CN116162619A - 一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法 - Google Patents
一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116162619A CN116162619A CN202310457133.0A CN202310457133A CN116162619A CN 116162619 A CN116162619 A CN 116162619A CN 202310457133 A CN202310457133 A CN 202310457133A CN 116162619 A CN116162619 A CN 116162619A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- plasmid
- liquid
- extraction kit
- low endotoxin
- endotoxin
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 82
- 238000000605 extraction Methods 0.000 title claims abstract description 32
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 29
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 12
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 claims abstract description 10
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 6
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 claims abstract description 5
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 20
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 20
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 20
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 9
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- -1 carboxyl silica gel Chemical compound 0.000 claims description 5
- 239000012043 crude product Substances 0.000 claims description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 125000005372 silanol group Chemical group 0.000 claims description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 241001052560 Thallis Species 0.000 claims description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 claims description 2
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 claims description 2
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 claims description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 claims description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 8
- 238000004134 energy conservation Methods 0.000 abstract description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 2
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 2
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 2-[2-(2,4,4-trimethylpentan-2-yl)phenoxy]ethanol Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=CC=C1OCCO IDOQDZANRZQBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 229920004929 Triton X-114 Polymers 0.000 description 1
- 239000000980 acid dye Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- TWYVVGMYFLAQMU-UHFFFAOYSA-N gelgreen Chemical compound [I-].[I-].C1=C(N(C)C)C=C2[N+](CCCCCC(=O)NCCCOCCOCCOCCCNC(=O)CCCCC[N+]3=C4C=C(C=CC4=CC4=CC=C(C=C43)N(C)C)N(C)C)=C(C=C(C=C3)N(C)C)C3=CC2=C1 TWYVVGMYFLAQMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- SCPYDCQAZCOKTP-UHFFFAOYSA-N silanol Chemical compound [SiH3]O SCPYDCQAZCOKTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/1013—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by using magnetic beads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法；包括洗涤液A、裂解液、中和沉淀液、孵育液、DNA结合液、洗杂液、洗涤液B和质粒溶解液；其中，所述DNA结合液由20%PEG6000、2.5 M NaCl、1%MOPS组成并使用纯水或超纯水定容。与现有方法相比，本发明中所使用的的试剂、耗材和设备均为国产，且试剂为分析纯，价格低廉，经成本测算，每1 mg质粒的提取可以将成本控制在40~50元，且内毒素低于1 EU/mL，低于业内要求的无内毒素标准，实验过程中使用的耗材可经碱法回收，实际上可将成本进一步降低，符合我国节能减排的环保要求。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法。
背景技术
质粒（Plasmid）广泛存在于生物界，是常见于原核细菌和真菌细胞中能独立于寄主染色体自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子，绝大多数的质粒是DNA型的，少部分为RNA型。天然DNA质粒大都具有共价、封闭、环状的分子结构，其分子量范围为1～300 kb。将一个外源目的基因导入细胞，需要运载工具携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具被称为载体（vector）。基因工程上所用述的载体特指一类能独立于细胞核DNA而自我复制的核酸分子，通过限制性核酸内切酶和核酸连接酶将目的基因剪辑至具有完整表达元件的启动子后，能够在宿主细胞中将目的基因进行转录和翻译。通过电转、PEI、磷酸钙等方法将载体转入真核细胞，与转入细菌表达系统相比，真核表达系统所表达出的蛋白更接近蛋白天然的空间结构。
在产品研发阶段，纳克级质粒即可满足研发需求，虽然质粒的需求量低，但是如果不能保证质粒的纯度，仍会给研发造成较大的困扰。而对于抗体等生物大分子的大量生产，则需要mg至g级的无内毒素质粒。现有无内毒素或低内毒素质粒提取试剂盒或是使用成本较高，或是内毒素仍不能满足真核表达系统转染需求。真核表达系统所需要的质粒除纯度外，对质粒的超螺旋比例也有较高的要求，一般大于90 %的超螺旋比例才会有较好的转染结果，而超螺旋比例较低则会导致转染效率低下。
综上所述，需要开发一种低毒、简便、廉价的适用于真核表达系统的细菌质粒DNA提取方法。
发明内容
本发明的目的是：提供一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法，用于克服上述技术问题中的至少一种。
为实现上述目的，本发明中采用的技术方案如下：
一种低内毒素质粒提取试剂盒，包括洗涤液A、裂解液、中和沉淀液、孵育液、DNA结合液、洗杂液、洗涤液B和质粒溶解液。
进一步的，所述DNA结合液由20 % PEG6000、2.5 M NaCl、1 % MOPS组成并使用纯水或超纯水定容。
进一步的，所述洗涤液A由MOPS、RNase A溶解于PBS中形成。
进一步的，所述裂解液由NaOH、SDS十二烷基硫酸钠溶解于水中制得；
所述中和沉淀液的配制方法为：1 L中和沉淀液中，乙酸钾300.0 g，冰乙酸250.0g其余为水；
所述孵育液的配制方法为：1L孵育液中，包括10 g Triton X-114，10.0 g MOPS，43.83 g NaCl，150.0 g 异丙醇，其余为水。
进一步的，所述洗杂液的配制方法为：20 mg 多粘菌素B（PMXB）、1.0 g PEG6000，7.30 g NaCl，1 g MOPS，使用超纯水定容至100 mL；
所述洗涤液B的的配制方法为：取800 mL无水乙醇，使用二次去离子水定容至1 L；
所述质粒溶解液的配制方法为：吸取1 M Tris-HCl（pH 7.4）1 mL和0.5 mM EDTA（pH 7.4）0.2 mL至100 mL容量瓶中，使用无菌水定容至100 mL。
本发明的目的是：提供一种低内毒素质粒的提取方法，用于克服上述技术问题中的至少一种。
一种质粒提取试剂盒提取质粒的方法，包括以下步骤：
（1）菌体培养及收集：收集处于对数生长中后期，活细胞较多的菌体沉淀；
（2）质粒粗品制备：收集的菌体沉淀经重悬，裂解，沉淀杂质后过滤得到含有质粒的上清；
（3）质粒DNA纯化：使用含有硅醇基的硅胶或羧基硅胶磁珠吸附质粒，通过微孔筛网过滤的方法去除内毒素、盐离子和其他杂质，最终使质粒溶于无内毒素的质粒溶解液中。
当使用含有硅醇基的硅胶作为纯化介质时，使用的过滤材料为10 μm无菌筛网，该筛网有两种规格，即可以搭配15 mL离心管和50 mL离心管使用。
当使用磁珠硅胶作为纯化介质时，搭配磁铁或电磁铁使用，条件允许则使用商品化核酸提取仪使用。
本发明中平均0.5 g菌体可以提出1.2 mg合格质粒，与现有方法相比，本发明中所使用的的试剂、耗材和设备均为国产，且试剂为分析纯，价格低廉，经成本测算，每1 mg质粒的提取可以将成本控制在40~50元，且内毒素低于1 EU/mL，低于业内要求的无内毒素标准（＜0.01 EU/uL），实验过程中使用的耗材（如离心管和硅胶）可经碱法回收，实际上可将成本进一步降低，符合我国节能减排的环保要求。使用本方法可以在1 h内获得mg级无内毒素适用于转染的质粒，且适用于单人操作，过程中并未使用耗时费力的离心步骤，节省了大量生产时间，提高了质粒生产效率。使用单分散球形羧基磁珠替代硅胶搭配核酸提取仪则可以进一步解放实验人员。
附图说明
图1：提取质粒凝胶电泳检测。
其中M为1 kB DNA ladder；1~8分别为24孔板E中A 1、C1、B2、D2、A4、D4、A6和C6孔中质粒样本。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。如没有特别强调温度，通常指在室温下进行反应，本发明中的室温是指10～30℃。
本发明的技术方案：
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。本发明所使用的试剂耗材均为国产，如无特殊说明，均为市售商品。
实施例1：利用硅醇基的硅胶纯化质粒
收集处于对数生长中后期，活细胞较多的菌体沉淀0.4 g于50 mL离心管中，加入40 mL洗涤液A，涡旋震荡2 min，6000 rpm 离心5 min，弃去上清。向沉淀中加入10 mL 1×PBS，涡旋震荡2 min，加入10 mL裂解液，旋紧瓶盖，上下颠倒5-6次，静置观察管内变澄清后缓慢加入中和沉淀液10 mL，上下颠倒5-6次，使用10 μm无菌筛网过滤至新的50 mL离心管中，即可获得质粒粗品。
硅胶工作液配制：称取1 g硅胶，加入10 mL DNA 结合液，涡旋后自然沉降，弃上清至固液比为1:1备用。
取20 mL质粒粗品，加入2 mL孵育液，涡旋震荡1 min，4 ℃静置10 min后加入预冷的DNA结合液10 mL，涡旋震荡1 min，加入预处理的硅胶工作液1 mL，将试管放置在4 ℃摇床中160 rpm结合15-20 min。
在超净工作台中，取新的10 μm无菌筛网于50 mL离心管上，将结合后的硅胶过滤至无菌筛网上，之后依次使用洗杂液和洗涤液B清洗3-5次硅胶。
在超净工作台中，将含有硅胶的无菌筛网转移至新的50 mL离心管上，使用1 mL质粒溶解液洗涤硅胶3-5次，之后将离心管中质粒转移至无内毒素1.5 mL离心管中。至此获得低内毒素质粒。
实施例2：利用分散球形羧基磁珠和核酸提取仪纯化质粒
核酸提取仪为Auto-Pure 96/48/24 全自动核酸提取仪，型号为：Auto-Pure 96/48/24，货号为AS-17070-00。单分散球形羧基硅胶磁珠为MagBind Particles货号为MB-10。
取60 mL质粒粗品至洁净的250 mL烧杯中，加入6 mL孵育液，使用磁力搅拌器搅拌混匀2 min；之后加入60 mL DNA结合液，继续搅拌混匀2 min；将混合好的溶液按每孔5.2mL逐个加入至24深孔板A中。
取新的24深孔板B，每孔加入洗杂液5 mL；取新的24深孔板C和D，每孔加入洗涤液B 5 mL；最后在超净工作台中，取新的24深孔板E，每孔加入0.8 mL使用0.22 μm针头过滤器过滤的质粒溶解液，备用。
向已有样本的24深孔板A中每孔加入混匀的磁珠100 μL。
将深孔板A~E转移至核酸提取仪中，运行程序，待程序运行至清洗第二次（24深孔板D）后晾干5 min。待深孔板E的操作结束后点击暂停按钮，立即盖上盖子暂封，再点击继续操作，以保证样品不受污染。
实施例3：核酸提取仪程序方法
深孔板A，位置1参数：6000 uL 震荡混匀1 min 吸磁5段每段10 s；
深孔板B~C，位置2~3参数：5000 uL 震荡混匀2 min 吸磁5段每段10 s；
深孔板D，位置4参数：5000 uL 震荡混匀2 min 吸磁5段每段10 s，设置等待时间≥ 4 min；
深孔板E，位置5参数：1000 uL 震荡混匀3 min 吸磁3段每段15 s；
e.将磁珠卸载在位置4，深孔板D中以便回收。
实施例4：使用Thermo Nanodrop 2000检测仪检测质粒的纯度和浓度
取2 μL质粒溶解液，抬起核酸检测仪样品臂，将质粒溶解液加至检测仪检测点，将仪器调零，调节完毕后使用擦镜纸清理干净；依次取24深孔板E中的质粒进行检测，直接读出A260/A280、A230/A260和核酸浓度。
表1质粒提取A260/A280
表2质粒提取A230/A260
表3质粒提取浓度
对样本数据进行分析，使用该质粒提取试剂，所提取的质粒纯度较高，且浓度较高。
实施例5：琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒的纯度和超螺旋比例
称取1 g琼脂糖，使用1×TAE 100 mL溶解（需多次加热并搅拌），待溶解后向溶液中加入核酸染料（GelGreen 10000×）10 μL，混合均匀后倒入模具中，待凝固后拔掉梳齿，备用。使用10×Loading Buffer染色质粒溶液，每个样本检测孔上样量为5 μL，电压为120V，恒压电泳40 min。如图1所示。
由琼脂糖凝胶电泳检测结果可知，所提取的质粒纯度较高，未见其他杂带且超螺旋比例＞90 %。
实施例6：提取质粒内毒素检测
使用厦门鲎试剂生物科技股份有限公司生产的鲎试剂检测试剂对样本中的内毒素进行检测。过膜的超纯水作为阴性对照，质粒粗品作为阳性对照，使用1 EU/mL 为检测限度进行检测，37 ℃静置孵育1 h，倒置第一次时不流下为阳性记为‘+’否则为阴性标记为‘-’，每个待检测样本均检测重复两次，结果见表4 所示。
表4：提取质粒内毒素检测结果
结果显示，随机挑出的待检测样本的内毒素均＜1 EU/mL，低于现行的无内毒素限度要求（小于10 EU/mL），说明使用本方法提取出的质粒内毒素含量极低，能够满足转染要求。
实施例6：硅胶磁珠提取质粒后回收
称取40 g分析纯NaOH至1L容量瓶中，加纯水定容，配制成1 M NaOH溶液备用，按以下操作流程回收磁珠：
①取磁珠（离心后磁珠量约3 mL），使用30 mL去离子水重悬，上下颠倒8~10次（颠倒后，磁珠不应沉底，若沉底，则需增加摇晃剧烈程度），1500 rpm离心1 min或1300 rpm离心2 min（若使用磁力架则在磁力架或大磁铁上吸附10~15 min），洗弃上清（保留约5 mL）；
②重复步骤①，清洗一次；
③向离心管中加入1 M NaOH 20~30 mL，于摇床中160~200 rpm混合20~30 min，沉降磁珠后洗弃上清；
④重复步骤①，清洗两次（尽量去除碱）；
⑤向离心管中加入稀盐酸调pH至7.0±0.5，上下颠倒8~10次，或使用涡旋振荡器混匀，倒置后不占壁为合格，沉降磁珠后洗弃上清；
⑥使用10 mL 20 %乙醇水溶液清洗一次；
⑦重复步骤①，清洗两次，最后一次尽量洗弃上清（可放置在大磁铁上）；
⑧按刻度值估算剩余磁珠量，1:1 加入DNA结合液中，吹洗混匀，4℃储存备用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：包括洗涤液A、裂解液、中和沉淀液、孵育液、DNA结合液、洗杂液、洗涤液B和质粒溶解液。
2.根据权利要求1所述的一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：所述DNA结合液由20 % PEG6000、2.5 M NaCl、1 % MOPS组成并使用纯水或超纯水定容。
3.根据权利要求1所述的一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：所述洗涤液A由1% MOPS、1 % RNase A溶解于1 × PBS中形成。
4.根据权利要求1所述的一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：所述裂解液由1% SDS十二烷基硫酸钠溶解于水中并使用6 M NaOH调pH≥14制得。
5.根据权利要求1所述的一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：中和沉淀液由30% 乙酸钾300.0 g，25 % 冰乙酸并用纯水定容。
6.根据权利要求1所述的一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：孵育液由1 %Triton X-114，1 % MOPS，2.5M NaCl，15 % 异丙醇组成，并用纯水定容。
7.根据权利要求1所述的一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：洗涤液B由体积分数80 %的无水乙醇和二次去离子水组成，使用0.22 μm无菌滤膜过滤后使用。
8.根据权利要求1所述的一种低内毒素质粒提取试剂盒，其特征在于：质粒溶解液的配制方法为：吸取1 M Tris-HCl 1 mL和0.5 mM EDTA 0.2 mL至100 mL容量瓶中，使用无菌水定容至100 mL。
9.如权利要求1-8中任一项所述的低内毒素质粒提取试剂盒提取质粒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）菌体培养及收集：收集处于对数生长中后期，活细胞较多的菌体沉淀；
（2）质粒粗品制备：收集的菌体沉淀经重悬，裂解，沉淀杂质后过滤得到含有质粒的上清；
（3）质粒DNA纯化：使用含有硅醇基的硅胶或羧基硅胶磁珠吸附质粒，通过微孔筛网过滤的方法去除内毒素、盐离子和其他杂质，最终使质粒溶于无内毒素的质粒溶解液中。
10.根据权利要求6所述的低内毒素质粒提取试剂盒提取质粒的方法，其特征在于：当使用含有硅醇基的硅胶作为纯化介质时，使用的过滤材料为10 μm无菌筛网，该筛网有两种规格，即可以搭配15 mL离心管和50 mL离心管使用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310457133.0A CN116162619A (zh) | 2023-04-26 | 2023-04-26 | 一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310457133.0A CN116162619A (zh) | 2023-04-26 | 2023-04-26 | 一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116162619A true CN116162619A (zh) | 2023-05-26 |
Family
ID=86418637
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310457133.0A Pending CN116162619A (zh) | 2023-04-26 | 2023-04-26 | 一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116162619A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103173438A (zh) * | 2013-04-10 | 2013-06-26 | 杭州百迈生物技术有限公司 | 一种提取质粒的试剂和方法 |
| CN107502606A (zh) * | 2017-09-21 | 2017-12-22 | 深圳市百恩维生物科技有限公司 | 一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法 |
| CN108148831A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-06-12 | 南京驯鹿医疗技术有限公司 | 一种无内毒素质粒大量制备工艺 |
| CN112481252A (zh) * | 2019-09-11 | 2021-03-12 | 普健生物（武汉）科技有限公司 | 一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法 |
| CN115029344A (zh) * | 2022-06-16 | 2022-09-09 | 通用生物(安徽)股份有限公司 | 一种高标准无内毒素质粒制备方法 |
| CN115369112A (zh) * | 2022-08-24 | 2022-11-22 | 广州美基生物科技有限公司 | 去内毒素质粒提取用结合液及试剂盒及质粒提取方法 |
-
2023
- 2023-04-26 CN CN202310457133.0A patent/CN116162619A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103173438A (zh) * | 2013-04-10 | 2013-06-26 | 杭州百迈生物技术有限公司 | 一种提取质粒的试剂和方法 |
| CN107502606A (zh) * | 2017-09-21 | 2017-12-22 | 深圳市百恩维生物科技有限公司 | 一种大规模提取去除内毒素的质粒的方法 |
| CN108148831A (zh) * | 2018-01-15 | 2018-06-12 | 南京驯鹿医疗技术有限公司 | 一种无内毒素质粒大量制备工艺 |
| CN112481252A (zh) * | 2019-09-11 | 2021-03-12 | 普健生物（武汉）科技有限公司 | 一种大规模提取用于转染哺乳动物细胞的无内毒素质粒的方法 |
| CN115029344A (zh) * | 2022-06-16 | 2022-09-09 | 通用生物(安徽)股份有限公司 | 一种高标准无内毒素质粒制备方法 |
| CN115369112A (zh) * | 2022-08-24 | 2022-11-22 | 广州美基生物科技有限公司 | 去内毒素质粒提取用结合液及试剂盒及质粒提取方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 密特拉: "《分析化学中的样品制备技术》", 中国人民公安大学出版社, pages: 287 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0764206B1 (en) | Magnetic bead precipitation method | |
| CN107663521B (zh) | 血浆游离核酸提取试剂盒及其应用 | |
| CN106124282B (zh) | 一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法 | |
| CA2983619C (en) | Method and test kit for rapid isolation of nucleic acids using rough surfaces | |
| US20060154247A1 (en) | Methods,compositions and kits for cell separation | |
| CN112322612A (zh) | 一种质粒提取试剂盒及提取方法 | |
| CN112391384B (zh) | 一种快速提取革兰氏阴性菌基因组dna的试剂盒及提取方法 | |
| EP3904512A1 (en) | Method for quickly extracting long-fragment genomic dna by single reaction tube, and kit | |
| US5047345A (en) | Composition for isolating and purifying nucleic acid and improved method using same | |
| US20090227011A1 (en) | Methods of purifying plasmid dna | |
| CN111676215A (zh) | 一种去内毒素质粒提取试剂盒及质粒提取的方法 | |
| CN116162619A (zh) | 一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法 | |
| JP2005505300A (ja) | 細菌細胞の非特異的濃縮のための方法 | |
| CN113604465A (zh) | 一种基于十六烷基三甲基溴化铵的磁珠核酸提取方法 | |
| WO2020200201A1 (zh) | 纳米磁珠的制备方法、游离dna提取试剂盒及提取方法 | |
| CN106834324B (zh) | 一种能促进蛋白可溶性表达及提高表达量的重组表达载体 | |
| CN116814612A (zh) | 一种低内毒素质粒提取试剂盒及其提取方法 | |
| WO2023125592A1 (zh) | 磁珠及其制备方法与在核酸提取中的应用 | |
| CN113846088B (zh) | 一种提取质粒dna的试剂盒及方法 | |
| CN106928315B (zh) | 基于氧化石墨烯的核酸结合蛋白提取方法 | |
| US5204257A (en) | Method of recovering bacteriophage | |
| JP4220164B2 (ja) | 核酸の精製方法および当該方法に用いる核酸抽出用溶液ならびに核酸精製用試薬キット | |
| CN112662665A (zh) | 磁珠法提取质粒dna的方法及提取质粒dna的试剂盒 | |
| CN102146369A (zh) | 一种基于配位作用的固相介质提取dna的方法 | |
| CN114214390B (zh) | 用于高通量测序的微生物饲料添加剂的核酸提取方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20230526 |