢杆菌具体名称为Bacillus pumilus SH-B9，NCBI中基因编号为CP011007.1。
选用质粒为pCas9，编号为#42876，来源为Addgene。
本发明的优点和有益效果：
本发明能一次性同时编辑多个基因的crebox序列，可产生转换与颠换等多种突变类型，解除了短小芽孢杆菌的CCR效应，获得了一种耐糖高分泌型菌株，可作为构建基因工程受体菌。本发明所得到的重组短小芽孢杆菌可作为一种高效的“细胞工厂”，其糖代谢不再受到葡萄糖的抑制，糖代谢下游相关的溢流代谢得到加强，次级代谢物，如抗菌肽、色素和胞外多糖的分泌量增加。在工业生产中，可利用高浓度的葡萄糖等碳源进一步刺激分泌，得到更大的产量。
附图说明
图1为Bacilluspumilus SH-B9改造前后细胞扫描电子显微镜图。
图2为Bacilluspumilus SH-B9改造前后在LB固体培养基上的菌落图。
图3为Bacilluspumilus SH-B9改造前后在LB液体培养基中生长状态图。
图4为Bacilluspumilus LG3145胞外蛋白酶活性鉴定图。
图5为七个目标基因crebox以及其上下200bp左右的DNA重测序结果。其中，明确突变位点为有阴影部分，n为不明确类型的突变位点。另框选出每个基因中所选的目标片段。
具体实施方式
下面结合附图及具体实例对本发明进行阐述：
实施例1：
一、重组质粒的构建
1、gRNA的设计
确定糖代谢途径中具有CCR效应且含有crebox这一顺式元件的目的基因，具体选取如下七个目标基因：
ackA UP12_RS13195 acetate kinase
ycgE UP12_RS01730 aminotransferase
ptsH UP12_RS06700 phosphocarrierprotein HPr
budA UP12_RS16915 acetolactate decarboxylase
acsA UP12_RS13395 acetyl-CoA synthetase
xylA UP12_RS09365 xylose isomerase
sucC UP12_RS07835 succinate-CoAligase[ADP-forming]subunitbeta
确定目标基因中crebox序列及具体位置。
利用gRNA进行定位后Cas9蛋白对结合位点5’端大约3bp处进行切割的特性，选取cre box以及其后20bp的序列选择PAM为NNG对目标片段进行目标片段设计，每个基因都对应着多组可能的目标片段，对七个基因目标编辑片段分析后进行归纳总结，根据目标片段的相似性进行分组，设计一条gRNA可同时对相似度较高的几个目标基因进行剪切，最终设计出三个gRNA序列，如表1所示。目标片段序列包含部分或全部的cre box序列，约为4～15bp。例如ycgE的目标片段序列CGCACCAAATGCGCCAGACG与cre box序列TTGCCAATGCTG的重合度为4bp。acsA的目标片段序列GTGGAAACGCTACCATCAGT与cre box序列GTGGAAACGCTACCA的重合度为15bp。若低于4bp可能会出现无法编辑目标cre box序列基因片段的现象。
表1：设计的三个gRNA序列及其与各个基因目标片段相似度
Figure BDA0002805539030000041
*采用模式菌株Bacillus.subtilis168(NC_000964.3)功能相同的基因名称命名。
2、gRNA与pCas9质粒重组
琼脂糖凝胶电泳
1)制备0.8％琼脂糖凝胶：称取0.24g琼脂糖置于锥形瓶中，加入30mL 1×TAE，微波炉高火加热煮沸1-2min至琼脂糖全部融化，摇匀，即成0.8％琼脂糖凝胶液。稍稍静置一会儿冷却到不烫手加入RbGreen染色剂3uL。
2)胶块制备：取电泳槽内制胶槽洗干净，晾干，放入制胶玻璃板。将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。将稍冷却的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上，铺平整个玻璃板表面形成胶层。室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中。添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板。
3)加样：在点样板上将2-5μL酶切后的质粒或质粒原液与1～2μL 6x溴酚蓝混合后用10uL移液枪吸取加入胶块上梳子形成的空洞中，每加完一个样品，更换一个枪头，以防污染，加样时小心不要碰坏样品孔周围的凝胶面。并加入3uLDNAmarker作为对照。
4)电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压100V，样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动，当溴酚蓝移动到距离胶板，下沿约2-3cm处时，停止电泳。
5)结束电泳后取出凝胶，在化学成像仪中观察，显示10000bp稍前处有明显条带。割胶回收(试剂来自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司DNA快速回收收试剂盒)
6)在化学发光成像仪的紫外灯光下切割下对应条带的胶块。
7)将胶块放入1.5mL离心管中，称量凝胶重量。按重量比1:3(即100mg胶加入300μL溶液A)加入溶液A，混合后55～60℃水浴10分钟,期间振荡助溶2-3次。再加入50μLB震荡混匀。
8)将混合液置于离心柱中。静置2分钟，12000rpm离心30s。
9)弃滤液，加入500uL溶液C于离心柱中12000rpm离心30s弃液体。
10)重复步骤4。
11)12000rpm再次离心1min，甩干剩余液体以除去残余酒精。
12)将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置5～10min，使乙醇挥发殆尽。
13)加入20～60μL溶液D(溶液D用前50℃预热)，静置2min。
14)12000rpm离心2min，管底溶液即为所需DNA。将DNA贮存于-20℃。
在pCas9质粒中选取合适的酶切位点即BsaI双位点，用BsaI限制性内切酶进行剪切，载体线性化并形成粘性末端，经电泳验证并进行切胶回收后保存。在设计好的Cax，Cac和Cpt gRNA的寡核苷酸两端加上BsaI识别位点，经退火后获得与酶切质粒互补的粘性末端，采用T4连接酶将gRNA插入pCas9质粒BsaI位点，构建成重组质粒。
按如下方法建立酶切体系：
混合下列溶液于一个无菌的微量离心管中
Figure BDA0002805539030000051
37℃温育60min。
连接反应体系如下。
在200μLPCR薄壁管中混合下列试剂。
Figure BDA0002805539030000052
22℃温育6～8小时，即可得到重组质粒：pCas9-Cax，pCas9-Cac和pCas9-Cpt。
二、CRISPR/Cas9编辑目的基因crebox
1、质粒提取操作方法(试剂来自TaKaRaMiniBEST PlasmidPurificationKitVer.4.0)
实验前确认Solution I中是否加入了RNaseA；Buffer wB中是否加入了无水乙醇。
实验操作前将SolutionⅢ置于4℃(或冰上)预冷后使用。
1)大肠杆菌的培养。从平板培养基上挑选单菌落接种至2μg/ml的含有氯霉素的液体LB培养基中，37℃过夜培养(培养12-16小时，培养超过16小时细胞将难以裂解，质粒收量也会随之降低)。
2)取1～4ml的过夜培养菌液，12,000rpm离心2分钟，弃上清。
3)用250μL的SolutionI(含RNaseA)充分悬浮细菌沉淀。
注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器(Vortex)等剧烈振荡使菌体充分悬浮。
4)加入250μL的Solution II轻轻上下翻转混合5～6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。轻轻颠倒混合，不可剧烈振荡，此步骤不宜超过5分钟。
5)加入350μL的4℃预冷的Solution I，轻轻上下翻转混合5～6次，直至形成紧实凝集块，然后室温静置2分钟。
6)室温12,000rpm离心10分钟，取上清。此时4℃离心不利于沉淀沉降。
7)将试剂盒中的Spin Column安置于Collection Tube.上。
8)将操作步骤6的上清液转移至Spin Column中，12,000rpm离心1分钟，弃滤液。
9)将500μL的Buffer WA加入Spin Column中，12.000rpm离心30秒钟，弃滤液。
10)将700山的Buffer WB加入Spin Column中，12.000rpm离心30秒钟，弃滤液。
11)重复操作步骤10)。
12)重新将SpinCoumn安置于Cleen Tube上，1.000rpm离心1分钟，除尽残留洗液。
13)将Spin Column安置于新的1.5m的离心管上，在SpinColunn膜的中央处加入50μL的灭菌水或Elution Bufer室温静置1分钟。将灭菌水或Elution Bffer加热至60C使用时有利于提高洗脱效率。
14)12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。
将重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，在1.5mL无菌离心管中加入质粒DNA1μL和200μL感受态细胞，混匀，在冰上放置30min，42℃的恒温水浴上90S，快速将离心管放到冰浴中，冰浴1～2分钟。向离心管中加入1mL预热至37℃的LB培养液，37℃振荡培养45分钟，离心浓缩菌体，弃上清。用LB(约150μL)液体培养基悬浮菌体，然后涂布到含有氯霉素的LB固体平板上，37℃恒温培养。转接到液体LB培养后提取质粒。
2、进行原生质体制备与转化
1)从培养24hr的LB平板上，挑取新鲜的Bacilluspumilus SH-B9单个菌落，接种于5mLLB液体培养基中，培养16～18hr。
2)次日取2％菌液接种于新的5mLLB液体培养基中，培养8hr至对数生长期末期。取5mL菌液在室温下12000rpm离心1min，弃上清。
3)加1mLSMMP和溶菌酶，使溶菌酶的终浓度达到0.4mg/mL，在37℃作用45min，制备原生质体。之后，用4000rpm离心10min除去溶菌酶，原生质体重新悬浮于0.05mLSMMP，得到“原生质体高渗悬浮液”。
4)将待转化的质粒DNA与等体积的2×SMM溶液混匀，然后加入0.05mL待转化菌株的“原生质体高渗悬浮液”。
5)混匀后立即加入40％的PEG4000溶液0.15mL，37℃水浴保温2分钟后立即加入0.5mLSMMP溶液以终止PEG4000的作用，然后以3000rpm离心10分钟。
6)弃上清液后用1mLSMMP溶液洗涤一次，3000rpm离心10分钟弃上清液后，再用0.5mL SMMP重新悬浮，在37℃水浴中保温培养90min。
7)将菌悬液涂布于CMR选择再生培养基上，37℃培养24～48h后，挑选转化子。
分别将三种质粒转入Bacilluspumilus SH-B9中，得到重组BacilluspumilusLG3145。经扫描电子显微镜与原子力显微镜检测后，发现有大量的分泌物并长出荚膜，如附图1所示，表明菌种基因改变后，细胞壁的性状发生较大；LB固体培养基上的菌落颜色由原始菌株的白色变为黄色，且菌落边缘由粗糙变为光滑如附图2所示，证明菌种基因改变后，分泌物有变化；采用LB液体培养时，表面出现大量白色分泌物如附图3所示，初步证明基因的突变，导致分泌物增多。
实施例2
葡萄糖发酵培养基(GYN)：2g酵母粉，0.05g MgSO4·7H2O，加入1％体积的尿素母液(20％0.05Mpa灭菌20min)，按不同浓度加入葡萄糖。加无离子水至100mL，pH 7.2～7.5，0.08Mpa灭菌20min。
挑取重组Bacilluspumilus LG3145在4μg/ml的含有氯霉素的液体培养基中培养12小时后取200μL加入100ml葡萄糖发酵培养基中150rpm，37℃震荡培养24个小时观察生长状况。并使用紫外分光光度计每两小时取样测定细菌浓度，Bacilluspumilus LG3145在高糖的情况下比野生菌生长状况要好很多。
将重组Bacilluspumilus LG3145在不同浓度的葡萄糖发酵培养基中培养，Bacillus pumilus LG3145的耐糖能力显著提升，耐糖度可到40g/100ml。
经扫描电子显微镜与原子力显微镜检测后，发现菌体外分泌物比在LB液体培养基中培养的时候更多，且会出现大糖被的现象。这些表型的改变显示改造菌的部分CCR效应被解除，crebox序列有突变。
基因测序结果表明七个目标基因的crebox及其附近都发生了突变，突变数量与类型列于表2，具体突变位点如附图5所示。结果表明，sucC基因的突变数目较少，其目标片段与Cax-gRNA相似性仅为30％；而ackA基因的突变数目较多，其目标片段与Cac-gRNA相似性达到70％，说明gRNA与目标片段相似度越高特异性越高，如果将相似度控制在一定范围(30～100％)，能很好的控制Cas9蛋白的编辑范围。
表2：七个目标基因cre box附近突变数目与类型
Figure BDA0002805539030000081
实施例3
重组短小芽孢杆菌胞外蛋白活性测定
1、双层脱脂奶粉固体培养基制备：下层：2.5g琼脂溶于100ml的去离子水中，121度30min高压灭菌，溶液铺在培养皿底层放凉凝固。上层：2g脱脂奶粉，2.5g琼脂溶于100ml去离子水中，105度20min高压灭菌，得到2％牛奶培养基，溶液铺在凝固好的下层琼脂上，放凉凝固。
2、从平板上挑取单菌落，接种于含有5mL LB培养基的试管中，37℃，120-200r/min过夜培养，取1mL菌液转种于接种到100mL LB培养基的250mL三角瓶中，37℃，120-200r/min培养。每隔两小时取1ml，12000r离心5min,得上清液取10ul上清液点在平板上检测发酵液中蛋白酶的活性。
实验结果如附图4所示，不同时间的发酵液均出现了明显的水解圈，表明采用本发明方法构建的重组短小芽孢杆菌Bacilluspumilus LG3145产生了一定量的外分泌蛋白，且具有较强的蛋白质水解活性。

Claims (5)

1.一种耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术一次性同时编辑多位点crebox序列，导致转换与颠换的多种突变，解除短小芽孢杆菌的CCR效应，得到耐糖高分泌型工程菌，步骤如下：
1)在糖代谢相关基因中挑选目的基因，并确定目的基因的crebox序列及位置；
2)根据目的基因的cre box序列以及其附近20bp碱基设计多组目标片段，对多个目的基因的多组目标片段对比分析确定gRNA序列；
3)将已经确定的gRNA序列与pCas9质粒重组构成重组质粒；
4)将重组质粒转入大肠杆菌中进行扩增和纯化，再转入短小芽孢杆菌中对目的基因进行编辑，构建重组菌株Bacilluspumilus LG3145。
2.根据权利要求1所述耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法，其特征在于：所设计的gRNA序列与多个基因的目标片段序列具有30％～100％的相似性，能够控制Cas9蛋白在基因组中的脱靶范围，实现一个gRNA对多个目标基因的编辑功能。
3.根据权利要求1所述耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法，其特征在于：用于一次性同时编辑多位点cre box序列的gRNA，其所对应的目标片段含cre box序列的4～15bp。
4.根据权利要求1所述耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法，其特征在于：所述目标基因均为糖代谢途径中具有CCR效应且含有cre box这一顺式元件的基因。
5.根据权利要求1所述耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法，其特征在于：所述重组质粒的构建采用如下两种方法：一种是将设计的能够一次性同时编辑多位点cre box序列的多条gRNA分别与多个pCas9质粒重组为多种重组质粒；另一种是将能够一次性同时编辑多位点crebox序列的多条gRNA同时与同一个pCas9质粒重组构成重组质粒。
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