CN107502606A - 一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法，包括先通过经典碱裂解法获得粗分离的质粒DNA，然后依次加入异丙醇、NH4Ac溶液、RNase A、NaCl，再加入PEG6000和NaCl的混合溶液，期间使用TE溶液溶解沉淀，通过无水乙醇重新沉淀，通过70%乙醇洗涤沉淀并配合离心操作，干燥后最终用TE溶液溶解沉淀，获得目的质粒。本发明能很好的去除内毒素对质粒DNA的污染，本发明所使用的所有试剂均为实验室常备的化学试剂，操作方法简洁，易于掌控，适合大规模质粒的提取。本发明所获得的质粒浓度可达5mg/mL，且内毒素低于5EU/μg，质粒可用于酶切、DNA序列的测序、细胞转染、病毒包装以及临床动物免疫实验。
Description
技术领域
本发明涉及质粒的提取方法，尤其涉及一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法。
背景技术
质粒是染色体外能进行自主复制的遗传单位，是可以把外源基因导入细菌进行扩增和表达的载体，是基因工程的主要工具。应用质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。研究表明，高质量的质粒是细胞转染、核酸疫苗、基因治疗等成功的基础。随着基因重组药物的研究和应用的快速发展，对重组质粒的需求量不断增加，常规的实验室制备方法已经不能很好达到要求，因此，摸索一种可靠的大规模的质粒提取方法具有重要意义。
目前常见的质粒大量提取的方法有分子克隆提供的碱裂解法、煮沸裂解法、商业化的试剂盒法。
传统的碱裂解法指用碱和SDS处理大规模细菌培养物，分离质粒DNA，是目前应用最为广泛的制备质粒DNA方法。但该过程不能对内毒素进行去除，内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的一种成分，为一种热源物质，含有内毒素的物质一旦注入动物体内可引起发热、微循环障碍、内毒素休克及散播性血管内凝血等毒性作用；在分子生物学实验中，内毒素的存在会降低质粒的转染效率和细胞的表达效率。
煮沸裂解法对温度控制要求较高，使得煮沸法在实验室的制备中稳定性较低，污染不易去除，不适合大规模质粒的提取。
试剂盒方法快速但费用高，不适于大规模质粒的提取。
发明内容
本发明的目的在于提供一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法，既能去除内毒素，又适合大规模质粒的提取。
本发明是这样实现的：一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法，包括以下步骤：
步骤S1，进行细菌培养，进行细胞重悬，获得含有质粒DNA的细菌培养物；
步骤S2，加入适量的NaOH-SDS溶液进行混合，离心，获得含粗分离的质粒DNA的上清液，使用滤纸过滤后将上清液移入离心管中；
步骤S3，在离心管中加入异丙醇初步沉淀质粒，离心弃去上清液；加入TE溶液溶解沉淀，加入NH4Ac溶液后，离心保留上清液；在上清液中加入无水乙醇重新沉淀，获得较为纯化的质粒DNA，加入TE溶液溶解沉淀；
步骤S4，先加入NaCl；再加入PEG6000和NaCl的混合溶液，混匀；置冰上放置20-40min，离心弃去上清液，加入无水乙醇，离心弃去上清液，保留沉淀；
步骤S5，用70%乙醇洗涤沉淀，干燥后用TE溶液溶解，获得目的质粒。
采用上述技术方案，步骤S1为质粒的培养方法。步骤S2为常规的碱裂解法。步骤S3中，高浓度NH4Ac溶液的加入使蛋白杂质很好地沉淀，通过乙醇沉淀去除了残留的异丙醇对质粒的影响。步骤S4对内毒素进行了去除，提高了所提取质粒DNA的质量。步骤S5通过70%的无水乙醇的洗涤沉淀，去除残留的盐离子对质粒DNA的影响。
作为本发明的进一步改进，所述步骤S3和步骤S4之间还包括步骤F:加入RNase A以去除RNA。RNase A是指核糖核酸酶 A，用来去除 DNA 样品中的 RNA。采用此技术方案，在步骤S3和步骤S4之间加入RNase A，对RNA的去除效果优于经典碱裂解法中在TE缓冲液中加入RNase A，更好地去除了RNA的污染。
作为本发明的进一步改进，在所述步骤S1具体包括：在含有抗性LB平板上培养目的菌落，取适量的目的菌落接种于含有抗性LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜，将过夜培养菌液全部倒入离心瓶中，离心，弃上清液，用振荡器打散细胞，在振荡状况下逐步加入TE溶液；直到细胞重悬，获得含有质粒DNA的细菌培养物。
作为本发明的进一步改进，所述步骤S2中，所述NaOH-SDS溶液为0.2mol/L NaOH和1％SDS的新鲜配制的混合溶液。
作为本发明的进一步改进，所述步骤S2中，在离心之前加入了pH4.8、预冷的3mol/L KAC溶液。KAC溶液的作用是中和溶液的pH。
作为本发明的进一步改进，所述步骤S3中，所述TE溶液为pH 8.0的10mmol/LTris-HCl与1mmol/L EDTA的混合溶液；所述NH4Ac溶液的浓度为10mol/L。Tris-HCl是指三羟甲基氨基甲烷溶液与盐酸的混合溶液。
作为本发明的进一步改进，所述步骤S4中，具体包括先加入1/3体积的5mol/LNaCl；再加入1/5体积的30％PEG6000和1.5mol/L NaCl的混合溶液。采用此技术方案，5mol/L NaCl增加溶液离子强度，有利于沉淀，30％PEG6000和1.5mol/L NaCl的混合溶液能有效沉淀质粒DNA，而内毒素不会被沉淀，由此把内毒素与质粒DNA分离开。
作为本发明的进一步改进，所述RNase A 的终浓度为10ug/mL
作为本发明的进一步改进，所述步骤S5中，所述采用70%乙醇洗涤沉淀的次数不小于两次。采用70%的无水乙醇的多次洗涤沉淀，去除残留的盐离子对质粒DNA的影响。
作为本发明的进一步改进，离心的温度为4℃。采用此技术方案，在低温下进行离心操作，保持质粒DNA的活性。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明采用先加入5mol/L NaCl；再加入的30％PEG6000和1.5mol/L NaCl的混合溶液的方式，能很好的去除内毒素对质粒DNA的污染，本发明所使用的所有试剂均为实验室常备的化学试剂，操作方法简洁，易于掌控，适合大规模质粒的提取。
利用本发明提取得到的去内毒素的质粒可用于酶切、DNA序列的测序、细胞转染、病毒包装以临床动物免疫实验。
具体实施方式
借助以下实施例对本发明进行进一步描述，这些具体的实施例仅在不违背本发明精神下的有限举例，本领域的一般技术人员亦可根据本发明的方案和实际情况，确定具体的实施方案。
实施例1
一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法，包括以下步骤：
步骤S1,进行细菌培养，进行细胞重悬，获得含有质粒DNA的细菌培养物；
步骤S2，加入适量的NaOH-SDS溶液进行混合，离心，获得含粗分离的质粒DNA的上清液，使用滤纸过滤后将上清液移入离心管中；
步骤S3，在离心管中加入异丙醇初步沉淀质粒，离心弃去上清液；加入TE溶液溶解沉淀，加入NH4Ac溶液后，离心保留上清液；在上清液中加入无水乙醇重新沉淀，获得较为纯化的质粒DNA，加入TE溶液溶解沉淀；
步骤F，加入RNase A以去除RNA；
步骤S4，先加入NaCl；再加入PEG6000和NaCl的混合溶液，混匀；置冰上放置20-40min，离心弃去上清液，加入无水乙醇，离心弃去上清液，保留沉淀；
步骤S5，用70%乙醇洗涤沉淀，干燥后用TE溶液溶解，获得目的质粒，并用Nanodrop2000测定OD值和OD260nm/OD280nm。
实施例1的技术方案，其关键在于，（1）利用步骤F，在较为纯化的质粒DNA中加入RNase A以去除RNA，替代经典碱裂解法中在TE缓冲液中加入RNase A，有利于提高去除RNA的效果。
（2）为解决碱裂解法中无法有效去除内毒素的问题，通过步骤S4，先加入NaCl增加溶液离子强度，有利于沉淀，然后加入PEG6000和NaCl的混合溶液来有效沉淀质粒DNA，而内毒素不会被沉淀，由此把内毒素与质粒DNA分离开。
实施例2
本实施例提供一种大规模提取去除内毒素的慢病毒质粒的方法，具体包括以下操作：
细菌培养：从含有Amp抗性LB平板上挑取已转化有pLVX-ZsGreen慢病毒质粒的单克隆菌落接种于5 mL含有Amp抗性LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜（250rpm）。取1mL过夜培养菌液接种于350 mL Amp终浓度为50μg/ mL LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜，转速设为250rpm。过夜培养菌液全部倒入500mL离心瓶中， 4,000rpm离心10min，4℃。
重悬细胞：尽可能完全的弃上清，用振荡器打散细胞，在振荡状况下逐步加入5mlTE溶液（终浓度：10mmol/L Tris-HCl，pH=8.0、1mmol/L EDTA）；仔细确定细胞是否完全重悬。
加入10mL新鲜配制的NaOH-SDS溶液（终浓度：0.2mol/L NaOH、1％SDS）颠倒混匀15秒；置冰上放置10min；在振荡状况下加入7.5mL预冷的（用前放置冰上15min）3mol/L pH=4.8 KAC溶液。
离心：9,000rpm离心15min，4℃。
将上清液通过滤纸过滤移入一个新的50 mL离心管中。
加入18mL异丙醇，倒置混匀，置室温放置30min。
离心：12,000rpm离心15min，4℃。
尽可能完全的弃上清，加入3 mL TE 溶液充分溶解沉淀。
加入1mL 10mol/L NH4Ac溶液，用加样枪轻微混匀，置冰上放置20min。
离心：12,000rpm离心15min，4℃。保留上清液于一个新的50mL离心管中。
在上清液中加入8mL无水乙醇，置-20℃冰箱放置30min。
离心：12,000rpm离心15min，4℃。
尽可能完全的弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀2次（沿管壁缓缓加入，切记不要接触管底，每次加入2mL 70％乙醇洗涤，12,000rpm离心3min）。
尽可能完全的弃上清，用420μL TE溶液充分溶解沉淀，移入一个新的EP管中。
加入终浓度为10ug/mL RNase A，37℃水浴放置20min。
加入180μL 5mol/L NaCl，混匀；再加入150μL的30％PEG6000和1.5mol/L NaCl的混合溶液，混匀；置冰上放置30min。
离心：4℃， 15,000rpm离心15min。
尽可能完全的弃上清。
用500μL TE溶液完全溶解沉淀。
加入1mL预先置-80℃冰箱预冷的无水乙醇，混匀；置-80℃冰箱放置15min。
4℃，15,000rpm离心15min，用70％乙醇洗涤沉淀2次（沿管壁缓缓加入，切记不要接触管底，每次加入1ml 70％乙醇洗涤，15000rpm离心3min）。
用10μL加样枪吸取剩余70％酒精，室温放置2- 5min即可自然干燥。
加入200μL TE溶液，待其完全溶解后，取1μL用Nanodrop2000测定OD值和OD260nm/OD280nm。
采用实施例2所获得的质粒浓度可达5mg/mL，且内毒素低于5EU/μg，能够有效地提取去除内毒素的质粒，且试剂均为实验室的常备试剂，价廉易得，提取成本低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1,进行细菌培养，进行细胞重悬，获得含有质粒DNA的细菌培养物；
步骤S2，加入适量的NaOH-SDS溶液进行混合，离心，获得含粗分离的质粒DNA的上清液，使用滤纸过滤后将上清液移入离心管中；
步骤S3，在离心管中加入异丙醇初步沉淀质粒，离心弃去上清液；加入TE溶液溶解沉淀，加入NH4Ac溶液后，离心保留上清液；在上清液中加入无水乙醇重新沉淀，获得较为纯化的质粒DNA，加入TE溶液溶解沉淀；
步骤S4，先加入NaCl；再加入PEG6000和NaCl的混合溶液，混匀；置冰上放置20-40min，离心弃去上清液，加入无水乙醇，离心弃去上清液，保留沉淀；
步骤S5，用70%乙醇洗涤沉淀，干燥后用TE溶液溶解，获得目的质粒。
2.根据权利要求1所述的大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，所述步骤S3和步骤S4之间还包括步骤F:加入RNase A以去除RNA。
3.根据权利要求1所述的大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，在所述步骤S1具体包括：在含有抗性LB平板上挑取目的菌落，取适量的目的菌落接种于含有抗性LB培养液中，37℃恒温摇床培养过夜，将过夜培养菌液全部倒入离心瓶中，离心，弃上清液，用振荡器打散细胞，在振荡状况下逐步加入TE溶液；直到细胞重悬，获得含有质粒DNA的细菌培养物。
4.根据权利要求1所述的大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述NaOH-SDS溶液为0.2mol/L NaOH和 1％SDS的新鲜配制的混合溶液。
5.根据权利要求1所述的大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，所述步骤S2中，在离心之前加入了pH4.8、预冷的3mol/L KAC溶液。
6.根据权利要求1所述的大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述TE溶液为pH 8.0的10mmol/L Tris-HCl与1mmol/L EDTA的混合溶液；所述NH4Ac溶液的浓度为10mol/L。
7.根据权利要求1所述的大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，所述步骤S4中，具体包括先加入1/3体积的5mol/L NaCl；再加入1/5体积的30％PEG6000和1.5mol/LNaCl的混合溶液。
8.根据权利要求2所述的大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，所述RNase A 的终浓度为10ug/mL 。
9.根据权利要求1所述的大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，所述步骤S5中，用70%乙醇洗涤沉淀的次数不小于两次。
10.根据权利要求1或3所述的大规模提取去除内毒素的质粒的方法，其特征在于，离心的温度为4℃。
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